CN111471608A - 一种吸附锰且对植物具有促生性能的菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于锰吸附技术领域，公开了一种吸附锰且对植物具有促生性能的菌株及其应用，所述吸附锰且对植物具有促生性能的菌株为苏云金芽孢杆菌HM7，已于2019年10月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2019786。所述应用包括以锰污染为主的锰矿修复；其他重金属为主，伴生锰污染的土壤污染修复。当前利用微生物治理修复重金属污染过程中，多数仅考虑微生物对重金属离子的吸附性能，吸附重金属的微生物以移除为主。本发明充分考虑锰元素对植物具有二重属性，即在适宜浓度条件下，对植物具有重要作用，仅在高浓度条件下对植物具有毒害作用，因此吸附后的菌株可作为后续植物恢复的营养来源。

Description

一种吸附锰且对植物具有促生性能的菌株及其应用
技术领域
本发明属于锰吸附技术领域，尤其涉及一种吸附锰且对植物具有促生性能的菌株及其应用。
背景技术
目前，最接近的现有技术：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)被发现已有100年的历史，利用苏云金杆菌菌株能够产生毒素的特性，苏云金杆菌被广泛应用于虫害防治，在矿山修复方面较少。利用吸附重金属的苏云金芽孢杆菌MRP-3进行矿山修复，但所针对的重金属仅为铅和/或铬。目前尚无对锰具有良好吸附性能的苏云金芽孢杆菌菌株被报道、保存。
锰在自然界广泛存在，一方面锰本身是植物必须的微量元素，锰为叶绿体的组成成分，对植物叶绿素合成和光合作用具有促进功能，能够改善物质运输的能量供应，促进碳水化合物合成与运输，影响氧化还原和呼吸作用，促进花粉发芽、花粉管伸长及果实膨大，促进核酸磷酸代谢，缺锰植物叶片的叶脉失绿或呈淡绿色，叶脉出现深绿色条纹肋骨状，受害叶片失绿部分变成灰色并局部坏死，植株生长瘦弱，发的发育不良，典型的缺锰症状有燕麦的“灰斑病”，甜菜的“黄斑病”，菠菜的“黄病”，薄壳山核桃的“鼠耳病”等。同时，过量的锰对植物具有毒害作用，植物吸收过量锰会产生生理代谢失调、生长发育受阻的中毒现象。锰污染是指人类生产活动中排放的含锰物质对环境造成的污染。过量的锰对植物、人体、生态系统等等均会产生较大的危害，锰对人类的危害主要作用于神经系统。锰污染修复是当前重金属修复的重要课题。
微生物在重金属污染修复方面具有重要的应用，主要以微生物菌剂为主。不同微生物对重金属吸附具有一定的专一性，筛选获得对特定重金属具有较好的吸附性能的微生物是微生物修复重金属污染的前提。
综上所述，现有技术存在的问题是：目前尚无对锰具有良好吸附性能的苏云金芽孢杆菌菌株被报道、保存。
解决上述技术问题的难度：在吸附重金属微生物筛选过程中，往往仅关注对重金属的吸附，在重金属污染土壤种筛选目标菌株是重要的微生物来源，由于重金属污染土壤重金属浓度高，植物难以生长，通过野外重金属污染的自然驯化，因此所筛选菌株往往仅有良好的吸附性能，对植物的促生往往被忽视。当前筛选的大多具有促生性能的菌株，大多是通过溶磷等改变土壤性质简介促生，直接分泌促生物质的菌株往往难以筛选获得。
解决上述技术问题的意义：一方面，本发明综合考虑锰元素对植物作用的二重性，既能应用于锰污染修复领域，又能为植物生长提供锰元素的支持，领用领域广泛，实现了锰污染修复的生物闭环。另一方面，景观恢复是矿山恢复的重要目的之一，本发明筛选的HM7菌株在修复锰污染的同时，有效促进植物生长，加速了矿山恢复过程中景观的恢复过程，为青山绿水提供了有力支持。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种吸附锰且对植物具有促生性能的菌株及其应用。
本发明是这样实现的，一种吸附锰且对植物具有促生性能的菌株，所述吸附锰且对植物具有促生性能的菌株为苏云金芽孢杆菌HM7，所述苏云金芽孢杆菌HM7已于2019年10月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为：CCTCC NO：M2019786。结果为：存活。分类命名：Bacillus thurngiensisHM7。
本发明的另一目的在于提供一种所述吸附锰且对植物具有促生性能的菌株在高锰浓度条件下污染修复的应用，包括以锰污染为主的锰矿修复，其他重金属为主，伴生锰污染的污染修复。
本发明的另一目的在于提供一种所述吸附锰且对植物具有促生性能的菌株在改善土壤、促进植物生长中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种包含所述吸附锰且对植物具有促生性能的菌株的生物菌剂。
本发明的另一目的在于提供一种包含所述吸附锰且对植物具有促生性能的菌株的土壤修复剂。
本发明的另一目的在于提供一种包含所述吸附锰且对植物具有促生性能的菌株的微生物菌肥。
本发明的另一目的在于提供一种所述吸附锰且对植物具有促生性能的菌株的筛选方法，所述吸附锰且对植物具有促生性能的菌株的筛选方法包括以下步骤：
第一步，采集锰矿区堆积锰矿渣，过筛，将采集矿渣装入灭菌的牛皮纸袋带回实验室，-4℃冰箱保存；
第二步，待实验室，解冻至恒温，将土壤样品在液体培养基中连续富集培养，结束后利用有机固体培养基进行涂布分离，经过多次划线纯化后得到耐锰菌株，保存至斜面培养基上；
第三步，将保存菌种活化后划线涂布于含有不同Mn2+浓度的平板，培养箱中下培养，且逐渐升高Mn2+浓度，观察菌落生长情况；
第四步，Mn2+浓度升高，挑选在4000mg/L的含Mn培养基长势较好的菌株。
第五步，测定菌株溶磷、产吲哚乙酸等促生性能指标，将菌株施用于植物根部，确定菌株的促生性能。
进一步，所述第二步将土壤样品在浓度为500mg/L的Mn2+液体培养基中连续富集培养，结束后利用有机固体培养基进行涂布分离，经过2-3次划线纯化后得到耐锰菌株，保存至斜面培养基上。
进一步，所述第三步在30℃培养箱中下培养3-5d，且逐渐升高Mn2+浓度，观察菌落生长情况。
进一步，所述第四步Mn2+浓度由500mg/L升高至4000mg/L。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明在锰矿区筛选获得苏云金芽孢杆菌，命名为HM7，所述苏云金芽孢杆菌HM7已于2019年10月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCC NO：M2019786。该菌株对锰元素具有较好的吸附特征，是治理锰污染的良好的微生物材料。
本发明筛选获得对锰具有较好吸附特性的苏云金芽孢杆菌菌株，命名为 HM7，保藏编号为CCTCC NO：M2019786(湖北武汉)。该菌株除对锰元素具有较好的吸附性能外，还具有较高的产IAA(吲哚乙酸，植物生长素类物质) 的能力与溶磷能力，是治理锰污染的良好的微生物材料。
当前利用微生物治理修复重金属污染过程中，多数仅考虑微生物对重金属离子的吸附性能，吸附重金属的微生物以移除为主。本发明充分考虑锰元素对植物具有二重属性，即在适宜浓度条件下，对植物具有重要作用，仅在高浓度条件下对植物具有毒害作用。因此吸附后的菌株可作为后续植物恢复的营养来源。
附图说明
图1是本发明实施例提供的吸附锰且对植物具有促生性能的菌株的筛选方法流程图。
图2是本发明实施例提供的HM7进化树示意图。
图3是本发明实施例提供的不同Mn2+浓度对HM7的生长、生物吸附和pH 的影响示意图；
图中：(a)初始Mn2+浓度(0-10000mg/L)对HM7的生长和生物吸附有影响；(b)溶液中的pH随着Mn2+浓度的增加而增加(0-600mg/L)，而在浓度为 600-10000mg/L时，随着浓度逐渐增加，pH逐渐降低，且从弱碱性过度到弱酸性。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种吸附锰且对植物具有促生性能的菌株及其应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)HM7从土壤中筛选得对锰较高抗性及较高吸附能力的土壤细菌，由16SrDNA测序确定为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，于2019年10月9日送交中国典型培养物保藏中心 (武汉大学)(武汉市武昌珞珈山)，其保藏编号为：CCTCC NO:M2019786。
如图1所示，本发明实施例提供的吸附锰且对植物具有促生性能的菌株的筛选方法包括以下步骤：
S101：采集锰矿区堆积锰矿渣(测定显示该矿渣平均Mn浓度达到20041 mg/kg，锰污染严重)，过筛，将采集矿渣装入灭菌的牛皮纸袋带回实验室，-4℃冰箱保存；
S102：待实验室，解冻至恒温，将土壤样品在浓度为500mg/L的Mn2+液体培养基中连续富集培养，结束后利用有机固体培养基进行涂布分离，经过多次 (2-3次)划线纯化后得到耐锰菌株，保存至斜面培养基上；
S103：将保存菌种活化后划线涂布于含有不同Mn2+浓度的平板，在30℃培养箱中下培养3-5d，且逐渐升高Mn2+浓度，观察菌落生长情况；
S104：Mn2+浓度由500mg/L升高至4000mg/L，挑选在4000mg/L的含Mn 培养基长势较好的菌株。
S105：测定菌株溶磷、产吲哚乙酸等促生性能指标，将菌株施用于植物根部，确定菌株的促生性能。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
实施例1：具有锰吸附和促生作用的细菌菌株筛选
(1)菌株筛选：采集锰矿区堆积锰矿渣(测定显示该矿渣平均Mn浓度达到20041mg/kg，锰污染严重)，过筛，将采集矿渣装入灭菌的牛皮纸袋带回实验室，-4℃冰箱保存。待实验室，解冻至恒温。随后将土壤样品在浓度为500mg/L 的Mn2+液体培养基中连续富集培养，结束后利用有机固体培养基进行涂布分离，经过多次(2-3次)划线纯化后得到耐锰菌株，保存至斜面培养基上。将保存菌种活化后划线涂布于含有不同Mn2+浓度的平板，在30℃培养箱中下培养3-5d，且逐渐升高Mn2+浓度，观察菌落生长情况。Mn2+浓度由500mg/L升高至4000mg/L，最后挑选在4000mg/L的含Mn培养基长势较好的菌株；
(2)理化性质测定：将获得的菌株通过划线法接种到固体培养基中， 28-30℃培养48h，观察菌落生长情况及其形态。之后对细菌进行革兰氏染色、甲基红、Voges Proskauer(V-P)、过氧化氢酶、硫化氢、葡萄糖及明胶液化等试验，方法参照《常见细菌系统鉴定手册》。采用纸片法对菌株的抗生素敏感性进行试验。将细菌均匀涂布在生长培养基中，用杀菌后的镊子将抗生素纸片(购买于温州市康泰生物科技有限公司)置于细菌平板上，28-30℃培养5天后观察，若出现抑菌圈则说明该菌对抗生素敏感。
(3)菌株促生性能鉴定：使用Sackowski’s比色法检测细菌分泌吲哚乙酸 (IAA)的能力。配制L-色氨酸母液(100mg/L)。高压灭菌后的马丁氏液体培养基(45mL)加入5mL色氨酸溶液，即为含10mg/L色氨酸的马丁氏液体培养基。在上述溶液中加入活化后的菌株，28-30℃反应3d。取上清液与Sackowski’s 试剂(V：V，1：2)充分混合，室温显色反应20min，以IAA标准溶液绘制标准曲线，使用紫外分光光度计(530nm)测定吸光值，定量分析。菌液活化12h 后，取1mL于100mL无机磷培养基中，对照组不接种细菌，28-30℃震荡培养3d，离心后用钼蓝法测上清液磷含量，度量细菌增磷能力。
(4)其中培养基及相关试剂制作如下。细菌筛选培养基制(牛肉膏蛋白胨培养基)：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，去离子水1L，固体培养基加 2％的琼脂。pH5.4-5.6，121℃灭菌30min，然后加入无菌的MnSO4贮藏液使之达到实验设计的浓度，作为含不同Mn2+离子浓度实验所用的培养基。Sackowski’s 试剂：浓硫酸30mL，0.5mol/L的FeCl3·6H2O溶液1.5mL，溶于50mL去离子水中。马丁氏培养基：蛋白胨5g，葡萄糖10g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 1g，溶于1L去离子水中。无机磷(NBRIP)培养基：葡萄糖10g，MgCl2·6H2O 5g， Ca3(PO4)2 5g，MgSO4·7H2O 0.25g，KCl 0.2g，(NH4)2SO4 0.1g，定容至1L(去离子水)，pH7.2。
(5)提取菌株总DNA为模板，利用16SrRNA引物进行PCR扩增，正向引物为：27FAGAGTTTGATCCTGGCTCAG，反向引物为：1492RGGTTACCTT GTTACGACTT。20ulTaq反应体系，其中10×Taq Buffer 2ul、2mM dNTPs 2ul、 25mM MgSO4 1.2ul、Taq酶1ul、Primer1(10pm)1ul、Primer2(10pm)1ul、 Plate 1ul、PCR增强剂5ul、H2O 5.8ul。PCR扩增菌株序列提交至National Center for Biotechnology Information(NCBI)的GenBank，注册号为：MF536805。利用16S序列分子鉴定，并结合理化性质确定该菌株为苏云金杆菌(图2)，HM7 对丁胺卡那、诺氟沙星、庆大霉素、环丙沙星具有抗性，HM产IAA能力为 2.55±0.043mg/L，增磷能力为8.76±0.617mg/L。
实施例2：不同Mn2+浓度条件下HM7的生长、生物吸附率
(1)制备种子液：150mL三角锥形瓶盛有牛肉膏蛋白胨液体培养基50mL，灭菌。挑取一环储存于斜面培养基中的HM7菌体接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28℃-30℃震荡培养48h-56h后，至OD600约为1.0-1.5，即为所获得的菌悬液。
(2)配置不同浓度锰溶液。150mL三角锥形瓶盛有牛肉膏蛋白胨液体培养基50mL，灭菌，加入无菌的MnSO4，配置不同浓度锰溶液，溶液锰浓度分别为 0、200、400、600、800、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、5000、 7500、10000mg/L。
(3)在不同Mn2+浓度的液体培养基中接种活化后的细菌悬液 (OD600＝1.0)，接种量为液体培养基的1％，pH5.4-5.6，30℃，120r/min，震荡培养72h。分析测定表明：初始Mn2+浓度(0-10000mg/L)对HM7的生长和生物吸附有影响(图3a)。在培养三天后，一定浓度范围内的Mn2+(0-800mg/L) 能促进HM7的生长，菌株在600mg/L的Mn2+浓度下OD600最大为1.90，显著大于未加Mn的对照组(p<0.05)。然而，当浓度大于2000mg/L时，OD600有明显的下降趋势并且出现了抑制菌株生长的现象，菌株HM7难以在4000mg/L以上的Mn2+溶液中生长。在Mn去除方面，去除率与HM7菌液浓度变化趋势基本一致，随着Mn2+浓度的增加，HM7对Mn2+的去除率先增加后减小，最大出现在400mg/L(95.04％)。同时，HM7的生长(OD600)与最终溶液中的pH相关 (r＝0.951，p<0.05)，在一定浓度范围的Mn(II)中，溶液中的pH随着Mn2+浓度的增加而增加(0-600mg/L)，而在浓度为600-10000mg/L时，随着浓度逐渐增加，pH逐渐降低，且从弱碱性过度到弱酸性(图3b)。
实施例3：HM7强化构树修复锰污染
(1)制备细菌菌悬液。在无菌操作台上，使用无菌接种环挑取少量HM7 菌体至装有牛肉膏蛋白胨的液体培养基中，28℃-30℃震荡培养48h-56h后，至OD600约为1.0-1.5，即为所获得的菌悬液。
(2)采集构树(Broussonetia papyrifera)一年生生长良好，根系发达，长势基本一致幼苗，。
在含营养土盆栽中加入100mL的Mn2+溶液(浓度分别为5mmol/L、50 mmol/L)，搅拌混匀，将长势一致的构树幼苗移植到含营养土或矿渣的盆栽中，每盆一棵，在各个Mn处理组中，设置一个对照组，一个接菌组，用无菌注射器分别取10mL的蒸馏水(对照)、HM7菌液注射到构树根际土壤中，每个实验组重复5次。不同Mn处理的植株统一在恒温组培室生长60d，光照周期10/14h 昼夜，温度26-30℃，每镉5天至底部托盘浇水，保持50％-70％的蓄水量，直至收获。
(3)HM7强化构树修复锰污染的效果：光合作用。在收获植物前三天(57 d)，通过LI-6400便携式光合作用系统(中国)测定了构树的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、细胞间二氧化碳浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)。上述指标含义如下：Pn为总光合速率与呼吸速率之差；Gs主要为植物的气孔张开程度；Ci 为植物细胞间CO2的浓度；Tr则为单位叶面积在一定时间下的水分蒸腾量。测定时间为实验第57d，上午8:30-11:30，标准偏差为1000μmol/m2/s，二氧化碳浓度为400μmol/mol。，温度为32.5±0.5℃，相对湿度为45.50％。表1为不同 Mn污染土壤下HM7对构树光合特征的影响。结果显示接种HM7提高了构树的净光合速率、胞间CO2浓度。
表1不同Mn污染土壤下HM7对构树光合特征的影响
Figure RE-GDA0002528126670000091
(4)HM7强化构树修复锰污染的效果：生物量。实验处理60天后，收获所有植物，并测定构树各个部位的干重和鲜重。离子水冲洗植物根部，用剪刀将其分为根，茎和叶三部分，滤纸吸干水分后测量植物各组织的鲜重(FW，mg)，装入信封袋保存。将植物样品放入烘箱，105℃杀青30分钟，70℃烘干到恒重。称量记录植物各组织干重(DW，mg)后，粉碎机粉碎，塑封袋干燥保存。表2为不同Mn污染土壤下接种HM7对构树生物量的影响结果表明：不同Mn污染土壤影响构树的生长和叶片形态，在5mmol/L的Mn处理营养土中，接种 HM7对构树叶片形态基本没有影响，在50mmol/L的Mn处理营养土中，未接种HM7的构树叶片表面出现发黄现象，HM7接种组基本正常生长。在生物量方面，各个处理组中，接种HM7的构树生物总量均高于未接种微生物的对照组，说明HM7都促进了植物的生长。
表2不同Mn污染土壤下接种HM7对构树生物量的影响
Figure RE-GDA0002528126670000092
Figure RE-GDA0002528126670000101
(5)HM7强化构树修复锰污染的效果：根系结构。将构树根系充分散开，至于EPSON扫描仪进行根系扫描，通过WinRHIZO Pro(Regent Instruments，加拿大)分析植物根系的总长度、总表面积、总体积、根尖数、分叉数和交叉数。其中总根长，直径小于2.5mm的根长度之和；总表面积，直径小于2.5mm 的根面积之和；根体积，直径小于2.5mm的根体积之和；分尖数，直径小于2.5 mm的根顶点总数；分叉数，直径小于2.5mm的根分叉总数；交叉数，直径小于2.5mm的根交叉点数之和。表3为不同Mn污染土壤下接种HM7对构树根系结构的影响。在构树根际接种HM7对其根系结构有很大的影响。在各个Mn 处理组中，构树根系接种了HM7的总根长、总表面积、交叉数、根尖数和分叉数都高于未接种的对照组。
表3不同Mn污染土壤下接种HM7对构树根系结构的影响
Figure RE-GDA0002528126670000102
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种吸附锰且对植物具有促生性能的菌株，其特征在于，所述吸附锰且对植物具有促生性能的菌株为苏云金芽孢杆菌HM7，所述苏云金芽孢杆菌HM7已于2019年10月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2019786。
2.一种如权利要求1所述吸附锰且对植物具有促生性能的菌株在高锰浓度条件下污染修复的应用，其特征在于，包括以锰污染为主的锰矿修复，其他重金属为主，伴生锰污染的污染修复。
3.一种如权利要求1所述吸附锰且对植物具有促生性能的菌株在改善土壤、促进植物生长中的应用。
4.一种包含权利要求1所述吸附锰且对植物具有促生性能的菌株的生物菌剂。
5.一种包含权利要求1所述吸附锰且对植物具有促生性能的菌株的土壤修复剂。
6.一种包含权利要求1所述吸附锰且对植物具有促生性能的菌株的微生物菌肥。
7.一种如权利要求1所述吸附锰且对植物具有促生性能的菌株的筛选方法，其特征在于，所述吸附锰且对植物具有促生性能的菌株的筛选方法包括以下步骤：
第一步，采集锰矿区堆积锰矿渣，过筛，将采集矿渣装入灭菌的牛皮纸袋带回实验室，-4℃冰箱保存；
第二步，待实验室，解冻至恒温，将土壤样品在液体培养基中连续富集培养，结束后利用有机固体培养基进行涂布分离，经过多次划线纯化后得到耐锰菌株，保存至斜面培养基上；
第三步，将保存菌种活化后划线涂布于含有不同Mn2+浓度的平板，培养箱中下培养，且逐渐升高Mn2+浓度，观察菌落生长情况；
第四步，Mn2+浓度升高，挑选在4000mg/L的含Mn培养基长势较好的菌株；
第五步，测定菌株溶磷、产吲哚乙酸等促生性能指标，将菌株施用于植物根部，确定菌株的促生性能。
8.如权利要求7所述的吸附锰且对植物具有促生性能的菌株的筛选方法，其特征在于，所述第二步将土壤样品在浓度为500mg/L的Mn2+液体培养基中连续富集培养，结束后利用有机固体培养基进行涂布分离，经过2-3次划线纯化后得到耐锰菌株，保存至斜面培养基上。
9.如权利要求7所述的吸附锰且对植物具有促生性能的菌株的筛选方法，其特征在于，所述第三步在30℃培养箱中下培养3-5d，且逐渐升高Mn2+浓度，观察菌落生长情况。
10.如权利要求7所述的吸附锰且对植物具有促生性能的菌株的筛选方法，其特征在于，所述第四步Mn2+浓度由500mg/L升高至4000mg/L。
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