CN114134071B - 一株能够快速降解多种农药残留的耐寒短杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种农药残留广谱降解菌株，分类命名为耐寒短杆菌1‑9‑1（Brevibacterium frigoritolerans 1‑9‑1），已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2021年7月26日，保藏编号为CCTCC NO：M 2021935。本发明提供的耐寒短杆菌1‑9‑1应用于土壤中，可以有效降解多种农药残留，降低化学农药对土壤的污染；同时有效降低因化学农药作用而导致的病原菌抗药性的增强，保护土壤微生态系统平衡，改善作物生存环境并提高其抗病能力，对作物增产和品质提高有着重要意义。

Description

一株能够快速降解多种农药残留的耐寒短杆菌
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体是一种能够快速降解多种农药残留的耐寒短杆菌。
背景技术
我国耕地面积广阔，地理环境和气候条件多样，农作物品类繁多，病虫草害发生频繁，给农业生产造成了严重威胁。人们以农药为武器，在与病虫草害长期斗争的实践中，积累了丰富的经验，效果显著。但农药的大量使用一方面使害虫的抗药性不断加大，另一方面也使害虫天敌受到极大的摧残，进而增加了农业生产对农药的依赖性，引起一系列的农产品和食品安全的问题。
随着农药使用量的不断增加，土壤中农药的残留量也在不断增加，致使作物的农残含量超标，反复大剂量应用农药，会导致恶性循环，进一步加剧土壤污染情况，危害生态环境安全。
生物修复技术是80年代以来出现和发展的清除和治理环境污染的生物工程技术，其主要利用生物特有的分解有毒有害物质的能力，去除污染环境如土壤中的污染物，达到清除环境污染的目的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一株能够快速降解多种农药残留的耐寒短杆菌。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
本发明提供了一株农药残留广谱降解菌株，分类命名为耐寒短杆菌1-9-1(Brevibacterium frigoritolerans 1-9-1)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2021年7月26日，保藏编号为CCTCC NO：M 2021935。
本菌株是从山东寿光种植20年的蔬菜大棚土壤中筛选得到，对吡虫啉、啶虫脒、三唑酮等能够造成土壤污染的农药具有快速的降解效果。
该菌株形态特征是菌落呈圆米黄色，直径3-5mm,菌落边缘光滑，湿润，有光泽，中间隆起，菌体为短直杆状，革兰氏阳性菌，可产生芽孢。芽孢呈椭圆形，局部呈圆形，孢子囊不膨胀。细胞单独、成对或呈短链状存在。
将该菌株进行分子生物学鉴定，测得其16S rDNA序列，并在GenBank核酸数据库中进行Blast比对。结合该菌株的生物学特性和16S rDNA比对结果，申请人确认该菌株为耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans 1-9-1)，分类命名为耐寒短杆菌1-9-1(Brevibacterium frigoritolerans 1-9-1)。
本发明提供所述的耐寒短杆菌1-9-1的基因岛、GO功能、KEGG功能、COG功能、NR功能和TCDB功能基因及数量。
本发明还提供了耐寒短杆菌1-9-1在降解吡虫啉、啶虫脒、三唑酮、噻唑膦、百菌清农药残留中的应用。
进一步的，所述耐寒短杆菌1-9-1可以降解土壤或水体环境中吡虫啉、啶虫脒、三唑酮、噻唑膦、百菌清等农药残留。
本发明还提供一种利用所述的耐寒短杆菌1-9-1生产的农药降解菌剂。所述农药降解菌剂对吡虫啉、啶虫脒、三唑酮等污染到土壤中的农药具有快速的降解效果。
所述的降解菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将耐寒短杆菌1-9-1培养到对数期的试管液按发酵培养基体积的0.5-1％接种于发酵培养基中，培养至对数期，制得发酵菌种；
(2)将上述制得发酵菌种按种子罐的培养基体积的5-10％接种于种子罐的培养基中，培养至对数生长期，制得种子液；
(3)将种子液按5吨生产罐的培养基体积的5-10％接种于生产罐的培养基中培养发酵，发酵温度为30发酵完成后加入轻质钙粉并进行喷雾干燥获得降解菌剂。
本发明的有益效果：
本发明提供的耐寒短杆菌1-9-1应用于土壤中，可以有效降解多种农药残留，降低化学农药对土壤的污染；同时有效降低因化学农药作用而导致的病原菌抗药性的增强，保护土壤微生态系统平衡，改善作物生存环境并提高其抗病能力，对作物增产和品质提高有着重要意义。
附图说明
图1为耐寒短杆菌1-9-1基因岛中基因分布统计图。
图2是基因功能注释GO功能分类图。
图3是基因功能注释KEGG代谢通路分类图。
图4是基因功能注释COG功能分类图。
图5是基因功能注释NR功能分类图。
图6是基因功能注释TCDB功能分类图。
具体实施方式
实施例1菌株来源与鉴定
1、菌株来源：
本实施例提供一种耐寒短杆菌，是从寿光种植20年的蔬菜大棚土壤中筛选得到，对吡虫啉、啶虫脒、三唑酮等污染到土壤中的农药具有快速的降解效果。
2、菌株鉴定：
该菌株形态特征是菌落呈圆米黄色，直径3-5mm,菌落边缘光滑，湿润，有光泽，中间隆起，菌体为短直杆状，革兰氏阳性菌，可产生芽孢。芽孢呈椭圆形，局部呈圆形，孢子囊不膨胀。细胞单独、成对或呈短链状存在。
将该菌株进行分子生物学鉴定，测得其16S rDNA序列，并在GenBank核酸数据库中进行Blast比对。结合该菌株的生物学特性和16S rDNA比对结果，申请人确认该菌株为耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans 1-9-1)，命名为耐寒短杆菌1-9-1(Brevibacterium frigoritolerans 1-9-1)。
申请人已于2021年7月26日将上述解耐寒短杆菌1-9-1(Brevibacteriumfrigoritolerans1-9-1)保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021935。
实施例2菌剂样品制备
将耐寒短杆菌1-9-1在5吨的发酵罐中液体发酵，镜检芽孢率达到90％以上时停止发酵，然后离心后再喷雾干燥，制得菌量为10亿/g的粉剂产品。
实施例3耐寒短杆菌1-9-1降解吡虫啉能力评价
1、试验地点山东省寿光市潍坊科技学院北洛试验基地
2、试验设计
将实验田块在2天前进行灌溉，两天后吡虫啉农药(98％原药)稀释为500mg/ml，取100ml均匀的施到甜瓜植株根围(定植的甜瓜苗一周后的植株)，同时施入含50g菌剂悬液100ml，设置阳性对照(根围施入100ml浓度为500mg/ml的吡虫啉农药和100ml清水)、阴性对照(根围施入600ml清水)。
3、吡虫啉农药降解效果测定
污染土壤修复7天和9天后分别取根围15cm深度范围内的土壤样品，利用液相色谱-三重四极杆质谱联用仪测定土壤样品中吡虫啉的的含量，同时进行吡虫啉标准农药的土壤添加回收实验，检测结果如表1-2所示，吡虫啉从土壤中的回收率在95％以上，1-9-1菌株修复7天和9天的污染土壤降解率比不修复的土壤吡虫啉降解率分别高19.32％和30％。
Figure GDA0004199215090000041
表1吡虫啉污染土壤耐寒短杆菌1-9-1降解7天测定结果
Figure GDA0004199215090000042
表2吡虫啉污染土壤耐寒短杆菌1-9-1降解9天测定结果
Figure GDA0004199215090000043
Figure GDA0004199215090000051
实施例4耐寒短杆菌1-9-1降解啶虫脒能力评价
1、试验地点山东省寿光市潍坊科技学院北洛试验基地
2、试验设计
将实验田块在2天前进行灌溉，两天后啶虫脒农药(98％原药)稀释为500mg/ml，取100ml均匀的施到甜瓜植株根围(定植的甜瓜苗一周后的植株)，同时施入含50g菌剂的悬液100ml，设置阳性对照(根围施入100ml浓度为500mg/ml的吡虫啉农药和100ml清水)、阴性对照((根围施入600ml清水)。
3、啶虫脒农药降解效果测定
污染土壤处理7天和14天后分别取根围15cm深度范围内的土壤样品，利用液相色谱-三重四极杆质谱联用仪测定土壤样品中啶虫脒的的含量，同时进行啶虫脒标准农药的土壤添加回收实验，检测结果如表3-4所示，啶虫脒从土壤中的回收率在96％以上，1-9-1菌株修复7天和9天的污染土壤降解率比不修复的土壤啶虫脒降解率分别高48.7％和36.3％。
Figure GDA0004199215090000052
表3啶虫脒污染土壤耐寒短杆菌1-9-1降解7天测定结果
Figure GDA0004199215090000053
Figure GDA0004199215090000061
表4啶虫脒污染土壤耐寒短杆菌1-9-1降解9天测定结果
Figure GDA0004199215090000062
Figure GDA0004199215090000071
实施例5耐寒短杆菌1-9-1降解噻唑膦能力评价
1、试验地点山东省寿光市潍坊科技学院北洛试验基地
2、试验设计
将实验田块在2天前进行灌溉，两天后噻唑膦农药(98％原药)稀释为500mg/ml，取100ml均匀的施到甜瓜植株根围(定植的甜瓜苗一周后的植株)，同时施入50g菌剂悬液100ml，设置阳性对照(根围施入100ml浓度为500mg/ml的吡虫啉农药和100ml清水)、阴性对照((根围施入600ml清水)。
3、噻唑膦农药降解效果测定
污染土壤处理9天和14天后分别取根围15cm深度范围内的土壤样品，利用液相色谱-三重四极杆质谱联用仪测定土壤样品中吡虫啉的的含量，同时进行噻唑膦标准农药的土壤添加回收实验，检测结果如表5所示，噻唑膦从土壤中的回收率在96％以上，1-9-1菌株修复7天和9天的污染土壤降解率比不修复的土壤噻唑膦降解率分别高51.9％和69.4％。
Figure GDA0004199215090000072
表5噻唑膦污染土壤耐寒短杆菌1-9-1降解9天和第14天测定结果
Figure GDA0004199215090000073
Figure GDA0004199215090000081
实施例6耐寒短杆菌1-9-1降解三唑酮能力评价
1、试验地点山东省寿光市潍坊科技学院北洛试验基地
2、试验设计
将实验田块在2天前进行灌溉，两天后三唑酮农药(98％原药)稀释为500mg/ml，取100ml均匀的施到甜瓜植株根围(定植的甜瓜苗一周后的植株)，同时施入50g菌剂悬液100ml，设置阳性对照(根围施入100ml浓度为500mg/ml的吡虫啉农药和100ml清水)、阴性对照((根围施入600ml清水)。
3、三唑酮农药降解效果测定
污染土壤处理7天和14天后分别取根围15cm深度范围内的土壤样品，利用液相色谱-三重四极杆质谱联用仪测定土壤样品中三唑酮的的含量，同时进行三唑酮标准农药的土壤添加回收实验，检测结果如表6-7所示，三唑酮从土壤中的回收率在96％以上，1-9-1菌株修复7天和9天的污染土壤降解率比不修复的土壤三唑酮降解率分别高43.5％和30.5％。
Figure GDA0004199215090000082
表6三唑酮污染土壤耐寒短杆菌1-9-1降解7天测定结果
Figure GDA0004199215090000083
Figure GDA0004199215090000091
表7三唑酮污染土壤耐寒短杆菌1-9-1降解14天测定结果
Figure GDA0004199215090000092
Figure GDA0004199215090000101
实施例7耐寒短杆菌1-9-1降解百菌清能力评价
1、试验地点：山东省寿光市潍坊科技学院北洛试验基地
2、试验设计
将实验田块在2天前进行灌溉，两天后百菌清农药(98％原药)稀释为1000mg/ml，取100ml均匀的施到甜瓜植株根围(定植的甜瓜苗一周后的植株)，同时施入50g菌剂悬液100ml，设置阳性对照(根围施入100ml浓度为500mg/ml的吡虫啉农药和100ml清水)、阴性对照((根围施入600ml清水)。
3、百菌清农药降解效果测定
污染土壤处理9天取根围15cm深度范围内的土壤样品，利用气相色谱-质谱仪测定土壤样品中百菌清的的含量，同时进行百菌清标准农药的土壤添加回收实验，检测结果如表8所示，百菌清从土壤中的回收率在96％以上，1-9-1菌株修复9天的污染土壤降解率比不修复的土壤百菌清降解率高87.8％。
Figure GDA0004199215090000102
表8百菌清污染土壤耐寒短杆菌1-9-1降解9天测定结果
Figure GDA0004199215090000103
/>
Figure GDA0004199215090000111
实施例8耐寒短杆菌1-9-1基因注释
提取耐寒短杆菌1-9-1的基因组DNA，利用随机PCR扩增和序列的双端测序，测序得到的原始数据(Raw Data)，由于原始数据会存在一定比例的低质量数据，为了保证后续信息分析结果的准确可靠，首先要对原始数据进行过滤处理，得到有效数据(Clean Data)，步骤如下：
(1)去除所含低质量碱基(质量值≤20)超过一定比例(默认设为40％)的reads；
(2)去除N碱基达到一定比例的reads(默认设为10％)；
(3)去除与Adapter之间overlap超过一定阈值(默认设为15bp)，且错配数小于3的reads；
(4)对于小基因组等项目，如果样品存在宿主污染，需与宿主数据库进行比对，过滤掉可能来源于宿主的reads。
从各样品质控后的Clean Data出发，进行基因组组装，得到能反映样品基因组基本情况的序列文件，并对组装结果进行评价。基因组组装的具体处理步骤如下：
(1)经过预处理后得到Clean Data，使用SOAP denovo组装软件进行组装：
选取不同的K-mer(默认选取95、107、119)进行组装，根据项目类型选择最优的kmer，选取最少scaffold的组装结果；利用最优kmer并调节其他参数(-d-u-R-F等)再次筛选得到初步组装结果；
(2)使用SPAdes软件进行组装：
选取不同的K-mer(默认选取99和127)进行组装，根据项目类型选择最优的kmer，选取最少scaffold的组装结果；
(3)使用Abyss软件进行组装：选取K-mer 64进行组装，获得组装结果：
(4)使用CISA软件整合三个软件的组装结果，并挑选其中最少scaffold的组装结果；
(5)采用gapclose软件对初步组装结果进行补洞，并且通过过滤低测序深度(小于平均深度的0.35)的reads去除同lane污染，从而得到最终的组装结果；
(6)过滤掉500bp以下的片段，并进行评估和统计分析以及后续基因预测。
(7)通过GO(Gene Ontology，http://geneontology.org/)、KEGG KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes，http://www.genome.jp/kegg/)、COG(Cluster ofOrthologous Groups of proteins，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)、NR(NonRedundant Protein Database)、TCDB(Transporter Classification Database)进行1-9-1功能基因的数量和功能注释。
功能注释基本步骤如下：
1)将预测基因与各功能数据库进行BLAST比对(blastp，evalue≤1e-5)；
2)BLAST结果过滤：对于每一条序列的BLAST结果，选取score最高的比对结果(默认identity>＝40％，coverage>＝40％)进行注释。
具体结果见图1-6，图1为耐寒短杆菌1-9-1基因岛中基因分布统计图。对耐寒短杆菌1-9-1进行框架测序，采用IslandPath-DIOMB软件(Version 0.2)预测基因岛，测序结果发现该菌株有12个基因岛，总基因长度为135681bp。
图2是基因功能注释GO功能分类图。GO的全称是Gene Ontology，是一套国际标准化的基因功能描述的分类系统。GO分为三大类：1)细胞组分(Cellular Component)：用于描述亚细胞结构、位置和大分子复合物，如核仁、端粒和识别起始的复合物；2)分子功能(Molecular Function)：用于描述基因、基因产物个体的功能，如与碳水化合物结合或ATP水解酶活性等；3)生物过程(Biological Process)：用来描述基因编码的产物所参与的生物过程，如有丝分裂或嘌呤代谢等。GO数据库三大分类基因的统计结果如下图。说明横坐标表示样品注释上的GO功能分类，右侧纵坐标表示注释上的基因个数，左侧纵坐标表示注释上的基因个数占所有编码基因的百分比。
图3是基因功能注释KEGG代谢通路分类图。KEGG全称为Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes。系统分析基因产物和化合物在细胞中的代谢途径以及这些基因产物的功能的数据库。它整合了基因组、化学分子和生化系统等方面的数据,包括代谢通路(KEGG PATHWAY)、药物(KEGG DRUG)、疾病(KEGG DISEASE)、功能模型(KEGG MODULE)、基因序列(KEGG GENES)及基因组(KEGG GENOME)等等。KO(KEGG ORTHOLOG)系统将各个KEGG注释系统联系在一起，KEGG已建立了一套完整KO注释的系统，可完成新测序物种的基因组或转录组的功能注释。说明条形图上的数字代表注释上的基因数目；其余一个坐标轴是数据库中level1各功能类的代码。
图4是基因功能注释COG功能分类图.COG，全称是Cluster of OrthologousGroups of proteins，由NCBI创建并维护的蛋白数据库，根据细菌、藻类和真核生物完整基因组的编码蛋白系统进化关系分类构建而成。通过比对可以将某个蛋白序列注释到某一个COG中，每一簇COG由直系同源序列构成，从而可以推测该序列的功能。COG数据库按照功能一共可以分为二十六类。横坐标表示COG功能类型，纵坐标表示注释上的基因个数。
图5是基因功能注释NR功能分类图.NR全称为Non-Redundant Protein Database，是一个非冗余的蛋白质数据库，由NCBI创建并维护，其特点在于内容比较全面，同时注释结果中会包含有物种信息，可作物种分类用。根据基因注释到的物种情况，统计注释到的物种及基因数目，其统计结果如下图。横坐标表示物种ID，纵坐标表示注释上的基因个数。
图6是基因功能注释TCDB功能分类图。CDB，全称是Transporter ClassificationDatabase，转运蛋白分类数据库，是膜转运蛋白，包括离子通道(ion channels)的分类系统(TC system)。TCDB数据库转移系统以5个级别进行分类，第一级统计结果如下图。横坐标表示TCDB一级分类类型，纵坐标表示注释上的基因个数。
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1. 一株具有农药残留降解功能的耐寒短杆菌1-9-1（Brevibacterium frigoritolerans 1-9-1），已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2021年7月26日，保藏编号为CCTCC NO：M 2021935。
2.权利要求1所述的耐寒短杆菌1-9-1在降解土壤或水体环境中农药残留上的应用；所述农药为吡虫啉、啶虫脒、三唑酮、噻唑膦、百菌清。
3.一种含有权利要求1所述耐寒短杆菌1-9-1的降解菌剂。
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