KR101524557B1

KR101524557B1 - 바실러스 아밀로리쿼페이션스 ｅｍｌ―ｃａｐ３를 포함하는 살충 조성물

Info

Publication number: KR101524557B1
Application number: KR1020120148960A
Authority: KR
Inventors: 이향범
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2012-12-18
Filing date: 2012-12-18
Publication date: 2015-06-01
Also published as: KR20140079231A

Abstract

본 발명은 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3, 이의 배양액 또는 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 곤충 방제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 바실러스 아밀로리쿼페이션스의 신규 균종인 EML-CAP3은 해로운 곤충 방제에 매우 탁월한 효능을 갖고 있어, 작물에 이용할 경우 상품성 및 생산성을 크게 증대시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 미생물 균주를 이용한 생물학적 방제제로서, 동물 및 식물에 매우 안전하여 해충의 친환경적 제어가 가능하다.

Description

바실러스 아밀로리쿼페이션스 ＥＭＬ―ＣＡＰ３를 포함하는 살충 조성물{Insecticidal Composition Comprising Bacillus amyloliquefaciens EML-CAP3 Strain}

본 발명은 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3을 포함하는 곤충 방제용 조성물 및 이를 이용한 방제 방법에 관한 것이다.

복숭아혹진딧물(Myzus persicae)은 매미목 진딧물과로 농작물에 큰 피해를 주는 해충의 하나이다. 진딧물은 전세계적으로 분포하고 있고 작물 잎의 시들음 증상과 그을음병을 유발하고, 각종 바이러스병을 매개하여 재배 농가에 큰 피해를 준다.

배추좀나방(Plutella xylostella)은 세계적으로 십자화과 식물에 피해를 주는 나비목(Lepidoptera) 집나방과(Yponomeutoidea)에 속하는 해충이다(Verkerk and Wright, 1997). 암컷 한 마리당 평생 평균 159개를 산란하며, 세대기간이 짧아 농작물 재배시기에 알, 유충, 번데기 그리고 성충으로 1년에 여러 차례 발생하는데 대부분의 피해는 유충시기에 발생한다.

파밤나방(Spodoptera exigua)은 나비목의 밤나방과의 해충으로 수박, 참외, 멜론, 파, 양파, 부추, 배추, 고추, 토마토 등 다양한 채소작물에 대해 식물 표피를 갉아먹거나 구멍을 뚫으며 가해한다.

이러한 해충의 피해는 농가의 소득감소의 주요 요인이 되었고 이를 효과적으로 방제하기 위해 많은 연구가 이루어졌다.

해충의 방제는 다양한 계통의 36종 이상의 살충제가 이용되어 왔으며, 이에 대한 저항성의 발달 및 환경오염의 심각성 등의 문제점이 보고되어 있다(Miyata, et al., 1986). 또한, 이러한 해충들은 방제가 어려운 것으로 알려져 있다.

현재까지 화학적 살충제의 저항성의 발달 및 환경오염 등의 문제점을 해결하기 위해 친환경적인 생물학적 방제에 대한 관심이 높아지고 있으며, 천적 및 미생물, 식물추출물을 이용한 생물방제제에 대한 연구가 이루어지고 있다.

진딧물의 생물학적 방제에는 천적을 이용한 방법과 곤충병원성 미생물을 이용한 방법 등이 알려져 있다(V, W. et. al., 2007). 지금까지 진딧물을 방제하는데 사용되는 곤충병원성 미생물로는 레카니실리움 롱기스포룸(Lecanicillium longisporum; Zare and Gams, 2001), 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana; Knudsen, et. al., 1990), 패실로마이세스 푸모소로세우스(Paecilomyces fumosoroseus; Kavkovand Curn 2005), 버티실리움 레카니이(Verticillium lecanii; Hall, 1976), 메타리지움 아니소플리애(Metarhizium anisopliae; Chandler, 1997) 등이 알려져 있다.

파밤나방에 대한 천적은 알려져 있지 않으며 주로 베큘로바이러스(Baculoviruses)를 이용하여 방제하는 방법이 보고되어 있다(Bianchi, et.al., 2002).

배추좀나방의 방제를 위한 미생물 살충제에 이용되는 미생물 중 가장 대표적인 미생물은 바실러스 튜링겐시스(Bacillus thuringiensis; 이하 Bt)이다. 생물농약인 Bt의 경우 세포에서 포자로 변화되는 시기에 생산하는 독소가 살충제로서의 역할을 하는 것으로 새로운 작용기작과 높은 선택성 등으로 미생물 살충제의 상업화 이후 지난 20년간 저항성과 관련된 내용은 거의 보고되지 않았다. 그러나 최근 세계적으로 Bt제에 대하여 배추좀나방이 높은 저항성이 관찰된다는 보고서가 점차 증가되고 있는 실정이다(Tabashnik et al., 1990). 이러한 Bt를 대신할 새로운 미생물 농약의 개발과 진딧물 및 파밤나방 등 작물에 가해를 입히는 해충을 방제할 수 있는 생물학적 방제제 (biocontrol agent 또는 biological control)를 개발할 필요가 요구되어 왔다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

Verkerk, R. H. J. and Wright, D. J. Field-based studies with the diamondback moth tritrophic system in Cameron Highlands of Malaysia : Implications for pest management. International J. Pest Management, 43:27-33. 1997. Miyata, T., Saito, T. and Noppun, V. Studies on the mechanism of diamondback moth resistance of insecticides. In (N. S. Talekar ed.) Diamond back Moth Management : Proceedings of the First International Workshop, AVRDC. pp. 347-357. 1986. V, W., Mackauer, M., Pell, J. K. and Brodeur, J. Aphids as crop pests, pp. 187-233. CABI, Oxfordshire. 2007. Zare, R. and Gams, W. A revision of Verticillium section Prostrata. IV. The genera Lecanicillium and Simplicillium. Nova Hedwigia, 73: 1-50. 2001. Knudsen, G. R., Johnson, J. B. and Eschen, D. J. Alginate pellet formulation of a Beauveria bassiana (Fungi: Hyphomycetes) isolate pathogenic to cereal aphids. J. Econ. Entomol., 83: 2225-2228, 1990. Kavkov, M. and Curn, V. Paecilomyces fumosoroseus (Deuteromycotina: Hyphomycetes) as a potential mycoparasite on Sphaerotheca fuliginea (Ascomycotina: Erysiphales). Mycopathologia, 159: 53-63. 2005. Hall, R. A. A bioassay of the pathogenicity of Verticillium lecanii conidiospores on the aphid Macrosiphoniella sambirni. 1976. Journal of Inv. Pathology, 27:41-48. Chandler, D. Selection of an isolate of the insect pathogenic fungus Metarhizium anisopliae virulent to the lettuce root aphid, Pemphigus bursarius. Biocontr. Sci. Tech., 7:95-104. 1997. Bianchi, F. J. J. A., Vlak, J. B., Rabbinge, R. and Van der Werf, W. Biological control of beet armyworm, Spodoptera exigua, with Baculoviruses in greenhouses: Development of a comprehensive process-based model. Biological Control, 23:35-46. 2002. Tabashnik, B. E., Finson, N. and Johnson, M. W. Field development of resistance to Bacillus thuringiensis in diamondback moth (Lepidoptera, Plutellidae). J. Econ. Entomolo., 83:1671-1676. 1990.

본 발명자들은 유해 곤충을 효과적으로 방제할 수 있는 생물학적 방제제를 개발하고자 노력하였다. 그 결과 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens)의 신규 균종인 EML-CAP3가 해충 박멸에 탁월한 효능을 보유한다는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 바실러스 아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3, 이의 배양액 또는 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 곤충 방제용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바실러스 아밀로리쿼페이션스, 이의 배양액 또는 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 살포 또는 도포하는 단계를 포함하는 곤충 방제 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3, 이의 배양액 또는 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 곤충 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 유해 곤충을 효과적으로 방제할 수 있는 생물학적 방제제를 개발하고자 노력한 결과, 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens)의 신규 균종인 EML-CAP3를 생물학적 방제제로 이용할 경우 동물 및 식물에 매우 안전하면서도 해충 방제에는 탁월한 효능을 보유한다는 것을 발견하였다.

본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3는 고추의 잎과 줄기로부터 분리된 식물내생균으로, 상기 균주의 16S rDNA의 염기서열을 분석한 결과, 바실러스 아밀로리쿼페이션스와 가까운 근연관계를 가지는 것을 확인할 수 있었다. 상기 신규한 균주를 바실러스 아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3라 명명하고, 상기 바실러스 아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3 균주를 2011년 6월 28일자로 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국생명공학연구소 내 미생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 11971BP를 부여받았다. 이의 계통도는 도 3과 같다.

본 발명의 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3은 미생물 자체로서 이용하거나 다양한 배지에서 배양한 배양액 또는 추출물을 이용할 수 있다. 예를 들어, LB 배지(Luria-Bertani, Difco^TM, USA), NB 배지(Nutrient Broth, Difco^TM, USA), YMB 배지(Yeast Malt Broth, yeast extract 3 g, malt extract 3 g, peptone 5 g, dextrose 10 g, distilled water 1000 ㎖), 감자한천 배지(Potato Dextrose Agar, DifcoTM, USA) 등의 배지에서 배양한 배양물을 이용할 수 있다. 배양시간은 12 내지 48시간으로 하는 것이 좋으며, 배양온도는 20 내지 40℃ 정도가 바람직하다. 통상 일반 세균들이 30℃ 내지 40℃ 정도의 비교적 고온에서 잘 생장하고 온도가 낮아지면 잘 자라지 못하는 반면, 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3의 생장 온도는 20 내지 35℃에서도 잘 배양되는 특징이 있어서, 실온에서 적용가능한 점을 고려할 때 해충의 생물학적 방제제로서 큰 장점이 있다.

또한, 본 발명의 바실러스 아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3은 일반적인 배지에 탄소원, 질소원 또는 이들의 혼합물을 더 포함하여 배양될 수 있다. 상기 탄소원은 수크로오즈(sucrose), 덱스트로오즈(dextrose), 락토오즈(lactose), 만니톨(mannitol), 수용성 전분(soluble starch) 및 솔비톨(sorbitol)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상인 것을 사용할 수 있으며, 첨가되는 양은 바람직하게 0.05 내지 1.0 중량%(w/v)를 첨가될 수 있다. 또한 상기 질소원은 배양균에 질소를 공급할 수 있는 모든 물질이 가능하며, 예컨대, 질산나트륨(NaNO₃), 질산암모늄(NH₄NO₃), 황산암모늄((NH₄)2SO₄), 맥아추출물(Malt extract), 펩톤(Peptone) 및 트립톤(Tryptone)으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상인 것을 사용할 수 있으며, 첨가되는 양은 바람직하게 0.05 내지 1.0 중량%(w/v)로 첨가될 수 있다.

만약 배지 내 탄소원 또는 질소원의 함량이 상기 범위보다 많을 경우 타 영양물질의 결핍이 생길 수 있으며, 상기 범위보다 적을 경우 탄소원 또는 질소원의 별도 공급으로 인한 균주의 생장 상승효과가 미미하게 된다.

또한, 상기 세균 생장을 위한 일반적인 배지 즉, LB의 배지를 이용할 경우 LB 배지의 농도 즉, 1% 또는 2.4%에 탄소원과 질소원을 첨가함에 있어서는 균주의 생장에는 크게 영향을 미치지 않아, 균주를 배양하는 과정에서 적은 양의 배지를 이용할 수 있어 생산 비용을 절감할 수 있는 장점도 있다.

본 발명의 바실러스 아밀로리쿼페이션스 배양액 추출물은 당업계에 공지된 다양한 추출방법을 이용하여 추출할 수 있으며, 이렇게 추출된 추출물 또는 추가적으로 분획과정을 거친 분획물 모두 상기 추출의 개념에 포함된다. 예를 들어, 유기 용매를 이용하여 추출하는 경우, 바람직하게는 C₁ _-4 알코올, 헥산, 아세톤, 아세토니트릴, 클로로포름 및 에틸아세테이트로부터 선택된 유기용매를 단독으로 사용하거나 2종 이상을 순차적으로 사용하여 추출을 수행할 수 있으며, 상기 추출물을 추가적으로 분획하여 이용할 수도 있다.

본 발명의 바실러스 아밀로리쿼페이션스 배양액 추출물은 화합물 추출물 또는 펩타이드 추출물일 수 있으며, 바람직하게는 펩타이드 추출물일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 바실러스 아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3 배양액을 14,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 추출물의 상층액 분획을 회수하고, 상기 상층액 분획을 고상추출(solid phase extraction, SPE) 컬럼을 이용하여 아세토니트릴(ACN) 추출 등을 실시하고 전처리(sample preparation)하여 펩타이드 조 추출물을 확보하였다.

본 발명의 바실러스 아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3, 이의 배양액 또는 배양 추출물을 포함하는 조성물은 동물 또는 식물에 피해를 주는 다양한 종류의 곤충 방제에 적합하다. 상기 곤충의 종류는 제한되지 않지만, 바람직하게는 작물의 해충으로 잘 알려진 진딧물(Aphidoidea) 또는 나방(Lepidoptera)일 수 있다.

본 발명의 조성물을 진딧물 방제에 이용하는 경우, 방제 대상에 진딧물의 접근을 예방하거나, 진딧물이 방제 대상을 기피하거나, 이미 방제 대상에 붙어 있는 진딧물을 효과적으로 살충할 수 있다.

본 발명의 조성물을 진딧물의 살충에 이용하는 경우, 조성물 적용 후 바람직하게는 1-140시간, 보다 바람직하게는 12-72시간, 가장 바람직하게는 24시간-60시간 내에 진딧물이 80-100% 살충된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 다양한 작물에 해로운 것으로 잘 알려진 진딧물의 한 종류인 복숭아혹진딧물(Myzus persicae)에 대한 본 발명의 배양액의 살충효과를 실험한 결과 24시간 이후부터 90%의 살충률, 36시간 이후부터는 100%의 살충률을 나타내었다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 배양액의 펩타이드 조추출물의 경우 복숭아혹진딧물에 대해 100 ppm에서도 48시간 후 60%의 살충율을 보이기 시작하였으며 200 ppm에서는 90-100%의 살충율을 보였다.

본 발명의 조성물을 나방 방제에 이용하는 경우, 당업계에 알려진 다양한 종류의 나방 방제에 이용할 수 있으며, 바람직하게는 좀나방과(Plutellidae) 나방 또는 밤나방과(Noctuidae) 나방의 방제에 이용할 수 있다.

본 발명의 조성물을 나방의 살충에 이용하는 경우, 조성물 적용 후 바람직하게는 1-140시간, 보다 바람직하게는 12-72시간, 가장 바람직하게는 24시간-60시간 내에 나방이 80-100% 살충된다.

좀나방과 나방은 십자화과 식물의 해충으로 잘 알려져 있으며, 대부분의 피해는 이의 유충으로부터 발생한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 좀나방과 나방의 한 종류인 배추좀나방 유충에 대한 살충효과를 실험한 결과 80 내지 100%의 살충률을 나타내었다.

밤나방과 나방은 대부분이 나뭇잎을 먹거나 초본류의 잎이나 줄기를 잘라먹어 농작물에 대한 피해가 심각하다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 밤나방과 나방의 한 종류인 파밤나방 유충에 대한 살충효과를 실험한 결과 100%의 살충률을 나타내었다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 곤충 방제 조성물은 다양한 다른 종류의 화학적 또는 생물학적 방제제를 추가적으로 포함하거나 이에 혼합될 수 있다.

본 발명에 추가될 수 있는 다양한 방제제는 피프로닐, 아세페이트, 클로르피리포스, 데메톤-S-메틸, 디술포톤, 에토프로포스, 페니트로티온, 말라티온, 모노크로토포스, 파라티온, 포살론, 피리미포스-메틸, 트리아조포스, 시플루트린, 사이퍼메트린, 델타메트린, 펜프로파트린, 펜발레레이트, 페르메트린, 알디카르브, 카르보술판, 메토밀, 옥사밀, 피리미카르브, 벤디오카르브, 테플루벤주론, 디코폴, 엔도술판, 린단, 벤족시메이트, 카르탑, 시헥사틴, 테트라디폰, 아베르멕틴, 이베르멕틴, 밀베미신스, 티오파네이트, 트리클로르폰, 디클로르보스, 디아베리딘, 스피노사드 및 디메트리다졸 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3, 이의 배양액 또는 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 살포 또는 도포하는 단계를 포함하는 곤충 방제 방법을 제공한다.

본 명세서에서, 용어 “방제”는 동물 또는 식물을 곤충의 피해로부터 예방, 제어 또는 구제하거나, 곤충이 동물 또는 식물을 기피하여 접근하지 못하도록 하는 것을 의미한다.

상기 방제의 방법은 당업계에 알려진 다양한 방식의 방제 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 본 발명의 조성물을 동물 또는 식물에 살포하거나 도포하여 해충을 방제할 수 있다. 본 발명의 조성물을 살포하는 경우, 대량 수력 분무기, 소량 분무기, 에어-블라스트, 항공 분무기 및 가루약으로서 살포할 수 있다. 또한, 본 발명의 방제는 동물의 경우 동물의 몸에 직접 방제 또는 축사에 간접 방제 가능하며, 식물의 경우 종자, 꽃, 잎, 가지, 줄기, 뿌리, 토양 등과 같은 다양한 부위에 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 살포 또는 도포에 적합하도록 또는 방제 효과를 상승시키기 위하여 적합한 담체, 살충제, 상승작용제, 미량 원소, 안정화제, 접착제, 습윤제, 분산제, 유화제, 침윤제, 용매, 필러 또는 각 경우에 상용되는 담체를 포함할 수 있다. 또한, 필요에 따라, 농약분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하고 분말, 펠렛, 과립 또는 용액 등으로 제형화하여 해충 방제용 조성물로서 사용할 수 있다. 상기 담체로는 물, 화이트 카본, 카올린 등을 사용할 수 있으며, 상기 배양액 또는 배양액 추출물은 액체 또는 고체일 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3, 이의 배양액 또는 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 곤충 방제용 조성물을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명에 따르면, 바실러스 아밀로리쿼페이션스의 신규 균종인 EML-CAP3은 해로운 곤충 방제에 매우 탁월한 효능을 갖고 있어, 작물에 이용할 경우 상품성 및 생산성을 크게 증대시킬 수 있다.

(ⅲ) 또한, 본 발명의 조성물은 미생물 균주를 이용한 생물학적 방제제로서, 동물 및 식물에 매우 안전하여 해충의 친환경적 제어가 가능하다.

도 1은 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3 균주의 배추좀나방에 대한 배양체 처리 12-24시간 후의 살충효과를 나타낸 사진이다(A 및 C: 대조구; B, D 및 E: EML-CAP3 처리구).
도 2는 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼페이션스EML-CAP3 균주의 복숭아혹진딧물에 대한 배양체 처리 24시간 후의 살충효과를 나타낸 사진이다(A: 대조구; B 및 C: EML-CAP3 처리구).
도 3은 본 발명에 따른 신규한 바실러스 아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3(KCTC 11971BP)의 16S rDNA를 통한 분자계통학적 위치를 확인한 결과이다(계통수는 Bacillus atrophaeus JCM 9070 및 Bacillus licheniformis DSM 13 균주를 외집단으로 사용하였으며 scale bar는 뉴클레오티드 당 0.01 substitutions을 나타냄),

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 바실러스 아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3의 배추좀나방의 인비트로 상에서의 살충 효과

고추에서 분리된 내생균인 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3의 배추좀나방에 대한 살충효과를 조사하기 위해 LB 배지(Luria-Bertani, Difco^TM, USA), NB 배지(Nutrient Broth, Difco^TM, USA) 및 YMB 배지(Yeast Malt Broth, yeast extract 3 g, malt extract 3 g, peptone 5 g, dextrose 10 g, distilled water 1000 ㎖)에 접종한 후 32℃에서 24시간 150 rpm으로 진탕배양하여 준비하였다.

살충력 효과 검정은 포장조건과 유사하고 재현성이 높은 스프레이법을 이용하여 실시하였다. 배추좀나방의 기주식물인 배추잎을 Ø10 ㎝로 절단한 후 페트리디쉬(Ø10 X 6 ㎝)에 넣고 3령 유충 각각 20마리 씩 접종하였다. 소형 스프레이를 이용하여 각각의 균주의 양을 3 ㎖ 정도로 페트리디쉬에 살포하였다. 실험 조건은 온도 25℃, 습도 50-60%, 광주기 16L:8D의 항온기내에서 실시하였다. 12시간 마다 충의 생사를 관찰하였으며 궁극적으로 72시간 동안의 살충력을 검정하였다. 대조구로는 물처리구와 무처리구를 각각 이용하였다. 모든 실험은 3 반복 수행하였으며, 충의 생사여부는 붓을 사용하여 충을 건들렸을 때 움직임이 없는 것을 사충으로 간주하였다.

표 1의 결과에서와 같이 LB, NB 및 YMB 세 개의 배지에서 배양한 배양액에서 모두 80-90% 이상의 높은 살충력을 보였으며, 2-3일 후 100%에 달하는 살충력을 보여주었다.

또한, 도 1에서 확인할 수 있듯이 EML-CAP3 균주를 처리한 후 죽은 배추좀나방의 애벌레를 관찰한 결과, 애벌레의 몸체의 운동이 느려지면서, 마르고 색이 검게 변하였다.

배추좀나방에 대한 EML-CAP3 균주의 배양배지 및 시간별 살충 효과

Time (hr)*	Mean mortality (%)**
Time (hr)*	LB	NB	YMB	Control
12	30	30	30	0
24	50	60	50	0
36	60	90	80	0
48	70	90	100	10
60	80	90	100	10
72	80	90	100	20

* 배추좀나방에 배양액 접종 후 경과시간, ** 사충의 수/전체 유충의 수 x 100.

실시예 2: 바실러스 아밀로리쿼페이션스 EML - CAP3 의 복숭아혹진딧물에 대한 살충 효과

바실러스 아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3의 복숭아혹진딧물에 대한 살충효과를 조사하기 위해 LB 배지에 접종한 후 32℃에서 24시간 150 rpm으로 진탕배양하여 준비하였다.

복숭아혹진딧물에 대한 살충력을 조사하기 위해 스프레이법을 이용하여 실시하였다. 기주식물인 배추잎을 Ø10 ㎝로 절단한 후 페트리디쉬(Ø10 X 6 ㎝)에 넣고 3령 유충 각각 20마리씩 접종하였다. 소형 스프레이를 이용하여 각각의 균주의 양을 3 ㎖ 정도로 페트리디쉬에 살포하였다. 실험 조건은 온도 25℃, 습도 50-60%, 광주기 16L:8D의 항온기내에서 실시하였다. 12시간 마다 충의 생사를 관찰하였으며 궁극적으로 72시간 동안의 살충력을 검정하였다. 대조구로는 물처리구와 무처리구를 각각 이용하였다. 모든 실험은 3반복 수행하였으며, 충의 생사여부는 붓을 사용하여 충을 건들렸을 때 움직임이 없는 것을 사충으로 간주하였다.

표 2에서와 같이, 복숭아혹진딧물에 대한 EML-CAP3 균주 배양체는 24시간 이후부터 90% 이상의 높은 살충력을 보였으며, 36시간 이후부터는 100%의 살충력을 보였다.

또한, 도 2에서와 같이, EML-CAP3 균주를 처리한 후 죽은 복숭아혹진딧물의 표면이 검게 변하고, 죽은 진딧물들의 몸이 꺾이거나 뒤집혀 있는 것이 관찰되었다.

복숭아혹진딧물에 대한 EML-CAP3 균주 배양액의 살충효과

Time (hr)*	Mean mortality (%)**
Time (hr)*	EML-CAP3	Control
12	80	0
24	90	0
36	100	0
48	100	0
60	100	0
72	100	0

* 복숭아혹진딧물에 배양액 접종 후 경과시간, ** 사충의 수/전체 유충의 수 x 100.

또한, 본 발명자들은 배양체 추출물에 대한 효과를 검정하기 위하여, 다음과 같이 배양체로부터 펩타이드를 추출하였다. EML-CAP3 균 전배양체를 자퍼멘터(jar fermentor; LB 배지, Difco)에 소량 접종하고 32℃에서 24시간 배양하였다. 이후, 상기 배양액을 14,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 추출물의 상층액 분획을 회수하였다. 상기 상층액 분획을 고상추출(solid phase extraction, SPE) 컬럼을 이용하여 아세토니트릴(ACN) 추출 등을 실시하고 전처리(sample preparation)하여 펩타이드 조 추출물을 확보하였다.

표 3에서와 같이, 복숭아혹진딧물에 대한 EML-CAP3 균 배양체의 SPE 컬럼을 통한 펩타이드 조추출물의 경우 100 ppm에서 36-48시간 후 50-60%의 살충율을 보이기 시작하며 200 ppm에서는 12-48 시간 후 90-100%의 살충율을 보였다.

진딧물에 대한 EML-CAP3 배양체의 SPE 컬럼 조추출 펩타이드의 살충효과

농도	Mean mortality (%)*
100 ppm	50-60
200 ppm	90-100
대조구	0

* 펩타이드 조 추출물 처리 48 시간후의 사충의 수/전체 유충의 수 x 100.

실시예 3: 바실러스 아밀로리쿼페이션스 EML - CAP3 의 파밤나방에 대한 살충 효과

바실러스 아밀로리쿼페이션스 EML-CAP3의 파밤나방에 대한 살충효과를 조사하기 위해 LB 배지, NB 배지 및 YMB 배지에 접종한 후 32℃에서 24시간 150 rpm으로 진탕배양하여 준비하였다.

파밤나방에 대한 살충력을 조사하기 위해 스프레이법을 이용하여 실시하였다. 배추잎을 Ø10 ㎝로 절단한 후 페트리디쉬(Ø10 X 6 ㎝)에 넣고 3령 유충 각각 20마리씩 접종하였다. 소형 스프레이를 이용하여 각각의 균주의 양을 3 ㎖ 정도로 페트리디쉬에 살포하였다. 실험 조건은 온도 25℃, 습도 50-60%, 광주기 16L:8D의 항온기내에서 실시하였다. 12시간 마다 충의 생사를 관찰하였으며 궁극적으로 72시간 동안의 살충력을 검정하였다. 대조구로는 물처리구와 무처리구를 각각 이용하였다. 모든 실험은 3반복 수행하였으며, 충의 생사여부는 붓을 사용하여 충을 건들렸을 때 움직임이 없는 것을 사충으로 간주하였다.

표 4의 결과와 같이, 파밤나방에 대한 EML-CAP3 균주는 배지에 상관없이 100%의 살충력을 보였다.

죽은 파밤나방의 애벌레를 관찰한 결과, 배추좀나방의 애벌레에 EML-CAP3 균주를 처리했을 때와 비슷한 증상을 보였다.

파밤나방에 대한 EML-CAP3 균주의 배지별 살충효과

Medium	Mean mortality (%)*
LB	100
NB	100
YMB	100
대조구	0

* 사충의 수/전체 유충의 수 x 100.

상기의 결과는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-CAP3 균주의 배양액 및 배양여액이 배추좀나방, 복숭아혹진딧물 및 파밤나방의 방제에 높은 살충효과를 나타내는 것을 확인한 결과이기도 하다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC11971BP

20110628

Claims

바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3(기탁번호:KCTC 11971BP), 이의 배양액 또는 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 곤충 방제용 조성물이고, 상기 곤충은 복숭아혹진딧물(Myzus persicae)인 곤충 방제용 조성물.
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제 1 항에 있어서, 상기 방제는 예방, 제어, 기피 또는 구제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 배양액 추출물은 펩타이드 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) EML-CAP3(기탁번호:KCTC 11971BP), 이의 배양액 또는 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 살포 또는 도포하는 단계를 포함하는 곤충 방제 방법이고, 상기 곤충은 복숭아혹진딧물(Myzus persicae)인 곤충 방제 방법.