CN108969956B

CN108969956B - 一种杀菌剂醚菌酯的降解菌株及其应用

Info

Publication number: CN108969956B
Application number: CN201810846938.3A
Authority: CN
Inventors: 陈少华; 滕诗雨; 冯彦媚; 占卉; 顾雅雯; 郭毅博; 温小云
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2018-07-27
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2038-07-27
Also published as: CN108969956A

Abstract

本发明公开了一种杀菌剂醚菌酯的降解菌株及其应用。该菌株为中华单胞菌（Sinomonas soli）TS‑04，于2018年7月5日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：60410。本发明首次公开了中华单胞菌对醚菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的降解作用，并筛选得到上述高效快速降解菌株TS‑04，而且，该菌在较宽的pH和温度范围内均能有效降解醚菌酯，并耐受较高浓度杀菌剂，可以作为优良的农药降解菌应用于水体和土壤等污染环境的生物修复方面。本发明为打破现有治理农药残留污染瓶颈提供了新的开发途径，丰富了农药降解菌的种质资源库，应用前景好。

Description

一种杀菌剂醚菌酯的降解菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物降解技术领域。更具体地，涉及一种杀菌剂醚菌酯的降解菌株及其应用。

背景技术

甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂常见类型有醚菌酯、嘧菌酯、吡唑醚菌酯，是目前全球销量额最高的保护性杀菌剂，是化学保护性杀菌剂中持效期最长的成分。该类杀菌剂内吸活性好，杀菌谱广，对草莓白粉病、黄瓜白粉病、梨黑星病、稻瘟病等真菌性植物病害具有良好的防效，对几乎所有真菌性病害均有防治效果，对葡萄所有真菌性病害均有效。因此应用十分广泛。但是，甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂不同成分，安全性存在较大差别；其除了杀菌活性外，也具有一定的生长调节作用，在使用中需加以注意。

而且，化学合成农药普遍具有难于降解、半衰期长的特点，大量施用或操作不规范都会残留在作物、水体和土壤等环境中，长久下来会影响土壤肥力，甚至降低农作物产量，更会对生态环境和人类健康造成危害。研究报道表明，醚菌酯对大型溞和草鱼亚成体具有潜在毒性（Cui, Chai and Liu, et al. Toxicity of three strobilurins (kresoxim-methyl, pyraclostrobin, and trifloxystrobin) on Daphnia magna[J].Environmental Toxicology and Chemistry, 2017, 36(1): 182-189.），并对两栖类胚胎有严重的致畸和致癌作用（Li, Liu and Yang, et al. Strong lethality andteratogenicity of strobilurins on Xenopus tropicalis embryos: basing on tenagricultural fungicides[J]. Environmental Pollution, 2016, 208(B): 868-874.）。此外，醚菌酯原药对大鼠经口亚慢性毒性实验表明这种农药对哺乳类动物的血液和肝脏都有毒性作用，肝脏可能是其重要的毒性靶器官（蔡婷峰, 葛怡琛, 高洪彬等.醚菌酯原药对SD大鼠亚慢性经口毒性研究,中国职业医学,2015,3: 2095-2619）。

微生物降解农药的研究始于20世纪40年代末，在目前已有的处理农药残留方法中，微生物降解以其安全、成本低、操作便利且无二次污染的优点倍受国内外研究人员的关注。而微生物降解特异性比较明显，因此需要筛选到高效降解的菌种。目前，关于醚菌酯降解菌的研究非常少，目前尚未有关于醚菌酯生物修复的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有醚菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂农药残留降解修复技术的不足，提供一株降解醚菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂农药的新菌株，能够快速高效降解醚菌酯等，可用于修复醚菌酯残留污染的土壤和水体等环境。

本发明的目的是提供中华单胞菌（Sinomonas soli）在降解甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂以及修复甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂污染的自然环境方面的应用。

本发明另一目的是提供一株可高效降解甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的中华单胞菌（Sinomonas soli）菌株TS-04。

本发明的再一目的是提供所述菌株TS-04在降解甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂以及修复甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂污染的自然环境方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首次发现中华单胞菌（Sinomonas soli）对醚菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的降解作用，并筛选得到一株高效快速降解醚菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的中华单胞菌菌株TS-04，该菌株是从广东佛山某农药厂污水处理口的活性污泥中经人工富集培养、分离纯化得到，对醚菌酯具有高效快速的降解效能，在以醚菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂为唯一碳源的基础盐培养基中培养5天，对醚菌酯的降解率达到85%以上；且在较宽的pH（5.0～9.0）和温度（25～37℃）条件下均能较好降解醚菌酯，可耐高浓度醚菌酯；将该菌株接种污染土壤10天后，土壤中杀菌剂残留量降低85%以上，降解能力优异，可高效快速去除水体和土壤中该类农药残留量，菌株TS-04可以作为优良的生物降解菌应用于醚菌酯农药污染的生物修复。

因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：

中华单胞菌（Sinomonas soli）在降解甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂方面的应用。

中华单胞菌（Sinomonas soli）在修复甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂污染的自然环境方面的应用。

一株可高效降解甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的菌株，为中华单胞菌（Sinomonas soli）菌株TS-04，于2018年7月5日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：60410。

上述菌株TS-04在降解甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂方面的应用。

上述菌株TS-04在修复甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂污染的自然环境方面的应用。

其中，优选地，所述甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂为醚菌酯、嘧菌酯和/或吡唑醚菌酯。

具体的，所述自然环境包括水体或土壤。

一种含有中华单胞菌（Sinomonas soli）的高效降解甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的菌剂。

优选地，菌剂中中华单胞菌为所述菌株TS-04。

优选地，所述菌剂中菌体数量不低于1.0×10³CFU/mL。

更优选地，所述菌剂中菌体数量不低于1.0×10⁵～1.0×10⁹CFU/mL。如1.0×10⁷～CFU/mL。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次公开了中华单胞菌（Sinomonas soli）对醚菌酯、嘧菌酯、吡唑醚菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的降解作用，并筛选得到一株高效快速降解醚菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的中华单胞菌（Sinomonas soli）菌株TS-04，丰富了农药降解菌的种质资源库，在该类农药残留污染的水体和土壤生物修复中有重大应用价值，为打破现有治理农药残留污染瓶颈提供了新的开发途径。

而且，该菌在较宽的pH和温度范围内均能有效降解醚菌酯，并耐受较高浓度醚菌酯（200 mg/L），证明菌株TS-04可以作为优良的农药降解菌应用于醚菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂污染环境的生物修复方面。

附图说明

图1为TS-04菌在 LB固体培养基上培养1 d的菌落形态特征图。

图2为TS-04菌的扫描电镜图。

图3为TS-04菌的 16S rDNA 的系统发育树。

图4为TS-04菌生长与降解醚菌酯的动态关系。

图5为TS-04菌在不同pH条件下对醚菌酯的降解效果。

图6为TS-04菌在不同温度下对醚菌酯的降解效果。

图7为TS-04菌在不同接菌量下对醚菌酯的降解效果。

图8为TS-04菌对不同浓度醚菌酯的降解效果。

图9为TS-04菌生长与降解嘧菌酯的动态关系。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备；以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中所述培养基配方如下：

基础盐培养基（MSM，g/L）：（NH₄）₂SO₄，2.0 g；CaCl₂·2H₂O，0.01 g；FeSO₄·7H₂O，0.001 g；Na₂HPO₄·12H₂O，1.5 g；MgSO₄·7H₂O，0.2 g；KH₂PO₄，1.5 g，pH 8.0。固体培养基：每1 L液体培养基加入17～20 g琼脂粉。

LB培养基：酵母提取物 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，氯化钠 10.0 g，去离子水1000mL，pH7.2，121℃灭菌20min。固体培养基：每1 L液体培养基加入17～20 g琼脂粉。

实施例1 菌株的分离与鉴定

1、醚菌酯降解菌株的筛选分离：

采集广东佛山某农药厂排污口的活性污泥，称取5 g活性污泥样品加入到50 mL含有醚菌酯（50 mg/L）的上述 MSM 液体培养基中。经30℃，200 rpm 培养7 d后，每次按10%的接种量，将农药质量浓度从50 mg/L依次升至100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、800 mg/L连续富集培养。然后将转接4次的培养液梯度稀释涂布于含有50 mg/L醚菌酯的LB固体平板上，30℃倒置培养2d。待平板上长出单菌落后，挑取单菌落多次划线纯化，分离获得一株高效细菌，编号为TS-04。

2、菌株TS-04的鉴定

（1）形态学鉴定：

将菌株TS-04接种于 LB 固体平板上 30℃倒置培养1 d，观察其菌落形态。LB 平板培养 1 d的菌落成圆形，微凸起，淡黄色，湿润，半透明，边缘整齐，表面光滑（见图 1）。扫描电镜下可以观察到该菌细胞呈球状或近球状（见图 2）。

（2）生理生化鉴定：

该菌株属于革兰氏阴性菌，好氧。接触酶、ONPG、硝酸盐还原试验、V-P测定呈阳性；淀粉水解试验、脲酶试验、吲哚试验、赖氨酸脱羧酶试验、精氨酸双水解酶试验和鸟氨酸脱羧酶试验呈阴性。其生理生化鉴定结果如表1所示。

表1 降解菌株TS-04生理生化特征结果

注：＋, 代表反应阳性；－, 代表反应阴性。

（3）Biolog系统鉴定：

菌株TS-04活化后培养16～24 h，依据微生物在微孔板上氧化或利用化合物的能力，置于Biolog Microstation System读数仪上读出结果。Biolog微生物自动分析系统的鉴定结果见表2。Biolog微生物自动分析系统结果显示为Sinomonas，说明菌株TS-04与中华单胞菌（Sinomonas）匹配良好。

表2 Biolog系统鉴定结果

（4）16S rDNA 分子生物学鉴定：

提取菌株TS-04基因组 DNA，以提取的基因组为模板，采用16S rDNA细菌通用引物（27F：5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1429R：5'- GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）进行 PCR 扩增，PCR 产物委托上海英潍捷基贸易有限公司进行测序。将菌株测得的16S rDNA序列在GenBank 数据库中利用BLAST进行比对分析，并选择同源性较高的相关序列利用Clustal1.8.1及MAGE 5.0软件构建系统进化树及分析进化关系。

如图3所示，本发明分离纯化得到的菌株TS-04的 16S rDNA 序列与Sinomonas soli CW 59同源性达 99%，进化距离最近。其培养特征与扫描电镜观察特征与中华单胞菌（Sinomonas soli）也最为相似，因此本发明筛选获得的降解菌鉴定为中华单胞菌（Sinomonas soli）。

因此，基于上述鉴定结果，本发明的菌株TS-04鉴定为中华单胞菌（Sinomonas soli），菌株分类命名为Sinomonas soli TS-04，并于2018年7月5日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：60410，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2 菌株TS-04对醚菌酯的降解效果实验

1、实验方法

（1）种子液制备：将纯化后的菌种TS-04接入含有5 mL的LB液体培养基过夜活化培养至对数期，4℃低温离心后菌体用生理盐水（0.9% NaCl）冲洗，所得菌体作为接种体。

（2）降解性能测定：按0.3 g/L湿菌体的接种量（等同于1.0×10⁷CFU/mL），分别向50 mL 含有醚菌酯（25 mg/L）的 MSM 培养液中接种，以不接菌作为对照，每组三个重复。在30 ℃，200 rpm 恒温摇床培养5d，每1 d取样一次，采用分光光度计测定OD₆₀₀值表示菌株TS-04的生长情况，采用HPLC测定其对醚菌酯的降解情况。

（3）色谱条件：采用安捷伦公司1260 Infinity Ⅱ型高效液相色谱仪。色谱柱为安捷伦C₁₈反相柱 (Phenomenex, 250 nm×4.60 mm, 5 μm)，进样温度为30 ℃，进样量10 μL，流速0.8 mL/min，流动相为色谱乙腈：超纯水 = 60：40，检测波长210 nm。

按照下式计算醚菌酯降解率：降解率（%）=（1-A ₁/A ₀）×100，A ₁为降解菌处理后醚菌酯残留浓度，A ₀为对照处理后的醚菌酯残留浓度。

质量控制：采用外标法校正标准物质制作标准曲线。

2、实验结果

结果如图4所示，菌株TS-04在培养初期就能够快速降解醚菌酯，随着培养时间的延长，醚菌酯农药降解与降解菌株TS-04生长呈正相关。在醚菌酯作为唯一碳源条件下，菌株TS-04没有生长和降解延滞期，培养1 d、2 d后降解率分别达到15.8%、32.4%，在2～3 d进入生长对数期，此时该菌株对醚菌酯的降解最快，降解率可达到73.7%。随着菌群密度的持续增长，对醚菌酯的降解率也随之上升。在培养的第4 d，菌株TS-04的生长进入稳定期，此时84.6%的醚菌酯被降解，培养4 d后菌株开始进入衰亡期，菌群密度下降，降解效率开始降低，第5 d测得菌株TS-04对醚菌酯的降解率为85.9%。而对照组（5 d自然降解率）仅为13.2%。

该结果说明菌株TS-04可利用醚菌酯作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，在醚菌酯浓度为25 mg/L时，培养至5 d，降解率为85.9%，表明该菌株具有高效快速降解醚菌酯的能力。

实施例3 菌株TS-04对醚菌酯的降解特性研究

1、实验方法

（1）pH值对 TS-04降解醚菌酯的影响：

分别向50 mL不同 pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）的 MSM 培养液中按0.3 g/L湿菌体的接种量接种（等同于1.0×10⁷CFU/mL），并添加醚菌酯使其终浓度为25 mg/L，以不接菌作为对照，每组三个重复。在 30 ℃，200 rpm 恒温摇床培养4 d之后，采用HPLC测定菌株TS-04在不同pH条件下对醚菌酯的降解情况。

（2）温度对TS-04降解醚菌酯的影响：

向50 mL的 MSM 培养液中按0.3 g/L湿菌体的接种量接种（等同于1.0×10⁷CFU/mL），并添加醚菌酯使其终浓度为25 mg/L，以不接菌作为对照，每组三个重复，分别放在温度为25 ℃、28 ℃、 30 ℃、35 ℃、37 ℃的恒温摇床中，200 rpm 培养4 d之后，采用HPLC测定菌株TS-04在不同培养温度条件下对醚菌酯的降解情况。

（3）接种量对TS-04降解醚菌酯的影响：

分别设置不同初始接种量（0.05、0.1、0.2、0.3和0.5 g·L^-1），分别接种到含有50mL的 MSM 培养液中，并添加醚菌酯使其终浓度为25 mg/L，在30 ℃、200 rpm 摇床条件下培养4 d之后，采用HPLC测定菌株TS-04在不同初始接种量条件下对醚菌酯的降解情况。

（4）醚菌酯初始浓度对TS-04降解性能的影响：

分别向50 mL含有不同初始浓度醚菌酯（10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L）的 MSM 培养液中按0.3 g/L湿菌体的接种量接种（等同于1.0×10⁷CFU/mL），以不接菌作为对照，每组三个重复，在 30 ℃、200 rpm培养4 d之后，采用HPLC测定菌株对不同初始浓度醚菌酯的降解情况。

2、实验结果如图5～8所示。

图5显示pH值对菌株TS-04降解醚菌酯的影响，在 pH值为7.0～9.0的范围内，该菌对醚菌酯的降解效果较好，当pH为8.0时降解效果最好；当pH低于或高于8.0时，其降解率下降，特别是在酸性条件下降解率较低。

图6显示温度对菌株TS-04降解醚菌酯的影响，当温度在25～30 ℃范围内，该菌对醚菌酯的降解率较高，在30 ℃时对醚菌酯的降解率达到最高；当温度高于30 ℃，降解能力有所下降，当温度提高至37 ℃时，其降解率约为55%。

图7显示接种量对菌株TS-04降解醚菌酯的影响，该菌株在接菌量为0.3～0.5g/L条件下均能较好地降解醚菌酯，接种量为0.3 g/L降解效果最好；在0.05～0.3g/L范围内，该菌株对醚菌酯的降解率随接种量的增加而逐渐上升。

图8显示醚菌酯初始浓度对菌株TS-04降解性能的影响，该菌株在醚菌酯初始浓度为25～50 mg/L范围内保持较高的降解率，最适宜浓度为25 mg/L；但当初始浓度增加到200mg/L，降解率迅速降低。

结果表明，菌株TS-04在较宽pH（5.0～9.0）和温度范围内（25～37 ℃）均能较好降解醚菌酯，并能够耐受200 mg/L醚菌酯，为其在复杂环境中的应用提供了保证。

实施例4 菌株TS-04对土壤中醚菌酯降解效果研究

1、供试土样

农田表层土(3～10 cm)，取自华南农业大学教学农场试验田，属红壤土，超过5年未施用醚菌酯农药。

土壤样品取回后首先置于阴凉通风处自然风干，风干后碾磨，过2mm筛，分别取一定量的醚菌酯溶于丙酮中，然后浸泡硅藻土，使醚菌酯被完全吸附。浸泡后的硅藻土置于通风橱中吹干，将其拌入土壤中，使土壤中醚菌酯的终浓度为50 mg/kg。取500 g土样于30℃恒温恒湿培养箱中培养，按1 .0×10⁷CFU/g的接种量接入TS-04降解菌悬液，以加蒸馏水的作为对照，土壤的持水量保持在40％。在30 ℃和避光条件下连续培养10天，并定期取样，HPLC法测定醚菌酯残留量并计算降解率。降解率计算方法如实施例2。

2、测定结果如表3，培养10 d后，菌株TS-04对土壤中的醚菌酯降解率可达到88.5%。

表3 菌株TS-04降解土壤中醚菌酯的降解效果

结果表明，菌株TS-04在直接施入土壤中后，没有出现不降解或降解滞后效应现象，其降解性能稳定，为菌株TS-04对醚菌酯的土壤修复提供了科学依据。

实施例5 菌株TS-04对其它甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂降解效果研究

1、实验方法

（1）种子液制备：如实施例2。

（2）降解性能测定：按0.3 g/L湿菌体的接种量（等同于1.0×10⁷CFU/mL）接种，向50 mL的 MSM 培养液中接种，并添加嘧菌酯使其终浓度为50mg/L，以不接菌作为对照，每组三个重复。在 30 ℃，200 rpm 恒温摇床培养7 d，每1 d取样一次，采用分光光度计测定OD₆₀₀值表示菌株TS-04的生长情况，采用HPLC测定其对嘧菌酯的降解情况。

色谱条件和降解率计算方法：如实施例2。

2、实验结果

结果如图9所示，菌株TS-04在培养初期就能够快速降解嘧菌酯，随着培养时间的延长，嘧菌酯农药降解与降解菌株TS-04生长呈正相关。在嘧菌酯作为唯一碳源条件下，降解菌株TS-04没有生长和降解延滞期，在1～4 d降解最快，培养4 d和7 d后降解率分别达到68.8%和80.2%。而对照组（7 d自然降解率）仅为9.1%。

结果表明，菌株TS-04可利用嘧菌酯作为唯一碳源进行生长，在嘧菌酯浓度为50mg/L时，培养至7 d，降解率为80.2%，表明该菌株具有高效快速降解嘧菌酯的能力，也表明该菌株对其它甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂同样具有较好的降解效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株可高效降解甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的菌株，其特征在于，其为中华单胞菌(Sinomonas soli)菌株TS-04，于2018年7月5日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：60410，所述甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂为醚菌酯、嘧菌酯和/或吡唑醚菌酯。

2.权利要求1所述菌株TS-04在降解甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂方面的应用，其特征在于，所述甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂为醚菌酯、嘧菌酯和/或吡唑醚菌酯。

3.权利要求1所述菌株TS-04在修复甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂污染的自然环境方面的应用，其特征在于，所述甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂为醚菌酯、嘧菌酯和/或吡唑醚菌酯。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述自然环境为水体或土壤。

5.一种高效降解甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述菌株TS-04，所述甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂为醚菌酯、嘧菌酯和/或吡唑醚菌酯。