CN114181862B - 一株能够快速修复酸化土壤的苏云金杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株能够快速修复酸化土壤的苏云金杆菌，分类命名为苏云金杆菌71‑1（Bacillus thuringiensis 71‑1），已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2021年7月26日，保藏编号为CCTCC NO：M 2021937。本发明提供的苏云金杆菌对酸化土壤具有非常好的改良修复功能，可以兼顾满足改善土壤离子结构、固定污染物、提升肥力等多种现实要求，保护土壤微生态系统平衡，改善作物生存环境并提高其抗病能力，对作物增产和品质提高有着重要意义。

Description

一株能够快速修复酸化土壤的苏云金杆菌
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体是一株能够快速修复酸化土壤的苏云金杆菌。
背景技术
近几十年来，由于酸雨与空气污染、化肥过度施用、大棚蔬菜连作等高强度人为活动的影响，农田土壤酸化现象加剧，土壤质量退化严重，对生态环境和农业生产造成巨大危害，特别是在热带和亚热带地区已成作物生长的重要障碍因子，而且通常还伴随着重金属污染情况威胁食品安全，因此，采取有效措施对严重酸化农田土壤进行改良和修复，对保护农业生态环境以及保障农产品安全生产和农业可持续发展具有重要环境意义和经济效益。
传统上国内外主要采用石灰、石膏等碱性物质来改良酸性土壤，但石灰的副作用过大，容易造成土壤板结及复酸化现象，石膏的使用则受可供给性和价格等因素限制。而且这些手段通常较为单一，无法兼顾土壤离子结构、固定污染物、提升肥力等多种现实要求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一株能够快速修复酸化土壤的苏云金杆菌。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株能够快速修复酸化土壤的苏云金杆菌，该菌株在LB固体培养基上的形态特征是菌落呈圆形或者椭圆形，淡黄色，边缘不规则，不透明，微隆起，呈滴蜡状。革兰氏阳性菌，可产生芽孢，芽孢呈椭圆形，局部呈圆形，芽孢囊微膨大。细胞单生或者呈短链状或者长链状排列存在。
将该菌株进行分子生物学鉴定，测得其16S rDNA部分序列，并在GenBank数据库中进行Blast比对。结合该菌株的生物学特性和16S rDNA比对结果，申请人确认该菌株为苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)，命名为苏云金杆菌71-1(Bacillus thuringiensis71-1)。
申请人已于2021年7月26日将上述苏云金杆菌71-1(Bacillus thuringiensis71-1)保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M2021937。
本菌株是从海洋沉积物中筛选得到，对由于土壤终年无歇，养分过度消耗、大水大肥所导致的土壤无法恢复养分平衡而造成的酸化具有快速修复的效果。
本发明还提供一种苏云金杆菌71-1在修复酸化土壤上的应用。
进一步的，本发明提供一种利用所述的苏云金杆菌71-1生产的酸化土壤修复菌剂。
更进一步的，所述酸化土壤修复菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将苏云金杆菌71-1培养到对数期的试管液按发酵培养基体积的0.5-1％接种于发酵培养基中，培养至对数期，制得发酵菌种；
(2)将上述制得发酵菌种按种子罐的培养基体积的5-10％接种于种子罐的培养基中，培养至对数生长期，制得种子液；
(3)将种子液按5吨生产罐的培养基体积的5-10％接种于生产罐的培养基中培养发酵，发酵温度为30℃。发酵完成后加入11.5％轻质钙粉并进行喷雾干燥获得降解菌剂。
相应的，本发明还提供一种利用所述的方法制备的酸化土壤修复菌剂。
本发明的有益效果：
本发明提供的苏云金杆菌对酸化土壤具体非常好的改良修复功能，可以兼顾改善土壤离子结构、固定污染物、提升肥力等多种现实要求；保护土壤微生态系统平衡，改善作物生存环境并提高其抗病能力，对作物增产和品质提高有着重要意义。
附图说明
图1苏云金杆菌71-1菌株基因岛预测图。
图2苏云金杆菌71-1菌株基因功能注释GO功能分类图。
图3苏云金杆菌71-1菌株基因功能注释KEGG代谢通路分类图。
图4苏云金杆菌71-1菌株基因功能注释COG功能分类图。
图5苏云金杆菌71-1菌株基因功能注释NR功能分类图。
图6苏云金杆菌71-1菌株基因功能注释TCDB功能分类图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
本发明所选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。对于本发明所涉及的培养基配方如下：
实施例1菌株来源与鉴定
1、菌株来源：
本菌株是由申请人从海洋沉积物中筛选得到，对由于土壤终年无歇，养分过度消耗、大水大肥所导致的土壤无法恢复养分平衡而造成的酸化具有快速修复的效果。
2、菌株鉴定：
该菌株在LB固体培养基上的形态特征是菌落呈圆形或者椭圆形，淡黄色，边缘不规则，不透明，微隆起，呈滴蜡状。革兰氏阳性菌，可产生芽孢。芽孢呈椭圆形，局部呈圆形，芽孢囊微膨大。细胞单生或者呈短链状或者长链状排列存在。
将该菌株进行分子生物学鉴定，测得其16S rDNA部分序列，并在GenBank数据库中进行Blast比对。结合该菌株的生物学特性和16S rDNA比对结果，申请人确认该菌株为苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)，命名为苏云金杆菌71-1(Bacillus thuringiensis71-1)。
申请人已于2021年7月26日将上述苏云金杆菌71-1(Bacillus thuringiensis71-1)保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M2021937。
实施例2苏云金杆菌71-1对酸化土壤pH值调节能力评价
1、供试菌液的制备
1.1液体培养菌液制备(菌液)
将苏云金杆菌71-1先在平板上培养，将培养好的苏云金杆菌71-1分别取1接种环接种到10瓶500ml的LB培养基中，30℃，220r/min培养72h。收集菌液，离心机3000r/min离心5min，弃掉上清，收集菌体，并利用无菌水进行悬浮，制备成供试菌液菌量为6×108-109CFU/ml的菌液备用。
1.2苏云金杆菌菌剂的制备(菌剂)
取苏云金杆菌71-1发酵罐发酵后所制备的酸化土壤修复菌剂，利用无菌水制成20g/L的菌悬液备用(菌量为6×108-109CFU/ml)。
2、酸化土壤的取样
选择来源于寿光种植10年以上的蔬菜大棚(10年前土壤pH值为8.0以上)，平度大田土壤(周边大部分土壤pH值6.3以上)和烟台果园土壤(10年前pH值7.0左右)的酸化土壤，将土壤放入花盆中待用(花盆尺寸：33cm×21cm)。
3、pH值变化的测定
利用苏云金杆菌71-1的菌液和菌剂(每次200ml)分别进行土壤处理，每间隔15天施加一次菌，共施用6次菌，然后进行正常的浇水管理，5个月后取土样根据NY/T1121.2-2006所述的土壤pH值测定方法进行样品pH值的测定，测定结果见表1。通过试验确定，菌株对不同地区的酸化土壤都有修复作用，对于大田的酸化土壤的修复效果更好。同时，利用新鲜培养的菌液与制备的苏云金杆菌菌剂同时进行酸化土壤的修复，修复效果基本相当，说明苏云金杆菌酸化土壤修复菌剂能完全能发挥苏云金杆菌的修复效果。
表1苏云金杆菌71-1修复酸化土壤效果
实施例3苏云金杆菌71-1对酸化土壤交换性盐基总量调节能力评价
1、苏云金杆菌菌剂的制备
取苏云金杆菌71-1发酵罐发酵后所制备的酸化土壤修复菌剂，利用无菌水制成20g/L的菌悬液备用。
2、酸化土壤的取样
选择来源于寿光种植10年的蔬菜大棚(10年前土壤pH值为8.0以上)，平度大田土壤(周边大部分土壤pH值6.3以上)和烟台果园土壤(10年前pH值7.0左右)的酸化土壤，将土壤放入花盆中待用(花盆尺寸：33cm×21cm)。
3、交换性盐基总量变化的测定
利用苏云金杆菌71-1菌剂(每次200ml)进行土壤处理，每间隔15天施加一次菌，共施用6次菌，然后进行正常的浇水管理，5个月后取土样根据LY/T 1247-1999所述的土壤盐基饱和度的测定方法进行样品交换性盐基总量的测定，测定结果见表2。通过试验确定，菌剂能够使酸化土壤的交换性盐基总量升高，最高的是对烟台地区的土壤调节，交换性盐基总量升高11.1％。
表2苏云金杆菌71-1酸化土壤交换性盐基总量调整效果
实施例4苏云金杆菌71-1对酸化土壤有效态锰调节能力评价
1、苏云金杆菌菌剂的制备
取苏云金杆菌71-1发酵罐发酵后所制备的酸化土壤修复菌剂，利用无菌水制成20g/L的菌悬液备用。
2、酸化土壤的取样
选择来源于寿光种植10年蔬菜大棚(10年前土壤pH值为8.0以上)，平度大田土壤(周边大部分土壤pH值6.3以上)和烟台果园土壤(10年前pH值7.0左右)的酸化土壤，将土壤放入花盆中待用(花盆尺寸：33cm×21cm)。
3、有效态锰变化的测定
利用苏云金杆菌71-1菌剂(每次200ml)进行土壤处理，每间隔15天施加一次菌，共施用6次菌，然后进行正常的浇水管理，5个月后取土样根据NY/T 890-2004所述的土壤有效态锰的测定方法进行样品有效态锰的测定，测定结果见表3。酸性土壤往往由于锰的供应过多而造成毒害，锰量过多比缺乏造成的危害更重。通过试验确定，菌剂对酸化土壤的有效态锰明显降低的作用，说明菌剂能够降低有效态锰的含量。
表3苏云金杆菌71-1酸化土壤有效态锰调整效果
实施例5苏云金杆菌71-1对酸化土壤阳离子交换量调节能力评价
1、苏云金杆菌菌剂的制备
取苏云金杆菌71-1发酵罐发酵后所制备的酸化土壤修复菌剂，利用无菌水制成20g/L的菌悬液备用。
2、酸化土壤的取样
选择来源于寿光种植10年蔬菜大棚(10年前土壤pH值为8.0以上)，平度大田土壤(周边大部分土壤pH值6.3以上)和烟台果园土壤(10年前pH值7.0左右)的酸化土壤，将土壤放入花盆中待用(花盆尺寸：33cm×21cm)。
3、阳离子交换量变化的测定
利用苏云金杆菌71-1菌剂(每次200ml)进行土壤处理，每间隔15天施加一次菌，共施用6次菌，然后进行正常的浇水管理，5个月后取土样根据LY/T 1247-1999所述的土壤阳离子交换量的测定方法进行测定，测定结果见表4。通过试验确定，菌株对不同来源的酸化土壤的阳离子交换量都有提升。
表4苏云金杆菌71-1酸化土壤阳离子交换量调整效果
实施例6苏云金杆菌71-1菌株的基因注释
提取苏云金杆菌71-1的基因组DNA，利用随机PCR扩增和序列的双端测序，测序得到的原始数据(Raw Data)，由于原始数据会存在一定比例的低质量数据，为了保证后续信息分析结果的准确可靠，首先要对原始数据进行过滤处理，得到有效数据(Clean Data)，步骤如下：
(1)去除所含低质量碱基(质量值≤20)超过一定比例(默认设为40％)的reads；
(2)去除N碱基达到一定比例的reads(默认设为10％)；
(3)去除与Adapter之间overlap超过一定阈值(默认设为15bp)，且错配数小于3的reads；
(4)对于小基因组等项目，如果样品存在宿主污染，需与宿主数据库进行比对，过滤掉可能来源于宿主的reads。
从各样品质控后的Clean Data出发，进行基因组组装，得到能反映样品基因组基本情况的序列文件，并对组装结果进行评价。基因组组装的具体处理步骤如下：
(1)经过预处理后得到Clean Data，使用SOAP denovo组装软件进行组装：
选取不同的K-mer(默认选取95、107、119)进行组装，根据项目类型选择最优的kmer，
选取最少scaffold的组装结果；利用最优kmer并调节其他参数(-d-u-R-F等)再次筛选得到初步组装结果；
(2)使用SPAdes软件进行组装：
选取不同的K-mer(默认选取99和127)进行组装，根据项目类型选择最优的kmer，选取最少scaffold的组装结果；
(3)使用Abyss软件进行组装：选取K-mer 64进行组装，获得组装结果：
(4)使用CISA软件整合三个软件的组装结果，并挑选其中最少scaffold的组装结果；
(5)采用gapclose软件对初步组装结果进行补洞，并且通过过滤低测序深度(小于平均深度的0.35)的reads去除同lane污染，从而得到最终的组装结果；
(6)过滤掉500bp以下的片段，并进行评估和统计分析以及后续基因预测。
(7)通过GO(Gene Ontology，http://geneontology.org/)、KEGG KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes，http://www.genome.jp/kegg/)、COG(Cluster ofOrthologous Groups of proteins，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)、NR(NonRedundant Protein Database)、TCDB(Transporter Classification Database)进行71-1菌株功能基因的数量和功能注释。
功能注释基本步骤如下：
1)将预测基因与各功能数据库进行BLAST比对(blastp，evalue≤1e-5)；
2)BLAST结果过滤：对于每一条序列的BLAST结果，选取score最高的比对结果(默认identity>＝40％，coverage>＝40％)进行注释。注释结果见附图1-附图6。
3)菌株71-1部分注释结果如图1-6所示。
图1苏云金杆菌71-1基因岛预测。对菌株进行框架测序，采用IslandPath-DIOMB软件(Version 0.2)预测基因岛，测序结果发现该菌株有12个基因岛，总基因长度为135681bp。具体结果见图1。
图2苏云金杆菌71-1菌株基因功能注释GO功能分类图。对菌株71-1进行的基因功能注释，GO功能的全称是Gene Ontology，是一套国际标准化的基因功能描述的分类系统。GO分为三大类：1)细胞组分(Cellular Component)：用于描述亚细胞结构、位置和大分子复合物，如核仁、端粒和识别起始的复合物；2)分子功能(Molecular Function)：用于描述基因、基因产物个体的功能，如与碳水化合物结合或ATP水解酶活性等；3)生物过程(Biological Process)：用来描述基因编码的产物所参与的生物过程，如有丝分裂或嘌呤代谢等。GO数据库三大分类基因的统计结果如下图。说明：横坐标表示样品注释上的GO功能分类，右侧纵坐标表示注释上的基因个数，左侧纵坐标表示注释上的基因个数占所有编码基因的百分比。
图3苏云金杆菌71-1基因功能注释KEGG代谢通路分类图。KEGG全称为KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes。系统分析基因产物和化合物在细胞中的代谢途径以及这些基因产物的功能的数据库。它整合了基因组、化学分子和生化系统等方面的数据,包括代谢通路(KEGG PATHWAY)、药物(KEGG DRUG)、疾病(KEGG DISEASE)、功能模型(KEGGMODULE)、基因序列(KEGG GENES)及基因组(KEGG GENOME)等等。KO(KEGG ORTHOLOG)系统将各个KEGG注释系统联系在一起，KEGG已建立了一套完整KO注释的系统，可完成新测序物种的基因组或转录组的功能注释。说明：条形图上的数字代表注释上的基因数目；其余一个坐标轴是数据库中level1各功能类的代码。
图4苏云金杆菌71-1基因功能注释COG功能分类图。COG全称是Cluster ofOrthologous Groups of proteins，由NCBI创建并维护的蛋白数据库，根据细菌、藻类和真核生物完整基因组的编码蛋白系统进化关系分类构建而成。通过比对可以将某个蛋白序列注释到某一个COG中，每一簇COG由直系同源序列构成，从而可以推测该序列的功能。COG数据库按照功能一共可以分为二十六类。横坐标表示COG功能类型，纵坐标表示注释上的基因个数。
图5苏云金杆菌71-1基因功能注释NR功能分类图。NR全称为Non-RedundantProtein Database，是一个非冗余的蛋白质数据库，由NCBI创建并维护，其特点在于内容比较全面，同时注释结果中会包含有物种信息，可作物种分类用。根据基因注释到的物种情况，统计注释到的物种及基因数目，其统计结果如下图。横坐标表示物种ID，纵坐标表示注释上的基因个数。
图6苏云金杆菌71-1基因功能注释TCDB功能分类图。CDB全称是TransporterClassification Database，转运蛋白分类数据库，是膜转运蛋白，包括离子通道(ionchannels)的分类系统(TC system)。TCDB数据库转移系统以5个级别进行分类，第一级统计结果如下图。横坐标表示TCDB一级分类类型，纵坐标表示注释上的基因个数。
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1. 一株能够修复酸化土壤的苏云金杆菌71-1（Bacillus thuringiensis 71-1），已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2021年7月26日，保藏编号为CCTCC NO：M2021937。
2.权利要求1所述的苏云金杆菌71-1在修复酸化土壤上的应用。
3.一种含有权利要求1所述苏云金杆菌71-1的酸化土壤修复菌剂。
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