KR100773986B1

KR100773986B1 - 곤충병원선충인 버틀리우스와 선충공생세균인프로비덴시아를 이용한 굼벵이류 방제제 및 방제방법

Info

Publication number: KR100773986B1
Application number: KR1020060104703A
Authority: KR
Inventors: 김정화
Original assignee: 김정화
Priority date: 2006-10-26
Filing date: 2006-10-26
Publication date: 2007-11-08

Abstract

본 발명은 곤충병원선충과 선충공생세균을 이용한 굼벵이류의 생물적 방제제 및 방제방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 골프장 잔디 및 수목의 뿌리에 피해를 가하는 굼벵이류를 방제할 수 있도록 곤충병원선충과 선충공생세균 중 고살충성을 갖는 버틀리우스와 프로비덴시아를 각각 선별하고 이를 이용하여 굼벵이류를 방제시키도록 하는 굼벵이류의 생물적 방제제 및 방제방법에 관한 것이다.

본 발명의 굼벵이류 방제제는 곤충병원선충인 버틀리우스(Butlerius sp.)와 선충공생세균인 프로비덴시아(Providencia sp.)로 이루어짐을 특징으로 한다.

본 발명은 굼벵이류에 대해 고살충력을 갖는 곤충병원선충인 버틀리우스와 선충공생세균인 프로비덴시아로 방제제를 제조하여 방제가 이루어지도록 함으로써 골프장 잔디에 발생하는 풍뎅이 유충뿐만 아니라 고구마나 감자등에 피해를 주는 풍뎅이 유충의 방제에도 적용할 수 있으며, 유기합성농약의 대체제로 사용할 수 있어 환경피해를 최소화 할 수 있는 친환경 방제제의 제공이 가능하게 된 것이다.

방제제, 곤충병원선충, 선충공생세균, 버틀리우스, 프로비덴시아

Description

곤충병원선충인 버틀리우스와 선충공생세균인 프로비덴시아를 이용한 굼벵이류 방제제 및 방제방법{Control Agent and method for White grub using Butlerius sp. of Entomopathogenic Nematode and Providencia sp. of Nematodes Symbiotic Bacteria}

도 1은 골프장에서 등얼룩풍뎅이 유충의 피해정도를 나타낸 사진.

도 2는 본 발명에 의해 채집된 곤충병원선충의 ITS region 분석을 통한 분자생물학적 분류결과.

도 3은 본 발명의 곤충병원선충에서 수취한 프로비덴시아의 리보솜 DNA의 ITS region 분석을 통한 분자생물학적 분류결과.

도 4는 본 발명의 실시예에 따라 등얼룩풍뎅이 유충에서 채취한 선충의 살충력 테스트한 그래프.

도 5는 선충의 농도별 등얼룩풍뎅이 유충의 사충률을 도시한 그래프.

도 6은 본 발명에 따른 곤충병원선충을 100 IJ/larvae로 감염시킨 등얼룩풍뎅이 유충의 사충율을 도시한 그래프.

도 7은 본 발명에 따른 곤충병원선충을 400 IJ/larvae로 감염시킨 꽃무지 유충의 사충율을 도시한 그래프.

도 8은 선충공생세균인 Xenorhabdus sp. 와 Providencia sp. 의 섭취에 따른 등얼룩풍뎅이 유충의 사충율을 도시한 그래프.

도 9는 등얼룩풍뎅이 유충 장내공생세균의 길항효과를 도시한 그래프.

도 10은 꽃무지 유충 장내공생세균의 길항효과를 도시한 그래프.

생활이 윤택해지고 여가시간의 증대로 인해 잔디로 형성된 골프장과 축구장등의 건설이 증가되고 있어 전체 체육시설면적의 85% 달하고 있으며, 잔디형성시설 면적은 지속적으로 증대되고 있는 실정이다.

이러한 잔디의 성장을 돕고 병해를 방지하고자 각 종 비료와 살충제등이 사용되고 있으나, 이는 대부분 유기합성농약을 사용하고 있으므로, 강우나 빗물 및 잔디에 생육을 위해 주는 물에 의해 이전에 살포된 독성농약의 잔류성분이 주변 하천이나 지하수로 유입되어 농약의 유해성분으로 인한 환경오염이 문제점으로 대두되고 있다.

이와같은 이유로 합성농약의 살포는 제한적으로 이루어지는데 반하여 병충해는 기하급수적으로 증가하고 있어 골프장등의 잔디 피해가 매년 증가되고 있는 실정이다.

특히 상기 잔디에 피해를 주는 해충으로는 잔디 뿌리를 가해하는 풍뎅이 유충인 굼벵이류가 주를 이루고 있는데 이의 방제가 어려워 살충제 과다 사용의 원인이 되고 있으며, 국내 골프장에서 발생하여 피해를 주는 굼벵이류는 등얼룩풍뎅이, 녹색콩풍뎅이, 주황긴다리풍뎅이, 주둥무늬차색풍뎅이의 유충으로 8속 12종이 보고되어 있다.

대표적으로는 토양 속 10cm 내외에서 서식하는 등얼룩풍뎅이 (Blitopertha orientalis Waterhouse)와 녹색콩풍뎅이 (Papillia guadriguttata Fabricius) 등의 풍뎅이류에 의한 피해가 주를 이루고 있는데 밀도가 높은 곳은 1m²당 120 ~ 150 마리까지 이르나 지상부에서 발생이 관찰되지 않으므로 예찰이 어렵고 방제가 매우 어려운 실정이다.

상기 풍뎅이류는 유충 시기에 활발한 섭식을 하여 잔디 뿌리를 가해하게 되는데, 생육이 왕성한 시기의 잔디는 굼벵이가 가해한 부분이 표면적으로 표시가 나지 않지만, 잔디가 휴면기를 거치고 이듬해 봄철이 되면 피해지역에 잔디가 올라오지 않으므로, 이 시기에 잔디 피해지역을 중심으로 방제를 시행하여도 이미 굼벵이들은 다른 지역으로 이동을 한 상태이므로, 예찰 및 방제가 매우 어렵다.

현재 굼벵이류의 방제에는 유기인계, 합성피레스로이드계, 클로로니코티닐계 및 티아니코티닐계의 유기농약이 사용되고 있으나, 대상 해충이 토양 지하부에 서식하기 때문에 방제제의 사용에 어려움이 많고, 유충이 약제에 대한 내성 유발, 잔디에 대한 약해 유발 등의 문제가 심각하며, 특히 넓은 골프장을 부분 관주 처리에 의한 방법으로 방제하는 일은 매우 비효율적이며 비경제적인 방법이다.

이를 극복하기 위해 곤충병원선충을 이용한 생물학적방제가 대두되고 있으며, 대표적으로는 선출원된 대한민국 특허등록 0390535호가 있다. 상기 등록건은 곤충병원성 선충 중 스타이너네마(Steinernema) 속의 칼포캡시(carpocapsae)와 글라이제리(glaseri)를 이용하여 방제가 이루어지도록 하고 있으나 온실 등의 제한적인 장소에서만 일부 사용되고 있으며, 농민들도 점차로 사용을 기피하는 추세이다.

이러한 이유는 기주특이성으로 인한 낮은 살충율과 생존율이 낮아 방제제로써의 제역할을 수행하지 못하고 있기 때문이다.

본 발명은 상기의 문제점을 해소하기 위해 안출된 것으로,

굼벵이류에 대해 고살충력을 갖는 곤충병원선충인 버틀리우스와 선충공생세균인 프로비덴시아로 방제제를 제조하여 방제가 이루어지도록 함으로써 골프장 잔디에 발생하는 풍뎅이 유충뿐만 아니라 고구마나 감자등에 피해를 주는 풍뎅이 유충의 방제에도 적용할 수 있으며, 유기합성농약의 대체제로 사용할 수 있어 환경피해를 최소화 할 수 있는 친환경 방제제의 제공을 목적으로 한다.

상기 과제를 달성하기 위한 본 발명의 굼벵이류 방제제는 곤충병원선충인 버틀리우스와 선충공생세균인 프로비덴시아로 이루어짐을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 굼벵이류 방제방법은 야생풍뎅이 유충을 포획하고, 포획된 유충으로부터 추출한 곤충병원선충과 선충공생세균을 이용한 굼벵이류의 방제방법에 있어서, 포획된 유충으로부터 곤충병원선충인 버틀리우스(Butlerius sp.)를 분리하고, 상기 유충으로부터 분리된 버틀리우스를 표면살균 처리 후 균질화시켜 선충공생세균인 프로비덴시아(Providencia sp.)를 추출하는 분리 및 추출하는 단계와; 추출한 선충공생세균을 배양액으로 배양하고, 이에 곤충병원선충을 접종하여 배양하는 배양단계와; 배양된 감염 곤충병원선충을 굼벵이 다량 서식지역에 살포하여 굼벵이를 사멸시키는 살포단계;를 포함하여 이루어진다.

상기 방제단계에서 살포는 30 ~ 150 IJ/larvae의 농도로 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 굼벵이류 방제제는 곤충병원선충인 버틀리우스(Butlerius sp.)와 선충공생세균인 프로비덴시아(Providencia sp.)로 제조된다.

상기 선충공생세균인 프로비덴시아는 하기 실시예에 의해 추출한 것으로, 굼벵이류에 대해 강한 살충성을 갖고 있다. 이는 단독으로 해충에 침투하는 것이 미비함으로 운반체인 곤충병원선충인 버틀리우스속을 이용하여 대상숙주에 침입하도록 하여 해충인 굼벵이류를 치사시키는 것이다. 물론 상기 버틀리우스속과 프로비 덴시아 속의 하부 분류인 선충과 공생세균에서 높은 사충률이 나타나고 있으나 본 발명에서는 각 속에 유사한 성질을 갖고 있으므로, 실험대상을 포함하는 속 전체로 표현하였다.

한편, 본 발명의 방제방법은 포획된 유충으로부터 추출한 곤충병원선충과 선충공생세균을 이용한 굼벵이류의 방제방법에 있어서, 분리추출단계와, 배양단계와, 살포단계를 포함하여 이루어진다.

상기 분리추출단계에서 포획된 유충은 White trap법과 Baermann funnel법을 이용하여 순수하게 분리하고, 분리된 곤충병원선충인 버틀리우스를 살균 처리 후 균질화시켜 공생세균을 추출하였다. 상기 살균은 선충의 표면에 묻어 있는 다른 세균을 제거하기 위한 것으로 선충의 장에서 활동하는 공생세균을 멸균시키는 것은 아니다.

또한 배양단계에서 배양은 일반적으로 탄소원, 질소원, 무기염류, 오일류가 포함된 배양액을 이용하여 배양하며, 각 조성물질을 선충배양에 적합한 농도를 취합하여 최적의 배양액을 조성하여 사용할 수 있다.

아울러, 직접적인 선충의 배양보다는 공생세균을 일정농도로 배양한 후 병원선충을 접종배양하여 선충의 증식효율을 상승시키도록 할 수 있다.

예컨대, 공생세균의 농도가 1×10⁹ cfu/ml 이하로 유지 될 경우 선충이 증식되지 않으므로, 최소한 상기 공생세균의 농도 이상에서 선충의 접종 및 증식이 이루어지도록 하는 것이 바람직하다. 아울러 상기 공생세균은 선충의 먹이가 됨으로 선충의 증식과 동시에 농도가 저하됨으로, 원활한 선충의 증식을 위해서는 초기 공생세균의 농도를 상기 기준농도보다 더 높은 농도에서 선충의 접종이 이루어지도록 하는 것이 바람직하다.

상기 배양으로 증식된 본 발명의 곤충병원선충인 버틀리우스는 높은 농도로 살포하여 살충이 이루어지도록 할 수 있으나, 풍뎅이유충에 대해 50~100 IJ/larvae으로 감염시켰을 경우 높은 사충률을 보이고 있으므로, 30 ~ 150 IJ/larvae의 농도로 살포하여 방제가 이루어지도록 하는 것이 바람직하다.

상기한 바와같이 살포가 이루어지면, 곤충병원선충인 버틀리우스는 풍뎅이 유충의 내부로 침투하고, 버틀리우스의 장내에 공생하는 세균인 프로비덴시아가 풍뎅이유충에 패혈증 발생되도록 하거나, 내성유발을 억제하도록 하여 치사가 이루어지게 하는 것이다.

이하, 실시예를 통해 본 발명에 따른 곤충병원선충인 버틀리우스와 선충공생세균인 프로비덴시아를 이용한 굼벵이류 방제제를 상세히 설명한다.

실시예1

- 야생 곤충병원선충 확보

야생 곤충병원선충을 수집은 2004년도와 2005년도에 풍뎅이 유충에 의해 큰 피해를 입은 경기도 김포군 소재 김포리버사이드CC와 경기도 여주군 소재 금강CC, 그리고 강원도 평창군 소재 보광피닉스파크CC를 대상으로 풍뎅이 유충에 의한 잔디 피해가 집중적으로 발생하는 8월부터 9월 사이에 수행하였다.

도 1은 골프장에서 등얼룩풍뎅이의 피해정도를 나타낸 사진으로, 참조한 바와같이 김포리버사이드CC의 경우 가해 지역이 물빠짐이 좋은 경사진 곳에 위치하였으며 풍뎅이 유충 또한 잔디 뿌리부터 지하 부 10 cm 부근의 토양에 걸쳐 분포하였으며, 특히 뿌리 부분에 집중적으로 서식하여 잔디를 가해하고 있었다.

유충의 밀도는 50 × 50 cm 당 평균 3마리로 조사되었다.(A1, B1, C1) 풍뎅이 유충의 피해가 가장 심했던 지역은 보광피닉스파크CC로 경사가 없고 충분한 사토 위에 잔디가 이식되어 있는 부분이었다.

이식된 잔디의 뿌리 부분부터 지하 부 5 cm 깊이로 50 × 50 cm 당 100 마리 이상으로 분포하였으며, 가해된 부분의 잔디는 잔뿌리를 비롯한 대부분의 뿌리가 식해 되어 관찰되지 않았다.(A2, B2, C2)

감염된 사체나 죽어가는 유충으로부터 분리된 곤충병원선충은 총 28개의 풍뎅이 유충으로부터 28 개 strains을 확보하였다. 풍뎅이 유충에 대한 살충성을 검증할 목적으로 수집된 Sterinernema 속 선충의 수집은 대전 근교의 산림토로 부터 총 2 strains 을 분리하였다.

실시예2

- 곤충병원선충 및 선충공생세균을 분리 동정

채집된 풍뎅이 유충은 항문주위의 raster배열의 특성 상 모두 등얼룩풍뎅이 (Blitopertha orientalis)의 유충인 것으로 동정되었다. 곤충병원선충은 감염충으 로부터 White trap법과 Baermann funnel법을 이용하여 순수하게 분리되었으며, 도 2를 참조한 바와같이 ribosomal DNA의 ITS region 분석을 통한 분자생물학적 분류를 수행한 결과 NCBI access number DQ121437인 Butlerius sp. 과 NCBI access number DQ121436인 Rhabditis blumi 와 높은 상동성을 보였다.

상기 Rhabditis blumi 는 Butlerius 속 선충과 동일하게 다른환경에서도 살수 있는 기생충의 생태학적인 특성을 갖고 있으나 곤충유래선충과 함께 곤충에 대하여 낮은 병원성을 갖고 있다. 따라서 상기 추출선충은 높은 후술된 바와같이 높은 살충성을 갖는 바 Butlerius 속 종 으로 판단된다.

한편, 선충공생세균을 분리하기 위하여 감염충으로부터 분리된 선충을 살균 처리 후 균질화시켜 공생세균을 분리하였다. 분리된 공생세균을 Akhurst법과 Krasomil-Osterfeld법을 이용한 화학적 동정법을 통하여 일차적으로 동정을 수행한 결과 산림토로부터 꿀벌부채명나방을 trap insect로 하여 분리된 선충으로부터 추출한 공생세균은 Xenorhabdus sp. 로 동정되었고 Sterinernema 속의 선충에 공생하고 있는 것으로 판단되었다.

또한 등얼룩풍뎅이 유충으로부터 분리된 선충으로부터 추출한 공생세균은 MacConkey agar에서의 특성상 Phase I bacteria로 동정되었고 NBTA agar에서 공생세균은 붉은색에서 자주색의 콜로니 색을 내었다. 정확한 동정을 위해서 16S rDNA 영역을 대상으로 한 분자생물학적 동정을 수행하였다. 도 3에 나타난 바와같이 분석 결과 NCBI access number AM040495 인 Providencia vermicola 와 NCBI access number AM040492 인 Providencia rettgeri 와 높은 상동성을 보였고, 본 발명에서는 프로비덴시아(Providencia sp.)로 통칭하였다. 본 발명의 실시예에서는 Providencia sp. 5 strain과 살충성 비교검정을 위한 Xenorabdus sp. 26 strains을 분리하여 사용하였다.

실시예3

- 고살충성 곤충병원선충 선발하기 위해 살충력을 검정

실험예1

- 감염충을 이용한 in vivo 살충력 검정

곤충병원선충에 감염된 등얼룩풍뎅이를 이용한 살충력 검정을 김포리버사이드 CC (경기도 김포군 소재)에서 채집된 감염충 1마리와 건전한 토양을 이용하여 실내에서 sand barrier method를 이용하여 조사한 결과 15일이 경과한 시점에서 100마리의 건전한 등얼룩풍뎅이 유충에 감염을 유발하였고 100%의 사충율을 보였다. 반면 인시류 유충으로부터 분리된 Steinernema sp.의 경우 등얼룩풍뎅이에 대해 살충효과를 보이지 않았다.

따라서 등얼룩풍뎅이의 유충으로부터 분리된 선충공생세균을 본 발명의 소재로 사용하였다.

실험예2

- 곤충병원선충의 살충 스크리닝

채집된 등얼룩풍뎅이 유충으로부터 일차적으로 선발된 높은 병원성을 갖는 5 strain의 곤충병원선충 중에서 가장 우수한 살충력을 갖는 strain을 선별하기 위한 살충 스크리닝을 수행한 결과는 도 4와 같다. 상기 각각의 곤충병원선충은 배지를 이용하여 다량 배양한 후 실험을 실시하였다. 분리된 곤충병원선충 strain 2, 3, 4, 5는 선충 무처리구 대비 접종 15일 째부터 살충성이 극명하게 구별되었고 27일에서 30일 사이 100%의 살충력을 보였다.

대부분의 선충 strain이 유사한 살충 효과를 갖는 경향을 보인 반면 strain 1의 경우 접종 3일째부터 높은 살충력을 갖는 것으로 관찰되었다. 특히 접종 6일째가 되는 시점에는 모든 등얼룩풍뎅이 유충을 사멸시킴으로서 100%의 사충율을 보였다. Strain 1은 분자생물학적 분류동정을 통해 Butlerius sp. 로 동정되었고(가칭 : Butlerius sp. HW101로 명명), 본 발명의 공시선충으로 사용하였다.

실험예3

- 감염태 선충의 접종농도에 따른 in vivo 살충력 검정

등얼룩풍뎅이를 공격하는 감염태 곤충병원선충의 적정농도를 규명하기 위하여 보광피닉스파크 CC(강원도 평창군 소재)에서 등얼룩풍뎅이로부터 채집된 본 발명의 공시선충을 이용하여 살아있는 감염태 선충을 분리한 후 배양하여 증식시켰다. one-on-one법에 따라 처리구별로 10, 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1600 IJ/larvae의 농도로 선충을 접종한 후 사충율을 조사한 결과 도 5에 도시된 바와같이 모든 농도의 선충 처리구는 무처리구에 비하여 높은 사충률을 보였다. 특히 감염 15일 째 사충율은 급격히 증가하는 것으로 관찰되었으며, 50과 100 IJ/larvae의 농도에서 각각 58 %와 56 %로 다른 높은 농도의 선충 처리구보다 높은 사충율을 보였다.

실험예4

- 숙주곤충의 령수에 따른 살충력 검정

골프장에서 채집한 2령 충, 3령 충, 4령 충의 등얼룩풍뎅이 유충과 구입한 꽃무지 유충을 대상으로 유충의 성장 단계 별 사충율을 조사하였다.

도 6을 참조한 바와같이 100 IJ/larvae의 선충을 감염시킨 등얼룩풍뎅이 유충의 경우 반수치사시간은 14일로 조사되었으며, 12 ~ 15일 사이에 급격하게 사망하는 것으로 조사되었다. 특히 2령 충에서 가장 높은 사충율을 보여주었으며, 영수가 증가함에 따라 낮아지는 것으로 조사되었다. 특히 감염 후 30일째 2령충에 대하여 75 %의 높은 사충율을 보였다.

반면 도 7을 참조한 바와같이 400IJ/larvae의 선충을 감염시킨 꽃무지 유충의 경우 3령 충에서 가장 높은 사충율을 보였다. 곤충병원선충인 Butlerius sp.은 높은 기주특이성을 갖는 것으로 조사되었고 등얼룩풍뎅이 유충에 대해서는 높은 사충율을 갖는 반면 꽃무지 유충에 대해서는 매우 낮은 사충율을 보였다. 따라서 본 살충력 검정에 있어서도 꽃무지 유충의 경우 400IJ/larvae의 등얼룩풍뎅이 유충보다 높은 농도가 병원성을 유발하기 위해 요구되었다.

실험예5

- 대체숙주를 이용한 살충력 검정

등얼룩풍뎅이의 대체숙주로 꽃무지 유충, 집파리 유충을 이용하여 본 발명의 곤충병원선충인 Butlerius sp.의 살충력을 비교하였다. Butlerius sp.는 꽃무지 유충에 대하여 등얼룩풍뎅이 유충 (100IJ/larvae)보다 높은 400IJ/larvae의 높은 농도에서 병원성을 유발하는 것으로 확인되었다. 그러나 집파리 유충과 파밤나방에 대해서는 병원성을 보이지 않았다. Butlerius sp.는 집파리유충에 대하여 병원성을 보이지 않는 것으로 확인되었다. 동일한 곤충을 대상으로 Steinernema 속 곤충병원선충의 살충력을 조사하여 비교한 결과 Steinernema 속 곤충병원선충은 파밤나방에 대해서는 병원성을 보인 반면 25 ~ 500 IJ/larve의 농도범위에서 등얼룩 풍뎅이와 꽃무지 유충을 공격하지 않았다. 그러나 sylinge를 이용하여 체내에 선충을 25 ~ 100 IJ/마리의 농도로 직접 투여한 결과 약 7일 후 progeny가 관찰되었다. 이러한 결과로 보아 인시류를 주 공격대상으로 하는 Steinernema 속 곤충병원선충과는 달리 본 발명의 공시 곤충병원선충인 Butlerius sp. 는 풍뎅이류 유충을 기주 특이적으로 공격하는 것으로 판단된다.

실시예4

- 선발된 선충으로부터 분리된 공생세균을 이용한 기내 살충력 검정

실험예6

- 혈강주입법을 통한 살충력 검정

본 발명의 곤충병원선충인 Butlerius sp.에서 분리한 Providencia sp.와 Steinernema sp.로부터 분리한 Xenorhabdus sp.를 이용하여 등얼룩풍뎅이 유충, 꽃무지 유충, 파밤나방 유충을 대상으로 직접투여를 통한 살충력을 검정하였다. 2 일간 배양된 Providencia sp.을 1×10¹⁰/ml 의 농도로 등얼룩풍뎅이 유충, 꽃무지 유충을 대상으로 각 충당 1, 2 ul씩을 주사한 후 12 시간 경과 후 검수하였다.

단순히 식염수를 주사한 처리구의 경우 사망충이 발생되지 않은 반면, 2 ul 투여군에서는 90% 치사율을 보였다. 1ul 처리군에서는 총 개체수의 50%가 치사하였고 모든 충에서 패혈증의 증세를 보였다. Providencia sp.는 파밤나방 유충에도 병원성을 갖는 것으로 조사되었다.

실험예7

- 도포법을 이용한 살충력 검정

본 발명의 곤충병원선충인 Butlerius sp.에서 분리된 Providencia sp.가 등얼룩풍뎅이 유충, 꽃무지 유충에 대하여 도포에 의한 직접적인 살충력을 유발할 수 있는가를 조사하였다.

Providencia sp.와 Xenorhabdus sp. 모두 도포법에 의한 살충성을 보이지 않았다.

따라서 이들 선충공생세균이 숙주해충에 병원성을 보이기 위해서는 carrier로서의 선충의 역할이 중요한다.

실험예8

- 자연 섭식법을 통한 살충력 검정

숙주곤충이 선충공생세균을 직접 섭식함으로서 유발되는 살충효과를 검정하였다.

도 8을 참조한 바와같이 4 strain의 Xenorhabdus sp. 와 Providencia sp. 은 등얼룩풍뎅이 유충에 대하여 우수한 살충성을 보였다. 특히 처리 후 25일 시점에서 Xenorhabdus sp. X19와 X25가 각각 75%와 66.7%로 가장 높은 사충율을 보였고 Providencia sp.은 Xenorhabdus sp. X17과 함께 50%의 사충율을 보였다. 또한 Providencia sp.는 파밤나방 유충에도 구기를 통한 병원성을 갖는 것으로 조사되었다.

따라서 선충공생세균은 자연적인 섭식을 통해서 곤충의 체내에 유입되었을 때도 살충성을 갖는 것으로 조사되었다.

실험예9

- 선충공생세균의 곤충장내공생세균에 대한 길항효과

선충공생세균이 섭식을 통하여 숙주해충의 장에 도달한 후 곤충장내공생세균에 대한 길항 효과를 agar diffusion법을 통하여 검증하는 것으로, 장내공생세균은 등얼룩풍뎅이와 꽃무지 유충을 표면살균한 후 해부하여 Hind gut 내의 공생세균을 멸균수에 현탁한 뒤 영양배지에 spreading하여 분리하였다.

등얼룩풍뎅이 유충으로부터 4 strains, 꽃무지 유충으로부터 3 strains 의 장내 우점세균이 분리되었으며 각각 3개씩의 major bacteria를 순수 분리하였고, 이 세균을 배양 한 후 농도를 OD₆₀₀에서 0.1로 동일하게 조절한 뒤 플레이트에 spreading하였다.

선충공생세균으로는 본 발명의 공시 곤충병원선충인 Butlerius sp.에서 분리한 Providencia sp.와 Steinernema sp.로부터 분리한 Xenorhabdus sp. 23 strain을 사용하였으며, OD₆₀₀에서 4 ~ 5로 조절된 세균 현택액을 paper disk를 깔고 50 ul씩 분주하였다.

24 시간 경과 후 nutrient agar에 생성된 할로(halo)의 직경을 측정하여 길항 정도를 비교해 본 결과 등얼룩풍뎅이 유충로부터 분리된 장내공생세균에 대해서 Xenorhabdus sp. X25, X26, X27 등이 모든 장내 세균에 대하여 고르게 우수한 효과를 보였으며, Providencia sp. 또한 우수한 길항 효과를 갖는 것으로 확인 되었다.

도 9와 도 10을 참조한 바와같이 꽃무지 유충으로부터 분리된 장내공생세균에 대해서는 Xenorhabdus sp. X12, X25 등이 우수한 효과를 보여주었고, Providencia sp. 또한 우수한 길항 효과를 갖는 것으로 확인 되었다. 전체적으로 보았을 때 등얼룩풍뎅이 유충에서 분리된 장내공생세균보다 꽃무지 유충에서 분리된 장내공생세균에 대하여 더 우수한 효과를 보였으나, Providencia sp.의 경우 꽃무지 유충과 등얼룩풍뎅이 유충에 걸쳐 높은 길항효과 갖는 것으로 조사되었다.

이상과 같은 본 발명의 굼벵이류 방제제 및 방제방법은,

굼벵이류에 대해 고살충력을 갖는 곤충병원선충인 버틀리우스와 선충공생세균인 프로비덴시아로 방제제를 제조하여 방제가 이루어지도록 함으로써 골프장 잔디에 발생하는 풍뎅이 유충뿐만 아니라 고구마나 감자등에 피해를 주는 풍뎅이 유충의 방제에도 적용할 수 있으며, 유기합성농약의 대체제로 사용할 수 있어 환경피해를 최소화 할 수 있는 친환경 방제제의 제공이 가능하게 된 것이다.

한편, 상기 서술한 예는, 본 발명을 설명하고자하는 예일 뿐이다. 따라서 본 발명이 속하는 기술분야의 통상적인 전문가가 본 상세한 설명을 참조하여 부분변경 사용한 것도 본 발명의 범위에 속하는 것은 당연한 것이다.

Claims

굼벵이류의 방제제에 있어서,

곤충병원선충인 버틀리우스(Butlerius sp.)와 선충공생세균인 프로비덴시아(Providencia sp.)를 포함하는 굼벵이류 방제제.
야생풍뎅이 유충을 포획하고, 포획된 유충으로부터 추출한 곤충병원선충과 선충공생세균을 이용한 굼벵이류의 방제방법에 있어서,

포획된 유충으로부터 곤충병원선충인 버틀리우스(Butlerius sp.)를 분리하고, 상기 유충으로부터 분리된 버틀리우스를 살균 처리 후 균질화시켜 선충공생세균인 프로비덴시아(Providencia sp.)를 추출하는 분리 및 추출하는 단계와;

추출한 선충공생세균을 배양액으로 배양하고, 이에 곤충병원선충을 접종하여 배양하는 배양단계와;

배양된 감염 곤충병원선충을 굼벵이 다량 서식지역에 살포하여 굼벵이를 사멸시키는 살포단계;를 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 곤충병원선충인 버틀리우스와 선충공생세균인 프로비덴시아를 이용한 굼벵이류 방제방법.
제 2항에 있어서,

상기 살포단계에서 곤충병원선충은 30 ~ 150 IJ/larvae의 농도로 살포됨을 특징으로 하는 곤충병원선충인 버틀리우스와 선충공생세균인 프로비덴시아를 이용한 굼벵이류 방제방법.