KR101952542B1 - 담체 배지를 이용한 곤충병원성 선충의 배양방법 또는 이를 이용한 해충 방제 방법 - Google Patents

담체 배지를 이용한 곤충병원성 선충의 배양방법 또는 이를 이용한 해충 방제 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 담체 배지를 이용한 곤충병원성 선충의 배양방법 또는 이를 이용한 해충의 방제 방법에 관한 것이다. 상기 방법에 적용된 효모추출물, 대두분, 전지분유, 올리브유, 난황분 및 담체를 주요성분으로 함유하는 배지를 사용하여 해충에 대한 살충력이 우수한 선충을 안정적으로 증식시킬 수 있는 배양이 가능하기에, 각종 작물과 화훼류에 대한 친환경적인 방제를 용이하게 수행할 수 있다.

Description

담체 배지를 이용한 곤충병원성 선충의 배양방법 또는 이를 이용한 해충 방제 방법 {The method for culturing entomopathogenic nematode using carrier medium or method for controlling insect pests using the same}
본 발명은 담체 배지를 이용한 곤충병원성 선충의 배양방법 또는 이를 이용한 해충의 방제 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 효모추출물, 대두분, 전지분유, 올리브유, 난황분 및 담체를 주요성분으로 함유하는 담체 배지를 사용하여 해충에 대한 살충력이 우수한 선충을 안정적으로 증식시킬 수 있는 배양방법 및 이를 이용한 다양한 식물류 대상의 해충 방제방법에 관한 것이다.
스타이너네마 칼포캡시(Steinernema carpocapsae)는 측미선구강 원충목에 속하는 곤충병원성 선충(entomopathogenic nematode, EPN)으로 장내에 공생세균을 가지고 있으며, 선충이 대상 해충의 자연 개구부(입, 항문, 기문 등)를 통하여 혈강으로 침입했을 때, 선충의 장속에서 공생세균이 분리되어 나와 곤충 독소물질과 항생물질을 분비하고 대상 곤충의 패혈증을 유도함으로써 살충효과를 발휘한다. 스타이너네마 칼포캡시의 공생세균으로는 주로 제노하브더스 속(Xenorhabdus sp.) 균주가 우세하게 자라며, 이 중의 하나인 제노하브더스 네마토필러스(Xenorhabdus nematophilus)가 살충효과가 우수한 것으로 알려져 있다. 이러한 공생균주는 선충의 증식에 필요한 영양분을 제공하기도 한다.
곤충병원성 선충인 스타이너네마 칼포캡시는 기주범위도 다양하여 토양에 서식하는 나비목, 딱정벌레목, 파리목 및 벼룩목 유충의 살충에 효과적이다. 특히 나비목 중에는 목화바둑명나방, 잔디밤나방, 미국흰불나방, 파밤나방, 이화명나방, 파밤나방, 담배거세미나방 등에 살충 효과가 있고, 딱정벌레목인 소나무뿔나무좀, 풍뎅이류인 녹색콩풍뎅이, 주둥무늬차색풍뎅이, 등얼룩풍뎅이 그리고 파리류인 작은뿌리파리, 긴수염버섯파리 등에 대해서도 우수한 살충 효과가 입증된 바 있다.
또한, 스타이너네마 칼포캡시는 24~48시간 안에 해충을 치사시키는 빠른 살충력, 뛰어난 기주탐색력 등을 가지고 있으며, 인축에 무해하고, 환경이나 생태에 부작용이 없으며, 다른 약재와 일반적으로 혼용살포가 가능하기 때문에 병해충 종합관리(IPM)를 위한 대안으로 부각되고 있다.
한편, 이런 곤충병원성 선충인 스타이너네마 칼포캡시를 생물학적 방제수단 및 IPM의 대안으로 충족시켜 주기 위해서는 선충의 대량배양이 필수적이다.
이전의 많은 연구자들은 여러 가지 재료와 방법으로 선충의 대량배양을 시도하였다. 예를 들어, 한천배지, 스티로폼 조각 등을 이용한 고체배양법과 액상의 성분과 여러 설비를 이용한 액체배양법 등이 연구되었지만, 낮은 생산수율, 값비싼 배지성분과 설비비용, 불안정한 제형화, 낮은 살충력 등으로 산업화에는 많은 문제가 있었다.
본 발명의 발명자들은 이를 해결하고자 노력한 결과, 특별한 설비를 갖추지 않아도 담체(스폰지)가 포함된 배지를 이용하여 기존에 이용하던 고체배양법과 액체배양법보다 안정적이고 효율적으로 스타이너네마 칼포캡시를 배양할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
대한민국 등록특허 제10-0390535호 (발명의 명칭 : 곤충병원성 선충 배양용 배지 및 그를 이용한 선충의 대량배양방법, 출원인 : 박재성 외 1인, 등록일 : 2003년06월25일) 대한민국 등록특허 제10-1187936호 (발명의 명칭 : 스타이너네마 칼포캡시의 배양방법, 출원인 : (주)에코윈, 등록일 : 2012년09월26일) 대한민국 등록특허 제10-0882013호 (발명의 명칭 : 곤충병원성 선충의 배양방법 및 배양조, 출원인 : 구경본 외 1인, 등록일 : 2009년02월04일)
김형환 외 4명, Steinernematid와 Heterorhabditid 곤충병원성 선충을 이용한 담배거세미나방(Spondoptera litura)의 생물적 방제, 한국응용곤충학회지, 2008, vol.47, no.4, 447-456. 추호열 외 4명, 온도 및 농도가 곤충병원성 선충, Steinernema carpocapsae 포천 계통(Nematoda: Steinernematidae)의 병원성과 증식에 미치는 영향, 2002, vol.41, no.4, 269-277. 강영진 외 5명, 곤충병원성 선충을 이용한 잔디밤나방, Spodoptera depravata (Butler) (나비목: 밤나방과)의 생물적 방제, 2004, vol.43, no.1, 61-70.
본 발명의 목적은 담체 배지를 이용한 곤충병원성 선충의 배양방법 또는 이를 이용한 해충의 방제 방법을 제공하는 데에 있다. 더욱 상세하게는 본 발명의 목적은 효모추출물, 대두분, 전지분유, 올리브유, 난황분 및 담체를 주요성분으로 함유하는 담체 배지를 사용하여 해충에 대한 살충력이 우수한 선충을 안정적으로 증식시킬 수 있는 배양방법 및 이를 이용한 다양한 식물류 대상의 해충 방제방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 담체 배지를 이용한 곤충병원성 선충의 배양방법에 관한 것이다.
보다 자세하게는, (제1단계) 효모추출물, 대두분, 전지분유, 올리브유, 난황분, 담체 및 물이 포함된 배지를 제조하는 단계;
(제2단계) 상기 제1단계의 배지에 공생균주를 접종하고 배양하는 단계; 및
(제3단계) 공생균주가 배양된 제2단계의 배지에 곤충병원성 선충을 접종하는 단계;를 포함하는 배양방법에 관한 것이다.
상기 제1단계의 배지에 포함되는 담체로는 스폰지를 사용할 수 있다.
상기 제1단계의 배지에 꿀벌부채명나방, 장수풍뎅이 및 갈색거저리로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택되는 곤충 유충이 추가될 수 있다.
상기 제2단계에서, 공생균주는 제노하브더스 베딩기(Xenorhabdus beddingii), 제노하브더스 네마토필라(Xenorhabdus nematophila), 포토하브더스 루미너선스(Photorhabdus luminescens), 포토하브더스 루미너선스 subsp. 루미너선스(Photorhabdus luminescens subsp. luminescens)로 이루어진 군 중에서 선택된 것일 수 있다.
상기 제2단계에서, 공생균주는 NB 배지(Nutrient broth)에 배양된 것을 특징으로 한다.
상기 NB 배지에는 염화나트륨(NaCl)이 0.5~2 중량%로 첨가될 수도 있다.
이 때, 상기 제3단계에서 선충 농도 4000~5000마리/g이 되도록 곤충병원성 선충을 접종하고, 12~15일 동안 배양할 수 있다.
상기 제3단계에서 접종되는 곤충병원성 선충은 스타이너네마 칼포캡시(Steinernema carpocapsae), 스타이너네마 글라이제리(Steinernema glaseri), 스타이너네마 롱지카우둠(Steinernema longicaudum), 스타이너네마 몬티콜룸(Steinernema monticolum), 스타이너네마 샴카야(Steinernema siamkayai), 헤테로라브디티스 sp. 경산(Heterorhabditis sp. Gyeongsan) 및 헤테로라브디티스 박테리오포라(Heterorhabditis bacteriophora)로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 방법으로 배양된 곤충병원성 선충의 배양액을 제공한다.
이 때, 상기 배양액을 방제대상 식물에 살포하여 해충을 방제할 수 있는 방법을 제공한다. 즉, 본 발명의 배양법을 통해 얻은 선충 또는 이의 배양액을 수확(수거)함으로써, 상기 선충 또는 이의 배양액을 식물에 처리하여 해충을 방제할 수 있는 방법을 제공한다.
상기 방제대상 식물은 과채류 식물, 엽채류 식물 및 화훼류 식물로부터 선택되는 식물일 수 있으며, 상기 해충은 인시류 해충 또는 풍뎅이류 해충일 수 있다.
이하 본 발명을 보다 자세히 설명한다.
상기 제1단계의 배지에 포함되는 난황분은 각 조류의 알로부터 채취한 난황을 분말화 한 것으로서, 닭, 메추라기, 오리 등의 가금류 알로부터 얻을 수 있다. 바람직하게는 달걀의 난황분을 사용할 수 있다.
상기 제1단계의 배지는, 효모추출물 0.5~5 중량%, 대두분 10~25 중량%, 전지분유 1~5 중량%, 올리브유 2.5~10 중량%, 난황분 2.5~10 중량%, 담체 8~12 중량% 및 물 40~73 중량%가 포함된 것을 멸균한 것일 수 있는데, 이렇게 적용된 배지를 통해 선충의 살충력을 80% 이상이 되게 할 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 상기 제1단계의 배지는, 효모추출물 1~5 중량%, 대두분 20~25 중량%, 전지분유 3~5 중량%, 올리브유 5~10 중량%, 난황분 5~10 중량%, 담체 8~12 중량% 및 물 40~55 중량%가 포함된 것을 멸균한 것일 수 있고, 이렇게 적용된 배지를 통해 선충의 살충력을 85% 이상이 되게 할 수 있다. 다만, 이러한 조건에서 물의 함량은 이 외의 다른 성분을 추가할 경우, 필요에 따라 조절할 수 있어 이 범위를 벗어나도 선충의 배양이 크게 저해되지 않는다. 이외의 각 배지의 구성성분은 상기에 개시된 함량 미만으로 포함될 경우 선충의 생산수율이 낮을 수 있으며 생산수율이 높더라도 살충력이 떨어질 수 있다. 또한 함량 초과로 각 성분이 배지에 포함되더라도 생산수율이나 살충력이 더 이상 증대되지 않아 비효율적일 수 있고, 오히려 선충의 생산수율이나 살충력이 감소될 수 있어 바람직하지 않다. 생산수율이 증가한다 하더라도 살충력이 낮은 경우는 선충 내의 공생균주의 생육이 원활하지 않기 때문이다.
상기 담체는 스폰지인 것을 특징으로 하며 배지에서 산소가 원활히 공급될 수 있게 한다.
상기 스폰지의 소재는 해면류로부터 얻은 천연 스폰지를 사용할 수도 있고, 천연라텍스, 합성라텍스, 각종 합성수지, 폴리우레탄, 알긴산, 폴리실록산 소재의 실리콘고무 등의 통상적인 고분자 소재로 제조된 것이라면 사용가능하며, 폴리우레탄 소재의 스폰지를 사용하는 것이 가장 좋다. 상기 스폰지가 갖는 기공 또는 밀도는 통상적인 형태의 스폰지라면 선충 배양에 크게 제한되지는 않는다.
상기 스폰지는 사방이 0.5~4cm의 지름 또는 길이를 갖는 구 또는 다면체인 것을 특징으로 한다. 상기 지름 또는 길이가 0.5cm 미만일 경우 선충이 담체 내에 머무르기에 적합하지 않으며, 4cm를 초과할 경우 스폰지의 내부 깊이까지 산소 전달이 잘 되지 않을 수 있어 바람직하지 않다.
상기 제1단계의 배지 제조시, 효모추출물, 대두분, 전지분유, 올리브유, 난황분, 담체 및 물을 혼합한 혼합물을 고압증기 멸균기에서 120~130℃ 및 1.1~1.5 기압 하에서 15~30분간 멸균할 수 있다.
상기 제1단계의 배지에 꿀벌부채명나방, 장수풍뎅이 및 갈색거저리로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택되는 곤충 유충이 추가될 수 있는데, 이 때, 상기 배지의 멸균 전, 각 배지 구성성분을 전체 100 중량% 기준으로 할 때, 각 곤충이 2~7 중량%가 포함될 수 있다.
상기 곤충은 2령 또는 3령 유충인 것을 사용하는 것이 좋고, 바람직하게는 3령 유충인 것이 더 좋다. 상기 배지에 포함되는 곤충은 생것 상태로 이용하는 것이 가장 바람직하나, 이를 건조, 가열 등의 방법으로 가공한 것을 사용하거나 건조, 가열 등의 처리 후에 다시 분말화하는 과정을 통해 사용하는 것도 바람직하다.
상기 제2단계에서, 공생균주는 NB 배지(Nutrient broth)에 배양된 것을 특징으로 한다. 이를 위해 NB 배지를 준비하고, 상기 NB 배지에 공생균주의 전배양액을 1.0 x 105 내지 1.0 x 109 cfu/ml로 NB 배지에 0.001~1 중량%로 접종한 후 0.5~3일간, 바람직하게는 1~3일간, 더 바람직하게는 1~2일간 배양한 후 배양액을 얻을 수 있는데, 상기 제2단계에서는 이 배양액 상태로 제1단계의 배지에 접종할 수 있다. 또한 상기 제2단계에서, 이 조건에서의 제1단계의 배지에 접종된 공생균주의 배양시간은 24시간~72시간이 적절하며 더 바람직하게는 48~72시간이 적절하다.
상기 NB 배지는 peptone 4~6 g, beef extract 1~5 g을 증류수에 녹여 총 부피 1ℓ, pH 6.8~7.4 상태로 조절된 것을 멸균하여 제조된 것일 수 있다. 멸균 조건은 120~130℃에서 1.1~1.5기압에서 15~30 분간 멸균할 수 있다. 상기 NB 배지에는 염화나트륨(NaCl)이 0.5~2 중량%로 첨가될 수도 있다. 이 조건에서 염화나트륨이 NB 배지에 0.5 중량% 미만으로 포함되는 것은 공생균주의 성장에 별다른 영향을 미치지 않으며, NaCl이 2 중량%를 초과하게 되면 염농도가 너무 높아 공생균주의 생육이 오히려 저하된다.
또한 제2단계에서, 공생균주를 제1단계의 배지에 접종시 배양액 상태로 첨가하는 것이 좋은데, 이 때, 공생균주의 배양액은 제1단계의 배지 100 중량부 기준으로 10~20 중량부가 첨가될 수 있다.
상기 제3단계에서, 공생균주가 배양된 배지에 곤충병원성 선충을 4000~5000마리/g의 농도로 접종하고 25~28℃에서 6~21일간 배양하는 것이 좋으며, 바람직하게는 12~15일간 배양하는 것이 좋다.
본 발명의 배양법에 적합한 상기 곤충병원성 선충은 기존에 곤충병원성 특성이 알려진 선충이라면 크게 제한되지는 않으나, 바람직하게는 스타이너네마 칼포캡시(Steinernema carpocapsae), 스타이너네마 글라이제리(Steinernema glaseri), 스타이너네마 롱지카우둠(Steinernema longicaudum), 스타이너네마 몬티콜룸(Steinernema monticolum), 스타이너네마 샴카야(Steinernema siamkayai), 헤테로라브디티스 sp. 경산(Heterorhabditis sp. Gyeongsan) 및 헤테로라브디티스 박테리오포라(Heterorhabditis bacteriophora)로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있고, 더 바람직하게는 스타이너네마 칼포캡시(Steinernema carpocapsae) 또는 헤테로라브디티스 박테리오포라(Heterorhabditis bacteriophora)에서 선택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 스타이너네마 칼포캡시(Steinernema carpocapsae)가 선택될 수 있다.
본 발명에서 배양된 곤충병원성 선충의 배양액을 이용할 수 있는 방제대상 식물은 크게 제한되지 않으나, 바람직하게는 과채류 식물, 엽채류 식물 및 화훼류 식물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 과채류 식물은 고추(Capsicum annuum), 가지(Solanum melongena), 호박(Cucurbita spp.), 오이(Cucumis sativus), 토마토(Solanum lycopersicum), 수박(Citrullus vulgaris), 참외(Cucumis melo), 멜론(Cucumis melo), 완두(Pisum sativum) 및 딸기(Fragaria spp.)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 엽채류 식물은 배추(Brassica rapa), 상추(Lactuca sativa), 쑥갓(Chrysanthemum coronarium), 셀러리(Apium graveolens), 미나리(Oenanthe javanica) 및 양배추(Brassica oleracea)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 화훼류 식물은 장미(Rosa hybrida), 국화(Chrysanthemum morifolium), 백합(Lilium longiflorum), 안개꽃(Gypsophila elegans Bieb), 수국(Hydrangea macrophylla), 군자란(Clivia miniata), 데이지(Bellis perennis), 봉선화(Impatiens balsamina) 및 아스파라거스(Asparagus officinalis)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명의 방제방법에서 방제대상 해충은 크게 제한되지 않으나, 바람직하게는 인시류 해충 또는 풍뎅이류 해충일 수 있으며, 인시류 해충은 거세미나방(Agrotis segetum), 배추흰나비(Artogeia rapae), 검은무늬밤나방(Autographa nigrisigna), 복숭아명나방(Dichocrocis punctiferalis), 미국흰불나방(Hyphanria cunea), 흰띠명나방(Hymenia recurvalis), 도둑나방(Mamestra brassicae), 목화바둑명나방(Palpita indica), 배추좀나방(Plutella xylostella), 파밤나방(Spodoptera exigua), 담배거세미나방(Spodoptera litura) 및 꿀벌부채명나방(Galleria mellonella)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 풍뎅이류 해충은 등얼룩풍뎅이(Blitopertha orientalis) 또는 밤바구미(Curculio sikkimensis)에서 선택될 수 있다.
본 발명은 담체 배지를 이용한 곤충병원성 선충의 배양방법 또는 이를 이용한 해충의 방제 방법에 관한 것이다. 상기 방법에 적용된 효모추출물, 대두분, 전지분유, 올리브유, 난황분 및 담체를 주요성분으로 함유하는 배지를 사용하여 해충에 대한 살충력이 우수한 선충을 안정적으로 증식시킬 수 있는 배양이 가능하기에, 각종 작물과 화훼류에 대한 친환경적인 방제를 용이하게 수행할 수 있다.
대한민국 등록특허 제10-0390535호, 대한민국 등록특허 제10-1187936호, 대한민국 등록특허 제10-0882013호 등에도 곤충병원성 선충의 다양한 배양 방법이 개시되어 있기는 하지만 본 발명에서처럼 배양초기부터 스폰지를 이용한 담체배지에서 곤충병원성 선충을 배양할 수 있는 최적조건을 개시한 선행기술은 확인되지 않는다. 본 발명자들의 예비 실험에 따르면 이러한 선행기술과 같이 액체배양만으로는 선충에 산소공급이 원활히 되지 않아 배양이 매우 어렵고 아가로오스 배지 등에서도 대량배양이 잘 되지 않음이 확인된다. 한편, 배양이 완료된 곤충병원성 선충 배양액을 스폰지에 침지시켜 판매하기도 하지만, 배양초기부터 스폰지를 담체로 이용하여 배양한 기술은 아직 공지된 바 없다. 또한 이렇게 기배양된 선충의 배양액을 스폰지에 침지시키더라도 본 발명의 방법으로 담체배양된 것과 비교하여 선충의 살충력이 증가되지는 않기에 배양시작부터 스폰지 담체를 이용한 본 발명의 기술적 특징이 강조된다 할 수 있다.
도 1은 본 발명의 곤충병원성 선충의 배양방법을 사진으로 나열한 것으로서, 담체 배지를 제조하고, 공생균주와 곤충병원성 선충을 접종 및 배양한 후, 선충의 배양상태를 현미경으로 확인하는 과정을 대략적으로 나타낸다.
도 2는 선충 배양용 배지 내에 포함되는 효모 추출물의 농도별 최종 수득된 선충의 수율 및 살충력을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 선충 배양용 배지 내에 포함되는 대두분의 농도별 최종 수득된 선충의 수율 및 살충력을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 선충 배양용 배지 내에 포함되는 전지분유의 농도별 최종 수득된 선충의 수율 및 살충력을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 선충 배양용 배지 내에 포함되는 올리브유의 농도별 최종 수득된 선충의 수율 및 살충력을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 선충 배양용 배지 내에 포함되는 난황분의 농도별 최종 수득된 선충의 수율 및 살충력을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 선충 배양용 배지 내에 포함되는 담체의 농도별 최종 수득된 선충의 수율 및 살충력을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 선충 배양용 배지에 접종되는 공생균주의 배양 시간별 최종 수득된 선충의 수율 및 살충력을 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 선충 배양용 배지에 접종되는 선충의 접종 농도별 최종 수득된 선충의 수율 및 살충력을 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 선충 배양용 배지에 선충을 접종 후 배양액을 수거(수확)하는 시기별 최종 수득된 선충의 수율 및 살충력을 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 선충 배양용 배지에 첨가하기 위한 공생균주의 NB(Nutrient broth) 배양액 제조 시, NaCl의 첨가 유무에 따른 공생균주의 배양조건을 확인한 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위하여 제시된 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1. 곤충병원성 선충 배양을 위한 담체배지의 최적 배지조건 확립>
실시예 1-1. 곤충병원성 선충 배양용 기본 배지 제조
곤충병원성 선충을 배양하기 위한 최적 배지조성을 확립하기 위해 기본배지 조성을 하기 표 1과 같이 제시하였고 표 2 이후에는 이 기본배지 조성에서 실험대상 성분만을 농도별로 처리하거나 대체성분으로 교체하여 배지를 제조하였다.
담체 배지의 구성성분 함량 (g)
효모추출물 (Yeast extract) 1
대두분 (Soy flour) 15
전지분유 (Whole milk powder) 2
올리브유 (Olive oil) 2.5
난황분 (Egg yolk) 2.5
담체 (스폰지) 8
물 69
이렇게 1,000ml 삼각플라스크에 표 1(또는 추가/대체되는 성분 포함)의 조성으로 배지 성분을 혼합하고 고압증기멸균기에서 121℃, 1.2 기압으로 15분 동안 멸균한 후 식혀 사용하였다.
제조된 배지에 공생균주인 제노하브더스 네마토필러스(Xenorhabdus nematophila)의 NB 배양액을 15g 접종한 후 2일간 배양하고 곤충병원성 선충인 스타이너네마 칼포캡시(Steinernema carpocapsae)를 4000마리/g로 접종 후 25℃에서 12일간 배양하였다. 이 때 제노하브더스 네마토필러스의 NB 배양액은 예비실험 결과를 통해 배양효율이 더 좋고 이를 통해 선충의 살충력을 높이는 것으로 확인된 조건인 NaCl이 0.5 중량% 포함된 NB 배지에 배양된 것을 사용하였다.
생산 수율은 곤충병원성 선충 접종 후 배양 12일 째에 삼각플라스크에서 수확하고, 삼각플라스크 당 수확량을 광학현미경을 이용하여 조사하였다. 살충력은 직경 90mm 페트리디쉬(Petri dish)에 필터페이퍼(Filter paper)를 깔고 꿀벌부채명나방 3령 유충에 곤충병원성 선충을 접종하고, 48시간이 지난 뒤에 사멸율을 조사하여 측정하였다.
실시예 1-2. 효모추출물 첨가농도에 따른 곤충병원성 선충의 생산 수율 및 살충력 확인
동물성 단백질원인 효모추출물(Yeast extract)이 곤충병원성 선충(Steinernema carpocapsae)의 생산 수율 및 살충력에 미치는 영향에 대해 확인하였다.
이를 위해 표 1의 기본배지 조건에 효모추출물(Yeast extract)의 농도 0, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 중량%로 조절하여 제조한 배지에 공생균주(Xenorhabdus nematophila) 및 곤충병원성 선충(Steinernema carpocapsae)을 순차적으로 접종 및 배양하여(다른 배양조건은 실시예 1-1과 동일), 상기 선충의 생산 수율을 확인하고, 이렇게 배양된 선충의 배양액이 갖는 살충력을 측정하였으며, 이에 대한 결과는 표 2와 도 2에 나타내었다(표 1의 조건에서 조절되는 함량만큼 물의 양 조절, 이하 동일).
Yeast extract
(중량%)		 생산수율 (×105 선충수 / 배지 g당) 살충력 (%)
횟수 각 회차별 평균 횟수 각 회차별 평균
0 1 0.41 0.36 1 56 58
2 0.35 2 58
3 0.33 3 60
0.5 1 1.35 1.31 1 80 82
2 1.25 2 84
3 1.33 3 82
1.0 1 2.11 2.08 1 90 89.3
2 2.08 2 90
3 2.05 3 88
2.0 1 3.62 3.68 1 98 99.3
2 3.54 2 100
3 3.88 3 100
5.0 1 3.70 3.62 1 96 98
2 3.64 2 100
3 3.52 3 98
표 2와 도 2을 참고하면, 배지에 포함되는 효모 추출물의 최적 함량은 바람직하게는 0.5~5.0 중량%, 더 바람직하게는 1.0~5.0 중량%인 것으로 확인되고, 효모 추출물이 배지에 2 중량% 첨가될 때 생산 수율과 살충력이 가장 높은 것을 알 수 있다. 효모 추출물이 5.0 중량%를 초과하게 되면 선충의 생산 수율이 더 급격하게 떨어져 배양이 오히려 잘 되지 않았기에 실험을 더 이상 수행하지 않았다.
실시예 1-3. 대두분 첨가농도에 따른 곤충병원성 선충의 생산 수율 및 살충력 확인
식물성 단백질원인 대두분(Soy flour)이 곤충병원성 선충(Steinernema carpocapsae)의 생산 수율 및 살충력에 미치는 영향에 대해 확인하였다.
이를 위해 표 1의 기본배지 조건에 대두분의 첨가농도를 0, 5, 10, 15, 20, 25 중량%로 조절하여 제조한 배지에 공생균주(Xenorhabdus nematophila) 및 곤충병원성 선충(Steinernema carpocapsae)을 순차적으로 접종 및 배양하여(다른 배양조건은 실시예 1-1과 동일), 상기 선충의 생산 수율을 확인하고, 이렇게 배양된 선충의 배양액이 갖는 살충력을 측정하였으며, 각 결과는 표 3과 도 3에 나타내었다.
Soy flour
(중량%)		 생산수율 (×105 선충수 / 배지 g당) 살충력 (%)
횟수 각 회차별 평균 횟수 각 회차별 평균
0 1 0.51 0.43 1 60 60
2 0.45 2 62
3 0.34 3 58
5 1 0.89 0.96 1 74 72
2 1.07 2 70
3 0.94 3 72
10 1 1.46 1.57 1 86 84
2 1.62 2 82
3 1.64 3 84
15 1 2.08 2.10 1 90 92
2 2.10 2 94
3 2.13 3 92
20 1 3.58 3.46 1 98 99.3
2 3.34 2 100
3 3.46 3 100
25 1 3.32 3.33 1 98 98.7
2 3.35 2 100
3 3.44 3 98
표 3 및 도 3과 같이, 배지에 포함되는 대두분의 최적 함량은 바람직하게는 10~25 중량%, 더 바람직하게는 20~25 중량%인 것으로 확인되고, 대두분이 배지에 20 중량% 첨가될 때 생산 수율과 살충력이 가장 높은 것을 알 수 있다. 대두분이 25 중량%를 초과하게 되면 선충의 생산 수율이 더 급격하게 떨어져 배양이 오히려 잘 되지 않았기에 실험을 더 이상 수행하지 않았다.
실시예 1-4. 전지분유 첨가농도에 따른 곤충병원성 선충의 생산 수율 및 살충력 확인
동물성 단백질원인 전지분유(Whole milk powder)의 농도가 곤충병원성 선충(Steinernema carpocapsae)의 생산 수율 및 살충력에 미치는 영향을 확인하였다.
표 1의 기본배지 조건에 전지분유의 첨가농도를 0, 1, 2, 3, 4, 5 중량%로 조절하여 제조한 배지에 공생균주(Xenorhabdus nematophila) 및 곤충병원성 선충(Steinernema carpocapsae)을 순차적으로 접종 및 배양하여(다른 배양조건은 실시예 1-1과 동일), 상기 선충의 생산 수율을 확인하고, 이렇게 배양된 선충의 배양액이 갖는 살충력을 측정하였으며, 그 결과는 표 4와 도 4에 나타내었다.
Whole milk powder
(중량%)		 생산수율 (×105 선충수 / 배지 g당) 살충력 (%)
횟수 각 회차별 평균 횟수 각 회차별 평균
0 1 0.43 0.41 1 62 60
2 0.40 2 64
3 0.41 3 54
1 1 1.46 1.4 1 78 80
2 1.23 2 82
3 1.51 3 80
2 1 2.34 2.38 1 92 90.7
2 2.43 2 86
3 2.38 3 94
3 1 3.52 3.42 1 100 99.3
2 3.34 2 100
3 3.41 3 98
4 1 3.23 3.29 1 100 98.7
2 3.28 2 98
3 3.36 3 98
5 1 3.16 3.17 1 96 97.3
2 3.14 2 98
3 3.21 3 98
표 4 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 배지에 포함되는 전지분유의 최적 함량은 바람직하게는 1~5 중량%, 더 바람직하게는 3~5 중량%인 것으로 확인되고, 전지분유가 배지에 3 중량% 첨가될 때 생산 수율과 살충력이 가장 높은 것을 알 수 있다. 전지분유가 5 중량%를 초과하게 되면 선충의 생산 수율이 더 급격하게 떨어져 배양이 오히려 잘 되지 않았기에 실험을 더 이상 수행하지 않았다.
실시예 1-5. 올리브유 첨가농도에 따른 곤충병원성 선충의 생산 수율 및 살충력 확인
식물성 지방원인 올리브유(Olive oil)가 곤충병원성 선충(Steinernema carpocapsae)의 생산 수율 및 살충력에 미치는 영향에 대해 확인하였다.
이를 위해 이를 위해 표 1의 기본배지 조건에 올리브유의 첨가농도를 0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0 중량%로 조절하여 제조한 배지에 공생균주(Xenorhabdus nematophila) 및 곤충병원성 선충(Steinernema carpocapsae)을 순차적으로 접종 및 배양하여(다른 배양조건은 실시예 1-1과 동일), 상기 선충의 생산 수율을 확인하고, 이렇게 배양된 선충의 배양액이 갖는 살충력을 측정하였으며, 각 결과는 표 5와 도 5에 나타내었다.
Olive oil
(중량%)		 생산수율 (×105 선충수 / 배지 g당) 살충력 (%)
횟수 각 회차별 평균 횟수 각 회차별 평균
0 1 0.45 0.41 1 58 60.7
2 0.37 2 58
3 0.42 3 66
2.5 1 2.21 2.08 1 86 88
2 2.05 2 90
3 1.98 3 88
5.0 1 3.54 3.56 1 100 99.3
2 3.53 2 100
3 3.61 3 98
7.5 1 3.25 3.32 1 98 99.3
2 3.49 2 100
3 3.23 3 100
10.0 1 3.12 3.10 1 98 98.7
2 3.01 2 100
3 3.17 3 98
표 5와 도 5에 나타낸 바와 같이, 올리브유의 최적 함량은 바람직하게는 2.5~10 중량%, 더 바람직하게는 5~10 중량%인 것으로 확인되고, 올리브유가 배지에 5 중량% 첨가될 때 생산 수율과 살충력이 가장 높은 것을 알 수 있다. 올리브유가 10 중량%를 초과하게 되면 선충의 생산 수율이 더 급격하게 떨어져 배양이 오히려 잘 되지 않았기에 실험을 더 이상 수행하지 않았다.
실시예 1-6. 난황분 첨가농도에 따른 곤충병원성 선충의 생산 수율 및 살충력 확인
동물성 단백질원인 난황분(Egg yolk)이 곤충병원성 선충(Steinernema carpocapsae)의 생산 수율 및 살충력에 미치는 영향에 대해 확인하였다.
이를 위해 이를 위해 표 1의 기본배지 조건에 난황분의 첨가농도를 0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0 중량%로 조절하여 제조한 배지에 공생균주(Xenorhabdus nematophila) 및 곤충병원성 선충(Steinernema carpocapsae)을 순차적으로 접종 및 배양하여(다른 배양조건은 실시예 1-1과 동일), 상기 선충의 생산 수율을 확인하고, 이렇게 배양된 선충의 배양액이 갖는 살충력을 측정하였으며, 그 결과는 표 6과 도 6에 나타내었다.
Egg yolk
(중량%)		 생산수율 (×105 선충수 / 배지 g당) 살충력 (%)
횟수 각 회차별 평균 횟수 각 회차별 평균
0 1 0.37 0.37 1 56 55.3
2 0.39 2 54
3 0.36 3 56
2.5 1 2.17 2.12 1 80 82.7
2 2.21 2 86
3 1.99 3 82
5.0 1 3.52 3.48 1 100 100
2 3.45 2 100
3 3.47 3 100
7.5 1 3.32 3.37 1 100 100
2 3.42 2 100
3 3.38 3 100
10.0 1 3.12 3.09 1 98 98
2 3.04 2 100
3 3.11 3 96
표 6과 도 6에 나타낸 바와 같이, 난황분의 최적 함량은 바람직하게는 2.5~10 중량%, 더 바람직하게는 5~10 중량%인 것으로 확인되고, 난황분이 배지에 5 중량% 첨가될 때 생산 수율과 살충력이 가장 높은 것을 알 수 있다. 난황분이 10 중량%를 초과하게 되면 선충의 생산 수율이 더 급격하게 떨어져 배양이 오히려 잘 되지 않았기에 실험을 더 이상 수행하지 않았다.
실시예 1-7. Oil의 성분 변화에 따른 곤충병원성 선충 생산 수율 및 살충력 확인
표 1의 기본배지 조건에서 오일의 함량을 5 중량%로 조절하고, 각 오일 성분을 올리브유, 콘오일, 팜오일, 피시오일, 라드 및 대두유 중에서 선택하여 제조한 배지에 공생균주(Xenorhabdus nematophila) 및 곤충병원성 선충(Steinernema carpocapsae)을 순차적으로 접종 및 배양하여(다른 배양조건은 실시예 1-1과 동일), 상기 선충의 생산 수율을 확인하고, 이렇게 배양된 선충의 배양액이 갖는 살충력을 측정하였으며, 그 결과를 표 7에 나타내었다.
Oil 성분
(5 중량%)		 생산수율 (×105 선충수 / 배지 g당) 살충력 (%)
횟수 각 회차별 평균 횟수 각 회차별 평균
올리브유 1 2.27 2.23 1 88 86
2 2.21 2 84
3 2.22 3 86
콘오일 1 2.09 2.11 1 80 81.3
2 2.13 2 82
3 2.11 3 82
팜오일 1 1.12 1.07 1 74 75.3
2 1.06 2 76
3 1.03 3 76
피시오일 1 1.37 1.37 1 78 78.6
2 1.41 2 78
3 1.33 3 80
라드 1 1.03 1.07 1 76 75.3
2 1.13 2 74
3 1.05 3 86
대두유 1 2.13 2.10 1 82 80.78
2 2.10 2 80
3 2.07 3 80
표 7에 나타낸 바와 같이, 최적의 생산 수율을 내는 오일 종류는 올리브유였고 콘오일과 대두유는 다음으로 좋은 생산 수율을 보였다. 그 외 팜오일, 피시오일 및 라드에서는 배양은 진행되나 생산 수율이 다른 오일에 비해 낮은 결과를 보였다. 생산 수율이 높은 오일에서 살충력 또한 높게 나오는 것으로 조사되었다. 이 결과를 통해 배양 배지로서 최적의 오일은 올리브유임이 확인된다.
실시예 1-8. 곤충의 성분변화에 따른 곤충병원성 선충 생산 수율 및 살충력 확인
표 1의 기본배지 조건에 살아있는 곤충 유충 3종(노숙 유충 : 꿀벌부채명나방 유충, 장수풍뎅이 유충, 밀웜[갈색거저리 유충])을 선택하여 5 중량%로 추가한 배지에 공생균주(Xenorhabdus nematophila) 및 곤충병원성 선충(Steinernema carpocapsae)을 순차적으로 접종 및 배양하여(다른 배양조건은 실시예 1-1과 동일), 상기 선충의 생산 수율을 확인하고, 이렇게 배양된 선충의 배양액이 갖는 살충력을 측정하였으며, 그 결과를 표 8에 나타내었다.
곤충 성분
(노숙유충)		 생산수율 (×105 선충수 / 배지 g당) 살충력 (%)
횟수 각 회차별 평균 횟수 각 회차별 평균
무첨가 1 2.11 2.12 1 86 83.3
2 2.14 2 82
3 2.12 3 82
꿀벌부채명나방 1 3.51 3.56 1 100 100
2 3.53 2 100
3 3.64 3 100
장수풍뎅이 1 3.27 3.28 1 98 98
2 3.31 2 100
3 3.29 3 96
밀웜 1 3.32 3.29 1 96 92.7
2 3.25 2 92
3 3.28 3 90
표 8에 나타낸 바와 같이, 곤충성분을 첨가하지 않은 것보다는 곤충성분을 첨가한 배지에서 더 높은 생산 수율과 살충력을 보였다. 그 중 꿀벌부채명나방을 추가한 배양에서 높은 생산 수율과 살충력을 보였다. 장수풍뎅이와 밀웜은 생산 수율은 비슷하나 살충력에서는 조금 차이를 나타내었다.
다음으로는 곤충병원성 선충만 헤테로라브디티스 박테리오포라(Heterorhabditis bacteriophora)로 바꾸어 동일한 실험을 수행하여 그 결과를 표 9에 나타내었다.
곤충 성분
(노숙유충)		 생산수율 (×105 선충수 / 배지 g당) 살충력 (%)
횟수 각 회차별 평균 횟수 각 회차별 평균
무첨가 1 2.11 평균
2.13		 1 80 82
2 2.12 2 84
3 2.16 3 82
꿀벌부채명나방 1 3.41 3.36 1 100 99.3
2 3.31 2 98
3 3.36 3 100
장수풍뎅이 1 3.21 3.21 1 98 98.7
2 3.25 2 98
3 3.18 3 100
밀웜 1 3.23 3.21 1 92 92
2 3.16 2 90
3 3.24 3 94
이에 표 9와 같이 선충의 종류가 달라도 곤충 성분의 추가를 통해 선충의 생산수율과 살충력이 증가됨을 확인할 수 있었다.
실시예 1-9. 담체 함량변화에 따른 선충 생산 수율 및 살충력 확인
담체(스폰지) 함량 변화가 곤충병원성 선충의 생산 수율 및 살충력에 미치는 영향에 대해 확인하였다. 표 1의 기본배지 조건에서 담체의 함량을 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 중량%로 조절하여 제조한 배지에 공생균주(Xenorhabdus nematophila) 및 곤충병원성 선충(Steinernema carpocapsae)을 순차적으로 접종 및 배양하여(다른 배양조건은 실시예 1-1과 동일), 상기 선충의 생산 수율을 확인하고, 이렇게 배양된 선충의 배양액이 갖는 살충력을 측정하였으며, 그 결과는 표 10 및 도 7에 나타내었다.
담체 함량
(중량%)		 생산수율 (×105 선충수 / 배지 g당) 살충력 (%)
횟수 각 회차별 평균 횟수 각 회차별 평균
0 1 0 0 1 0 0
2 0 2 0
3 0 3 0
2 1 0.21 0.23 1 38 38.7
2 0.23 2 40
3 0.25 3 38
4 1 1.28 1.28 1 72 74.7
2 1.24 2 78
3 1.32 3 74
6 1 1.25 1.32 1 78 75.3
2 1.34 2 74
3 1.37 3 74
8 1 2.15 2.13 1 86 86.7
2 2.14 2 88
3 2.11 3 86
10 1 2.12 2.11 1 88 86.7
2 2.09 2 86
3 2.12 3 86
12 1 2.09 2.09 1 88 86
2 2.11 2 84
3 2.07 3 86
표 10 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 담체가 전혀 포함되지 않은 배지나 담체가 2중량%로 포함된 배지에서 선충이 배양되었을 경우 산소 공급이 이루어지지 않아 배양이 원활히 진행되는 않는 것으로 확인된다. 또한 원활하지 않은 배양으로 인해 살충력 또한 낮게 나타나는 것으로 조사되었다. 담체 함량이 8 중량%, 10 중량%, 12 중량%에서 높은 생산 수율과 살충력을 관찰할 수 있었으며, 이로 비추어 볼 때 최적의 배양 담체 함량은 8~12 중량%, 가장 바람직하게는 8 중량% 조건에서 선충을 배양하는 것이 좋음을 알 수 있다. 담체 함량이 12 중량%를 초과한 것에서는 선충의 배양이 원활하지 않아 추가 실험은 수행하지 않았다.
<실시예 2. 공생균주 배양시간 및 선충 접종 농도별 생산 수율 및 살충력 확인>
표 1의 기본배지 조건으로 제조한 배지에 공생균주(Xenorhabdus nematophila)를 접종 후 배양시간을 0, 12, 24, 48, 72시간으로 조절하여 배양한 후 곤충병원성 선충(Steinernema carpocapsae)을 배양하였고(다른 배양조건은 실시예 1-1과 동일), 배양시간에 따른 상기 선충의 생산 수율을 확인하고, 이렇게 배양된 선충의 배양액이 갖는 살충력을 측정하였으며, 그 결과를 표 11과 도 8에 나타내었다.
공생균주 배양시간 (hr) 생산수율 (×105 선충수 / 배지 g당) 살충력 (%)
횟수 각 회차별 평균 횟수 각 회차별 평균
0 1 0.14 0.13 1 30 32
2 0.13 2 32
3 0.13 3 34
12 1 0.24 0.24 1 52 53.3
2 0.25 2 54
3 0.23 3 54
24 1 0.75 0.73 1 78 76
2 0.73 2 74
3 0.71 3 76
48 1 2.14 2.15 1 86 86
2 2.19 2 88
3 2.12 3 84
72 1 2.05 2.08 1 82 82.7
2 2.11 2 80
3 2.08 3 86
표 11과 도 8의 결과를 참고하면, 공생균주를 접종하고 동시에 선충을 접종한 배양 조건(공생균주만의 배양시간 0시간)이나 공생균주를 12시간만 배양 후 선충을 접종한 조건에서는 낮은 수율과 살충력을 나타내었다. 이 결과를 통한 적절한 공생균주의 배양시간은 24~72시간이며, 더 바람직하게는 48~72시간으로 확인되며, 가장 좋은 조건은 48시간임을 알 수 있다.
다음으로는 실시예 1-1의 조건에서 곤충병원성 선충(Steinernema carpocapsae)을 접종하는 단계에서 선충의 접종 농도별 생산 수율 및 살충력에 미치는 영향에 대해 조사하였고 그 결과를 표 12와 도 9에 나타내었다.
선충 접종농도
(마리수/g)		 생산수율 (×105 선충수 / 배지 g당) 살충력 (%)
횟수 각 회차별 평균 횟수 각 회차별 평균
500 1 0.26 0.25 1 42 41.3
2 0.22 2 42
3 0.27 3 40
1000 1 0.52 0.50 1 64 64.6
2 0.45 2 64
3 0.54 3 66
2000 1 1.05 0.99 1 72 74.7
2 0.96 2 74
3 0.97 3 78
3000 1 1.05 1.02 1 76 76.7
2 1.03 2 78
3 0.98 3 76
4000 1 2.08 2.09 1 86 84.7
2 2.12 2 82
3 2.07 3 86
5000 1 2.11 2.11 1 88 86
2 2.09 2 84
3 2.13 3 86
표 12와 도 9를 참고하면, 1,000마리/g 미만으로 선충이 접종된 조건에서는 생산 수율이 낮고 살충력도 좋지 않았다. 4,000마리/g 및 5,000마리/g에서 생산 수율이 높고 살충력이 좋아 곤충병원성 선충의 담체배양 시, 4,000~5,000마리/g으로 접종하는 것이 최적임을 알 수 있다. 5,000마리/g을 초과한 조건은 선충의 배양 상태가 더 좋지 않았다.
<실시예 3. 곤충병원성 선충의 접종 후 배양시간에 따른 생산 수율 및 살충력 확인>
표 1의 기본배지 조건에 공생균주(Xenorhabdus nematophila) 및 곤충병원성 선충(Steinernema carpocapsae)을 순차적으로 접종 및 배양하되, 곤충병원성 선충 접종 후 6, 9, 12, 15, 18, 21일 배양한 후 이를 수확하여 곤충병원성 선충의 생산 수율 및 살충력을 비교하였다. 그 결과를 표 13과 도 10에 나타내었다.
선충 접종 후
배양일자
(day)		 생산수율 (×105 선충수 / 배지 g당) 살충력 (%)
횟수 각 회차별 평균 횟수 각 회차별 평균
6 1 1.01 1.03 1 70 73.3
2 1.05 2 76
3 1.03 3 74
9 1 1.90 1.91 1 78 79.3
2 1.96 2 78
3 1.87 3 82
12 1 2.12 2.17 1 86 86.7
2 2.24 2 88
3 2.15 3 86
15 1 2.05 2.07 1 86 86
2 2.07 2 84
3 2.09 3 88
18 1 1.95 1.91 1 78 79.3
2 1.87 2 80
3 1.91 3 80
21 1 1.85 1.85 1 78 78.7
2 1.84 2 80
3 1.87 3 78
표 13 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 곤충병원성 선충을 접종하고 12~15일 동안 배양 후 수확하였을 때 높은 생산 수율을 나타내었다. 12일 이전과 15일 이후에서는 생산수율이 낮았고, 살충력 또한 생산 수율에 비례하게 나타났다. 따라서, 공생균주가 배양된 배지에 곤충병원성 선충을 접종한 후 최적 배양일(수확 일자)은 곤충병원성 선충을 접종하고 12~15일인 것으로 파악된다.
<실시예 4. 공생균주의 배양조건 확립>
NB 배지에 배양된 공생균주의 배양액을 선충 배양용 배지에 투여하기에 가장 적합한 상태의 배양조건을 확립하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
NB 배지(beef extract 3g 및 peptone 5g을 총부피 1ℓ가 되도록 증류수를 첨가[pH=7.0]하고 멸균한 것)를 제조할 때, NaCl을 0.5~3 중량%가 되도록 농도별로 첨가하였다. 이렇게 제조된 NB 배지에 1.0 x 108 cfu/ml 상태의 공생균주 전배양액을 각각의 NB 배지에 0.01 중량%가 되게 접종하였다. 접종 후 24시간 후에 공생균주의 성장조건을 확인하였고, 이 중에서 NaCl이 첨가되지 않은 NB 배지(before NaCl)와 0.5 중량%의 NaCl이 첨가된 NB 배지(Afger 0.5% NaCl)에서 자란 것을 비교하여 도 11에 나타내었다.
도 11을 참고하면, NaCl이 첨가된 조건에서 공생균주인 제노하브더스 네마토필러스(Xenorhabdus nematophila), 포토하브더스 루미너선스(Photorhabdus luminescens) 모두에서 배양이 크게 증가되는 것을 확인할 수 있다. 이는 NaCl이 0.5~2 중량%로 첨가된 조건에서 농도별로 증가하는 것으로 나타났으며, 2 중량%를 초과한 3 중량% 조건에서는 오히려 배양이 잘 되지 않았다. 또한 도 11의 결과에서 보여준 2종의 공생균주 이외에 제노하브더스 베딩기(Xenorhabdus beddingii), 포토하브더스 루미너선스 subsp. 루미너선스(Photorhabdus luminescens subsp. luminescens)도 같은 패턴으로 NaCl이 첨가된 배지에서의 성장이 더 좋은 것으로 확인된다(그래프 미첨부).
<실시예 5. 곤충병원성 배양용 배지의 최종 조건 확립>
이상과 같은 실험 이후, 추가적으로, 곤충병원성 선충의 배양용 배지로서 종합적으로, 효모추출물 0.5~5 중량%, 대두분 10~25 중량%, 전지분유 1~5 중량%, 올리브유 2.5~10 중량%, 난황분 2.5~10 중량%, 담체 8~12 중량% 및 물 40~73 중량%가 포함된 배지를 멸균하여 사용한 것을 사용하여 80% 이상 해충이 사멸하는 것을 확인하였다.
다음으로는 배지 제조시, 효모추출물 2~5 중량%, 대두분 20~25 중량%, 전지분유 3~5 중량%, 올리브유5~10 중량%, 난황분 5~10 중량%, 담체 8~12 중량% 및 물 40~55 중량%가 포함된 것으로 제조한 배지 이용시, 85% 이상 해충이 사멸됨을 파악하였다. 또한, 여기에 추가적으로 꿀벌부채명나방 등의 곤충이 2~7 중량%가 첨가된 것을 이용한 배지에서 곤충병원성 선충의 배양이 가장 원활하며, 이렇게 배양된 선충 배양액이 배추 등의 식물에서의 꿀벌부채명나방 등의 살곤충 효과가 90~100%로서 가장 높음을 최종 확인하였다.
이 때, 효모추출물 0.5~5 중량%, 대두분 10~25 중량%, 전지분유 1~5 중량%, 올리브유 2.5~10 중량%, 난황분 2.5~10 중량%, 담체 8~12 중량% 및 물 40~73 중량%의 제조 조건 범위를 크게 벗어날 경우 선충의 배양조건이나 살곤충 효율이 80% 미만으로 낮아져 바람직하지 않았다.

Claims (11)

  1. (제1단계) 꿀벌부채명나방, 장수풍뎅이 및 갈색거저리로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택되는 곤충 유충, 효모추출물, 대두분, 전지분유, 올리브유, 난황분, 스폰지 및 물이 포함된 배지를 제조하는 단계;
    (제2단계) 상기 제1단계의 배지에 제노하브더스 베딩기(Xenorhabdus beddingii), 제노하브더스 네마토필러스(Xenorhabdus nematophila), 포토하브더스 루미너선스(Photorhabdus luminescens), 포토하브더스 루미너선스 subsp. 루미너선스(Photorhabdus luminescens subsp. luminescens)로 이루어진 군 중에서 선택된 공생균주를 접종하고 배양하는 단계; 및,
    (제3단계) 공생균주가 배양된 제2단계의 배지에 곤충병원성 선충을 접종하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 곤충병원성 선충의 배양방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제2단계의 공생균주는 NB 배지(Nutrient broth)에 배양된 것을 특징으로 하는 곤충병원성 선충의 배양방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 NB 배지에 염화나트륨(NaCl)이 0.5~2 중량%로 첨가된 것을 특징으로 하는 곤충병원성 선충의 배양방법.
  7. 제1항에 있어서,
    제3단계의 곤충병원성 선충은 스타이너네마 칼포캡시(Steinernema carpocapsae), 스타이너네마 글라이제리(Steinernema glaseri), 스타이너네마 롱지카우둠(Steinernema longicaudum), 스타이너네마 몬티콜룸(Steinernema monticolum), 스타이너네마 샴카야(Steinernema siamkayai), 헤테로라브디티스 sp. 경산(Heterorhabditis sp. Gyeongsan) 및 헤테로라브디티스 박테리오포라(Heterorhabditis bacteriophora)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 곤충병원성 선충의 배양방법.
  8. 제1항의 방법으로 배양된 곤충병원성 선충의 배양액.
  9. 제8항의 배양액을 방제대상 식물에 살포하는 것을 특징으로 하는 해충 방제방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 방제대상 식물은 과채류 식물, 엽채류 식물 및 화훼류 식물로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물인 것을 특징으로 하는 해충 방제방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 해충은 인시류 해충 또는 풍뎅이류 해충인 것을 특징으로 하는 해충 방제방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210051775A (ko) 2019-10-31 2021-05-10 오헌식 장기보관을 위한 곤충병원성 선충의 제형화 방법
CN113396868A (zh) * 2021-06-29 2021-09-17 中国科学院南京土壤研究所 一种土壤中线虫原位富集方法及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4334498A (en) * 1975-08-26 1982-06-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Assemblage for rearing nematodes
KR20010108793A (ko) * 2000-05-31 2001-12-08 박선호 곤충병원성 선충 배양용 배지 및 그를 이용한 선충의 대량배양방법
KR100882013B1 (ko) 2008-07-11 2009-02-04 구경본 곤충병원성 선충의 배양방법 및 배양조
KR20120089522A (ko) * 2010-12-16 2012-08-13 연세대학교 산학협력단 곤충병원성 선충 랍디티스 블루미를 이용한 해충 방제제 및 해충 방제 방법
KR101187936B1 (ko) 2012-02-03 2012-10-08 구경본 스타이너네마 칼포캡시의 배양방법
KR20140092525A (ko) * 2013-01-15 2014-07-24 주식회사 에스엠바이오비전 갈색거저리 유충 및 버미큐라이트를 함유한 곤충병원성 선충 대량증식용 배지 조성물

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4334498A (en) * 1975-08-26 1982-06-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Assemblage for rearing nematodes
KR20010108793A (ko) * 2000-05-31 2001-12-08 박선호 곤충병원성 선충 배양용 배지 및 그를 이용한 선충의 대량배양방법
KR100390535B1 (ko) 2000-05-31 2003-07-04 송미향 곤충병원성 선충 배양용 배지 및 그를 이용한 선충의 대량배양방법
KR100882013B1 (ko) 2008-07-11 2009-02-04 구경본 곤충병원성 선충의 배양방법 및 배양조
KR20120089522A (ko) * 2010-12-16 2012-08-13 연세대학교 산학협력단 곤충병원성 선충 랍디티스 블루미를 이용한 해충 방제제 및 해충 방제 방법
KR101187936B1 (ko) 2012-02-03 2012-10-08 구경본 스타이너네마 칼포캡시의 배양방법
KR20140092525A (ko) * 2013-01-15 2014-07-24 주식회사 에스엠바이오비전 갈색거저리 유충 및 버미큐라이트를 함유한 곤충병원성 선충 대량증식용 배지 조성물

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
강영진 외 5명, 곤충병원성 선충을 이용한 잔디밤나방, Spodoptera depravata (Butler) (나비목: 밤나방과)의 생물적 방제, 2004, vol.43, no.1, 61-70.
김형환 외 4명, Steinernematid와 Heterorhabditid 곤충병원성 선충을 이용한 담배거세미나방(Spondoptera litura)의 생물적 방제, 한국응용곤충학회지, 2008, vol.47, no.4, 447-456.
추호열 외 4명, 온도 및 농도가 곤충병원성 선충, Steinernema carpocapsae 포천 계통(Nematoda: Steinernematidae)의 병원성과 증식에 미치는 영향, 2002, vol.41, no.4, 269-277.

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210051775A (ko) 2019-10-31 2021-05-10 오헌식 장기보관을 위한 곤충병원성 선충의 제형화 방법
KR102346710B1 (ko) 2019-10-31 2021-12-31 오헌식 장기보관을 위한 곤충병원성 선충의 제형화 방법
CN113396868A (zh) * 2021-06-29 2021-09-17 中国科学院南京土壤研究所 一种土壤中线虫原位富集方法及其应用

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