CN112375687A - 一种土壤微生物诱集的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种土壤微生物诱集的方法，首先进行微生物培养，先将土壤装入玻璃培养皿中，用蒸馏水将土壤润湿，制作含有固体培养基的微生物诱集装置，将装置置于培养皿中湿润的土壤中，制作成微生物培养装置，再将微生物培养装置置培养箱培养；然后进行微生物分离，将固体培养基捣碎，加入无菌水放置，梯度稀释，取菌液涂布于寡营养培养基、吹干，并置于养箱中培养，观察菌落生长，纯化鉴定后保存。该方法通过固体培养基在土壤中诱集、驯化土壤微生物，有助于获得包括“难培养、繁殖速度慢”的菌在内的土壤微生物，拓展了土壤微生物的分离深度。通过本发明获得的微生物可用于微生物的形态观察、分类鉴定及植物病害防治、农药降解、环境保护等方面。

Description

一种土壤微生物诱集的方法
技术领域
本发明涉及微生物培养技术领域，尤其涉及一种土壤微生物诱集的方法。
背景技术
土壤中具备了各种微生物生长发育所需的营养、水分、空气、酸碱度、渗透压和温度等条件，所以土壤是微生物生活的良好环境，几乎包含了所有的微生物种群，因此土壤是最丰富的“菌种资源库”。土壤中所含微生物量巨大，尤其细菌居多，据估计每克土壤中含有4000～7000种不同的细菌种类，总数共10亿个左右(燕艳,陈健,燕昌江,等.利用分子生物学技术鉴定土壤微生物的方法[J].东北农业大学学报,2008,39(003):129-133.)。
土壤微生物种类丰富，但由于培养分离方法的限制和微生物自身的变异性，目前还不可能将土壤中的全部微生物培养出来。土壤微生物的培养方法主要使用不同营养成分的固体培养基对土壤中可培养的微生物进行分离培养。
常规微生物平板培养法是进行土壤微生物分离培养的常用方法，它采用特有的培养基对土壤中可培养的微生物进行培养分离，一般分为稀释—接种—培养—纯化等步骤，该方法简便易行，一直以来，被广泛应用。然而，该方法也存在不少缺陷，主要表现在固体培养基的选择和实验室培养条件等方面的限制上。
首先，由于微生物对培养基具有选择性，只适用于快速生长且有很高生长量的细菌和能在培养介质中生长的某些细菌。因此有限的几种培养基不可能将土壤中所有的微生物培养出来。例如，在实验室用营养丰富的牛肉膏蛋白胨作为培养基分离土壤微生物时，大量营养贫瘠微生物则不适宜生长。
其次，常规的平板培养法由于无菌水的稀释，使土壤样品中的必须生长因子在稀释过程中损失掉，致使一些特殊的微生物难以培养。
因此利用平板培养法不可能全面地获得土壤中所有的或者绝大多数的微生物的全部信息。据估计，利用平板培养法测定的土壤微生物类群数量仅占土壤中实际存在的微生物总数的0.1％～1.0％(章家恩,蔡燕飞,高爱霞,等.土壤微生物多样性实验研究方法概述[J].土壤,2004,36(004):346-350.)。说明大部分微生物不能用常规的琼脂培养基平板培养技术实现(钟文辉,蔡祖聪.土壤微生物多样性研究方法[J].应用生态学报,2004,15(005):899-904.)。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题及不足，本发明提供了一种土壤微生物诱集的方法。具体采用了以下设计结构及设计方案：一种土壤微生物诱集的方法，包括以下步骤，
步骤S1，微生物培养，包括：
(1)将土壤样品去除杂质和较大块状物后，装入玻璃培养皿中，用蒸馏水采用滴定瓶将土壤润湿；
(2)制作微生物诱集装置，首先在微孔滤膜边缘涂布胶水，将不锈钢平底垫圈置于微孔滤膜上；然后向垫圈内腔加入2.5～4.0mL固体培养基；再用胶水涂布金属垫圈上表面，盖上另一微孔滤膜；
(3)将微生物诱集装置置于(1)中湿润的土壤上，轻轻压实微生物诱集装置，确保微孔滤膜与土壤充分接触，再用剩余土壤将装置完全覆盖，并用蒸馏水采用滴定瓶再次润湿土壤；
(4)盖好培养皿，用封口膜将培养装置封好，并置于25～30℃培养箱培养7～21d；
步骤S2，微生物分离，包括：
(1)从培养箱中取出经过诱集的培养装置，将固体培养基捣碎，加入无菌水放置5～15min后，梯度稀释至10-4；
(2)取10-3、10-4菌液涂布于寡营养培养基，每个梯度涂布5皿，在超净工作台中吹干，并置于25～30℃培养箱中培养3～10d，观察菌落生长情况；
优选的，所述微孔滤膜孔径为0.20～0.80μm。
优选的，所述固体培养基含1.2％结冷胶或琼脂，1％维生素，1％无菌的病原菌裂解液。
优选的，所述无菌的病原菌裂解液为任一病原菌，以后续实验目的而定。
优选的，所述寡营养培养基含0.1％酪蛋白氨基酸，0.1％营养肉汤，1.5％琼脂。
步骤S3，微生物保存，包括：
观察菌落生长情况，根据菌落形态、颜色等不同，将代表性单菌落划线于纯化培养基平板，置于培养箱培养，获得单菌落即为纯培养物。
接种纯培养物于保存培养基，置于恒温振荡培养箱培养后，离心收集菌体，加保存液悬浮菌体，置于-80℃超低温冰箱保藏。
优选的，纯化培养基以g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0及琼脂15.0～19.0；其pH为7.0～7.5。
优选的，纯化培养基以g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0；其pH为7.0～7.5。
优选的，保存培养基成分为：所述保存液为：20～50％甘油、50～80％无菌水。
本发明的工作原理如下：
本发明在微生物诱集装置中加入固体培养基，上下覆孔径0.20～0.80μm的微孔滤膜制成微生物诱集装置，放置于加水湿润的土壤中并置于25～30℃培养7～21d后，取出固体培养基，捣碎稀释后涂布于寡营养的培养基中获得单菌落，诱集过程中，微生物和土壤中的生长因子通过0.20～0.80μm微孔滤膜选择性进入固体培养基，土壤中的生长因子可为特殊微生物提供营养，基本模拟了土壤微生物的天然生存环境，拓展了微生物的分离深度。
本发明与现有技术相比所产生的有益效果是：(1)本发明在微生物诱集时采用固体培养基，在土壤中培养7～21d甚至更长的时间，原位“驯化”土壤微生物，以适应新的室内生长环境；(2)本发明还在固体培养基中添加了无菌的病原菌裂解液，通过化感作用，诱集与病原菌裂解液相互作用的微生物，增强分离的针对性，降低错漏率；(3)本发明在微生物诱集时使用的固体培养基仅含微量维生素、支撑介质结冷胶或琼脂，以及在土壤微生物分离时选用寡营养培养基，选择上述培养基一方面有助于难培养微生物的生长，另一方面可减慢繁殖快的菌的繁殖速度，有效消除微生物间的遮蔽影响，降低分离的随机性。
附图说明
图1为本发明的微生物培养装置在培养箱中培养的示意图。
图2为微生物诱集装置的结构爆炸图。
图3为微生物诱集装置最后粘贴上部微孔滤膜时的示意图。
图4为本发明的流程图。
图5为本发明的富集法与常规培养法获得的细菌数目的比较。
图6为本发明的富集法与常规培养法测得的OTU值差异的比较。
图7为本发明的富集法与常规培养法分离细菌的物种、OTU数目的指数比较。
图8为本发明的富集法与常规培养法两种方法分离的物种丰富度比较。
图9为温度对菌落数形成的影响。
图10为湿度对菌落数形成的影响。
图11为结冷胶、琼脂为诱集介质时培养的细菌数目对比。
图12为以CN、LB、NA、SE培养基分离的平均菌落数。
图13为添加青枯菌裂解液对细菌数目的影响。
附图标号：a、微孔滤膜；b、垫圈；c、固体培养基，e、微生物诱集装置；f、土壤；g、培养皿；h、培养箱；CK、常规培养法；D7、本发明的富集法；CN、寡营养培养基。
具体实施方式
下面结合附图以及具体的实施例对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明。
如说明书附图4所示流程，一种土壤微生物诱集的方法，包括以下步骤，
S1：微生物诱集，
(1)将土壤样品去除杂质和较大块状物后，装入直径120～180mm的玻璃培养皿中，高约为1.5～2.0cm，用蒸馏水采用滴定瓶将土壤润湿；
(2)制作微生物诱集装置，首先在直径50mm、孔径为0.20～0.80μm的微孔滤膜a边缘涂布胶水，将不锈钢平底垫圈b置于微孔滤膜a上；然后向垫圈b内腔加入2.5～4.0mL固体培养基c，固体培养基c含1.0～1.5％结冷胶或琼脂、0.8～1.2％维生素和0.1～10％无菌的病原菌裂解液；再用胶水涂布金属垫圈b上表面，盖上另一孔径为0.20～0.80μm微孔滤膜a；
(3)将微生物诱集装置置于(1)中湿润的土壤上，轻轻压实诱集装置，确保微孔滤膜a与土壤充分接触，再用剩余土壤将装置完全覆盖，并用蒸馏水采用滴定瓶再次润湿土壤；
(4)盖好培养皿，用封口膜将培养装置封好，并置于25～30℃培养箱培养7～21d；
S2：微生物分离，
(1)从培养箱中取出经过诱集的培养装置，将固体培养基c捣碎，加入3～5mL无菌水放置5～15min后，梯度稀释至10-4；
(2)取10-3、10-4菌液涂布于寡营养培养基CN，其中寡营养培养基CN含0.1％酪蛋白氨基酸，0.1％营养肉汤，1.5％琼脂，每个梯度涂布5皿，于超净工作台吹干，并置于25～30℃培养箱中培养3～10d；
(3)收集涂有10-3稀释液的平板上生长的菌落，提取细菌总基因组DNA，并送生物测序公司分析16S V4区序列特征。
步骤S3，微生物保存，包括：
(1)根据菌落形态、颜色等不同，将代表性单菌落划线于纯化培养基平板，置于培养箱培养，获得单菌落即为纯培养物；
(2)接种纯培养物于保存培养基，置于恒温振荡培养箱培养24～48h，1000～15000r/min离心1～2min收集菌体，加入800～1500μL含20～50％甘油的保存液悬浮菌体，置于-80℃超低温冰箱保藏。
实施例1：
为了明确微生物诱集装置富集法D7(称为富集法D7，下同)培养微生物的效率，我们将其与常规培养法CK进行了可培养菌落数和可培养细菌种类两方面的比较。
1、富集法D7：
S1：微生物诱集，
(1)将土壤样品去除杂质和较大块状物后，装入直径120mm的玻璃培养皿中，土层厚度约为1.5cm，用蒸馏水采用滴定瓶将土壤润湿；
(2)如图2、3所示，制备微生物诱集装置，首先在直径50mm、孔径为0.45μm的微孔滤膜a边缘涂布胶水，将不锈钢平底垫圈b置于微孔滤膜a上；然后向垫圈b内腔加入3mL固体培养基c，固体培养基c含1.2％结冷胶和1.0％维生素；再用胶水涂布金属垫圈b上表面，盖上另一孔径为0.45μm微孔滤膜a；
(3)将微生物诱集装置置于(1)中湿润的土壤上，轻轻压实装置，确保微孔滤膜a与土壤充分接触，再用剩余土壤将装置完全覆盖，并用蒸馏水采用滴定瓶再次润湿土壤；
(4)盖好培养皿，用封口膜将培养装置封好，并置于30℃培养箱培养7d，期间观察土壤湿度，若土壤湿度低则用无菌水补足(图1)；
S2：微生物分离与鉴定，
(1)从培养箱中取出经过诱集的培养装置，将固体培养基c捣碎，加入3mL无菌水放置10min后，梯度稀释至10-4；
(2)取10-3、10-4菌液涂布于寡营养培养基CN，其中寡营养培养基CN含0.1％酪蛋白氨基酸，0.1％营养肉汤，1.5％琼脂，每个梯度涂布5皿，于超净工作台吹干，并置于30℃培养箱中培养7d，观察计数菌落数。上述实验设置3次重复。培养7d后，计数涂布有10-4稀释液的平板的菌落数；
(3)收集涂有10-3稀释液的平板上生长的菌落，提取细菌总基因组DNA，并送生物测序公司分析16S V4区序列特征。
2、常规培养法CK：
称取1g土壤，置于100mL PBS缓冲液中，1L PBS缓冲液含有0.24g磷酸二氢钾、1.44g磷酸氢二钠、8g氯化钠、0.2g氯化钾(pH 7.4)，摇培30min后静置10min，取上清液梯度稀释至10-3，取10-2、10-3菌液涂布LB培养基，每个梯度涂布5皿，置于超净台吹干，并放入30℃培养箱培养。7d后，计数涂布有10-3稀释液的平板的菌落数；并收集涂有10-2稀释液的平板上生长的菌落，提取细菌总基因组DNA，送生物测序分析16S rRNA基因V4区序列特征。
结果表明，富集法D7获得的细菌数目比常规培养法CK多一个数量级(10倍)(图5)；富集法D7测得的OTU(operational taxonomic units)值与常规分离法没有差异(图6)，但富集法D7分离细菌的物种(observed species)、OTU数目的指数(chao1)均高于常规培养法CK获得的测量值(图7)，说明富集法D7分离获得的细菌种类比常规培养法CK多；富集法D7分离细菌的丰富度和均一度不如常规培养法CK，富集法D7分离的细菌物种组成的丰富度和均匀度指数ace和shannon低于常规培养法CK，而simpson指数则相反(图7)；富集法D7和常规培养法CK均能分离到假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、食酸菌属(Acidovorax spp.)、芽孢杆菌(Bacillus spp.)、金黄杆菌属(Chryseobacterium spp.)等属的细菌，但富集法D7获得更多的金黄杆菌属、假黄单胞菌属、食酸菌属、土地杆菌属(Pedobacter spp.)、噬几丁质杆菌属(Chitinophaga spp.)及成对杆菌属(Dyadobacter spp.)的细菌，而常规培养法CK分离更多的节杆菌属(Arthrobacter spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、不动杆菌属(Acinetobacter spp.)、栖水菌属(Enhydrobacter)等属的细菌(图8)。
综述所述，富集法D7比常规培养法CK有明显的区别，富集法D7比常规培养法CK分离获得更多的细菌，且分离获得细菌种类更丰富，富集培养法能诱集金黄杆菌、假黄单胞菌、食酸菌、土地杆菌、噬几丁质杆菌及成对杆菌等属的细菌。此外，本实验中富集法D7用10-3培养物进行分析，而常规培养法CK用10-2培养物，可能低估了富集法D7分离获得的菌种的数量和种类。
实施例2：
为明确适合于富集法D7分离细菌的培养温度、湿度，在不同培养温度下按富集法D7培养土壤细菌，比较不同条件下分离获得的可培养细菌数目；通过向土壤中添加不同量的无菌水模拟低、中、高三种湿度条件，分析湿度对细菌分离数目的影响。
实施例2除以下试验及结果不同外，其余操作步骤与实施例1相同。
1、培养温度对可培养细菌数目和种类的影响
培养装置分别置于25℃、30℃、37℃和室温(温度不稳定，在20～35℃培养。
2、土壤湿度对可培养细菌数目和种类的影响
微生物诱集装置的制作与前述方法相同，制作完毕后将微生物诱集装置置于(1)中湿润的土壤上，轻轻压实装置，确保微孔滤膜a与土壤充分接触，再用剩余土壤将装置完全覆盖，并用蒸馏水采用滴定瓶再次分别加入20、40和60mL无菌水润湿土壤。盖好培养皿，用封口膜将培养装置封好，并置于30℃条件下暗培养7d。土壤细菌的分离、培养、观察计数与前述微生物分离的方法相同。
结果表明，不同培养温度对菌落数影响显著，在25℃、30℃、37℃和室温条件下分离获得的菌落数的平均对数值(Log10)分别为6.022、6.488、6.271、5.988(图9)，说明运用富集法D7在30℃条件下培养获得的菌落数最多；在低、中、高条件培养土壤、诱集细菌，获得的菌落数平均对数值分别为7.13、7.18、6.84(图10)，说明中等偏低的湿度适宜于富集法D7。
实施例3：
进一步地，为明确诱集培养基、分离培养基对可培养细菌数目的影响，以琼脂、结冷胶为诱集介质诱集土壤细菌，分析两种介质对可培养细菌数目的影响；用不同的微生物分离培养基培养细菌，比较不同培养基分离可培养细菌的差异，为高效利用富集法D7分离土壤细菌提供参考。
实施例3除以下试验及结果不同外，其余操作步骤与实施例1相同。
1、不同诱集介质对可培养细菌数目的影响
(1)制作微生物诱集装置时，设置固体培养基c分别以1.2％结冷胶、1.2％琼脂为支撑介质的处理；
(2)培养装置置于28℃培养箱培养7、14、21d；
2、分离培养基对可培养细菌菌落数形成的影响
(1)取10-3、10-4菌液分别涂布于寡营养培养基CN、LB、NA、SE培养基。其中寡营养培养基CN含0.1％酪蛋白氨基酸、0.1％营养肉汤、1.5％琼脂，LB培养基含1％胰蛋白胨、0.05％酵母提取物、0.05％氯化钠、1.5％琼脂，NA培养基含1.0％蛋白胨、0.03％牛肉膏粉、0.05％氯化钠、1.5％琼脂，SE培养基含有10％土壤浸提液、1.5％琼脂；
(2)土壤浸提液按下述步骤制成：称取1g土壤，置于100mL PBS缓冲液中，1L PBS缓冲液含有0.24g磷酸二氢钾、1.44g磷酸氢二钠、8g氯化钠、0.2g氯化钾(pH 7.4)，摇培30min后静置10min，取上清液经0.22μm微孔滤膜a过滤3次制成无菌土壤浸提液；
结果表明，结冷胶为诱集介质时培养的细菌数目比以琼脂为介质培养的细菌数目多一个数量级(10倍)(图11)；以寡营养的CN为分离培养基时分离获得的平均菌落数的对数值(Log10)最高，以寡营养、LB、NA、SE培养基分离的平均菌落数的对数值分别为6.48、6.26、6.46、6.12(图12)。综上所述，分别以结冷胶和寡营养培养基CN为诱集介质和分离培养基时获得的可培养细菌菌落数最佳。
实施例4：
为改良诱集培养基成分，在培养基中加入一定比例的病原菌裂解液，定向诱集对病原菌有趋化性的细菌，本实验比较分析了不同浓度青枯菌裂解液对可培养细菌数目的影响。
实施例4除以下试验及结果不同外，其余操作步骤与实施例1相同。
(1)固体培养基c以1.2％结冷胶和1.0％维生素为基础培养基，并分别加入0、0.1％、1％、10％青枯菌裂解液，设置仅含1.2％结冷胶及含1.2％结冷胶和1％青枯菌裂解液为对照；
(2)青枯菌裂解液由下述步骤制备：挑取新活化的青枯菌单菌落置于100mL CG培养基，28℃180r/min培养24h，收集菌体后用25mL 0.9％氯化钠悬浮菌体，用超声波破碎仪破碎细胞5min，4℃6000r/min条件下离心10min，取上清再次离心，用0.22μm微孔滤膜a2次，滤液即为青枯菌裂解液，置于-20℃备用；
结果表明，随着诱集培养基中青枯菌裂解液浓度的增多，可培养的细菌数目逐渐增多，但加入10％青枯菌裂解液时形成的菌落数目下降。其中，以1.2％结冷胶、1.0％维生素、1.0％青枯菌裂解液为诱集培养基时分离获得的细菌数量最佳。上述结果说明在诱集培养基中加入一定比例的病原菌裂解液可以诱集更多的细菌(图13)。
实施例5：
实施例5除以下试验及结果不同外，其余操作步骤与实施例1相同。
(1)根据菌落形态、颜色等不同，挑取有10-4稀释液的平板上生长的单菌落，划线于纯化培养基平板，置于培养箱培养，获得纯培养物；
(2)接种纯培养物于保存培养基，置于恒温振荡培养箱培养后，离心收集菌体，加保存液悬浮菌体，置于-80℃超低温冰箱保藏；
(3)对上述纯培养物，提取细菌基因组DNA，通过分子生物学方法鉴定。分子鉴定方法如下：细菌基因组DNA的提取试剂盒，方法参见试剂盒说明书。PCR扩增选用引物F27/R1492，常规条件扩增，扩增产物经胶回收后，连接于载体pEAZY-T5 Zero载体，热激转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取菌落以M13F/M13R为引物进行菌落PCR鉴定。阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。
试验结果：利用本发明的方法，从293份土壤样品中分离到6720株菌，并已保存于云南省烟草农业科学研究院农艺研究中心菌株保存库。对其16S rDNA序列分析后发现，其中包括常见的芽孢杆菌、假单胞菌和肠杆菌，还包括寡养单胞菌(Stenotrophomonasspp.)、金黄杆菌(Chryseobacterium spp.)和黄单胞菌(Xanthomonas spp.)。上述结果说明，本发明的方法可诱集到多种不同属的细菌。
本发明的保护范围不仅仅局限于上述实施例，上述实施例只是为了帮助解释和说明本发明，而不是对本发明的保护范围进行限制，只要设计与本发明的设计相同或者是只要是等同替换的都落在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (10)

1.一种土壤微生物诱集的方法，所述微生物包括细菌，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1，微生物培养，包括：
(1)分选土壤：将土壤样品去除杂质和较大块状物后，装入培养皿中，用蒸馏水将土壤润湿；
(2)制作微生物诱集装置：
首先在微孔滤膜边缘涂布胶水，将不锈钢平底垫圈置于微孔滤膜上；然后向垫圈内腔加入固体培养基；再用胶水涂布金属垫圈上表面，盖上另一微孔滤膜；
将所述微生物诱集装置置于(1)中湿润的土壤上，轻轻压实该微生物诱集装置，确保微孔滤膜与土壤充分接触，再用土壤将微生物诱集装置完全覆盖，并用蒸馏水再次润湿土壤；
(3)培养：盖好培养皿，用封口膜将玻璃培养基封好，即制作成微生物培养装置，并置于培养箱培养；
步骤S2，微生物分离，包括：
(1)制备菌悬液并梯度稀释：从培养箱中取出经过微生物诱集的培养装置，将固体培养基捣碎，加入无菌水放置5～15min后，梯度稀释至10-4；
(2)涂布寡营养平板并培养：取10-3、10-4菌液涂布于寡营养培养基，每个梯度涂布5皿，于超净工作台吹干，并置于培养箱培养；
步骤S3，微生物保存，包括：
(1)根据菌落形态、颜色等不同，将代表性单菌落划线于纯化培养基平板，置于培养箱培养，获得单菌落即为纯培养物；
(2)接种纯培养物于保存培养基，置于恒温振荡培养箱培养后，离心收集菌体，加保存液悬浮菌体，置于-80℃超低温冰箱保藏。
2.根据权利要求1所述的一种土壤微生物诱集的方法，其特征在于，步骤S1微生物培养中：
所述土壤样品可以是任一来源的土壤。
3.根据权利要求1所述的一种土壤微生物诱集的方法，其特征在于，步骤S1微生物培养中：
所述培养温度为：25～30℃，时间7～21d；
所述固体培养基成分为：1.0～1.5％结冷胶或琼脂、0.8～1.2％维生素。
4.根据权利要求1至3所述的微生物诱集的方法，其特征在于，步骤S1微生物培养中：
所述固体培养基成分还可含0.1～10％任一病原菌无菌裂解液。
5.根据权利要求1至4任一项所述的一种土壤微生物诱集的方法，其特征在于：
所述微孔滤膜孔径为0.20～0.80μm；所述用蒸馏水将土壤润湿采用滴定瓶实现。
6.根据权利要求5所述的一种土壤微生物诱集的方法，其特征在于：
用于细菌诱集时微孔滤膜孔径不大于0.45μm；用于纯微生物在土壤中的培养时微孔滤膜孔径不大于0.20μm。
7.根据权利要求1所述的一种土壤微生物诱集的方法，其特征在于，步骤S2微生物分离中：
所述培养温度为：25～30℃，时间7～14d；
所述寡营养培养基成分为：0.1％酪蛋白氨基酸、0.1％营养肉汤及1.5％琼脂。
8.根据权利要求1所述的一种土壤微生物诱集的方法，其特征在于，步骤S3微生物保存中：
所述培养温度为：25～30℃，时间48～72h；
所述纯化培养基以g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0及琼脂15.0～19.0；其pH为7.0～7.5。
9.根据权利要求1所述的一种土壤微生物诱集的方法，其特征在于，步骤S3微生物保存中：
所述培养温度为：25～30℃，时间24～48h；
所述保存培养基以g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0；其pH为7.0～7.5。
10.根据权利要求1所述的一种土壤微生物诱集的方法，其特征在于，步骤S3微生物保存中：
所述保存温度为：-80℃；
所述保存液为：20～50％甘油、50～80％无菌水；
所述纯培养物可用于微生物的形态观察、分类鉴定及微生物在植物病害防治、农药降解、环境保护等方面。
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