CN110760457B - 一种拟除虫菊酯类农药的降解菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种右旋苯醚菊酯等拟除虫菊酯类农药的降解菌株及其应用。所述降解菌株为非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)菌株Y4,该菌于2019年9月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏号为GDMCC No:60762。本发明首次公开了非脱羧勒克菌对右旋苯醚菊酯农药的降解作用,并筛选得到上述高效快速降解菌株Y4,而且,该菌还具有生长速度快、培养方法简单、适应能力强、不易变异的特点,可以作为优良的农药降解菌应用于水体和土壤等污染环境的生物修复方面。本发明为打破现有治理农药残留污染瓶颈提供了新的开发途径,丰富了农药降解菌的种质资源库,应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于农药污染治理技术领域。更具体地,涉及一株降解右旋苯醚菊酯农药的非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)菌株Y4及其生产的菌剂和应用。
背景技术
拟除虫菊酯类农药是一类由人工合成的化学品,包括市场化不久的右旋苯醚菊酯,由于其对人畜低毒,对人类和其他非靶标生物较为安全,因此在全球范围内越来越广泛地被应用于农业生产、家庭卫生和城市防蚊等领域。
近年来,随着该类农药使用量的增加,其残留导致的食品及环境污染问题越来越严重。微生物降解是去除农药残留的有效措施,具有高效、安全、低毒、无残留等优点,应用前景广阔。
但也会存在菌株退化、效果不甚理想的问题。尤其是右旋苯醚菊酯作为一种市场化不久的拟除虫菊酯类农药,国内外鲜有右旋苯醚菊酯的微生物降解的研究报道。
因此,丰富右旋苯醚菊酯等拟除虫菊酯类农药的降解菌库,对该类农药残留的防治意义重大。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足,筛选与鉴定右旋苯醚菊酯降解菌株,并研究其降解特性及生物修复潜力,其结果可丰富农药降解菌资源库,为发展新的农药残留处理技术提供基础。
本发明的目的是提供一种右旋苯醚菊酯农药的降解菌株,即非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)菌株Y4。该菌能够快速高效降解右旋苯醚菊酯,其在培养11天后对50mg/L的右旋苯醚菊酯降解率达90.6%。
本发明另一目的是提供所述非脱羧勒克菌菌株Y4降解右旋苯醚菊酯等拟除虫菊酯类农药的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现:
本发明研究发现,非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)对右旋苯醚菊酯等拟除虫菊酯类农药具有很好的降解作用。并筛选得到一株高效降解拟除虫菊酯类农药的菌株,即非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)菌株Y4,于2019年9月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏号为GDMCC No:60762,保藏地址:广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明所述非脱羧勒克菌菌株Y4来源于黑龙江哈尔滨郊区农田土壤,经人工富集培养、分离纯化得到。该菌株对右旋苯醚菊酯具有高效快速的降解效能,在培养11天后对50mg/L的右旋苯醚菊酯降解率达90.6%,证明菌株Y4可以作为优良的生物降解菌应用于右旋苯醚菊酯农药污染的生物修复。
因此,以下应用也在本发明的保护范围之内:
非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)在降解拟除虫菊酯类农药方面的应用。
非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)在修复拟除虫菊酯类农药污染的自然环境方面的应用。所述自然环境包括水体或土壤。
优选地,所述拟除虫菊酯类农药为右旋苯醚菊酯、丙烯菊酯、胺菊酯、氯菊酯或氯氰菊酯。
优选地,所述非脱羧勒克菌为上述非脱羧勒克菌菌株Y4。
一种高效降解右旋苯醚菊酯农药的菌剂,其特征在于,含有非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)。
优选地,所述非脱羧勒克菌为上述非脱羧勒克菌菌株Y4。
优选地,所述菌剂中菌体数量为1.0×103--1.0×108CFU/mL。
更优选地,所述菌剂中菌体数量为1.0×105--1.0×108CFU/mL。
本发明具有以下有益效果:
本发明研究发现,非脱羧勒克菌对右旋苯醚菊酯等拟除虫菊酯类农药具有很好的降解作用,并筛选得到一株高效降解拟除虫菊酯类农药的菌株,即非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)菌株Y4,丰富了农药降解菌的种质资源库,而且该菌对右旋苯醚菊酯降解效果显著,在培养11天后对50mg/L的右旋苯醚菊酯降解率达90.6%,证明菌株Y4在右旋苯醚菊酯污染环境的生物修复方面具有很大的发展潜力。
附图说明
图1为菌株Y4的形态学特征。
图2为菌株Y4的16S rDNA系统进化分析。
图3为右旋苯醚菊酯浓度和峰面积关系的标准曲线。
图4为右旋苯醚菊酯高效液相色谱图。
图5为降解菌Y4在含有右旋苯醚菊酯的MM培养基中的生长曲线。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中所述培养基配方如下:
MM培养基(基础培养基):磷酸二氢钾10.5g;磷酸氢二钾4.5g;硝酸铵2.0g;甘露醇2.0g;甘油2.0g;七水合硫酸镁0.2g;氯化钙0.01g;氯化锰0.002g;七水合硫酸亚铁0.005g;蒸馏水1000mL。
LB培养基:胰蛋白胨10.0g;酵母浸粉5.0g;氯化钠10.0g;琼脂1.5%;蒸馏水1000mL。
MSM培养基:硝酸铵2.0g;七水合硫酸镁0.2g;二水合氯化钙0.01g;七水合硫酸铁0.001g;十二水合磷酸氢二钠1.5g;磷酸氢二钾1.5g;蒸馏水1000mL。
所有的培养基在121℃的高压灭菌锅中灭菌20min。
实施例1农药降解菌株Y4的分离、筛选和鉴定
1、右旋苯醚菊酯降解菌的富集培养和分离筛选:
从采集黑龙江哈尔滨郊区农田土壤中,称取5g土壤样品加入到50mL含有右旋苯醚菊酯(50mg/L)的上述MSM液体培养基中。经30℃,200rpm培养7d后,每次按10%的接种量,将农药质量浓度从50mg/L依次升至100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L连续富集培养。然后将转接4次的培养液梯度稀释涂布于含有50mg/L右旋苯醚菊酯的LB固体平板上,30℃倒置培养2d。待平板上长出单菌落后,挑取单菌落多次划线纯化,分离获得一株细菌,编号为Y4。
2、菌株Y4形态学鉴定:
将菌株Y4接种于LB固体平板上30℃倒置培养2d,观察其菌落形态。非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)菌株Y4在LB固体平板中菌落呈黄色,菌落圆形,凸起,边缘整齐,表面光滑,湿润(图1)。菌株Y4为革兰氏阴性菌,细胞呈杆状。
3、菌株Y4的16S rDNA分子生物学鉴定:
提取菌株Y4基因组DNA,以提取的基因组为模板,采用16S rDNA细菌通用引物(27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';1429R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增,PCR产物委托上海英潍捷基贸易有限公司进行测序。将菌株测得的16S rDNA序列在GenBank数据库中利用BLAST进行比对分析,并选择同源性较高的相关序列利用Clustal 1.8.1及MAGE 5.0软件构建系统进化树及分析进化关系(图2)。如图2所示,本发明分离纯化得到的菌株Y4的16S rDNA序列与Leclercia adecarboxylata NBRC 102595同源性最高。
因此,综合形态学观察、生理生化特性及16S rDNA序列分析,菌株Y4鉴定为非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata),并于2019年9月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏号为GDMCC No:60762,保藏地址:广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例2非脱羧勒克菌Y4对右旋苯醚菊酯的降解能力测定
1、实验方法
(1)种子液制备:
将纯化后的菌种Y4接入含有5mL的LB液体培养基过夜活化培养至对数期,4℃低温离心后菌体用生理盐水(0.9%NaCl)冲洗,所得菌体作为接种体。
(2)降解性能测定:
按1.0×107CFU/mL湿菌体的接种量,分别向50mL含有右旋苯醚菊酯(50mg/L)的MM培养基中接种,并分别以不接菌作为对照,每组三个重复。在30℃,200rpm恒温摇床培养7d,分别于第1、3、5、7天取样一次,采用分光光度计测定OD600值表示菌株Y4的生长情况,采用HPLC测定其对右旋苯醚菊酯的降解情况。
(3)色谱条件:
采用2690型高效液相色谱仪(Water,美国)。色谱柱为C18反相柱(Phenomenex,250nm×4.60mm,5μm),进样温度为28℃,进样量10μL,流速0.7mL/min,流动相为色谱乙腈:超纯水=65:35,检测波长254nm。
按照下式计算右旋苯醚菊酯降解率:
(4)质量控制:采用外标法校正标准物质制作标准曲线。
S5.添加回收率测定:设置添加回收实验,配制标准样品,向20mL无菌水中加入右旋苯醚菊酯使其质量浓度分别为5mg/L、10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L,再向其中加入20mL丙酮,超声30min后加入乙酸乙酯进行萃取并采用HPLC进行测定,计算添加回收率。
2、实验结果如下:
(1)右旋苯醚菊酯降解菌株的筛选:在经过富集培养和分离培养后得出7株有一定降解右旋苯醚菊酯能力的菌株,分别编号为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6和Y7,将这7株菌株分别在含50mg/L右旋苯醚菊酯的MM培养基中进行培养,并进行OD值测试。经HPLC测定,Y4的降解能力最高,11d降解率达90.6%。因此,本发明选取菌株Y4进入下一步研究。
(2)右旋苯醚菊酯的含量与峰面积关系的标准曲线:右旋苯醚菊酯的含量与峰面积呈良好的线性关系。右旋苯醚菊酯的标准曲线方程为(见图3):
y=13.94e+4X+(R2=0.999681)
右旋苯醚菊酯的液相色谱图见图4。
(3)添加回收率测定:
标准样品中右旋苯醚菊酯的添加回收率试验结果见表1。
表1右旋苯醚菊酯的添加回收率
表中数据分析得出,右旋苯醚菊酯的添加回收率区间为79.4%~105.3%。
(4)降解菌Y4生长曲线测定:
通过挑选单菌落,接种于MM培养基中,以50mg/L右旋苯醚菊酯为生长基质,测定菌株在1、3、5、7天的OD600值,得到生长曲线如图5所示。由图中可以得知,菌株在以50mg/L右旋苯醚菊酯为生长基质的MM培养基中生长良好。
(5)降解菌Y4降解能力测定结果:
菌株Y4能快速降解右旋苯醚菊酯。如表2所示,在含有50mg/L右旋苯醚菊酯的基础培养基中,菌株Y4培养1、3、5、7、9和11d后,降解菌株Y4对50mg/L的右旋苯醚菊酯降解率分别达到1.2%、15.7%、36.5%、69.7%、81.4%和90.6%,而对照(自然降解率)11d降解率仅为9.7%。
该结果说明菌株Y4可利用右旋苯醚菊酯作为生长基质进行生长繁殖,在右旋苯醚菊酯浓度为50mg/L时,培养至11d,降解率达到90.6%,表明该菌株具有高效快速降解右旋苯醚菊酯的能力。
表2菌株Y4对右旋苯醚菊酯的降解能力测定
另外测试显示,非脱羧勒克菌Y4对其他拟除虫菊酯类农药如丙烯菊酯、胺菊酯、氯菊酯和氯氰菊酯也具有很好的降解作用。
实施例3非脱羧勒克菌Y4降解土壤中右旋苯醚菊酯的效果测定
1、供试土样
农田表层土(3~10cm),取自华南农业大学教学农场试验田,属红壤土,超过3年未施用右旋苯醚菊酯农药。
土壤样品取回后首先置于阴凉通风处自然风干,风干后碾磨,过2mm筛,分别取一定量的右旋苯醚菊酯溶于丙酮中,然后浸泡硅藻土,使右旋苯醚菊酯被完全吸附。浸泡后的硅藻土置于通风橱中吹干,将其拌入土壤中,使土壤中右旋苯醚菊酯的终浓度为50mg/kg。取500g土样于30℃恒温恒湿培养箱中培养,按1.0×107CFU/mL的接种量接入Y4降解菌悬液,以加蒸馏水的作为对照,土壤的持水量保持在40%。在30℃和避光条件下连续培养15天,并定期取样,HPLC法测定右旋苯醚菊酯残留量并计算降解率。降解率计算方法如实施例2。
2、测定结果如表3,培养15d后,菌株Y4对土壤中的右旋苯醚菊酯降解率可达到70.4%。
表3菌株Y4降解土壤中右旋苯醚菊酯效果
结果表明,菌株Y4在直接施入土壤中后,没有出现不降解或降解滞后效应现象,其降解性能稳定,为菌株Y4对右旋苯醚菊酯的土壤修复提供了科学依据。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一株可高效降解拟除虫菊酯类农药的菌株,其特征在于,其为非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)菌株Y4,于2019年9月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏号为GDMCC No:60762,保藏地址:广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
2.权利要求1所述非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)菌株Y4在降解拟除虫菊酯类农药方面的应用,其特征在于,所述拟除虫菊酯类农药为右旋苯醚菊酯、丙烯菊酯、胺菊酯、氯菊酯或氯氰菊酯。
3.权利要求1所述非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)菌株Y4在修复拟除虫菊酯类农药污染的自然环境方面的应用,其特征在于,所述拟除虫菊酯类农药为右旋苯醚菊酯、丙烯菊酯、胺菊酯、氯菊酯或氯氰菊酯。
4.根据权利要求3所述应用,其特征在于,所述自然环境为水体或土壤。
5.一种高效降解右旋苯醚菊酯农药的菌剂,其特征在于,含有权利要求1所述非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)菌株Y4。
6.根据权利要求5所述的菌剂,其特征在于,所述菌剂中菌体数量为1.0×103-1.0×108CFU/mL。
7.根据权利要求6所述的菌剂,其特征在于,所述菌剂中菌体数量为1.0×105-1.0×108CFU/mL。
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