PL168777B1

PL168777B1 - Kompozycja do zwalczania mieczaków PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL168777B1
Application number: PL92302033A
Authority: PL
Inventors: Michael J Wilson; David M Glen; Jeremy D Pearce
Original assignee: Agricultural Genetics Co
Priority date: 1991-07-11
Filing date: 1992-07-09
Publication date: 1996-04-30
Also published as: EP0598746A1; SK2294A3; CA2113173A1; NZ243533A; CZ285283B6; CA2113173C; SK279691B6; ATE142845T1; DK0598746T3; DE69213947T2; HU219857B; ES2094362T3; WO1993000816A1; TR26297A; EP0598746B1; PT100669B; US5527525A; GR3021953T3; HU9400060D0; JP2927960B2

Abstract

1. Kompozycja do zwalczania mieczaków, znamienna tym, ze zawiera gatunki nicieni z rodzajów Phasmarhabditis w asocjacji z odpowiednia bakteria przyspieszajaca ich wzrost lub ze spolecznoscia odpowiednich bakterii przyspieszajacych ich wzrost, wraz z odpowiednim nosni- kiem lub srodkiem kapsulkujacym. PL PL PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy kompozycji do zwalczania mięczaków, w tym ślimaków nagich, np. Deroceras reticulatum oraz ślimaków muszlowych, np. Monacha cantiana. Dla wygody wynalazek zostanie opisany głównie w odniesieniu do zwalczania ślimaków nagich, z tym że należy zdawać sobie sprawę, jest on równie przydatny do zwalczania innych mięczaków będących szkodnikami roślin na polach i w cieplarniach, albo przenoszących pasożyty niebezpieczne dla ludzi i zwierząt.

Ślimaki nagie są rozpowszechnionymi szkodnikami szeregu podstawowych upraw rolnych, zwłaszcza pszenicy ozimej, rzepaku i ziemniaka w Wielkiej Brytanii, innych krajach europejskich, w północnej i środkowej Ameryce oraz w Australoazji. Stanowią one również problem w ogrodnictwie i w ogrodach przydomowych.

Najważniejszym gatunkiem ślimaka nagiego jest szary ślimak połowy, Deroceras reticulatum (rodzina Limacidae), choć także inne ślimaki takie jak Arion (rodzina Arionidae), Tandonia, Millax (rodzina Milacidae) i gatunki Boettgerilla mogą również poczynić wiele szkód. Ślimaki muszlowe mogą również być szkodnikami w ogrodnictwie i w rolnictwie; przy czym przykładem takiego ślimaka jest Monacha cantiana (rodzina Helicidae). Przykłady mięczaków jako szkodników podał Godan w „Pests Slugs and Snails“ (1983, Springer-Verlag, Berlin). Mięczaki mogą również przenosić szkodniki stanowiące niebezpieczeństwo dla zdrowia ludzi i zwierząt. Przykładowo wymienić można gatunki Lymnaea (rodzina Lymnaeidae), które przenoszą motylicę wątrobową Fasciola hepatica i gatunki Bulinus (rodzina Bulinidae), które przenoszą Opisthorcis sinen168 777 3 sis. Rodziny Limicidae, Arionidae, Milacidae I Helicidae należą do rzędu Stylomnatophora. Rodziny Bulinidae i Lymnaeidae należą do rzędu Basomnatophora.

Aktualne sposoby zwalczania są jedynie częściowo skuteczne, a wiele dostępnych chemikaliów jest toksyczne dla ptaków i ssaków. W związku z tym istnieje wyraźne zapotrzebowanie na bardziej skuteczne, stabilne i mniej toksyczne sposoby zwalczania mięczaków.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że nicienie z gatunku Phasmarhabditis stanowią skuteczne środki zwalczania wielu różnych gatunków mięczaków. Szczególnie skutecznymi gatunkami Phasmarhabditis są spokrewnione organizmy P. neopapillosa i P. hermaphrodita, które zostaną dokładniej opisane poniżej. Gatunki te są znane od wielu lat i opisane są w literaturze, a w szczególności zostały scharakteryzowane przez Andrassy'ego w „A Taxonomic Review of the Sub-Order Rhabditina (Nematoda: Secementina)“ (1983, Ostrom, Paryż). Jednakże biologiczne działanie tych organizmów na ślimaki nagie i inne mięczaki nie zostało dotychczas stwierdzone.

Kompozycja do zwalczania mięczaków według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera gatunki nicieni z rodzaju Phasmarhabditis w asocjacji z odpowiednią bakterią przyspieszającą ich wzrost lub ze społecznością odpowiednich bakterii przyspieszających ich wzrost wraz z odpowiednim nośnikiem lub środkiem kapsułkującym.

Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera nicienie w stadium larwy uśpionej. Kompozycja według wynalazku korzystnie zawiera nicienie z gatunku P. neopapillosa lub P. hermaphrodita.

Jako nośnik kompozycja według wynalazku korzystnie zawiera glinkę.

Jako bakterie przyspieszające wzrost kompozycja według wynalazku zawiera bakterie wybrane z grupy obejmującej:

Pseudomonas fluorescens Providencia rettegeri Serratia proteomaculans Aeromonas salmonicida Maraxella phenylpyruvica Bacillus cereus Flavobacterium odoratum Flavobacterium brevi, a zwłaszcza bakterie przyspieszające wzrost Maraxella phenylpyruvica szczep NC IMB 40508 lub Pseudomonas fluoresecens szczep NCI MB 40509.

Kompozycja według wynalazku korzystnie ma postać proszku, przy czym najkorzystniej jako nośnik zawiera glinkę w postaci montmorylonitu wapniowego, wodę i nicienie, których stężenie wynosi od 0,1 X 10⁶ do 2,0 X 10⁶ na gram (wagi na mokro), korzystnie od 0,3 X 10⁶ do 0,8 X 10⁶na gram (wagi na mokro).

Tak więc wynalazek dotyczy kompozycji, w których zastosowano gatunki Phasmarhabditis do zwalczania mięczaków. Organizmy te można uzyskać ze ślimaków nagich żyjących na polu i hodować sposobami opisanymi poniżej w celu uzyskania ilości umożliwiających wytworzenie odpowiednich kompozycji do stosowania na polu lub w cieplarni. Typowe kompozycje do praktycznego stosowania zawierają dopuszczalne materiały stanowiące nośniki, takie jak torf, glinki oraz inne stałe lub półstałe nośniki, takie jak materiały w postaci żeli. Próby na poletkach doświadczalnych oraz próby polowe wykazały, że nicienie mogą zabijać ślimaki nagie oraz chronić sadzonki kapusty chińskiej i nasiona pszenicy przed uszkodzeniem przez ślimaki nagie co najmmniej tak skutecznie, albo nawet lepiej niż methiocarb, najlepszy dostępny obecnie środek chemiczny.

Biologia organizmu

Nicienie wyizolowano z nagich ślimaków zebranych na Long Asthon Research Station w Wielkiej Brytanii. Stwierdzono, że nicienie powodują śmiertelną chorobę nagich ślimaków z charakterystycznymi objawami, z których najwyraźniejsze jest puchnięcie płaszcza nagiego ślimaka. Nicienie zidentyfikowano jako należące do podgatunku Rhabditina, a dokładniej określono je z wykorzystaniem klucza Andrassy'ego (1983). Głównymi cechami taksonometrycznymi tej grupy są części gębowe i męskie struktury rozrodcze. Nicienie wyizolowane na Long Asthon

168 777 zawierały wyrażone krótkie przetchlinki z izomorficzną metastomą, a osobniki męskie, jeśli występowały, zawierały kaletki peloderanowe charakterystyczne dla gatunku Phasmarhabditis. Almassy (1983) wymienia dwa morfologicznie identyczne gatunki tych nicieni różniące się między sobą ilością osobników męskich w populacji. W przypadku Phasmarhabditis neopapillosa osobniki męskie i żeńskie występują jednakowo licznie, podczas gdy w przypadku P. hermaphrodita osobniki męskie występują bardzo rzadko. Do tej pory nie wiadomo, czy P. hermaphrodita stanowi odrębny gatunek, czy też po prostu wariant biologiczny P. neopapillosa. P. hermaphrodita zostały po raz pierwszy opisane przez Maupasa w Archives de Zoologie (1990), Vol. 8, 464-624, który nazwał te nicienie Rhabditis caussaneli. Znalazł on przetrwalnikowe formy larw w przewodzie pokarmowym Arion ater zebranych w Normandii. Maupas utrzymywał hodowle nicieni na zgniłym mięsie przez dwa lata. Stwierdził, że dojrzałe gąsienice były w przeważającym stopniu protandrycznymi, samozapładniającymi się hermafrodytami. Osobniki męskie występowały w bardzo małych ilościach (jeden osobnik męski na 1300 żeńskich), a ponadto warunki odżywiania nie wpływały na ilość osobników męskich w hodowli. Maupas nigdy nie zaobserwował kopulacji osobników męskich z żeńskimi, które nie wykazywały zmian płodności, ani zmian w stosunku płci u potomstwa w obecności osobników męskich. Maupas nie stwierdził, że nicienie te mogą być pasożytami nagich ślimaków.

Phasmarhabditis neopapillosa został opisany przez Mengerta, który nadał temu nicieniowi nazwę Rhabditis neopapillosa w Zietschrift fur Morphologie und Okologie Tiere (1953), Vcl. 41, 311-349 w swojej pracy nad zależnościami między nicieniami i mięczakami lądowymi. Znalazł on nicienie w stadium przetrwalnikowej larwy („larwy uśpione) w tylnym jelicie nagiego ślimaka Limax cinereoniger. Mengert uważał, że P. neopapillosa jest saprofitem, który rozwija się na psującym się materiale przez szereg generacji, ale gdy warunki stają się niekorzystne, młode osobniki przestają dojrzewać i tworzą przetrwalnikowe, nie odżywiające się larwy uśpione. Stwierdził on, że pod względem sposobu życia P. neopapillosa jest identyczny z dwoma innymi gatunkami, Phasmarhabditis paplillosa i P. hermaphrodita. Stwierdził on, że jeśli nadarzy się okazja, larwy uśpione wszystkich tych trzech gatunków przedostają się do organizmu nagich ślimaków, gdzie pozostają jako larwy uśpione aż do śmierci nagiego ślimaka, po czym rozwijają się i mnożą odżywiając się jego ciałem. Menregt sądził, że przebywanie w organizmie nagiego ślimaka nie stanowi niezbędnego stadium cyklu życia nicieni, ale uważał, że larwy uśpione tych gatunków wykazują pewien stopień przystosowania do życia w nagich ślimakach. Stwierdził on jednak, że nicienie te nie są pasożytami nagich ślimaków.

Nicienie można wyizolować z nagich ślimaków zebranych z pola z wykorzystaniem pułapek z przynętą w postaci otrąb pozostawionych na świeżej trawie. Po zbiorze nicienie można wydzielić z jelita lub jamy płaszczowej nagiego ślimaka, po wykonaniu sekcji. Wiele gatunków nicieni związanych jest ze ślimakami nagimi (Mengert, 1953) i istnieje konieczność identyfikacji P. hermaphrodita i P. neopapillosa z wykorzystaniem klucza taksonomicznego (Andrassay, 1983). Jeśli w nagim ślimaku stwierdzi się infekcje stadium nicieni (larwy uśpione), to należy założyć hodowlę nicieni w celu dokonania identyfikacji.

Nicienie Phasmarhabditis wyizolowano na Long Asthon w wielu przypadkach. W pewnych przypadkach populacja nicieni zawierała osobniki męskie i żeńskie, podczas gdy w innych przypadkach populacje składały się wyłącznie z hermafrodytów. Nicienie z obydwu typów populacji zbadano pod mikroskopem optycznym i mikroskopem skaningowym. Zbadano również profile białek z różnych populacji po rozdzielaniu białek metodą ogniskowania izoelektrycznego. Żadne z powyższych metod nie wykazały różnic między populacjami. Wyizolowane nicienie odpowiadają dostępnym opisom P. neopapillosa i P. hermaphrodita.

Nicienie Phasmarhabditis hodować można sposobami ujawnionymi w niniejszym opisie. Wiadomo, że nicienie będące pasożytami owadów hodować można na wielką skalę do wykorzystania technicznego stosując ciekłe hodowle z zastosowaniem mieszanych zbiorników lub napowietrzanych fermentatorów, albo też hodowle stałe w torbach lub na tacach z piankowych płatków. Podobne techniki wykorzystać można w hodowli w dużej skali P. hermaphrodit i P. neopapillosa. I tak nicienie wykorzystywane zgodnie z wynalazkiem łatwo hoduje się w ośrodku opartym na

168 777 nerkach w spienionych płatkach, albo w hodowli ciekłej z wykorzystaniem technik podobnych do wykorzystywanych w hodowli nicieni będących pasożytami owadów. Według wynalazku zaleca się dokonywanie zbiorku nicieni w stadium larwy uśpionej.

Wymagania odnośnie zasocjowanych bakterii

Nicienie Phasmarhabditis odżywiają się bakteriami. Stwierdzono, że wiele izolatów bakteryjnych zasocjowanych jest z nicieniami Phasmarhabditis po ich wydzieleniu z konających nagich ślimaków. Zbadano zależności między nicieniem i tymi zasocjowanymi bakteriami w celu ustalenia, które z bakterii mogą podtrzymywać szybki wzrost nicieni i porównano patogeniczności nicieni hodowanych na różnych gatunkach bakterii.

Aby zapewnić wysokie wydajności w hodowli nicieni Phasmarhabditis będących patogenami mięczaków, korzystnie rozwija się je w hodowlach z jednym znanym gatunkiem zasocjowanych bakterii (w hodowlach monoksenicznych), w związku z czym należy opracować sposób selekcji pojedynczych gatunków bakterii zdolnych do podtrzymywania wzrostu nicieni. Bakterie zdolne do podtrzymywania wzrostu nicieni wydzielić można z nicieni, z hodowli nicieni rozwijających się na mieszanej populacji drobnoustrojów, z nagich ślimaków zainfekowanych bakteriami oraz z ciał nagich ślimaków zaatakowanych przez nicienie. Nicienie można następie uwolnić od wszystkich zanieczyszczających bakterii i wprowadzić do hodowli różnych indywidualnych hodowli bakterii. Inkubacja tych hodowli umożliwia selekcję izolatów bakteryjnych zdolnych do podtrzymywania wzrostu nicieni.

Około 100 izolatów bakteryjnych uzyskano z nicieni, z nagich ślimaków zaatakowanych przez nicienie i z padniętych nagich ślimaków zaatakowanych przez nicienie. 15 spośród tych izolatów zbadano pod względem ich zdolności do podtrzymywania wzrostu nicieni. Stwierdzono, że 9 spośród tych izolatów, reprezentujących 8 gatunków, dobrze podtrzymuje wzrost nicieni na agarze. Następujących 8 gatunków bakterii dobrze podtrzymuje wzrost nicieni:

Pseudomonas fluorescens Providencia rettgeri Serratia proteomaculans Aeromonas salmonicida Moraxella phenylpyruvica Bacillus cereus Flavobacterium odoratum Flavobacterium brevi

Zdolność nicieni hodowanych na różnych gatunkach bakterii do uśmiercania nagich ślimaków można zbadać wykonując próby biologiczne. W próbie takiej nagie ślimaki wystawia się na działanie różnej liczby nicieni i rejestruje się śmiertelność nagich ślimaków. Wykorzystując taką metodę wyznaczyć można ilościowo patogeniczność (np. LD50) nicieni w stosunku do nagich ślimaków, którą można z kolei wykorzystać do porównania patogeniczności nicieni hodowanych na różnych gatunkach bakterii. Dostarczanie nicieni w postaci zasocjowanej z konkretnymi bakteriami ma istotne znaczenie nie tylko z uwagi na wzrost nicieni (in vitro i in vivo), ale również na ich zdolność do uśmiercania nagich ślimaków. Nicienie przenoszą zasocjowane bakterie przechodząc do nagiego ślimaka, co umożliwia szybkie zadomowienie się i mnożenie nicienia prowadzące do śmierci nagiego ślimaka.

Do przykładowych odpowiednich szczepów bakterii należy szczep 48 Moraxella phenylpyruvica i szczep 141 Pseudomonas fluorescens, których próbki zdeponowano zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim w National Collection of Industrial and Marine Bacteria*, odpowiednio pod numerami NCIMB 40508 i NCIMB 40509, w dniu 9 czerwca 1992. Szczep 141 Pseudomonas fluorescens jest Gram-dodatnią, oksydazowo-dodatnią, katalazowo-dodatnią bakterią, nieruchomą i dającą wynik ujemny w próbie D/F (Hugh i Leifson) aerobowego i anaerobowego rozkładu glikozy. Szczep 48 Moraxella phenylopyruvica jest Gram-ujemną, oksydazowododatnią, katalozowo-dodatnią bakterią, nieruchomą i dającą wynik ujemny w próbie O/F (Hugh i Leifson). Poniżej podano biochemiczne profile obydwu szczepów na standardowym podkładzie (pasek testowy API ZONE). Adres: 23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB2, 1RY, Wielka Brytania.

168 777

Reakcja	Moraxella	Pseudomonas
NO3-NO2	phenylpyruvica 48 +	fluorescens 141
NO₃-N₂	X	—
Indol	—	—
Kwas z glikozy	—	—
Dihydrolaza argminowa	—	+
Ureaza	—	—
Hydroliza eskuliny	—	—
Hydroliza żelatyny	—	4-
β-galaktozydaza		—
Asymilacja glikozy	__	+
arabinozy	—	+
mannozy	—	+
N-acetyloglikozaminy	—	+
maltozy	—	—
glikonianu	—	+
karpomanu	—	+
adypinanu	—	—
jabiczanu	—	+
cytrynianu	+	+
octanu fenylu	—	—

X = nie badano

Użyteczne warianty szczepu M. phenylpyruvica 48 i szczepu P. fluorescens 141 uzyskać można powtarzając podhodowle czystych hodowli tych szczepów. Warianty można także uzyskać ponownie wydzielając bakterie z nicieni Phasmarhabditis hodowanych uprzednio w asocjacji z którymkolwiek ze szczepów lub ponownie wydzielając bakterie z nagich ślimaków zainfekowanych nicieniami. W takich wariantach mogą wystąpić zmiany genotypowe lub fenotypowe na skutek oddziaływania środowiska lub selektywnego nacisku. Wykonać można przydatne konstrukcje szczepu M. phenylpyruvica 48 i szczepu P. fluorescens 141 wprowadzając DNA kodujący pożądane cechy z innego organizmu. Sposoby wprowadzania obcego DNA do bakterii są dobrze znane specjalistom i obejmują techniki takie jak transfer, transdukcję i transfekcję plazmidu. Użyteczne mutanty szczepu M. phenylpyruvica 48 i szczepu P. fluorescens 141 uzyskać można na drodze mutagenezy z wykorzystaniem metod dobrze znanych specjalistom, takich jak techniki chemiczne (np. z zastosowaniem nitrozoguanidyny), fizyczne (promieniowanie nadfioletowe) i genetyczne (mutageneza transpozonowa). Takie warianty, pochodne i mutanty szczepów mogą różnić się takimi cechami jak szybkość wzrostu i zdolność do wzrostu na pewnych źródłach pożywienia, z tym, że będą zachowywać zasadnicze cechy istotne z punktu widzenia wynalazku, to znaczy zdolność do podtrzymywania nicieni Phasmarhabditis oraz indukowania ich patogeniczności w stosunku do mięczaków.

W celu zastosowania do zwalczania szkodników rolniczych nicienie zbiera się z fermentatorów na drodze odwirowania, filtracji lub osiadania grawitacyjnego. Nicienie przemywa się w celu usunięcia składników wyczerpanego ośrodka i albo od razu przyrządza się preparaty, albo też przechowuje się je w schłodzonych, napowietrzonych zawiesinach wodnych przed późniejszym wytwarzaniem preparatów. Do stosowania w rolnictwie preparaty nicieni można przyrządzać w postaci wodnych zawiesin, na stałych nośnikach takich jak węgiel drzewny, glinki, torf, wermikulit lub gąbka polieterowopoliuretanowa, albo kapsułkować w żelach takich jak alginian lub poliakryloamid. Szczególnie korzystny preparat zawiera osuszone lub częściowo osuszone nicienie. Preparaty nicieni zastosować można do zwalczania szkodników wykonując wodne zawiesiny, które nanosi się na miejsce przeznaczone do obróbki metodami natrysku, nawadniania lub podlewania.

Przykład I. Sposób wydzielania nicieni Phasmarhabditis. Żywe nicienie wyizolowane z nagich ślimaków zebranych na polu z wykorzystaniem pułapek z przynętą z otrąb umieszcza się na ośrodku agarowym opartym na nerce, uzyskanym w wyniku zmieszania 10% homogenizatu nerki wieprzowej, 3,5% oleju kukurydzianego, 2% agaru o 84,5% wody (wag.), który sterylizuje się następnie przez autoklawowanie i umieszcza na szelkach Petriego. Ośrodek przyspiesza wzrost

168 777 7 bakterii zasocjowanych z nicieniami. Nicienie odżywiają się tymi bakteriami oraz rosną i mnożą się na szalkach.

Przykład II. Wydzielanie bakterii zasocjowanych z nicieniami lub z nagimi ślimakami zainfekowanymi przez nicienie.

(I) Wydzielanie bakterii z nicieni. Nicienie sterylizuje się powierzchniowo zanurzając je w 0,1% (wag./objęt.) etylortęciotiosalicylanu sodowego (Thimerosal) na 1 godzinę, a następnie przenosząc je do świeżego odczynnika Thimerosal na kolejne 3 godziny. Bakterie uwolnić można z nicieni z wykorzystaniem sterylnych technik mikrobiologicznych dwoma sposobami:

a) Poszczególne larwy nicieni przenosi się na kroplę sterylnego roztworu soli na sterylizowanym płomieniowo szkiełku mikroskopowym. Nicienie rozcina się następnie wzdłuż na szereg kawałków. Kroplę roztworu soli wraz z kawałkami nicienia przenosi się następnie za pomocą sterylnej pipety Pasteura na 9 cm szalki Petriego z pożywką agarową i rozprowadza się je po powierzchni za pomocą bagietki szklanej sterylizowanej w płomieniu spirytusowym.

b) Szereg powierzchniowo sterylizowanych nicieni zawiesza się w 1 ml sterylnego roztworu Rongera, po czym przenosi się do 5 ml teflonowego homogenizatora tkanek. Zawiesinę nicieni rozdrabnia się, a następnie przenosi do 9 ml sterylnego bulionu pożywkowego. Bulion intensywnie wstrząsa się, po czym seryjnie rozcieńcza się. Próbki po 0,1 ml każdej z rozcieńczonych zawiesin umieszcza się na płytkach z pożywką agarową, rozprowadza się za pomocą szklanej bagietki i prowadzi się inkubację. Po 48 godzinach inkubacji w 25°C wyselekcjonować można różne izolaty bakteryjne na podstawie morfologii kolonii i prowadzić podhodowlę z wykorzystaniem standardowych technik mikrobiologicznych.

(II) Wydzielanie bakterii z hodowli na płatkach jałowej pianki.

Płatki zawierające nicienie i bakterie pobiera się z dobrze rozwiniętych jałowych hodowli za pomocą szczypiec sterylizowanych w płomieniu palnika spirytusowego. Każdy z płatków umieszcza się w próbce zawierającej 10 ml sterylnego bulionu pożywkowego i całość miesza się. Wykonuje się kolejne rozcieńczenia uzyskanej zawiesiny bakteryjno/nicieniowej, po czym próbki po 0,1 ml każdej z rozcieńczonych zawiesin umieszcza się na płytkach z pożywką agarową, rozprowadza się i prowadzi się inkubację.

(III) Wydzielanie bakterii z żywych nagich ślimaków zainfekowanych nicieniami.

P. hcrmaphrodita/P. neopapillosa infekuje i mnoży się w regionie płaszczowym nagich ślimaków i z tego właśnie regionu bakterie można wyizolować. Płaszcz najpierw wyciera się suchymi wacikami w celu usunięcia możliwe jak największej ilości śluzu. Powierzchnię płaszcza wyciera się następnie 70% (objęt./objęt.) etanolu w celu powierzchniowego wysterylizowania płaszcza. Obsadzoną igłę wysterylizowaną w płomieniu stosuje się do przekłucia płaszcza i krople płynu z końca igły przenosi się bezpośrednio na płytki z pożywką agarową, na której rozprowadza się ją za pomocą szklanej bagietki i prowadzi się inkubację.

(IV) Wydzielanie bakterii z padłych nagich ślimaków. Rozmazy tkanki korpusów nagich ślimaków padłych w wyniku infekcji nicieniowej i pokrytych nicieniami zawiesza się w bulionie pożywkowym za pomocą ezy. Wykonuje się kolejne rozcieńczenia, po czym próbki po 0,1 ml umieszcza się na płytkach z pożywką agarową, rozprowadza się i prowadzi się inkubację.

Przykład III. Sposób selekcji bakterii podtrzymujących dobry wzrost nicieni.

Zanim stanie się możliwe przeprowadzenie selekcji różnych bakterii pod względem ich zdolności do podtrzymywania wzrostu nicieni, należy najpierw uzyskać nicienie wolne od bakterii. Żeński przewód rozrodczy nicieni jest zazwyczaj sterylny (Poinar i Hansen, Helminthological Abstracts, Series B [1986]. Vol. 3, nr 3,61-81) i w związku z tym młode J1 bezpośrednio po wykluciu są sterylne. Pojedyncze ciężarne dorosłe nicienie wybrane z hodowli nicieni lub nagich ślimaków przenosi się na sterylne szkiełka zegarkowe zawierające 0,02% (wag./objęt.) Thimerosal, gdzie pozostawia się je na noc w 10°C. W tym czasie młode osobniki (J1) wykluwają się z jajeczek w dorosłych osobnikach, po czym wydostają się. Następnego dnia młode przenosi się za pomocą pipety do probówek do wirowania wypełnionych 10 ml roztworu Ringera o 1/4 mocy, zawierającego 500 jednostek/ml penicyliny G i siarczanu streptomycyny. Młode trzyma się w tym roztworze przez kolejne 24 godziny w 10°C. Następnie zatęża się je prowadząc łagodne odwirowanie (50 X g

168 777 przez 10 minut), zbiera się z dna probówki, ponownie zawiesza się w roztworze Ringera o 1/4 mocy i znowu odwirowuje się.

Zawieszanie i wirowanie powtarza się jeszcze raz w celu usunięcia jakichkolwiek śladów antybiotyków. Larwy umieszcza się następnie na sterylnym szkiełku zegarkowym. Nicienie można następnie przenieść za pomocą mikropipet wykonanych przez wyciąganie kroplomirzy w palniku Bunsena na szerokość około 0,1 mm. Hodowle nicieni prowadzi się następnie na agarze nerkowym (w sposób opisany w przykładzie I) na 3 cm szalkach Petriego. Jedną ezę wypełnioną 18-godzinną hodowlą badanych bakterii w bulionie pożywkowym rozprowadza się na jednej połowie 30 mm płytki nerkowej. 10 jałowych młodych nicieni uzyskanych w sposób opisany w przykładzie 8 wprowadza się na brzeg szalki Petriego w połówce bez bakterii, tak że nicienie muszą przebyć drogę co najmniej 15 mm przez powierzchnię wolną od bakterii, zanim dotrą do badanych bakterii. Szalki inkubuje się w 15°C. Jakiekolwiek bakterie obecne na nicieniach, które nie zostały uśmiercone w czasie wyjaławiania, utworzą widzialne kolonie na tej połówce szalki, tak że szalki te można będzie odrzucić. Po tygodniu szalki wykazujące zanieczyszczenie bakteryjne w „czystej połowie odrzuca się. Po 2 tygodniach zliczyć można bezpośrednio pod mikroskopem ilość nicieni znajdujących się na szalce; przykrywkę szalki Petreigo zdejmuje się i yoctpniiio inn ą przykrywko z zanaczoną Ciatką do zliczeń. Po 3 tygodniach nicienie można zliczyć ponownie spłukując je z agaru do znanej objętości wody i zlicza się ilość nicieni w zawiesinie wykorzystując do tego celu 1 ml komorę do zliczeń Petera.

różnych gatunków bakterii zebranych z wykorzystaniem opisanych metod poddano selekcji pod względem ich aktywności do podtrzymywania wzrostu nicieni. Wyniki podano w tabeli 1.

Tabela 1

Ilości nicieni Fhasmarhabiditis/szalkę Petriego po 2 i 3 tygodniach wzrostu w jałowej hodowli z różnymi bakteriami.

Wyniki przekształcono w logarytmy w celu wykonania analizy statystycznej

Bakteria	2 tygodnie	3 tygodnie
Ilość	log	Ilość	log
Wyjałowione	2	0,41	0	0,00
Bakteria 1A	170	2,18	18090	4,22
Bakteria 17	0	0,04	0	0,00
Bakteria 34	1	0,13	890	1,00
Bakteria 48	60	1.70	54060	4,73
Bakteria 54	80	1,53	25950	4,39
Bakteria 77	1160	3,06	86340	4,93
Bakteria 83	520	2,46	67000	4,78
Bakteria 141	690	2,77	75220	4,85
Bakteria 156	250	2,26	83630	4,89

Standardowe odchylenie błędu dla porównania log ilości nicieni = 0,204, współczynnik odchylenia 128

Po 3 tygodniach wystąpiły wysoce znaczące (P<0,001) różnice w zdolności bakterii do podtrzymywania wzrostu nicieni.

Przykład IV. Sposób hodowli w masie nicieni Phasmarhabditis metodą hodowli na płatkach pianki.

Nicienie można hodować w masie na płatkach pianki polieteropoliuretanowej, wykorzystując techniki zbliżone do stosowanych w masowej hodowli nicieni będących pasożytami owadów (Bedding, w Nematologica (1981), Vol. 27, 109-114 oraz Annals of Applied Biology (1984), Vol. 104, 117-120). Ośrodek zawiera 65% nerki wieprzowej, 15% tłuszczu wołowego i 25% wody, (% wag.). Nerkę sieka się na małe kawałki, dodaje się wodę i mieszankę „upłynnia się w mieszarce Waring. Tłuszcz wołowy topi się na dużej patelni na palniku gazowym, po czym dodaje się homogenizat nerki i miesza się dokładnie z tłuszczem, po czym smaży się aż do zbrązowienia. Mieszankę ponownie wlewa się do mieszarki Waring i homogenizuje się. Homogenizat miesza się z płatkami pianki, stosując 12 części wag. mieszanki na 1 część płatków pianki. Uzyskany ośrodek

168 ΠΊ umieścić można w kolbach stożkowych lub torebkach do autoklawowania, jak to opisał Bedding (1984). Pożywki z płatków pianki zaszczepia się równocześnie nicieniami i bakteriami. W każdej torebce wykonuje się nacięcie i na wierzch wprowadza się 75 ml prowadzonej przez noc hodowli bakterii. Hodowla bakterii może być w postaci mieszanej populacji bakteryjnej opisanej w przykładzie II, albo w postaci czystej hodowli szczepu bakterii wyselekcjonowanego pod względem zdolności do podtrzymywania dobrego wzrostu nicieni, opisanej w przykładzie III. Dodaje się nicienie na agarze z szalek Petriego lub na płatkach pianki z poprzedniej hodowli w torebkach. Torebki do hodowli inkubuje się w 15°C przez 3 tygodnie. Po tym okresie zaobserwować można wiele infekcyjnych młodych osobników wewnątrz torebek oraz pozostawiony wyczerpany ośrodek. Nicienie zbiera się z płatków pianki z wykorzystaniem zmodyfikowanej techniki wydzielania na lejku, podobnej do tej, którą wykorzystuje się do zbierania nicieni z próbki gleby. Miedziane sita do gleby o średnicy 17,5 cm wykłada się 17,5 cm gazą i umieszcza się w 50 cm doniczkach. Płatki pianki z torebek wsypuje się na sita na grubość około 2 cm i doniczki wypełnia się wodą w takiej ilości, aby jej poziom sięgał spodu warstwy płatków pianki. Sita pozostawia się na noc; w tym czasie żywe nicienie przechodzą przez gazę i zbierają się w wodzie pod nią. Po oczyszczeniu zawiesiny nicieni do wyczerpanego ośrodka i bakterii poprzez wielokrotne zmienianie wody, nicienie przechowuje się w napowietrzonej wodzie w 10°C aż do wykorzystania.

Prz yk la dV. Ciekła hodowla monoeksenicznych nicieni Phasmarhabditis.

Wyjałowione nicienie hoduje się na stałym ośrodku (opartym na nerce) z odpowiednimi bakteriami. Po 3 tygodniach nicienie przenosi się do ciekłej hodowli.

Nicienie hodowano w wytrząsanych kolbach do hodowli, w następujących warunkach: Ośrodek - 10% nerki, 1% ekstraktu drożdżowego, 3,5% oleju kukurydzianego Kolba - 250 ml kolby stożkowe z 50 ml ośrodka

Temperatura - 15°C

Szybkość wytrząsarki - 200 obrotów/minutę.

Kolby zaszczepiono 1 ml odpowiedniego gatunku bakterii hodowanego w bulionie pożywkowym. Po 24 godzinach nicienie spłukiwano do kolb sterylną wodą wodociągową i prowadzono inkubację przez 3 tygodnie.

Nicienie przemywano dwukrotnie sterylną wodą i zliczano. Nicienie te zastosowano następnie jako zaszczep w doświadczeniach hodowlanych. Nicienie dodawano w ilości 3000 nicieni/ml do kolby wstępnie zaszczepionych bakteriami.

Nicienie hodowano z czterema różnymi bakteriami. W czasie hodowania nicienie zliczano w różnych okresach czasu. Za larwy uśpione (określane również jako młode osobniki infekcyjne) uważano nicienie, które osiągnęły stadium drugiego naskórka.

Nicienie zliczano po 20 dniach, a uzyskane wyniki podano w tabeli 2.

Tabela 2

Ciekła hodowla monoksenicznych nicieni

Bakteria	Średnia liczba nicieni w ml
Ilość replik	Larwy uśpione	Inne stadia
P. fluorescens	6	1220	110
S. proteomaculans	6	11500	7400
P. rettgen	6	99900	189000
M. phenylopyruvica	3	72000	223000

Na podstawie warunków opisanych w tym przykładzie specjalista będzie mógł łatwo przeprowadzić masową hodowlę nicieni w ciekłym ośrodku w fermentatorach w dużej skali.

Przykład VI. Sposób selekcji bakterii nadających patogeniczność w stosunku do nagich ślimaków.

Nicienie hodowane w monoksenicznej hodowli z dwoma gatunkami bakterii, Providencia rettgeri i Moraxella phenylpyruvica, w sposób opisany w przykładzie 5 zbadano pod względem patogeniczności w stosunku do nagiego ślimaka Deroceras reticulatum. W pudełkach plastiko10

168 777 wych (135 X 75 X 50 mm) umieszczono 440 mg wysuszonych na powietrzu grudek ziemi o średnicy

12.5- 25 mm, uzyskanych w wyniku przesiewania. Grudki z każdego pudełka wyjęto i nasączono 80 ml wody.

Zastosowano pudełka kontrolne, do których nie wprowadzono nicieni oraz pudełka, do których dodano nicienie w 5 dawkach (15000,23000, 35000, 55000 i 75000 nicieni/pudłeko), Dla każdego z 6 sposobów obróbki z obydwoma partiami monoksenicznych nicieni stosowano po 2 pudełka.

Nicienie zliczono i odpowiednie ich ilości zawieszono w 50 ml wody wodociągowej. Grudki ponownie umieszczono w pudełkach i zawiesinę nicieni równomiernie rozprowadzono na powierzchni grudek, warstwa po warstwie. Między pośrednimi warstwami w każdym z pudełek umieszczono po 10 osobników D. reticulatum. 50 ml wody wodociągowej rozprowadzono równomiernie na grudki w pudełkach, do których nie dodano nicieni, tak aby zawartość wilgoci w każdym z pudełek była w przybliżeniu jednakowa (30% wag./wag.).

Ślimaki zarażono w glebie przez 5 dni w 10°C, po czym wyjęto je i przeniesiono pojedynczo na szalki Petriego, gdzie trzymano je karmiąc liśćmi kapusty chińskiej. Po kolejnych 9 dniach w 10°C (14 dni od wystawienia na działanie nicieni) zarejestrowano ilość padniętych i żywych nagich ślimaków. Dane odnośnie śmiertelności skorygowano uwzględniając śmiertelność w pudełkach bez dodanych nicieni. W oparciu o skorygowane dane odnośnie śmiertelności wykreślono krzywą w funkcji dawki nicieni hodowanych w monoksenicznych hodowlach z każdą z bakterii.

Doświadczenia wykazały, że nicienie hodowane z M.phenylpyruvica i Pr. rettgeri są patogeniczne w stosunku do D. reticulatum. Metodą tą można wykorzystać do selekcjonowania innych szczepów bakterii, np. szczepu P. fluorescens 141, który nadaje patogeniczność w stosunku do nagich ślimaków.

Przykład VII. Wytwarzanie preparatów nicieni Phasmarhabditis.

Monokseniczne nicienie Phasmarhabditis, które hodowano w obecności szczepu M. phenylpyruvica 48 w sposób opisany w przykładzie V, zebrano przez odwirowanie i przemyto wodą powtarzając szereg razy osadzanie i ponowne zawieszanie w świeżej wodzie, aż do pozbawienia nicieni resztek ośrodka wzrostu. Przemyte nicienie zatężono przez odwirowanie uzyskując wodną pastę nicieni zawierającą od 0,1 X 10⁶ do 2,0 X 10⁶ nicieni/g pasty. Pastę nicieni wymieszano z glinką z montmorylonitu wapniowego uzyskując środek w postaci proszku dyspergowalnego w wodzie, zawierającego od 0,05 X 106 1,8 x 106 nicieni/g (waga na mokro).

Przykład VIII. Zdolność nicieni Phasmarhabditis wytworzonych w hodowli na płatkach pianki do uśmiercania różnych gatunków nagich ślimaków.

Nicienie Phasmarhabditis hodowane na mieszanej florze bakteryjnej sposobami opisanymi w przykładzie IV poddano testom biologicznym na 6 gatunkach nagich ślimaków jako szkodników, Deroceras reticulatum, D. carunae, Arion ater, A. intermedius, A. distinctus i Tandonia (Milax) sowerbyi. Ślimaki te zebrano z pułapek z przynętą z otrąb w Long Asthon Research Station w listopadzie 1990 roku. Wszystkie nagie ślimaki były osobnikami dojrzałymi, z wyjątkiem A. ater, które były młode (średnia waga 770 mg). Nicienie hodowano w jałowej hodowli w torebkach z płatkami pianki, w sposób opisany w przykładzie IV. Frakcję dużych grudek ziemi o średnicy

12.5- 25 mm, uzyskaną w wyniku przesiania, umieszczono w plastikowych pudełkach (133X75X50 mm), po 440 g wysuszonej na powietrzu ziemi w pudełku. Do każdego z pudełek zarażanych nicieniami dodano około 1,9 X 10^s infekcyjnych larw Phasmarhabditis zawieszonych w 130 ml wody wodociągowej. Do nie zarażonych pudełek dodano po 130 ml wody wodociągowej bez nicieni. Po 10 nagich ślimaków umieszczono w każdym z pudełek, z wyjątkiem dużych gatunków nagiego ślimaka (T. sowerbyi i A. ater), w przypadku których w każdym pudełku trzymano po 5 ślimaków. 17 nagich ślimaków A. distinctus zarażono nicieniami, a 18 zastosowano jako niezarażone ślimaki kontrolne. We wszystkich pozostałych przypadkach 20 ślimaków zarażano, a kolejne 20 trzymano jako kontrolne. Ślimaki zarażano w glebie przez 5 dni, po czym pudełka opróżniono z gleby i ustalono liczbę padniętych nagich ślimaków. Ślimaki, które przeżyły, przeniesiono na 9 cm szalki Petriego wyłożone wilgotną bibułą filtracyjną i trzymano je pojedynczo karmiąc krążkami liści kapusty chińskiej. W czasie każdej z prób biologicznych pudełka z glebą i szalki Petriego

168 777 trzymano w 10°C. Ilości padniętych nagich ślimaków ustalano jeszcze dwukrotnie w odstępach trzydniowych. Śmiertelności poszczególnych gatunków nagich ślimaków w pudełkach zarażonych i nie zarażonych w dowolnym okresie czasu porównano z wykorzystaniem testu z². Wyniki podano w tabeli 3.

Tabela 3

Procent śmiertelności różnych gatunków nagich ślimaków w 8, 11 i 14 dni po zarażeniu nicieniami i nie zarażonych

Gatunek ślimaka	Dzień 5	Dzień 8	Dzień 11
zara- żone	nie zarażone	zara- żone	nie zarażone	zara- żone	nie zarażone
Deroceras reticulatum	100	10	100	25	100	40
Deroceras caruanae	70	10	100	15	100	20
Arion ater	5	0	40	0	100	0
Anon intermedius	100	40	100	60	100	70
Arion distmctrus	6	6	88	11	100	28
Tandoma sowerbyi	20	15	80	15	100	25

Po 5 dniowym okresie infekcji różnice w śmiertelności między zarażonymi nicieniami i nie zarażonymi ślimakami nagimi były bardzo znaczące (P<0,001) w przypadku D. reticulatua, D. caruanae i A. intermedius. Różnice w śmiertelności między zarażonymi i nie zarażonymi ślimakami nagimi w przypadku 3 pozostałych gatunków w tym stadium nie były wyraźne. Po 8 dniach różnice w śmiertelności między ślimakami nagimi zarażonymi i nie zarażonymi nicieniami były bardzo znaczące w przypadku wszystkich badanych gatunków (P<0,001 w przypadku D. reticulatum, D. caruanae, T. spwerbyi i A. distinctus oraz P<0,01 dla A. ater i A. intermedius). W 11 dniu wszystkie zarażone nagie ślimaki padły. Różnice w śmiertelności między zarażonymi nicieniami i nie zarażonymi ślimakami nagimi były bardzo w przypadku wszystkich badanych gatunków (P<0,01 dla A. intermedius, P<0,001 dla wszystkich pozostałych gatunków). W przypadku A. intermedius różnica nie była tak duża, gdyż wiele nie zarażonych nagich ślimaków padło.

Z powyższych badań wynika wyraźnie, że nicienie Phasmarhabditis są zdolne do uśmiercania wszystkich zbadanych gatunków nagich ślimaków.

Przykład IX. Zdolność nicieni Phasmarhabditis uzyskanych w hodowli na płatkach pianki do zmniejszania uszkodzenia roślin powodowanych przez polowego nagiego ślimaka Deroceras reticulatum w warunkach polowych.

Eksperymenty na poletkach doświadczalnych przeprowadzono w celu porównania uszkodzeń sadzonek kapusty chińskiej przez nagiego ślimaka, na poletkach bez obróbki, poletkach, na których zastosowano pastylki methiocarbu (ogólnie uważanego za najlepszy środek chemiczny do zwalczania nagiego ślimaka) oraz na poletkach, na których zastosowano jedną dużą dawkę nicieni uzyskanych w hodowli na płatkach pianki z mieszaną florą bakteryjną, w sposób opisany w przykładzie III. Próby przeprowadzono na 40 mikropoletkach z glebą gliniastą na podłożu z grubego żwiru. Zastosowano poletka o wymiarach 70 X 70 cm o głębokości 30 cm, przedzielonych barierami drewnianymi lub cementowymi, otoczonych płotkiem o wysokości 10 cm z tkanej siatki miedzianej 0,8 mm służącej jako bariera zapobiegająca przemieszczaniu się nagich ślimaków między poletkami.

Na 36 poletek wprowadzono nagie ślimaki między marcem i czerwcem 1989. Na pozostałe 4 poletka nie wprowadzono żadnych ślimaków, aby sprawdzić miejscową ich populację. Na każde poletko przeznaczone do zasiedlania wprowadzo do 5 zebranych z pola dorosłych osobników D. reticulatum. Ślimaki te trzymano w pudełkach do kwarantanny przez co najmniej 2 tygodnie, aby upewnić się, że nie przenoszą one żadnych pasożytów. 36 wyhodowanych w laboratorium nowodorków D. reticulatum dodawano na każde poletko w ciągu 3 miesięcy, tak aby na początku doświadczenia na poletku występowały nagie ślimaki w wielu różnych stadiach rozwoju.

768 777

Doświadczenie zaprojektowano tak, aby uzyskać 9 powtórek w 4 przypadkowo wybranych blokach, przy czym w każdym bloku znajdowały się dwa poletka bez obróbki, jedno poletko, na które wprowadzono nicienie oraz jedno poletko, na którym zastosowano pastylki methiocarbu.

1,05 X 10⁶ nicieni zawieszono w 900 ml wody wodociągowej i uzyskaną zawiesiną podlano każde z poletek stosując konewkę z sitkiem. Kolejne 100 ml wody wodociągowej użyto do spłukania konewki i również wylano na poletka. Po 1 litrze wody zastosowano również na poletka nie poddane obróbce i poletka z methiocarbem. Pastylki methiocarbu zastosowano w zalecanych dawkach polowych (5,5 kg/ha = 0,275 g/poletko). Pastylki odważono i w sposób równomierny rozsiano ręcznie na poletkach. Poletka nawadniano z podwieszonej rury przez cały czas prowadzenia doświadczenia, aby zapewnić warunki korzystne dla aktywności nagich ślimaków.

Na początku eksperymentu młode sadzonki kapusty chińskiej hodowane w szklarni wsadzono, po 9 na każdym poletku, w kwadracie 3X3. Oceniano je co 2 tygodnie i wielkość uszkodzenia każdej z roślinek szacowano z dokładnością do 5%.

W 2 tygodnie po wsadzeniu sadzonki na pewnych poletkach zostały całkowicie zniszczone, tak że resztki stałych sadzonek wyrwano ze wszystkich poletek i wsadzono nowe. Powtórzono to po kolejnych 2 tygodniach. Po następnych dwóch tygodniach doświadczenie zakończono (tak że trwało ono łącznie 6 tygodni). Uszkodzenie sadzonek rejestrowano dwa razy na tydzień przez cały czas prowadzenia doświadczenia. Przegrody z siatki miedzianej w jednym z bloków badawczych (blok 9) usunięto po pierwszych 4 tygodniach, co umożliwiło przemieszczanie się nagich ślimaków między poletkami. Poletka te pominięto, tak że dane dla 5 i 6 tygodnia dotyczą jedynie 8 bloków.

Pod koniec doświadczenia z każdego z poletek w pozostałych 8 blokach pobrano po dwie próbki gleby 25 X 25 X 10 cm, przy czym jedną próbkę pobrano ze środka, a drugą z południowowschodniego rogu każdego z poletek. Próbki stopniowo zalewano w ciągu 9 dni w urządzeniu do zbierania nagich ślimaków LARS (Glen & Wiltshire, w Proceedings 1986 British Crop Protection Conference (1986), Vol. 1, 139-144). Ślimaki zbierano z powierzchni codziennie.

Ilość uszkodzeń sadzonek przez nagie ślimaki w każdym z rodzajów obróbki w czasie przeprowadzania doświadczenia pokazano na fig. 1.

Analiza wariancji po przekszatłceniu biegunowym w celu jej ustabilizowania wykazuje, że zarówno pastylki methiocarbu jak i nicienie znacząco (P< 0,001) zmniejszają uszkodzenia sadzonek przez nagie ślimaki. Przy pierwszym odczycie (4 dni po obróbce) było znacząco więcej (P <0,05) uszkodzeń na poletkach z nicieniami niż na poletkach, na których zastosowano methiocarb, z tym że w miarę wzrostu sadzonek wyjściowa różnica w uszkodzeniach między poletkami, na których zastosowano nicienie i methiocarb, zmniejszała się. Pod koniec pierwszego tygodnia na poletkach z nicieniami było mniej uszkodzeń niż na poletkach, na których zastosowano methiocarb, z tym że różnica nie była znacząca. Po 17 dniach (pierwsze badanie drugiej porcji sadzonek) uszkodzenia na poletkach z nicieniami były znacząco mniejsze (P < 0,05) niż na poletkach, na których zastosowano merhiocarb. Tendencja ta utrzymywała się (P < 0,01) aż do końca doświadczenia.

W próbkach gleby znaleziono 3 gatunki nagich ślimaków, Deroceras reticulatum Deroceras caruanae i Boettgerilla palens. Na wszystkich poletkach znaleziono jedynie 2 D. caruanae przy 89

B. pallens i 55 D. reticulatum. B. pallens zostały prawdopodobnie wprowadzone do gleby wcześniej , tak że rozmnożyły się i skolonizowały poletka. Korzystne pożywienie tego nagiego ślimaka nie jest znane, z tym że w próbach laboratoryjnych nie powodował on uszkodzeń liści kapusty chińskiej w ciągu 3 tygodniowej ekspozycji przy braku alternatywnego źródła pożywienia. Nie jest w związku z tym prawdopodobnie, aby taki nagi ślimak powodował uszkodzenia sadzonek w tym eksperymencie.

W próbkach gleby z 4 poletek, na których nic nie zastosowano, nie znaleziono D. reticulatum. Sugeruje to, że w przeciwieństwie do B. pallens na poletkach znajdowało się na początku doświadczenia co najwyżej bardzo mało ślimaków D. reticulatum.

Z liczb oznaczających całkowitą ilość nagich ślimaków i wydzieloną biomasę z różnych rodzajów obróbki wyciągnięto pierwiastki kwadratowe w celu wykonania analizy statystycznej. Wyniki przedstawiono na fig. 2.

168 777

Znacząco mniej nagich ślimaków wyodrębniono z poletek, na które wprowadzono nicienie niż z poletek bez obróbki (P < 0,01 dla wszystkich gatunków nagiego ślimaka oraz dla samego D. reticulatum), a mniej wyodrębniono z poletek, na których zastosowano methiocarb niż z poletek bez obróbki (P < 0,05 dla wszystkich gatunków nagiego ślimaka oraz dla samego D. reticulatum). Jakkolwiek mniej nagich ślimaków wyodrębniono z poletek, na które wprowadzono nicienie niż z tych, na których zastosowano methiocarb, to różnica ta nie była znacząca. Z poletek, na które wprowadzono nicienie, nie wyodrębniono wcale D. reticulatum, co sugeruje, że gatunek ten została prawie całkowicie wytępiony na tych poletkach. Nicienie lub methiocarb nie wpływały znacząco na ilość B. pallens, choć mniej B. pallens znaleziono na poletkach, na które wprowadzono nicienie niż na poletkach bez obróbki.

Przykład X. Zdolność monoksenicznych nicieni Phasmarhabditis do uśmiercania różnych gatunków szkodników mięczakowych.

Działanie monoksenicznych nicieni Phasmarhabditis hodowanych w asocjacji ze szczepem M. phenylpyruvica 48 w sposób opisany w przykładzie V w stosunku do różnych gatunków szkodników mięczakowych, w tym w stosunku do ślimaka muszlowego z Kentu, Monacha cantiana, oceniono w próbce biologicznej w sposób opisany w przykładzie VIII. Wyniki zestawiono w tabeli 4.

Tabela 4

Procent uśmiercenia różnych gatunków szkodników mięczakowych po zastosowaniu monoksenicznych nicieni oraz bez obróbki

Gatunek mięczaka	Czas trwania próby (dni)	Z obróbką	Bez obróbki
Deroceras reticulatum	11	100	15
Deroceras caruanae	11	100	10
Monacha cantiana	5	100	0
Arion intermedius	5	100	0
Arion distmctus	11	100	0
Tandoma sowerbyi	11	70	5

Różnice w śmiertelności między mięczakami poddanymi i nie poddanymi obróbce były znaczące dla wszystkich badanych gatunków (P < 0,001), co wskazuje, że wszystkie gatunki badanych mięczaków były podatne na Phasmarhabditis sp. monoksenizowane szczepem M. phenylpyruvica 48. W porówananiu z jałowymi nicienami zakres aktywności monoksenicznych nicieni nie uległ zmianie.

Monokseniczne nicienie Phasmarhabditis hodowano w asocjacji z M. phenylpyruvica lub P. rettgeri w sposób opisany w przykładzie V, po czym przeprowadzono test biologiczny przy różnych wielkościach dawki w odniesieniu do gatunków nagiego ślimaka D. reticulatum w sposób opisany w przykładzie VIII. Wyniki przedstawiono na fig. 3. Obydwa typy monoksenicznych nicieni są aktywne w stosunku do D. reticulatum.

Przykład XI. Zdolność monoksenicznych nicieni Phasmarhabditis do zmniejszania uszkodzeń roślin powodowanych przez nagiego ślimaka polowego Deroceras reticulatum w warunkach polowych.

Przeprowadzono próby polowe w celu porównania powodowanych przez nagie ślimaki uszkodzeń pszenicy ozimej (odmiana Mercia) na poletkach bez obróbki, na poletkach, na których zastosowano methiocarb oraz na poletkach, na które wprowadzono w różnych dawkach nicienie. Monokseniczne nicienie wyhodowano w asocjacji ze szczepem M. phenylpyruvica 48 w sposób opisany w przykładzie V, po czym wykonano z nich preparaty z glinką w sposób opisany w przykładzie VII, w postaci dyspergowalnego w wodzie proszku zawierającego 0,36 X 10⁶ nicieni/g (waga na mokro). Nicienie zastosowano w postaci oprysku wodnego w dawce odpowiadającej 1 100 litrów/hektar natychmiast po wysiewie ziarna. Pastylki methiocarbu naniesiono ręcznie w zalecanych dawkach polowych (5,5 kg/hektar).

168 777

Pułapki powierzchniowe i próbki gleby wykorzystano do śledzenia populacji nagiego ślimaka na poletkach doświadczalnych. Na poletkach stwierdzono obecność wielu gatunków nagiego ślimaka, w tym Deroceras reticulatum, Arion siivaticus, Arion subfuscus, Arion ater, Tandonia sowerbyi i Milax gagates, z tym że D. reticulatum był gatunkiem zdecydowanie dominującym.

tygodni po siewie poletka oceniano pod względem stanu wzejścia pszenicy, co stanowiło podstawę do oceny całkowitego uszkodzenia przez ślimaki (czyli zmniejszenia ilości roślin), a ponadto szacowano niepełne uszkodzenia przez ślimaki (naruszenie roślin) oceniając wzrokowo wybrane rośliny. Średnie ilości wzeszłych roślin pszenicy na 0,5 m długości bruzdy dla różnych dawek nicieni podano w tabeli 5.

Tabela 5

Średnia ilość wzeszłych roślin pszenicy w bruździe o długości 0,5 m przy różnych obróbkach w próbie polowej (ocena w 6 tygodni po siewie)

Obróbka	Średnia ilość wzeszłych roślin
Bez obróbki	12,93
Dawka nicieni 1X 10⁸/ha	12,78
Dawka nicieni 3X 10⁸/ha	13,95
Dawka nicieni 1 X 10⁹/ha	13,25
Dawka nicieni 3 X 10⁹/ha	14,88
Dawka nicieni 1X 10^1o/ha	16,50
Methiocarb	14,57

Standardowe odchylenie błędu = 1,314 (współczynnik odchylenia 399).

Wyraźnie widoczny jest wzrost ilości wzeszłych roślin ze zwiększaniem dawki nicieni, co świadczy o tym, że obróbka nicieniami zapewnia zmniejszenie całkowitego uszkodzenia powodowanego przez nagie ślimaki.

Dane odnośnie średniego procentowego uszkodzenia powierzchni liści przez nagie ślimaki przekształcono w wielkości kątowe przed wykonaniem analizy. Wyniki podano w tabeli 6.

Tabela 6

Średnia kątowy procent uszkodzenia powierzchni pojedynczej rośliny przez nagie ślimaki przy różnych obróbkach w próbie polowej (ocena w 6 tygodni po siewie)

Obróbka	Średni kątowy procent uszkodzenia powierzchni pojedynczej rośliny
Bez obróbki	31,82
Dawka nicieni 1 X 10^e/ha	29,15
Dawka nicieni 3 X 10^B/ha	28,87
Dawka nicieni 1 X i0⁹/ha	22,11
Dawka nicieni 3 X 10⁹/ha	18,63
Dawka nicieni 1 X 101°/ha	16,49
Methiocarb	25,17

Standardowe odchylenie błędu = 3,395 (współczynnik odchylenia 24)

Występują znaczące różnice w powierzchni liścia uszkodzonego przez nagie ślimaki między stosowanymi obróbkami (P < 0,001), przy czym w przypadku roślin z trzema największymi dawkami nicieni uszkodzenia roślin przez nagie ślimaki są znacząco (P <0,01) mniejsze niż w przypadku roślin na poletkach, na których nie stosowano nicieni. Rośliny z poletek, na które wprowadzono największą dawkę nicieni zostały znacząco (P < 0,05) mniej uszkodzone przez nagie ślimaki niż rośliny z poletek, na których zastosowano methiocarb. W związku z tym nicienie są zdolne do zapobiegania naruszaniu roślin przez nagie ślimaki.

Przykład XII. Zdolność monoksenicznych nicieni Phasmarhabditis do zwalczania ślimaka wodnego Lymnaea stagnalis.

Z monoksenicznych nicieni wyhodowanych w asocjacji ze szczepem M. phenylpyruvica 48 w sposób opisany w przykładzie V wykonano w sposób opisany w przykładzie VII preparaty z glinką

168 777 15 w postaci dyspergowalnego w wodzie proszku zawierającego około 0,36 X 106 nicieni/g (waga na mokro). Po 10 osobników ślimaka wodnego Lymnaea stagnalis wprowadzono do każdego z 5 czystych akwariów w połowie wypełnionych wodą ze stawu, zawierającą trochę roślin wodnych służących jako źródło pożywienia dla ślimaków. Akwaria napowietrzano za pomocą małej pompki powietrznej i utrzymywano w 15°C.

Do każdego z 4 akwariów dodano po około 6 X 106 _ni_cieni w postaci proszkowego preparatu dyspergowalnego w wodzie. Do piątego kontrolnego akwarium nie dodano nicieni. Średnia śmiertelność ślimaków w akwariach z nicieniami wynosząca po 3 dniach inkubacji 45% wzrosła do 100% po 6 dniach. Nie stwierdzono śmiertelności w akwarium kontrolnym bez nicieni po 6 dniach inkubacji.

168 777

Pierwiastek kwadratowy z liczby ślimaków

methiocarbem Q Całkowita Fj liczba ślimaków

D. Rełiculatum

Odchylenie metodą najmniejszych kwadratów

1: dla porównania całkowi tej liczby ślimaków /P=0,05, współczynnik odchylenia 22/

2: dla porównana liczby D. reticulatm /P-0,05, współczynnik odchylenia 22j

FIG.2

Wpływ nicieni Ράβθΐϋ^ΜΙίΙβ na liczbę ślimaków wszystkich gatunków oraz na liczbę Deroceras retictlattm w eksperymentach na i ^poletkach doświadczalnych

168 777

FIG. 3.

Próba biologiczna działania monoksenicznych nicieni Phasmarhabdiiie iaeoejowanyeh c U. phenylpyruvica lab P. rettgeri aa O. reticulatum

168 777

Odchylenie metodą najmniejszych kwadratów uszkodzenia przez ślimaki /skala kątowa/

Bicienie

FIG 1

Zastosowanie nicieni Phasmarhabditis do zmniejszania uszkodzeń roślin powodowanych przez nagie ślimaki

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja do zwalczania mięczaków, znamienna tym, że zawiera gatunki nicieni z rodzajów Phasmarhabditis w asocjacji z odpowiednią bakterią przyspieszającą ich wzrost lub ze społecznością odpowiednich bakterii przyspieszających ich wzrost, wraz z odpowiednim nośnikiem lub środkiem kapsułkującym.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że nicienie są w stadium larwy uśpionej.

3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera gatunki P. neopapillosa lub P. hermaphrodita.

4. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jako nośnik zawiera glinkę.

5. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że bakterie przyspieszające wzrost wybrane są z grupy obejmującej:

Pseudomonas fluorescens Providencia rettgeri Serratia proteomaculans Aeromonas salmonicida Maraxella phenylpyruvica Bacillus cereus Flavobacterium odoratum Flavobacterium brevi.

6. Kompozycja według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, znamienna tym, że bakterie przyspieszające wzrost stanowi Moraxella phenylpyruvica szczep NCIMB 40508 lub Pseudomonas fluoresecens szczep NCIMB 40509.

7. Kompozycja według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienna tym, że ma postać proszku i jako nośnik zawiera glinkę w postaci montmorylonitu wapniowego, wodę i nicienie, przy czym stężenie nicieni wynosi od 0,1 X 106 do 2,0 X 106 gram (wagi na mokro), a korzystnie od 0,3 X 106 do 0,8 X 106 na gram (wagi na mokro).