CZ285283B6 - Způsob biologického hubení měkkýšů - Google Patents
Způsob biologického hubení měkkýšů Download PDFInfo
- Publication number
- CZ285283B6 CZ285283B6 CS9410A CS109492A CZ285283B6 CZ 285283 B6 CZ285283 B6 CZ 285283B6 CS 9410 A CS9410 A CS 9410A CS 109492 A CS109492 A CS 109492A CZ 285283 B6 CZ285283 B6 CZ 285283B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- nematodes
- slugs
- use according
- growth
- phasmarhabditis
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 claims abstract description 196
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 claims abstract description 97
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 70
- 241001133384 Phasmarhabditis Species 0.000 claims abstract description 36
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 claims abstract description 26
- 241001300076 Deroceras reticulatum Species 0.000 claims abstract description 25
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims abstract description 19
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 claims abstract description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 37
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 29
- 241001148186 Psychrobacter phenylpyruvicus Species 0.000 claims description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 16
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 claims description 13
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 13
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 11
- 241001133383 Phasmarhabditis hermaphrodita Species 0.000 claims description 10
- 241000836459 Phasmarhabditis neopapillosa Species 0.000 claims description 10
- 241000692821 Arion intermedius Species 0.000 claims description 8
- 241000482272 Deroceras panormitanum Species 0.000 claims description 8
- 239000004927 clay Substances 0.000 claims description 8
- 241001298365 Arion ater Species 0.000 claims description 6
- 241000638111 Tandonia sowerbyi Species 0.000 claims description 6
- 241001458849 Arion distinctus Species 0.000 claims description 5
- 241000089862 Monacha cantiana Species 0.000 claims description 5
- 241000588777 Providencia rettgeri Species 0.000 claims description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 claims description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000607525 Aeromonas salmonicida Species 0.000 claims description 3
- 241000237526 Arionidae Species 0.000 claims description 3
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 claims description 3
- 241000589586 Empedobacter brevis Species 0.000 claims description 3
- 241000237365 Helicidae Species 0.000 claims description 3
- 241001523586 Limacidae Species 0.000 claims description 3
- 241001599626 Milacidae Species 0.000 claims description 3
- 241000589588 Myroides odoratus Species 0.000 claims description 3
- 241000607720 Serratia Species 0.000 claims description 3
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 claims description 3
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000003898 horticulture Methods 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 2
- 241000237354 Lymnaea Species 0.000 claims 1
- 239000008393 encapsulating agent Substances 0.000 claims 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims 1
- 230000002013 molluscicidal effect Effects 0.000 claims 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 claims 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 abstract description 4
- 230000000443 biocontrol Effects 0.000 abstract 4
- 241000073866 Edolisoma monacha Species 0.000 abstract 1
- 101150047834 SNAI2 gene Proteins 0.000 description 43
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 22
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 21
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 19
- 239000005951 Methiocarb Substances 0.000 description 18
- YFBPRJGDJKVWAH-UHFFFAOYSA-N methiocarb Chemical compound CNC(=O)OC1=CC(C)=C(SC)C(C)=C1 YFBPRJGDJKVWAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 15
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 14
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 8
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 235000010149 Brassica rapa subsp chinensis Nutrition 0.000 description 6
- 235000000536 Brassica rapa subsp pekinensis Nutrition 0.000 description 6
- 241000499436 Brassica rapa subsp. pekinensis Species 0.000 description 6
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 6
- 241000137592 Boettgerilla pallens Species 0.000 description 5
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 4
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 3
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 3
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 2
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000237357 Lymnaea stagnalis Species 0.000 description 2
- 241000237355 Lymnaeidae Species 0.000 description 2
- 241001300083 Milax Species 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 241000244173 Rhabditis Species 0.000 description 2
- 241000482273 Tandonia Species 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000003816 axenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000010196 hermaphroditism Effects 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003415 peat Substances 0.000 description 2
- 230000008654 plant damage Effects 0.000 description 2
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 2
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 2-nitrosoguanidine Chemical compound NC(N)=NN=O WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N Aesculin Natural products OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1Oc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N 0.000 description 1
- 108010082340 Arginine deiminase Proteins 0.000 description 1
- 241000237518 Arion Species 0.000 description 1
- 241001488154 Arion silvaticus Species 0.000 description 1
- 241001458848 Arion subfuscus Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000137583 Boettgerilla Species 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 241000041029 Bulinus Species 0.000 description 1
- 241001260012 Bursa Species 0.000 description 1
- 241000238008 Cerithidea rhizophorarum Species 0.000 description 1
- WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N Cichoriin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)c1c(O)cc2c(OC(=O)C=C2)c1 WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 241001300085 Deroceras Species 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000242711 Fasciola hepatica Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000584390 Limax cinereoniger Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001364998 Milax gagates Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 208000000291 Nematode infections Diseases 0.000 description 1
- 241000133504 Opisthorchis sinensis Species 0.000 description 1
- 241000935974 Paralichthys dentatus Species 0.000 description 1
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 description 1
- 229920005830 Polyurethane Foam Polymers 0.000 description 1
- 241000243142 Porifera Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000237361 Stylommatophora Species 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000027326 copulation Effects 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-M decanoate Chemical compound CCCCCCCCCC([O-])=O GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- GUJOJGAPFQRJSV-UHFFFAOYSA-N dialuminum;dioxosilane;oxygen(2-);hydrate Chemical compound O.[O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3].O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O GUJOJGAPFQRJSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 229940093496 esculin Drugs 0.000 description 1
- XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N esculin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC(C(=C1)O)=CC2=C1OC(=O)C=C2 XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N 0.000 description 1
- AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N esculin Natural products OC1OC(COc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O)C(O)C(O)C1O AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000005002 female reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 238000010413 gardening Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- ONXVIDHGXDFGBU-UHFFFAOYSA-N hexanedioic acid;2-hydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O.OC(=O)CCCCC(O)=O ONXVIDHGXDFGBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N phenylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 238000005554 pickling Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 239000011496 polyurethane foam Substances 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 1
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/10—Animals; Substances produced thereby or obtained therefrom
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Farming Of Fish And Shellfish (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Catching Or Destruction (AREA)
- Measuring Pulse, Heart Rate, Blood Pressure Or Blood Flow (AREA)
Abstract
Použití nematodů Phasmarhabditis pro hubení měkkýšovitých škůdců v zemědělství a zahradnictví s škůdců ohrožujících zdraví člověka a zvířat. Dále se popisují nové bakteriální kmeny Moraxella phenylpyruvica 48, NCIMB 40508 a Pseodomonas fluorescens 141, NCIMB 40509, které se zvláště hodí pro podporu růstu nematodů rodu Phasmarhabditis, zejména zvláště vhodný druh P. neopapillosa a P. hermaphrodita. Řešení se týká též moluskocidního prostřdedku obsahujícího nematody rodu Phasmarhabditis, ve spojení s bakteriemi podporujícími jejich růst, způsobu produkce těchto a způsobupotlačování měkkýšů za použití těchto nematodů.ŕ
Description
Způsob biologického hubení měkkýšů
Oblast techniky
Vynález se týká potlačování zemědělských a zahradnických škůdců a zejména hubení měkkýšů, včetně slimáků, jako je například slimáček polní (Deroceras reticulatum) a šneků, jako je například Monacha cantiana. Z důvodu účelnosti je vynález dále popisován zejména ve vztahu k hubení slimáků, ale je samozřejmé, že ho lze využít také při hubení jiných měkkýšů, kteří škodí rostlinám na poli a ve skleníku nebo kteří přenášejí parazity, škodlivé pro člověka nebo zvířata.
Dosavadní stav techniky
Slimáci jsou rozšíření škůdci několika důležitých zemědělských plodin, jako je zejména ozimá pšenice, řepka olejka a brambory. Tito škůdci způsobují velké škody ve všech zemích světa, jako jsou Velká Británie a jiné evropské země, země severní a střední Ameriky, asijské země a Austrálie. Způsobují také problémy v zahradnictví zahrádkářům. Z ekonomického hlediska působí největší škody slimáček polní (Deroceras reticulatum, čeleď Limacidae), přestože i jiní slimáci z této čeledi, jakož i slimák Arion (čeleď Arionidae), Tandonia. Milax (čeleď Milacidae) a Boettgerilla, mohou také způsobovat podstatné škody. Také šneci či hlemýždi se mohou stát obtížnými škůdci v zahradnictví a zemědělství. Jako jeden příklad šneků je možno uvést šneka Monacha cantiana (čeleď Helicidae). Další příklady škůdců ze skupiny měkkýšů jsou uvedeny v publikaci Godan, Pěst Slugs and Snails, 1983, Springer-Verlag, Berlín, Německo. Měkkýši mohou také nést škůdce, kteří představují riziko pro zdraví člověka nebo zvířat. Jako příklady lze uvést druh Lymnaeo (čeleď Lymnaeidae), který je nositelem motolice jatemí (Fasciola hepatica) a druh Bulinus (čeleď Bulinidae), který je nositelem Opisthorchis sinensis. Čeledi Limacidae, Arionidae, Milacidae a Helicidae náleží do řádu Stylommatophora. Čeledi Bulinidae a Lymnaeidae náleží do řádu Basommatophora.
Současné způsoby hubení těchto škůdců jsou jen zčásti účinné a dostupné chemikálie jsou vysoce toxické pro ptáky a savce. Z toho důvodu jasně existuje potřeba nalézt účinnější, trvalejší a méně toxické způsoby potlačování měkkýšů.
Podstata vynálezu
Nyní se s překvapením zjistilo, že nematodi rodu Phasmarhabditis představují účinný prostředek pro hubení široké palety druhů měkkýšů. Z druhů, které spadají do rodu Phasmarhabditis, jsou obzvláště účinné příbuzné organismy P. neopapillosa a P. hermaphrodita, kteří budou podrobněji popsáni dále. Tyto druhy jsou známé mnoho let a jsou popsány v literatuře a charakterizovány zejména v publikaci Andrassy, A Taxonomie Review of the Sub-Order Rhabditina (Nematoda: Secementina) (1983, Orstom, Paříž, Francie). Biologická účinnost těchto organismů proti škůdcům ze skupiny slimáků a šneků však dosud známa nebyla.
Předmětem vynálezu je tedy použití druhu Phasmarhabditis pro hubení zemědělských a zahradnických škůdců nebo škůdců poškozujících zdraví člověka a zvířat, zejména škůdců ze skupiny měkkýšů. Tyto organismy je možno získat ze slimáků na poli a pěstovat dále popsanými způsoby tak, aby byly získány v dostatečném množství pro zpracování na vhodné prostředky, které by bylo možno aplikovat na poli nebo ve skleníku. V typických prostředcích pro praktické použití se používá vhodných nosičových materiálů, jako je rašelina, jíl a jiné pevné nebo polopevné nosiče, jako jsou gelovité materiály. Venkovní testy prováděné v malém měřítku i v polním měřítku ukázaly, že nematodi mohou usmrcovat slimáky a chránit semenáčky čínského zelí a osivo nebo semenáčky pšenice před poškozením slimáky přinejmenším stejně
- 1 CZ 285283 B6 dobře nebo lépe než to činí methiocarb, což je nejlepší chemikálie, která je pro tento účel v současné době k dispozici.
Biologie organismu
Nematodi byli izolováni ze slimáků nasbíraných ve výzkumné stanici Long Ashton Research Station ve Velké Británii. Bylo zjištěno, že tito nematodi způsobují smrtelnou chorobu slimáků, která se projevuje určitými charakteristickými symptomy, z nichž je nejnápadnější otok pláště slimáka. Bylo zjištěno, že tito nematodi náleží do podřádu Rhabditina a pro jejich další identifikaci bylo použito klíče (Andrassy, 1983). Dvě hlavní taxonomické charakteristiky této skupiny jsou část ústní a samčí reprodukční struktury. Nematodi izolovaní na stanici Long Ashton mají charakteristická krátká ústa (stoma) s isomorfním metastomem a samci, pokud jsou přítomni, mají peladeranové bursy, což jsou charakteristické znaky rodu Phasmarhabditis. Andrassy (1983) zaznamenal dva druhy, které jsou morfologicky totožné s těmito nematody, ale vzájemně se od sebe liší počtem samců přítomných v těchto populacích. U druhu Phasmarhabditis neopapillosa jsou samci a samice stejně četní, zatímco u Phasmarhabditis hermaphrodita jsou samci extrémně vzácní. Dosud není známo, zda P. hermaphrodita představuje zvláštní druh nebo pouze biologickou variantu P. neopapillosa (Andrassy 1983). P. hermaphrodita byl poprvé popsán Maupasem v Archives de Zoologie (1900), sv. 8, str. 464 až 624, který tento nematod nazval Rhabditis caussaneli. Maupas našel ve střevech slimáka Arion ater, kterého nasbíral v Normandii, resistentní larvální formy tohoto nematoda. Choval kultury tohoto nematoda na shnilém mase po dobu dvou let. Zjistil, že dospělí červi jsou převážně protandričtí autogamní hermafroditi. Dále zjistil, že samci jsou přítomni jen ve velmi malých počtech (1 samec na 1300 samic) a že počet samců v kulturách není ovlivněn nutričními podmínkami. Maupas nikdy nezaznamenal kopulaci samců se samicemi, z čehož bylo zřejmé, že za přítomnosti samců nedošlo k žádné změně fekundity nematodů ani sexuálního poměru v potomstvu. Maupas nepovažoval tohoto nematoda za parazita slimáka.
Phasmarhabditis neopapillosa byl popsán Mengertem, který nazval tohoto nematoda Rhabditis neopapillosa, v časopisu Zeitschrift fur Morphologie und Oekologie Tiere (1953), sv. 41, str. 311 až 349, ve své studii, týkající se vztahu mezi nematody a zemními měkkýši. Našel tohoto nematoda ve formě resistentních larválních stadií (které označil názvem dauer larvae) v zadní části trávicího ústrojí slimáka Limax cinereoniger. Mengert považoval nematoda P. neopapillosa za saprofyta, kteiý prosperuje na hnijícím materiálu po mnoho generací, ale když se stanou podmínky nepříznivými, mladí jedinci nedospějí a vytvoří resistentní formy dauer larvae, které nepřijímají potravu. Mengert se domníval, že P. neopapillosa žije stejným způsobem jako dva jiné druhy Phasmarhabditis papillosa aP. hermaphrodita. Domníval se dále, že dauer larvae těchto tří druhů vstoupí, když se naskytne příležitost, do těla slimáků, kde zůstanou v podobě dauer larvae tak dlouho, dokud slimák neuhyne. Teprve potom pokračují ve vývoji a reprodukují se, přičemž se živí mrtvým tělem slimáka. Mengert se domníval, že pobyt ve slimákovi není nutnou součástí životního cyklu nematoda, ale předpokládal, že dauer larvae těchto druhů skutečně vykazují určitý stupeň adaptace na život ve slimákovi. Tvrdil však, že tito nematodi na slimácích neparazitují.
Nematody je možno izolovat ze slimáků sebraných na poli za použití pastí s návnadou z drcených otrub, které se rozmísí na travnaté ploše. Po rozříznutí slimáků je nematody možno izolovat z trávicího ústrojí slimáka nebo dutiny pláště. Ve slimácích žije mnoho druhů nematodů (Mengert, 1953) a identifikaci P. hermaphrodita aP. neopapillosa je třeba potvrdit za použití taxonomického klíče (Andrassy, 1983). Pokud se ve slimákovi najdou pouze infekční stadia nematodů (dauer larvae) je zapotřebí nematody pěstovat, aby bylo možno je identifikovat.
Nematodi Phasmarhabditis byli izolováni ve výzkumné stanici Long Ashton při četných příležitostech. V některých případech se populace nematodů skládala ze samců a samic, zatímco v jiných případech se populace skládaly pouze z hermafroditů. Nematodi z populací obou typů
-2CZ 285283 B6 byli vyšetřováni světelnou mikroskopií a elektronovou mikroskopií (SEM). Také byly zjišťovány proteinové profily v různých populacích po separaci proteinů isoelektrickou fokusací. Nebyly zjištěny žádné rozdíly mezi populacemi za použití kterékoliv z výše uvedených metod. Izolovaní nematodi odpovídají dostupnému popisu P. neopapillosa a P. hermaphrodita.
Nematody Phasmarhabditis je možno pěstovat způsoby, které jsou uvedeny v tomto popisu. V tomto oboru je již známo, že nematody, kteří parazitují na hmyzu, je možno pěstovat ve velkém měřítku pro obchodní využití v kapalných kulturách za použití míchaných nádrží nebo tzv. airlift fermentorů, nebo v pevných kulturách v pytlích nebo na podnosech s kousky pěny. Podobných technik se může používat při produkci P. hermaphrodita nebo P. neopapillosa ve velkém měřítku, kterých se používá podle tohoto vynálezu, je tedy možno snadno pěstovat na ledvinovém médiu ve formě kousku pěny nebo ve formě kapalné kultury, za použití podobných technik, jakých se používá při produkci nematodů, kteří parazitují na hmyzu. Pro účely tohoto vynálezu se doporučuje, aby byla kultura nematodů sklízena ve stavu dauer larvae.
Požadavky na připojené bakterie
Nematodi Phasmarhabditis se živí bakteriemi. Po izolaci z uhynulých slimáků bylo zjištěno, že nematodi Phasmarhabditis jsou spojeni s mnoha bakteriálními izoláty. V souvislosti s vynálezem byl studován vztah mezi těmito nematody a připojenými bakteriemi, aby se zjistilo, které bakterie jsou schopny podporovat dobrý růst nematodů a pro porovnání patogenicity nematodů chovaných na různých druzích bakterií.
Za účelem konsistentní produkce ve velkém měřítku nematodů Phasmarhabditis, kteří jsou patogeničtí vůči slimákům, se nematodi přednostně pěstují v kulturách s jednou známou připojenou bakterií (monoxenické kultury) a z toho důvodu je zapotřebí vyvinout způsob selekce jednotlivých druhů bakterií, které jsou schopny podporovat růst nematodů. Bakterie, které jsou schopny podporovat růst nematodů, mohou být izolovány z nematodů, z kultur nematodů rostoucích na směsné mikrobiální populaci, ze slimáků infikovaných bakteriemi a z mrtvých těl slimáků, zamořených nematody. Nematody lze potom zbavit všech kontaminujících bakterií a převést do kultur s odlišným jediným druhem bakterie. Inkubace těchto kultur umožňuje selekci bakteriálních izolátů, které jsou schopny podporovat růst nematodů.
Z nematodů, slimáků infikovaných nematody a mrtvých slimáků zamořených nematody bylo získáno přibližně 100 bakteriálních izolátů, z nichž 15 bylo zkoušeno na schopnost podporovat růst nematodů. Bylo zjištěno, že z těchto 15 izolátů, celkem 9 izolátů, které představují 8 druhů, podporuje dobiý růst na agaru. 8 druhů bakterií, o nichž se zjistilo, že podporují dobrý růst nematodů je uvedeno dále.
Pseudomonas fluorescens
Providencia rettgeri
Serratia proteomaculans Aeromonas salmonicida
Moraxella phenylpyruvica
Bacillus cereus
Flavobacterium odoratum
Flavobacterium brevi
Schopnost nematodů, pěstovaných na různých druzích bakterií, usmrcovat slimáky, je možno zjistit biologickým pokusem. Při takovém biologickém pokusu jsou slimáci exponováni různému počtu nematodů a zaznamenává se výsledná mortalita slimáků. Pomocí této metody lze kvantitativně vyhodnotit patogenicitu (například hodnotu LD50) nematodů proti slimákům a použít této hodnoty pro porovnání patogenicity nematodů pěstovaných na různých druzích bakterií. Je důležité, aby byli nematodi dodáváni ve spojení se specifickými bakteriemi,
-3 CZ 285283 B6 poněvadž bakterie jsou důležité nejen pro růst nematodů (jak in vitro, tak in vivo), nýbrž také pro jejich schopnost usmrcovat slimáky. Nematod si nese připojené bakterie při vstupu do slimáka, což umožňuje rychlé zabydlení a rychlou reprodukci nematodů, která vede ke smrti slimáka.
Jako příklady vhodných bakteriálních kmenů je možno uvést Moraxella phenylpyruvica kmen 48 a Pseudomonas fluorescens kmen 141, jejichž vzorky byly uloženy v souladu s Budapešťskou dohodou v národní sbírce průmyslových a mořských bakterií (National Collection of Industrial and Marině Bacteria, 23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB2 IRY, Velká Británie) pod přírůstkovými čísly NCIMB 40508 aNCIMB 40509 dne 9. června 1992. Kmen Pseudomonas io fluorescens 141 je gram negativní, oxidáza positivní, katalasa positivní bakterie, která je nemotilní a vykazuje negativní výsledek při zkoušce O/F (Hugh and Leifson) při aerobním nebo anaerobním štěpení glukózy. Kmen Moraxella phenylpyruvica 48 je gram negativní, oxidáza positivní, katalasa positivní bakterie, která je nemotilní a vykazuje negativní výsledek při zkoušce O/F (Hugh and Leifson). Biochemické profily obou těchto kmenů na standardních 15 substrátech (zkušební proužek API ZONE) jsou uvedeny dále.
| Reakce | Moraxella phenylpyruvica 48 | Pseudomonas fluorescens 141 |
| NO3-NO2 | + | |
| no3-n2 | * | - |
| indol | - | |
| kyselina z glukózy | - | |
| arginin dihydrolasa | + | |
| ureasa | - | |
| hydrolýza eskulinu | - | |
| hydrolýza želatiny | + | |
| β-galaktosidasa | - | |
| Asimilace | ||
| glukózy | + | |
| arabinosy | ||
| manózy | + | |
| N-acetylglukózaminu | + | |
| maltosy | - | |
| glukonátu | + | |
| kaprátu | + | |
| adipátu | - | |
| malátu | + | |
| citrátu | + | + |
| fenylacetátu | - | - |
* = nezkoušeno
Užitečné varianty kmene M. phenylpyruvica 48 a kmene P. fluorescens 141 je možno získat opakovaným přenášením čistých kultur těchto kmenů do subkultur. Varianty je možno také získat reizolací bakterií z nematodů Phasmarhabditis, kteří byli předtím pěstováni ve spojení s kterýmkoliv z těchto kmenů, nebo reizolací bakterií ze slimáků infikovaných nematody. Takové varianty mohou mít zakotveny genotypické nebo fenotypické změny, v důsledku vlivů okolí nebo selektivního tlaku. Užitečné deriváty kmene M. phenylpyruvica 48 a kmene P. fluorescens 141 je možno zkonstruovat zavedením DNA z jiného organismu, která kóduje požadované atributy. Způsoby zavádění cizí DNA do bakterií jsou odborníkům v tomto oboru dobře známy a zahrnují takové techniky, jako je přenos plasmidu, transdukce a transfekce. Užitečné mutanty kmene M. phenylpyruvica 48 a kmene P. fluorescens 141 je možno získat mutagenesí za použití metod, které jsou odborníkům v tomto oboru dobře známy, jako jsou chemické techniky (například za
-4CZ 285283 B6 použití nitrosoguanidinu) fyzikální techniky (například za použití ultrafialového světla) a genetické metody (například mutagenese transposonu). Takové varianty, deriváty a mutanty těchto kmenů je možno měnit, pokud se týče takových vlastností, jako je rychlost růstu nebo schopnost růst na určitých zdrojích potravy, ale zachovávají si hlavní vlastnosti, které jsou důležité pro tento vynález, tj. schopnost podporovat růst nematodů Phasmarhabditis a indukovat těmto nematodům patogenicitu vůči měkkýšům.
Pro použití na hubení zemědělských škůdců se nematodi sklízejí z fermentorů odstřeďováním filtrací nebo gravitačním usazováním. Nematodi se promyjí, za účelem odstranění složek vyčerpaného média a buď přímo zpracují na pesticidní prostředek, nebo se skladují ve formě chlazených provzdušňovaných vodných suspenzí před tím, než se zpracují na tento prostředek. Pro zemědělské použití je nematody možno zpracovávat na vodné suspenze na pevných nosičích, jako je aktivní uhlí, jíl, rašelina, vermikulit nebo polyether-polyurethanová houba, neboje možno je zapouzdřit do gelů, například do alginátového nebo polyakrylamidového gelu. Obzvláště vhodným prostředkem je prostředek obsahující vysušené nebo zčásti vysušené nematody. Nematodový prostředek se může aplikovat při hubení škůdců ve formě vodné suspenze, která se z něho vyrobí a která se aplikuje na ošetřovanou plochu například postřikem zavodněním nebo mořením.
Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Způsob izolace nematodů Phasmarhabditis
Živí nematodi získaní ze slimáků sebraných na poli za použití pastí s drcenými otrubami, jako návnadou, se umístí na ledvinové agarové médium vyrobené smícháním 10% homogenizovaných vepřových ledvin, 3,5 % kukuřičného oleje, 2 % agaru a 84,5 % vody (% hmotnostní), které bylo sterilizováno v autoklávu a nalito do Petriho misek. Toto médium povzbuzuje růst bakterií spojených s nematody. Nematodi se těmito bakteriemi živí a na miskách rostou a reprodukují se.
Příklad 2
Izolace bakterií spojených s nematody nebo se slimáky infikovanými nematody
Bakterie spojené s nematody nebo se slimáky infikovanými nematody se mohou izolovat kterýmkoliv z následujících způsobů:
(i) Izolace bakterií z nematodů
Nematodi se povrchově sterilizují ponořením do roztoku ehtylmerkurithiosalicylátu sodného (Thimerosal) o koncentraci 1 g/1 na dobu 1 hodiny a potom se přenesou do čerstvého roztoku Thimerosalu na další 3 hodiny. Bakterie je možno uvolnit z nematodů následujícími 2 sterilními mikrobiologickými technikami:
a) Jednotlivé larvy nematodů se přenesou do kapky sterilního roztoku chloridu sodného, která je umístěna na mikroskopickém sklíčku, které bylo sterilizováno plamenem. Nematodi se
-5CZ 285283 B6 potom rozříznou na několika místech po délce svého těla. Kapka roztoku kuchyňské soli obsahující mrtvá těla nematodů se potom pomocí sterilní Pasteurovy pipety přenese do Petriho misky s živnou agarovou půdou o průměru 9 cm a rozprostře se na povrchu pomocí stěrky, která byla sterilizována v plameni alkoholového hořáku.
b) Velké množství povrchově sterilizovaných nematodů se suspenduje v 1 ml sterilního Ringerova roztoku a vzniklá suspenze se přenese do 5 ml homogenizátoru tkání z teflonu. Suspenze nematodů se rozdrtí a potom přenese do 9 ml sterilní živné půdy. Živná půda se intenzivně protřepává a provede se sériové ředění. 0,1 ml alikvotní vzorek každé zředěné půdy se umístí na misku s živným agarem, rozprostře se po povrchu pomocí skleněné stěrky a provede se inkubace. Po 48 hodinách inkubace při 25 °C je možno na základě morfologie kolonií vybrat různé bakteriální izoláty a přenést je do subkultur standardními mikrobiologickými postupy.
(ii) Izolace bakterií z xenických kultur s kousky pěny
Z prosperujících xenických kultur se pomocí chemických kleští, které byly sterilizovány v plameni alkoholového hořáku odeberou kousky pěny obsahující nematody a bakterie. Každý kousek se umístí do zkumavky obsahující 10 ml sterilní živné půdy a obsah zkumavky se promíchá. Provede se sériové ředění vzniklé suspenze bakterií a nematodů a 0,1 ml alikvotní vzorek různě zředěné půdy se rozprostře na misce s živným agarem, načež následuje inkubace.
(iii) Izolace bakterií z živých slimáků infikovaných nematody
P. hermaphrodita/P. neopapillosa infikuje plášťovou oblast slimáka, kde dochází také kjeho reprodukci. Právě z této oblasti je možno izolovat bakterie. Plášť se nejprve otře suchým chomáčkem vaty, aby se odstranilo co nejvíce slizu. Potom se povrch pláště otře 70 % (objemově) ethanolem, za účelem povrchové sterilizace pláště. V plameni sterilizovanou jehlou se propíchne plášť a potom se kapky tekutiny na konci jehly přímo přenesou na misky se živným agarem, kde se rozprostřou pomocí skleněné stěrky a inkubují.
(iv) Izolace bakterií z mrtvých slimáků
Tkáňové stěry z mrtvého těla slimáka, který uhynul po infekci nematody aje nematody pokryt, se suspendují v živné půdě za použití bakteriologického očka. Provede se sériové ředění vzniklé suspenze a 0,1 ml alikvotní vzorky se rozprostřou na miskách s živným agarem a inkubují.
Příklad 3
Způsob selekce bakterií, které podporují růst nematodů
Před tím, než je možné provést skríning různých bakterií, pokud se týče jejich schopnosti podporovat růst nematodů, je nejprve nutno získat nematody, kteří by byli prosti bakterií. Samičí reprodukční trakt nematodů je obvykle sterilní (Poinar a Hansen, Helminthological Abstracts, Serie B, (1986) sv. 55, č. 3, str. 61 až 81), a proto jsou juvenilové JI ihned po vylíhnutí sterilní. Jednotliví gravidní dospělci nematodů, vybraní z kultur nematodů nebo slimáků se přenesou na sterilní hodinové sklíčko obsahující roztok Thimerosalu o koncentraci 0,2 g/1, kde se ponechají přes noc při 10 °C. V průběhu této doby se z vajíček v dospělcích vylíhnou a uvolní juvenilové (JI). Následující den se juvenilové přenesou pipetou do centrifugačních zkumavek naplněných 10 ml Ringerova roztoku o čtvrtinové síle, který obsahuje 500 U/ml penicillinu G a streptomycinsulfátu. Juvenilové se v tomto roztoku ponechají dalších 24 hodin při 10 °C. Potom se zkoncentrují jemným odstředěním (50 x g, po dobu 10 minut), seberou se ze dna zkumavky a resuspendují v čerstvém sterilním Ringerově roztoku o čtvrtinové koncentraci
-6CZ 285283 B6 a znovu se odstředí. Resuspendování a centrifugace se ještě jednou opakuje, aby se odstranily všechny stopy antibiotika. Potom se larvy umístí na sterilní hodinové sklo. Potom je možno s nematody manipulovat jednotlivě pomocí mikropipety, která je zhotovena odtažením kapací pipety v Bunsenově hořáku, až do šířky přibližně 0,1 mm. Nematodové kultury se pěstují na ledvinovém agaru (popsaném v příkladu 1) v Petriho miskách o průměru 3 cm. Dávka jednoho bakteriologického očka 18 hodin staré kultury živné půdy se zkoušenými bakteriemi se naproužkuje přes polovinu 30 mm misek s ledvinovým agarem. Na kraj Petriho misky v té její polovině, která neobsahuje bakterie se umístí 10 axenických juvenilních nematodů, získaných způsobem popsaným v příkladu 8 tak, aby nematodi museli překonat alespoň 15 mm vzdálenost přes povrch bez bakterií před tím, než se dostanou ke zkoušené bakterii. Misky se inkubují při 15 °C. Jakákoliv bakterie, která je přítomna na nematodovi a která nebyla usmrcena v průběhu axenizačního procesu, vytváří viditelné kolonie v této polovině misky a takové misky lze potom vyřadit. Po 1 týdnu se misky vykazující bakteriální kontaminaci v čisté polovině zlikvidují. Po 2 týdnech se může spočítat počet nematodů přítomných na misce přímým mikroskopickým pozorováním, víčko Petriho misky se odstraní s nahradí jiným víčkem, na němž byla předtím vyznačena počítací mřížka. Po 3 týdnech je možno nematody spočítat znovu tak, že se nematodi spláchnou z agaru do známého objemu vody a nematodi se ve výsledné suspenzi spočítají v Peterově jednomililitrové počítací komůrce.
Devět různých druhů bakterií, které byly izolovány výše popsanými způsoby, se podrobí zkoušení na schopnost podporovat růst nematodů. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 1.
Tabulka 1
Počet nematodů Phasmarhabditis v Petriho misce po 2 a 3 týdnech růstu v monoxenické kultuře s různými bakteriemi. Pro statistickou analýzu jsou data převedena na logaritmy.
| Bakterie | Po 2 týdnech | Po 3 týdnech | ||
| Počet | Log | Počet | Log | |
| Axenické | 2 | 0,41 | 0 | 0,00 |
| Bakterie IA | 170 | 2,18 | 18090 | 4,22 |
| Bakterie 17 | 0 | 0,04 | 0 | 0,00 |
| Bakterie 34 | 1 | 0,13 | 890 | 1,00 |
| Bakterie 48 | 60 | 1,70 | 54060 | 4,73 |
| Bakterie 54 | 80 | 1,53 | 25950 | 4,39 |
| Bakterie 77 | 1160 | 3,06 | 86340 | 4,93 |
| Bakterie 83 | 520 | 2,46 | 67000 | 4,78 |
| Bakterie 141 | 690 | 2,77 | 75220 | 4,85 |
| Bakterie 156 | 250 | 2,26 | 83630 | 4,89 |
Směrodatná odchylka pro porovnávání logarithmů počtu nematodů je 0, 204,128 D. F.
Po 3 týdnech vznikly vysoce signifikantní (P<0,001) rozdíly ve schopnosti bakterií podporovat růst nematodů.
Příklad 4
Způsob masové kultivace nematodů Phasmarhabditis v kultuře s kousky pěny.
Nematody je možno masově pěstovat na kouscích polyether-polyurethanové pěny za použití podobných technik, jaké byly vyvinuty pro masovou produkci nematodů parazitujících na hmyzu (Bedding, v Nematologica (1981), sv. 27, str. 109 až 114 a Annals of Applied Biology (1984), sv. 104, str. 117 až 120). Toto médium se skládá z 65% vepřové ledviny, 15% hovězího vypečeného tuku a 25 % vody (% hmotnostní). Ledvina se rozseká na malé kousky, přidá se voda a směs se rozmělní na kapalinu v mísiči Waring. Hovězí vypečený tuk se roztaví v široké pánvi nad kruhovým plynovým hořákem, potom se kněmu přidá ledvinový homogenát, který se důkladně smísí stukem a vaří tak dlouho, dokud nezhnědne. Směs se potom vrátí do mísiče Waring, kde se znovu rozemele. Vzniklá směs se potom smíchá s kousky pěny, přičemž k jednomu hmotnostnímu dílu kousků pěny se přidá 12 dílů hmotnostních média. Vzniklé médium se může uložit do kónických baněk nebo autoklávovacích pytlů, popsaných Beddingem (1984). Kultury s kousky pěny se současně zaočkují jak nematody, tak bakteriemi. V každém pytli se v horní části prořízne štěrbina a přidá se 75 ml přes noc narostlé kultury bakterií. Kultura bakterií může být v podobě směsné mikrobiální populace, získané způsobem popsaným v příkladu 2, nebo ve formě čisté kultury bakteriálního kmene, vybraného na základě schopnosti podporovat růst nematodů, jak je to popsáno v příkladu 3. Přidají se nematodi na agaru z Petriho misek nebo na kouscích pěny z dřívějších pytlových kultur. Pytlové kultury se inkubují při 15 °C po dobu 3 týdnů. Po této době je možno uvnitř pytlů vidět mnoho infekčních juvenilů, které v pytlích zanechají upotřebené médium. Nematodi se sklidí z kousků pěny modifikovaným postupem extrakce v nálevce, který se podobá postupu používanému pro izolaci nematodů ze zemních vzorků. Měděné síto na zeminu o průměru 17,5 cm se obloží 17,5 cm filtrem na mléko a umístí na 50 cm misku pod květináč. Kousky pěny z pytlů se umístí v sítech do hloubky přibližně 2 cm a potom se květináčové misky naplní vodou tak, že se vodní hladina právě dotýká spodní části vrstvy kousků pěny. Síta se potom v tomto stavu uchovávají přes noc. V průběhu této doby živí nematodi proplavou filtrem na mléko a shromáždí se ve vodě pod filtrem. Suspenze nematodů se pročistí od vypotřebovaného média a bakterií několikanásobnou výměnou vody a potom se nematodi skladují v provzdušňované vodě při 10 °C až do doby použití.
Příklad 5
Kapalná kultura monoxenických nematodů Phasmarhabditis
Axenizovaní nematodi se pěstují na pevném médiu (s obsahem ledviny) s příslušnými bakteriemi. Po třech týdnech se nematodi přenesou do kapalné kultury.
Nematodi se pěstují v kultuře, umístěné ve třepací láhvi, za následujících podmínek:
Médium: 10 % ledvin, 1 % kvasinkového extraktu, 3,5 % kukuřičného oleje Nádoba: 250 ml kónická baňka s 50 ml média
Teplota: 15 °C
Frekvence otáčení třepačky: 200 min'1.
Nádoby se zaočkují 1 ml druhu bakterie pěstovaného v živné půdě. Po 24 hodinách se nematodi spláchnou do baněk pomocí sterilní vodovodní vody a následuje třítýdenní inkubace.
Nematodi se 2x opláchnou sterilní vodou a spočítají. Potom se těchto nematodů použije jako inokula pro experimentální kultury. Nematodi se přidají do baněk předem inokulovaných bakteriemi v množství 3000 nematodů na 1 ml obsahu baňky.
Nematodi se pěstují ve spojení se 4 různými druhy bakterií. V průběhu kultivace se v různou dobu zjišťují počty nematodů. Dauer larvae (stadium, které je rovněž známé pod označením infekční juvenilové) se považují za nematody se zachovaným druhým stupně cuticula.
Nematodi se spočítají po 20 dnech inkubace a zjištěné výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.
-8CZ 285283 B6
Tabulka 2
Kapalná kultura monoxenických nematodů
| Bakterie | Počet replikací | Střední počet nematodů v 1 ml | |
| Dauer Larvae | Jiná stadia | ||
| P. fluorescens | 6 | 1220 | 110 |
| S. proteomaculans | 6 | 11500 | 7400 |
| P. rettgeri | 6 | 99900 | 189000 |
| M. phenylpyruvica | 3 | 72000 | 223000 |
Odborníci v tomto oboru mohou na základě, podmínek popsaných v tomto příkladu snadno vyřešit masovou produkcí nematodů v kapalné kultuře ve velkoprostorových fermentorech.
Příklad 6
Způsob selekce bakterií udělujících patogenicitu proti slimákům
Nematodi pěstovaní v monoxenické kultuře se 2 druhy bakterií. Providencia rettgeri a Moraxella phenylpyruvica (viz příklad 5) se zkoušejí na patogenicitu proti slimáčkovi polnímu Deroceras reticulatum. Krabice s plastu (rozměry 135x75x50 mm) se naplní 440 g na vzduchu sušených zemních agregátů o průměru 12,5 až 25 mm, které byly získány zpracováním na sítech. Zemní agregáty z každé krabice se vyjmou a namočí 80 ml vody.
Používá se jednak neošetřených krabic, do kterých se nepřidají nematodi a krabic, do kterých se přidají nematodi v 5 různých dávkách (15 000, 23 000, 35 000, 55 000 a 75 000 nematodů na krabici z plastu). Pro všech 6 pokusů s oběma várkami monoxenických nematodů se použije vždy 2 krabic (dvojnásobná replikace).
Nematodi se spočítají a jejich příslušný počet se suspenduje v 50 ml vodovodní vody. Agregáty se znovu umístí do krabice a suspenze nematodů se rovnoměrně rozdělí na povrch agregátů vrstva po vrstvě. Mezi prostřední vrstvy v každé krabici se umístí 10 jedinců D. reticulatum. Na agregátech v každé krabici se rovnoměrně rozdělí 50 ml vodovodní vody, aniž by se přidávali další nematodi tak, aby výsledný obsah vlhkosti v každé krabici byl přibližně 30 % hmotnostních.
Slimáci se chovají v půdě po infekční periodu v délce 5 dnů při 10 °C a potom se vyjmou a přenesou do Petriho misek, kde se chovají jednotlivě a krmí kotoučky odebranými z listů čínského zelí. Po dalších 9 dnech při 10 °C (po 14 dnech od počáteční expozice nematodům) se zaznamená počet mrtvých a živých slimáků. Data mortality se opraví vzhledem k mortalitě pozadí, která je, zřejmá z neošetřených krabic. Opravená data mortality se vynesou do grafu, jakožto závislost na dávce nematodů (tj. nematodů pěstovaných v monoxenické kultuře s oběma bakteriemi).
Při tomto experimentu jsou nematodi pěstovaní s M. phenylpyruvica a Pr. rettgeri patogenní vůči D. reticulatum. Této metody je možno použít pro selekci jiných kmenů bakterií, například kmene P. fluorescens 141, který uděluje patogenicitu proti slimákům.
-9CZ 285283 B6
Příklad Ί
Zpracování nematodů Phasmarhabditis na pesticidní prostředek
Monoxeničtí nematodi Phasmarhabditis, kteří byli pěstováni ve spojení s kmenem 48 M. phenylpyruvica (viz příklad 5) se sklidí odstředěním a promytím vodou za použití opakovaného cyklu usazování a resuspendace v čerstvé vodě, který se provádí tak dlouho, dokud nejsou nematodi zbaveni reziduálního růstového média. Promytí nematodi se zkoncentrují odstřeďováním na vodnou pastu tvořenou nematody, v níž je obsaženo Ο,ΙχΙΟ6 až 2,0xl06 nematodů v jednom gramu. Nematodová pasta se smíchá s jílem na bázi montmorillonitu vápenatého, za vzniku ve vodě dispergovatelné práškovité směsi obsahující 0,05xl06 až l,8xl06 nematodů v jednom gramu (hmotnost za vlhka).
Příklad 8
Schopnost nematodů Phasmarhabditis, produkovaných v kultuře z kousků pěny, usmrcovat různé druhy slimáků
Nematodi Phasmarhabditis, kteří byli pěstováni na směsné bakteriální floře způsoby popsanými v příkladu 4 byli zkoušeni v biologickém pokusu proti šesti škodlivým druhům slimáků. Těmito druhy jsou Deroceras recitulatum, D. caruanae, Arion ater, A. intermedius, A. distinctus a Tandonia (Milax) sowerbyi. Slimáci byli nasbíráni do pastí s návnadou z rozemletých otrub ve výzkumné stanici Long Ashton Research Station v listopadu roku 1990. Všichni slimáci byli dospělci, s výjimkou A. ater, což byli juvenilní formy (střední hmotnost 770 mg). Nematodi byli pěstováni v xenických pytlových kulturách s kousky pěny způsobem popsaným v příkladu 4. Do plastových krabic (o rozměrech 135x75x50 mm) bylo umístěno 440 g na vzduchu sušených zemních hrubozmných agregátů o průměru 12,5 až 25 mm, které byly získány zpracováním na sítech. Do každé z krabic ošetřovaných nematody bylo přidáno přibližně 1,9 x 105 infekčních larev Phasmarhabditis, suspendovaných ve 130 ml vodovodní vody. Do neošetřených krabic bylo přidáno 130 ml vodovodní vody bez nematodů. Do každé z krabic bylo vloženo 10 slimáků, s výjimkou větších druhů (T. sowerbyi a A. ater), kterých bylo přidáno vždy 5. 17 slimáků A. distinctus bylo ošetřeno nematody a 18 slimáků bylo chováno bez ošetření, jako kontrolní zvířata. U všech ostatních druhů bylo vždy 20 slimáků ošetřeno a 20 slimáků ponecháno bez ošetření, jako kontrolní zvířata. Slimáci byli ponecháni v půdě po pětidenní infekční periodu, po níž byly krabice se zeminou rozebrány a byl zaznamenán počet mrtvých slimáků. Přeživší slimáci byli přeneseni do 9 cm Petriho misek obložených zevnitř vlhkým filtračním papírem, kde byli uchováváni jednotlivě a krmeni listovými kotoučky čínského zelí. Krabice se zeminou a Petriho misky byly po celou dobu trvání biologického pokusu uchovávány při 10 °C. Počet mrtvých slimáků byl zaznamenán ještě 2x v třídenních intervalech. Mortalita jednotlivých druhů slimáků v ošetřených a neošetřených krabicích v každém okamžiku, kdy bylo zaznamenávání prováděno, byla porovnávána pomocí chí2 testu. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.
- 10CZ 285283 B6
Tabulka 3
Procentická mortalita různých druhů slimáků po 5, 8 a 11 dnech od ošetření nematody nebo bez ošetření
| Druh slimáka | Po 5 dnech | Po 8 c | nech | Po 11 dnech | ||
| ošetřený | neošetřený | ošetř. | neošetř. | ošetř. | neošetř. | |
| Deroceras reticulatum | 100 | 10 | 100 | 25 | 100 | 40 |
| Deroceras caruanae | 70 | 10 | 100 | 15 | 100 | 20 |
| Aion ater | 5 | 0 | 40 | 0 | 100 | 0 |
| Arion intermedius | 100 | 40 | 100 | 60 | 100 | 70 |
| Arion distinctus | 6 | 6 | 88 | 11 | 100 | 28 |
| Tandonia sowerbyi | 20 | 15 | 80 | 15 | 100 | 25 |
Po pětidenní infekční periodě byly rozdíly v mortalitě mezi slimáky ošetřenými nematody a neošetřenými slimáky vysoce signifikantní (P<0,001), v případě D. reticulatum. D. caruanae a A. intermedius. Rozdíly v mortalitě mezi ošetřenými a neošetřenými slimáky u ostatních tří druhů nebyly v tomto stadiu signifikantní. Po osmi dnech byly rozdíly v mortalitě mezi ošetřenými a neošetřenými slimáky signifikantní u všech zkoušených druhů (P<0,001 pro D. reticulatum. D. caruanae. T. sowerbyi a A. distinctus a P<0,01 pro A. ater a A. intermedius). Do jedenáctého dne všichni slimáci, na něž byli aplikováni nematodi, uhynuli. Rozdíly v mortalitě mezi ošetřenými a neošetřenými slimáky byly signifikantní pro všechny druhy (P<0,01 pro A. intermedius aP<0,001, pro všechny ostatní druhy). Rozdíl v případě A. intermedius nebyl tak velký, poněvadž mnoho neošetřených slimáků uhynulo.
Z těchto výsledků je zřejmé, že nematodi Phasmarhabditis jsou schopni usmrcovat všechny zkoušené druhy slimáků.
Příklad 9
Schopnost nematodů Phasmarhabditis, pěstovaných v kulturách s kousky pěny, snižovat poškození rostlin způsobené slimáčkem polním Deroceras reticulatum za polním podmínek
Byl proveden pokus na minipolíčcích, jehož účelem bylo srovnat poškození semenáčků čínského zelí slimáky na neošetřených políčcích, políčcích ošetřených peletami methiocarbu (tato látka je považována za nejlepší dostupnou chemikálii potlačující slimáky) a políčcích ošetřených jedinou vysokou dávkou nematodů, produkovaných v kultuře s kousky pěny, na směsné bakteriální flóře, způsobem popsaným v příkladu 3. Při pokuse se používá série 40 mikropolíček obsahujících hlinitou zem na loži z hrubého štěrku. Rozměiy políček byly 70x70 a jejich hloubka byla 30 cm. Políčka byla od sebe oddělena dřevěnými nebo betonovými obrubníky, na nichž byl upevněn 10 cm vysoký plot z měděného drátěného pletiva o průměru 0,8 mm, který představoval zábranu pro pohyb slimáků mezi jednotlivými políčky.
V rozmezí březen až červen 1989 bylo 36 těchto políček osídleno slimáky. Do zbývajících čtyř políček nebyli přidáni žádní slimáci a tato políčka sloužila jako měřítko rezidentní slimáčí populace. Do každého z osídlených políček bylo vloženo 5 na poli sebraných dospělců D. reticulatum. Tito slimáci byli drženi alespoň dva týdny v karanténních krabicích, aby se zaručilo, že nenesou žádné parazity. Na každé políčko bylo v průběhu tříměsíční periody vloženo 34 v laboratoři chovaných nově vylíhlých jedinců D. reticulatum, takže na začátku pokusu byli na políčcích přítomni slimáci v mnoha stadiích vývoje.
- 11 CZ 285283 B6
Experiment byl koncipován tak, že se provádělo 9 replikací 4 randomizovaných bloků, přičemž každý blok zahrnoval 2 neošetřená políčka, 1 políčko ošetřené nematody a 1 políčko ošetřené peletami methiocarbu.
V 900 ml vodovodní vody bylo suspendováno 1,05 x 106 nematodů a vzniklé suspenze bylo použito pro zálivku políček pomocí kropicí konvičky. Dalších 100 ml vodovodní vody bylo použito pro vypláchnutí konvičky a i tato voda byla nalita na políčka. Na neošetřená políčka a na políčka ošetřená methiocarbem byl také nalit 1 1 vodovodní vody. Pelety methiocarbu byly přidány v doporučené dávce pro polní ošetření (5,5 kg/ha = 0,275 g/políčko). Pelety byly naváženy a ručně rovnoměrně rozděleny po políčcích. V průběhu celého pokusu byla políčka zavlažována svrchu pomocí zavlažovacího potrubí, tak aby se zajistily příznivé podmínky pro aktivitu slimáků.
Na začátku pokusu bylo na každé políčko vysazeno 9 semenáčků (čtverec 3x3) čínského zelí, napěstovaných ve skleníku. Rostliny byly kontrolovány 2x týdně a odhadem (s přesností na 5 %) bylo zjišťováno poškození rostlin slimáky.
Dva týdny po vysazení byly semenáčky na některých neošetřených políčcích úplně zničeny, takže zbytky starých semenáčků byly ze všech těchto políček odstraněny a byly vysazeny nové. To se opakovalo po dalších 2 týdnech. Po dalších 2 týdnech byl pokus ukončen (celková doba trvání pokusu byla 6 týdnů). Poškození semenáčků bylo v průběhu pokusu zaznamenáváno 2x týdně. Plůtky z měděného drátěného pletiva mezi políčky se v jednom z bloků (blok č. 9) uvolnily po prvních 4 týdnech, což umožnilo slimákům pohyb mezi těmito políčky. Tato políčka byla proto ignorována a zaznamenané výsledky po 5 a 6 týdnech se vztahují pouze k 8 blokům.
Na konci každého pokusu byly z každého políčka ze zbývajících 8 bloků odebrány 2 vzorky zeminy (25x25x10 cm), přičemž 1 vzorek byl odebrán zprostředka a 1 z jihovýchodního rohu každého políčka. Vzorky byly postupně zavodňovány po dobu 9 dnů v extrakční jednotce pro slimáky LARS (Glen & Wiltshire. Proceedings 1986 British Crop Protection Conference (1986), sv. 1, str. 139 až 144), a z povrchu byli každý den odstraňováni slimáci.
Rozsah poškození semenáčků slimáky při každém ošetření v průběhu pokusuje zřejmý z obr. 1.
Analýza variance po úhlové transformaci, za účelem stabilizace variance, ukazuje, že jak pelety methiocarbu, tak nematodi signifikantně (P<0,001) snížili rozsah škody způsobené semenáčkům. Při prvním odečítání (4 týdny po ošetření) byla zjištěna signifikantně (P<0,05) rozsáhlejší škoda na políčcích ošetřených nematody, ve srovnání s políčky ošetřenými methiocarbem, ale když semenáčky růstem překonaly počáteční poškození, rozdíl mezi políčky ošetřenými nematody a políčky ošetřenými methiocarbem se snížil. Koncem prvního týdne vykazovala políčka ošetřená nematody menší poškození než políčka ošetřená methiocarbem, ale tento rozdíl nebyl signifikantní. Po 17 dnech (první vyšetření druhé dávky semenáčků) vykazovala políčka ošetřená nematody signifikantně (P<0,05) nižší poškození, ve srovnání s políčky ošetřenými methiocarbem a tento stav (P<0,01) zůstal zachován až do konce pokusu.
V zemních vzorcích byly nalezeny 3 druhy slimáků. Deroceras reticulatum, Deroceras caruanae a Boetgerilla pallens. Na všech políčcích byli nalezeni pouze 2 slimáci D. caruanae, ale 89 slimáků B. pallens, ve srovnání s 55 slimáky D. reticulatum, Slimáci B. pallens byli na políčka pravděpodobně zavlečeni někdy dříve a mezi tím se reprodukovali a políčka osídlili. Strava, které tito slimáci dávají přednost, není známa, ale při laboratorních zkouškách nepoškozovali listy čínského zelí v průběhu třítýdenní expozice, při které jim nebyl nabídnut žádný alternativní zdroj potravy. Je tedy nepravděpodobné, že by tito slimáci způsobili poškození semenáčků při popisovaném pokusu.
- 12CZ 285283 B6
V zemních vzorcích ze 4 políček, na něž nebyli přidáni žádní slimáci D. reticulatum, nebyli ani žádní tito slimáci nalezeni. To naznačuje, že narozdíl od B. pallens nebyli před zahájením pokusu na políčcích žádní slimáci D. reticulatum nebo jich tam bylo jen málo.
Celkové počty slimáků a hodnoty biomasy extrahované ze vzorků s různým ošetřením byly převedeny na druhou odmocninu, za účelem statistické analýzy. Tyto výsledky jsou zřejmé z obr. 2.
Signifikantně méně slimáků bylo extrahováno z políček ošetřených nematody než z neošetřených políček (P<0,01 pro všechny druhy slimáků a pro samotný druh D. reticulatum) a také bylo extrahováno méně slimáků z políček ošetřených methiocarbem než z neošetřených políček (P<0,05 pro všechny druhy slimáků a pro samotný druh D. reticulatum). Přestože bylo extrahováno méně slimáků z políček ošetřených nematody než z políček ošetřených methiocarbem, tento rozdíl nebyl signifikantní. Z políček ošetřených nematody nebyl extrahován žádný slimák D. reticulatum, což ukazuje, že tento druh byl na políčcích téměř vyhuben. Počty slimáků B. pallens nebyly podstatně ovlivněny nematody, ani methiocarbem, přestože na políčcích ošetřených nematody bylo zjištěno méně slimáků B. pallens než na políčcích, která ošetřena nebyla.
Příklad 10
Schopnost monoxenických nematodů Phasmarhabditis usmrcovat různé druhy škůdců ze skupiny měkkýšů
Monoxenických nematodů Phasmarhabditis, kteří byli pěstováni ve spojení s kmenem 48 M. phenylpyruvica způsobem popsaným v příkladu 5 bylo použito při biologickém pokusu proti různým druhům škůdců ze skupiny měkkýšů, včetně Monacha cantiana, způsobem popsaným v příkladu 8. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.
Tabulka 4
Procentická mortalita různých druhů škodlivých měkkýšů po ošetření monoxenickými nematody nebo bez ošetření
| Druh měkkýše | Trvání biologického pokusu (dny) | Po ošetření | Bez ošetření |
| Deroceras reticulatum | 11 | 100 | 15 |
| Deroceras caruanae | 11 | 100 | 10 |
| Monacha cantiana | 5 | 100 | 0 |
| Arion intermedius | 5 | 100 | 0 |
| Arion distinctus | 11 | 100 | 0 |
| Tandonia sowerbyi | 11 | 70 | 5 |
Rozdíly v mortalitě mezi ošetřenými a neošetřenými měkkýši byly signifikantní (P<0,001) u všech zkoušených druhů, což ukazuje, že všechny zkoušené druhy Škůdců ze skupiny měkkýšů byly susceptibilní vůči nematodům Phasmarhabditis sp., monoxenizovaným pomocí kmene 48 M. phenylpyruvica. Spektrum aktivity monoxenických nematodů nebylo změněno ve srovnání s xenickými nematody.
Monoxeničtí nematodi Phasmarhabditis byli pěstováni ve spojení sM. phenylpyruvica nebo P. rettgery způsobem popsaným v příkladu 5 a bylo jich použito v různé dávce při biologickém pokusu proti slimákům druhů D. reticulatum způsobem popsaným v příkladu 8. Výsledky jsou shrnuty na obr. 3. Oba typy monoxenických nematodů byly účinné proti D. reticulatum.
Příklad 11
Schopnost monoxenických nematodů Phasmarhabditis potlačovat poškození rostlin způsobené slimáčkem polním Deroceras reticulatum za polních podmínek
Byl proveden polní pokus za účelem porovnání škody na ozimé pšenici (odruha Mercia), způsobené slimáky, na neošetřených políčcích, políčcích ošetřených peletami methiocarbu a políčcích ošetřených různými dávkami nematodů. Monoxeničtí nematodi byli napěstováni ve spojení s kmenem 48 M. phenylpyruvica, způsobem popsaným v příkladu 5 a způsobem popsaným v příkladu 7 zpracováni za použití jílu na ve vodě dispergovatelný prášek, obsahující 0,36 x 106 nematodů v gramu výsledného prostředku (vlhká hmotnost). Nematodi byli aplikováni ihned po osetí políček ve formě vodného postřiku o objemu ekvivalentním 11001/ha. Methiocarbové pelety byly aplikovány ručně v doporučené polní dávce (5,5 kg/ha).
Pro monitorování slimáčí populace na pokusných políčcích bylo použito povrchových pastí a zemních vzorků. Na políčcích bylo nalezeno mnoho různých druhů slimáků, včetně Deroceras reticulatum. Arion silvaticus. Arion subfuscus. Arion ater. Tandonia sowerbyi a Milax gagates, ale D. reticulatum jasně převazoval.
Šest týdnů po setí byla políčka zkontrolována na vzešlé semenáčky. Tato kontrola představuje odhad lethálního poškození slimáky (tj. snížení počtu vzešlých rostlin). Zároveň byl proveden odhad sub-lethálního poškození slimáky (tj. ožeru rostlin slimáky), na základě vizuálního odhadu u náhodně zvolených rostlin. Střední počet vzešlých pšeničných rostlin, vztažený na 0,5 m délky brázdy při různých ošetřeních je uveden v tabulce 5.
Tabulka 5
Střední počet vzešlých rostlin pšenice, vztažený na délku 0,5 m brázdy při různém ošetření při polním pokusu (hodnocení prováděno 6 týdnu po setí)
| Ošetření | Střední počet vzešlých rostlin |
| bez ošetření | 12,93 |
| dávka nematodů 1 x 108/ha | 12,78 |
| dávka nematodů 3 x 108/ha | 13,95 |
| dávka nematodů 1 x 109/ha | 13,25 |
| dávka nematodů 3x109/ha | 14,88 |
| dávka nematodů 1 x 1010/ha | 16,50 |
| methiocarb | 14,57 |
směrodatná odchylka = 1,314 (399 d.f.)
Se zvyšující se dávkou nematodů jasně stoupá počet vzešlých rostlin, což je důkazem, že ošetření nematody snížilo lethální poškození slimáky.
Data, vztahující se ke střední procentické ploše listu, poškozené slimáky, byla před analýzou převedena na úhly. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 6.
-14CZ 285283 B6
Tabulka 6
Střední úhlová procentická plocha listů poškozená slimáky, vztažená na rostlinu při různých ošetřeních při polním pokusu (hodnocení se provádí 6 týdnů po setí)
| Ošetření | Střední úhlová procentická plocha listů poškozená u jedné rostliny |
| bez ošetření | 31,82 |
| dávka nematodů 1 x 108/ha | 29,15 |
| dávka nematodů 3 x 108/ha | 28,87 |
| dávka nematodů 1 x 109/ha | 22,11 |
| dávka nematodů 3 x 109/ha | 18,63 |
| dávka nematodů 1 x 1010/ha | 16,49 |
| methiocarb | 25,17 |
směrodatná odchylka = 3,395, (24 d.f.)
Byly zjištěny podstatné rozdíly v ploše listu poškozené slimáky mezi jednotlivými ošetřeními (P<0,001), přičemž rostliny ošetřené třemi nej vyššími dávkami nematodů vykazovaly signifikantně (P<0,01) nižší poškození slimáky než rostliny z neošetřených políček. Rostliny z políček ošetřených nejvyšší dávkou nematodů vykazovaly podstatně (P<0,05) nižší poškození slimáky, ve srovnání s rostlinami z políček ošetřených methiocarbem. Je tedy zřejmé, že nematodi jsou schopni poskytnout dobrou úroveň potlačení sub-lethálních škod způsobených slimáky.
Příklad 12
Schopnost monoxenických nematodů Phasmarhabditis usmrcovat vodní šneky Lymnaea stagnalis
Monoxeničtí nematodi byli napěstováni ve spojení s kmenem 48 M. phenylpyruvica, způsobem popsaným v příkladu 5 a způsobem popsaným v příkladu 7 zpracováni za použití jílu na ve vodě dispergovatelný prášek, obsahující 0,36 x 106 nematodů v gramu výsledného prostředku (vlhká hmotnost). 10 exemplářů vodního šneka Lymnaea stagnalis bylo přidáno do každé z pěti čistých nádrží na ryby, které byly z poloviny naplněny rybniční vodou obsahující některé vodní rostliny, jako zdroj potravy pro šneky. Nádrže byly provzdušňovány malým vzduchovým čerpadlem a udržovány při teplotě 15 °C.
Do každé ze čtyř nádrží bylo přidáno přibližně 6x106 nematodů ve formě ve vodě dispergovatelného práškového prostředku. Do páté nádrže, která sloužila jako kontrolní, nebyli přidáni žádní nematodi. Po 3 dnech inkubace byla průměrná hodnota mortality šneků v nádržích ošetřených nematody 45% a po 6 dnech vzrostla na 100%. Po 6 dnech inkubace nebyla zaznamenána žádná mortalita v neošetřené kontrolní nádrži.
Claims (28)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Použití nematodů Phasmarhabditis pro hubení zemědělských a zahradnických měkkýšovitých škůdců a měkkýšovitých škůdců ohrožujících zdraví člověka a zvířat.
- 2. Použití podle nároku 1, kde nematodi jsou zvoleni ze souboru zahrnujícího P. neopapillosa a P. hermaphrodita.
- 3. Použití podle nároků 1 nebo 2 ve spojení s vhodnou bakterií podporující růst.
- 4. Použití podle nároků 1 nebo 2 ve spojení s vhodným společenstvím bakterií podporujících růst.
- 5. Použití podle nároků 1, 2, 3 nebo 4 pro hubení škůdců ze skupiny měkkýšů v zemědělství a zahradnictví.
- 6. Použití podle nároku 5 pro hubení škodlivých slimáků z čeledi Limacidae, zejména Deroceras reticulatum a Deroceras caruanae.
- 7. Použití podle nároku 5 pro hubení škodlivých slimáků z čeledi Arionidae, zejména Arion ater. Arion intermedius a Arion distinctus.
- 8. Použití podle nároku 5 pro hubení škodlivých slimáků z čeledi Milacidae, zejména Tandonia sowerbyi.
- 9. Použití podle nároku 5 pro hubení škodlivých šneků z čeledi Helicidae, zejména Monacha cantiana.
- 10. Použití podle nároků 1, 2, 3 nebo 4 pro potlačování měkkýšovitých škůdců ohrožujících zdraví člověka a zvířat.
- 11. Použití podle nároku 10 pro hubení šnečích škůdců rodu Lymnaea.
- 12. Použití podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, při němž se nematodi aplikují v podobě dauer larvae.
- 13. Použití podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, při němž se nematodi aplikují ve spojení s bakteriemi podporujícími růst těchto nematodů.
- 14. Kmen 48 Moraxella phenylpyruvica, jehož vzorek byl uložen pod přírůstkovým číslem NCIMB 40508, nebo jeho varianta, derivát nebo mutant mající schopnost podporovat růst a indukovat patogenicitu nematodů Phasmarhabditis vůči měkkýšům.
- 15. Kmen 141 Pseudomonas fluorescens, jehož vzorek byl uložen pod přírůstkovým číslem NCIMB 40509, nebo jeho varianta, derivát nebo mutant mající schopnost podporovat růst a indukovat patogenicitu nematodů Phasmarhabditis vůči měkkýšům.
- 16. Prostředek pro hubení škodců ze skupiny měkkýšů v zemědělství a zahradnictví a měkkýšovitých škůdců ohrožujících zdraví člověka a zvířat, vyznačující se tím, že obsahuje-16CZ 285283 B6 druh nematoda rodu Phasmarhabditis, ve spojení s vhodnou bakterií nebo bakteriální komunitou, podporující růst těchto nematodů a vhodný nosič nebo zapouzdřovací činidlo.
- 17. Prostředek podle nároku 16, vyznačující se tím, že nematodi jsou v něm přítomni ve formě dauer larvae.
- 18. Prostředek podle nároku 16, vyznačující se tím, že obsahuje druh nematodů P. neopapillosa nebo P. hermaphrodita.
- 19. Prostředek podle nároku 16, vyznačující se tím, že bakterie podporující růst jsou zvoleny ze souboru zahrnujícíhoPseudomonas fluorescensProvidencia rettgeriSerratia proteomaculansAeromonas salmonicidaMoraxella phenylpyruvicaBacillus cereusFlavobacterium odoratumFlavobacterium brevi.
- 20. Prostředek podle nároku 19, vyznačující se tím, že jako bakterii podporuj ící růst obsahuje kmen Moraxella phenylpyruvica NCIMB 40508 nebo Pseudomonas fluorescens NCIMB 40509.
- 21. Prostředek podle nároku 16, vyznačující se tím, že jako nosič obsahuje jíl.
- 22. Ve vodě dispergovatelný práškovitý prostředek podle některého z nároků 16 až 21, vyznačující se tím, že obsahuje jíl tvořený montmorillonitem vápenatým, vodu anematody, přičemž koncentrace nematodů je v rozmezí od 0,1x106 do 2,0x106, přednostně od 0,3x106 do 0,8x106 na gram vlhké hmotnosti.
- 23. Způsob produkce nematodů pro hubení měkkýšů, vyznačující se tím, že se nematodi Phasmarhabditis pěstují v kapalném médiu, přičemž růstové médium se preinokuluje alespoň jednou bakterií podporující jejich růst a indukující nematodům patogenicitu a potom se nematodi sklidí ve formě dauer larvae.
- 24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že se bakterie podporující růst volí ze souboru zahrnujícíhoPseudomonas fluorescensProvidencia rettgeriSerratia proteomaculans Aeromonas salmonicidaMoraxella phenylpyruvicaBacillus cereusFlavobacterium odoratumFlavobacterium brevi.
- 25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že bakterií podporující růst je buď Moraxella phenylpyruvica, nebo Pseudomonas fluorescens.- 17CZ 285283 B6
- 26. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 23 až 25, vyznačující se tím, že růstové médium obsahuje zdroj vitaminů a minerálů, zdroj triglyceridů a zdroj proteinu.
- 27. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 23 až 26, vyznačující se tím, že růstové 5 médium obsahuje ledvinu, kvasinkový extrakt a kukuřičný olej.
- 28. Způsob hubení měkkýšů, vyznačující se tím, že se na plochu, která je měkkýši zamořena, aplikují moluskocidní nematodi rodu Phasmarhabditis, ve spojení s bakteriemi podporujícími jejich růst.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB919115011A GB9115011D0 (en) | 1991-07-11 | 1991-07-11 | Biological control of slugs |
| PCT/GB1992/001248 WO1993000816A1 (en) | 1991-07-11 | 1992-07-09 | Biological control of molluscs |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ1094A3 CZ1094A3 (en) | 1994-07-13 |
| CZ285283B6 true CZ285283B6 (cs) | 1999-06-16 |
Family
ID=10698220
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS9410A CZ285283B6 (cs) | 1991-07-11 | 1992-07-09 | Způsob biologického hubení měkkýšů |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5527525A (cs) |
| EP (1) | EP0598746B1 (cs) |
| JP (1) | JP2927960B2 (cs) |
| AT (1) | ATE142845T1 (cs) |
| AU (1) | AU659199B2 (cs) |
| CA (1) | CA2113173C (cs) |
| CZ (1) | CZ285283B6 (cs) |
| DE (1) | DE69213947T2 (cs) |
| DK (1) | DK0598746T3 (cs) |
| ES (1) | ES2094362T3 (cs) |
| GB (1) | GB9115011D0 (cs) |
| GR (1) | GR3021953T3 (cs) |
| HU (1) | HU219857B (cs) |
| IE (1) | IE922218A1 (cs) |
| IL (1) | IL102451A (cs) |
| NZ (1) | NZ243533A (cs) |
| PL (1) | PL168777B1 (cs) |
| PT (1) | PT100669B (cs) |
| SK (1) | SK279691B6 (cs) |
| TR (1) | TR26297A (cs) |
| WO (1) | WO1993000816A1 (cs) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994019940A1 (en) * | 1993-03-04 | 1994-09-15 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Method for packaging entomopathogenic nematodes for storage and transport |
| US5965149A (en) * | 1993-08-13 | 1999-10-12 | Thermo Trilogy Corporation | Granular formulation of biological entities with improved storage stability |
| GB9400271D0 (en) * | 1994-01-07 | 1994-03-02 | Agricultural Genetics Co | Novel feeds for use in aquaculture |
| CA2450241A1 (en) | 2001-06-15 | 2002-12-27 | Grain Processing Corporation | Biodegradable sorbents |
| US6691454B1 (en) * | 2002-08-09 | 2004-02-17 | John E. Conroy | System for repelling garden slugs |
| US7566461B2 (en) | 2004-06-18 | 2009-07-28 | Sci Protek, Inc. | Methods for controlling molluscs |
| US7846463B2 (en) | 2005-05-11 | 2010-12-07 | Grain Processing Corporation | Pest control composition and method |
| NL1033726C2 (nl) * | 2007-04-20 | 2008-10-21 | Cooeperatie Horticoop U A | Gewasbeschermingssysteem. |
| US8313828B2 (en) | 2008-08-20 | 2012-11-20 | Johnson & Johnson Vision Care, Inc. | Ophthalmic lens precursor and lens |
| US8317505B2 (en) | 2007-08-21 | 2012-11-27 | Johnson & Johnson Vision Care, Inc. | Apparatus for formation of an ophthalmic lens precursor and lens |
| US9417464B2 (en) | 2008-08-20 | 2016-08-16 | Johnson & Johnson Vision Care, Inc. | Method and apparatus of forming a translating multifocal contact lens having a lower-lid contact surface |
| GB2463501A (en) * | 2008-09-16 | 2010-03-17 | Anthony Barker | The application of the slug parasitic nematode Phasmarhabditis hermaphrodita through rain-gun irrigation systems for the control of slugs |
| US9414590B2 (en) | 2009-03-16 | 2016-08-16 | Marrone Bio Innovations, Inc. | Chemical and biological agents for the control of molluscs |
| PT2601840T (pt) | 2009-04-20 | 2017-04-03 | Marrone Bio Innovations Inc | Agentes químicos e biológicos para controlo de moluscos |
| DE102009053902B4 (de) * | 2009-11-20 | 2013-11-07 | E-Nema Gesellschaft für Biotechnologie und biologischen Pflanzenschutz mbH | Vorrichtung zur Bekämpfung von Käfern mit entomopathogenen Nematoden |
| GB201008877D0 (en) | 2010-05-27 | 2010-07-14 | Becker Underwood Ltd | Biolgical control of molluscs |
| AR083811A1 (es) * | 2010-11-13 | 2013-03-27 | Marrone Bio Innovations Inc | Agentes para el control de limnoperna sp. |
| EP2820140B1 (en) | 2012-02-28 | 2018-01-10 | Marrone Bio Innovations, Inc. | Control of phytopathogenic microorganisms with pseudomonas sp. and substances and compositions derived therefrom |
| US8728754B1 (en) | 2013-01-23 | 2014-05-20 | Marrone Bio Innovations, Inc. | Use of proteins isolated from Pseudomonas to control molluscs |
| US9645412B2 (en) | 2014-11-05 | 2017-05-09 | Johnson & Johnson Vision Care Inc. | Customized lens device and method |
| WO2016191430A1 (en) * | 2015-05-28 | 2016-12-01 | Marrone Bio Innovations, Inc. | Use of proteins to control molluscs |
| US10772333B2 (en) | 2015-10-02 | 2020-09-15 | The Regents Of The University Of California | Mollusk-killing biopesticide |
| US10359643B2 (en) | 2015-12-18 | 2019-07-23 | Johnson & Johnson Vision Care, Inc. | Methods for incorporating lens features and lenses having such features |
| US11364696B2 (en) | 2020-09-18 | 2022-06-21 | Johnson & Johnson Vision Care, Inc | Apparatus for forming an ophthalmic lens |
| CN113475529B (zh) * | 2021-06-15 | 2022-04-19 | 四川省农业科学院植物保护研究所 | 一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991000012A1 (en) * | 1989-06-28 | 1991-01-10 | Imperial Chemical Industries Plc | Microbes for controlling pests |
-
1991
- 1991-07-11 GB GB919115011A patent/GB9115011D0/en active Pending
-
1992
- 1992-07-07 IE IE221892A patent/IE922218A1/en not_active IP Right Cessation
- 1992-07-09 US US08/178,294 patent/US5527525A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-09 JP JP5502109A patent/JP2927960B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-09 IL IL102451A patent/IL102451A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-07-09 EP EP92915023A patent/EP0598746B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-09 SK SK22-94A patent/SK279691B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1992-07-09 CZ CS9410A patent/CZ285283B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-07-09 AT AT92915023T patent/ATE142845T1/de active
- 1992-07-09 HU HU9400060A patent/HU219857B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-07-09 DE DE69213947T patent/DE69213947T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-09 DK DK92915023.3T patent/DK0598746T3/da active
- 1992-07-09 CA CA002113173A patent/CA2113173C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-09 PT PT100669A patent/PT100669B/pt not_active IP Right Cessation
- 1992-07-09 AU AU22556/92A patent/AU659199B2/en not_active Ceased
- 1992-07-09 ES ES92915023T patent/ES2094362T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-09 PL PL92302033A patent/PL168777B1/pl unknown
- 1992-07-09 WO PCT/GB1992/001248 patent/WO1993000816A1/en active IP Right Grant
- 1992-07-13 NZ NZ243533A patent/NZ243533A/xx not_active IP Right Cessation
- 1992-07-13 TR TR92/0643A patent/TR26297A/xx unknown
-
1996
- 1996-03-29 US US08/625,018 patent/US5849284A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-12-10 GR GR960403370T patent/GR3021953T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0598746A1 (en) | 1994-06-01 |
| SK2294A3 (en) | 1994-09-07 |
| CA2113173A1 (en) | 1993-01-21 |
| NZ243533A (en) | 1993-10-26 |
| CA2113173C (en) | 1999-12-21 |
| SK279691B6 (sk) | 1999-02-11 |
| ATE142845T1 (de) | 1996-10-15 |
| DK0598746T3 (cs) | 1997-03-24 |
| DE69213947T2 (de) | 1997-02-20 |
| HU219857B (hu) | 2001-08-28 |
| ES2094362T3 (es) | 1997-01-16 |
| WO1993000816A1 (en) | 1993-01-21 |
| TR26297A (tr) | 1995-03-15 |
| EP0598746B1 (en) | 1996-09-18 |
| PT100669B (pt) | 1999-06-30 |
| US5527525A (en) | 1996-06-18 |
| GR3021953T3 (en) | 1997-03-31 |
| PL168777B1 (pl) | 1996-04-30 |
| HU9400060D0 (en) | 1994-05-30 |
| JP2927960B2 (ja) | 1999-07-28 |
| CZ1094A3 (en) | 1994-07-13 |
| AU2255692A (en) | 1993-02-11 |
| PT100669A (pt) | 1994-01-31 |
| GB9115011D0 (en) | 1991-08-28 |
| US5849284A (en) | 1998-12-15 |
| DE69213947D1 (de) | 1996-10-24 |
| IE922218A1 (en) | 1993-01-13 |
| IL102451A (en) | 1998-01-04 |
| AU659199B2 (en) | 1995-05-11 |
| IL102451A0 (en) | 1993-01-14 |
| HUT69629A (en) | 1995-09-28 |
| JPH06509091A (ja) | 1994-10-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5849284A (en) | Biological control of molluscs with dauer larvae of Phasmarhabditis nematodes | |
| Wilson et al. | The rhabditid nematode Phasmarhabditis hermaphrodita as a potential biological control agent for slugs | |
| JPH05505591A (ja) | 殺線虫菌剤 | |
| CN107549120B (zh) | 一种蝙蛾的人工饲养方法及其幼虫饲料配方 | |
| Steiner et al. | The possibility of control of Heterodera radicicola and other plant-injurious nemas by means of predatory nemas, especially by Mononchus papillatus Bastian | |
| JP2949218B2 (ja) | 菌食性線虫アフェレンクス・アベネの大量生産法 | |
| Morales-Ramos et al. | Production of hymenopteran parasitoids | |
| NZ234241A (en) | Acaricidal compositions, bacillus strain, process for preparing acaricidally active agent, mixed micropopulation and treatment of honey bees | |
| EP0303673A1 (en) | A method of controlling nematode infection in animals and a composition therefor | |
| Wilson | A nematode parasite for biological control of slugs | |
| LEATHERJACKET | in the Department | |
| Lam | Effect of some nematodes and microorganisms on the leatherjacket, Tipula paludosa Meig. larvae, and their potential use as biological control agents.- | |
| JPH11266769A (ja) | 菌食性線虫アフェレンクス・アベネによる土壌病害虫の予防法 | |
| JPH11266740A (ja) | 菌食性線虫アフェレンクス・アベネの長期保存法 | |
| Bode | The codling moth, Laspeyresia pomonella (Lepidoptera: Olethreutidae): effects of an introduced granulosis virus on a field population and laboratory rearing on artificial diets | |
| Taylor | Bioassay systems for evaluating effectiveness of pesticides and biological control agents against Bradysia impatiens (Johan.)(Diptera: Sciaridae) larvae with emphasis on age, sex, and generation effects | |
| Poinar | Techniques for studying entomogenous nematodes | |
| Mramba | Ecological and public health aspects of stable flies (Diptera: muscidae): microbial interactions | |
| Koontz | Biological and ecological relationships of the fungus, Entomophthora coronata (Constantin) Kevorkian, and the garden symphylan, Scutigerella immaculata (Newport) | |
| Revelo | Effects of Bacillus thuringiensis on some corn lepidoptera under tropical conditions | |
| Bonner | Ecology and physiology of the aphid pathogenic fungus erynia neoaphidis | |
| Hyder | Management strategies for soil-borne pathogens in greenhouse production systems | |
| Pinheiro | Class amphibia (amphibians): frogs, toads | |
| Sivik | An investigation of the biology and control of the Gray Garden Slug, Deroceras reticulatum (Müller). | |
| GAUR et al. | DIVISION OF ANIMAL GENETICS IVRI, IZATNAGAR 243 122 (UP) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20120709 |