CN107541479A - 一种杀虫剂右旋苯醚菊酯降解菌株及其菌剂和降解工艺 - Google Patents
一种杀虫剂右旋苯醚菊酯降解菌株及其菌剂和降解工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种杀虫剂右旋苯醚菊酯降解菌株及其菌剂和降解工艺。所述菌株为黄褐假单胞菌（Pseudomonas fulva）菌株P31，于2017年5月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017256。该菌株及其菌剂对多种拟除虫菊酯类农药具有很好的降解作用，尤其是对右旋苯醚菊酯，48h内对50mg/L右旋苯醚菊酯的降解率达到86.4%，72h内可完全降解；直接施用本菌剂短时间内可使水体或土壤中右旋苯醚菊酯残留量降低77%以上；可用于修复拟除虫菊酯类农药污染的水体、土壤等环境，解决了农业生产中该类农药残留超标问题及环境污染问题，生产出无毒无公害的绿色农产品。
Description
技术领域
本发明属于农药污染处理技术领域。更具体地，涉及一种杀虫剂右旋苯醚菊酯降解菌株及其生产的菌剂和最优降解工艺条件。
背景技术
农药的问世和使用给人类带来了巨大的经济效益和社会效益，特别是在保护农作物、防治病虫草害、改善人类生存环境方面发挥了至关重要的作用。但农药的连年使用势必造成污染，引起食物中的农药残留，并对人类健康造成负面的影响。近年来，人们的生活水平不断提高，全社会对环境和生态平衡也日益重视，寻找高效、经济、安全、稳定的治理环境和农产品中农药残留污染的新技术迫在眉睫。
拟除虫菊酯类农药是由天然除虫菊素发展而来的一类新型、高效、广谱的仿生杀虫剂。继部分有机磷农药被禁用之后，拟除虫菊酯的需求量逐年上升，但有关该类农药的残留问题及其危害也逐渐暴露出来，如对一些农业有益昆虫(家蚕、蜜蜂和赤眼蜂等)和水生生物具有很高的毒性。另外，大量研究表明，拟除虫菊酯对非靶标生物存在内分泌干扰、免疫毒性、神经毒性及生殖毒性等多种潜在毒性，长期接触可诱发一些慢性疾病，高剂量下甚至有致癌、致畸、致突变的危险。其中，右旋苯醚菊酯，是一种常用的Ⅰ型拟除虫菊酯类杀虫剂，因其较强的触杀力，胃毒和残效性而被广泛应用于家庭、公共场所、工业区苍蝇、蚊虫、蟑螂等卫生害虫的防治。然而随着右旋苯醚菊酯的广泛使用，有关该类农药的残留问题及其危害日益严重，美国Our Stolen Future网站甚至把右旋苯醚菊酯列入“具有内分泌干扰效应的普遍污染物清单”中。因此，如何消除环境中的右旋苯醚菊酯残留已成为科研工作者亟待解决的具有重大经济和社会意义的科研命题。
生物修复技术是一种利用微生物或其他生物将环境中的有害污染物降解为无机小分子化合物的新兴技术，具有高效、安全、无残留、无二次污染等优点，逐渐成为治理农药残留、重金属超标等各种污染的最佳选择方案。目前利用生物修复技术成功治理有机物污染的例子很多，例如国内的北京佳农新贸易发展有限公司已成功生产“比亚”降解酶制剂，国际上利用微生物治理石油面源污染等。但是，由于微生物对农药的矿化能力和降解性能不稳定，导致现有的降解菌资源库远远不能满足化学农药残留污染生物降解的实际需求。而且微生物种类针对农药种类也有限制，目前还没有专门针对右旋苯醚菊酯的降解制剂产品。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有右旋苯醚菊酯降解微生物制剂的缺陷和不足，提供一种专门针对降解杀虫剂右旋苯醚菊酯等拟除虫菊酯类农药的微生物菌株及其生产的菌剂和最优降解工艺条件。应用时，将该菌株制备成液体制剂或固体菌剂剂型，生产成本低，使用方便。直接施用本菌剂短时间内可使水体或土壤中右旋苯醚菊酯残留量降低77％以上，解决了农业生产中右旋苯醚菊酯残留超标问题及环境污染问题，生产出无毒无公害的绿色农产品。
本发明的目的是提供一株可降解右旋苯醚菊酯等拟除虫菊酯类农药的黄褐假单胞菌(Pseudomonas fulva)菌株P31。
本发明另一目的是提供由所述菌株P31制备的降解菌剂。
本发明的再一目的是提供所述菌株P31及其降解菌剂在降解右旋苯醚菊酯等拟除虫菊酯类农药方面的应用。
本发明的再一目的是提供所述菌株P31及其降解菌剂的最优降解工艺条件。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一株可降解拟除虫菊酯类农药(尤其是右旋苯醚菊酯)的黄褐假单胞菌(Pseudomonas fulva)菌株P31，该菌株于2017年5月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2017256；保藏地址：中国武汉，武汉大学。
优选地，所述拟除虫菊酯类农药为右旋苯醚菊酯、氯菊酯、氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯或联苯菊酯。最优选为右旋苯醚菊酯。
该菌株P31是从采集自广西某化工厂污水排放口及周边的活性污泥中筛选分离获得，经形态学特征、生理生化特性、16S rRNA系统发育分析及Biolog微生物自动分析系统鉴定为Pseudomonas fulva。
具体地，该菌株P31在LB固体平板中生长快，极富运动性。菌落在LB固体平板中呈现淡黄色，菌落圆形，边缘光滑，不透明(图1A)。该菌株P31的主要生物学特性为：该菌株属于革兰氏阴性菌，好氧，富有运动性；无芽胞、有荚膜，细胞呈杆状，大小为(1.5～4.0)×(0.5～1.0)微米，具端鞭毛，可以运动(图1B)；接触酶、氧化酶、柠檬酸盐试验、硝酸盐还原试验、溶血试验和精氨酸双水解酶试验呈阳性；明胶液化试验、脲酶试验、吲哚试验和七叶苷试验呈阴性；菌株P31可耐40℃和5％NaCl生长，在pH 5.0～10.0营养肉汤中生长良好。将菌株P31的16S rRNA基因序列与BLAST在线数据库中比对分析，结果显示菌株P31与菌株Pseudomonas sp.SRZ19(登录号：KU877341)相似性达96％以上，菌株P31的系统进化分析见图2。
另外，本发明的菌株P31具有显著的降解拟除虫菊酯类农药(尤其是右旋苯醚菊酯)的能力，可用于制备拟除虫菊酯类农药(尤其是右旋苯醚菊酯)的降解菌剂，因此，该菌株P31及其菌剂在降解拟除虫菊酯类农药(尤其是右旋苯醚菊酯)方面的应用，以及在制备拟除虫菊酯类农药(尤其是右旋苯醚菊酯)降解菌剂方面的应用，均应在本发明的保护范围之内。
一种含有所述菌株P31和/或其发酵液的拟除虫菊酯类农药的降解菌剂，也在本发明的保护范围之内。优选地，所述拟除虫菊酯类农药为右旋苯醚菊酯、氯菊酯、氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯或联苯菊酯。最优选为右旋苯醚菊酯。
优选地，所述降解菌剂中菌体的数量不低于1.0×107CFU/mL。
更优选地，所述降解菌剂由包括如下步骤的方法生产而成：
S1.将所述菌株P31接种于LB培养基振荡培养至对数期，获得菌种；
S2.将所得菌种按照体积比5％～10％的接种量接入种子培养基，培养至对数生长期，获得种子液；
S3.将所得种子液按体积比5～10％的接种量接种入发酵培养基进行发酵培养，发酵完成后培养液分装成液体剂型或采用泥炭吸附后分装成固体菌剂剂型。
具体地，作为实践工业生产的实施方式，所述降解菌剂由包括如下步骤的方法生产而成：
S1.将所述菌株P31试管种接种于装有LB培养基的摇瓶中，振荡培养至对数期，获得菌种；
S2.将所得菌种按照体积比5％～10％的接种量接入装有种子培养基的种子罐，培养至对数生长期，获得种子液；
S3.将所得种子液按照体积比5～10％的接种量接种入装有发酵培养基的生产发酵罐，进行发酵培养，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
其中，优选地，步骤S2中在种子培养基中(种子罐)和步骤S3中发酵培养基中(发酵罐)的培养过程中，无菌空气的通气量为0.45～0.60m3/min，搅拌速度为180～240r/min，培养温度28～30℃，全流程培养时间为24～36h，发酵结束后菌体数量≥1.0×109CFU/mL。
其中，所述的种子培养基、发酵培养基也均为LB培养基。
优选地，所述LB培养基的配方为：酵母膏0.4～0.6％，蛋白胨0.8～1.2％，NaCl0.8～1.2％，pH值为7.2～7.5。
更优选地，所述LB培养基的配方为：酵母膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 1％，pH值为7.2～7.5。
另外，本发明所述菌株P31或其降解菌剂在降解拟除虫菊酯类农药方面的应用，包括应用于水体或土壤等自然环境中拟除虫菊酯类农药残留的降解，均应在本发明的保护范围之内
优选地，所述拟除虫菊酯类农药为右旋苯醚菊酯、氯菊酯、氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯或联苯菊酯。
最优选地，所述拟除虫菊酯类农药为右旋苯醚菊酯。
另外，优选地，所述应用的方法为：将所述降解菌剂稀释后喷洒到水体或土壤中，稀释后的降解菌剂中菌体的数量不低于1.0×107CFU/mL。
优选地，应用时，上述菌株P31或其降解菌剂降解拟除虫菊酯类农药的降解工艺条件为：温度28～30℃，pH 7～7.5，接种量0.1～0.5g/L。
更优选地，应用时，上述菌株P31或其降解菌剂降解拟除虫菊酯类农药的降解工艺条件为，温度29.5℃，pH 7.3和接种量0.3g/L。
即，本发明还提供了菌剂最优降解工艺条件：温度29.5℃，pH 7.3和接种量0.3g/L，具体是采用响应曲面优化设计方法对降解菌剂的降解工艺条件进行了优化，步骤如下：
S1.利用SAS 9.0统计软件根据响应曲面法Box-Behnken设计原则进行试验设计，以关键因子温度值(X1)、pH(X2)和接种量(X3)为自变量，以右旋苯醚菊酯降解率为响应值(Y1)，建立多元二次回归方程：
Y1＝-494.163+22.1325X1+75.125X2-24.125X3–0.3795X1 2+0.04X1X2-0.15X1X3-5.5625X2 2+14.5X2X3-113.75X3 2
S2.根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应曲面图；
S3.对多元二次回归方程求一阶偏导，通过解方程得到该模型的极值点，即菌剂最优降解工艺条件。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一株黄褐假单胞菌(Pseudomonas fulva)菌株P31，该菌株可以利用右旋苯醚菊酯等多种拟除虫菊酯类农药作为唯一碳源生长，对多种拟除虫菊酯类农药具有很好的降解效果，尤其是对右旋苯醚菊酯，60h内对50mg/L右旋苯醚菊酯的降解率达到96.1％，72h内可完全降解，可开发为专门针对右旋苯醚菊酯的降解制剂产品，弥补现有相关技术和市场的空白。
同时，该菌株可用于修复右旋苯醚菊酯污染的水体、土壤等自然环境，直接施用短时间内可使水体或土壤中右旋苯醚菊酯残留量降低77％以上；可用于修复拟除虫菊酯类农药污染的水体、土壤等环境，解决了农业生产中该类农药残留超标问题及环境污染问题，生产出无毒无公害的绿色农产品。
另外，本发明还提供了一种使用菌株P31生产制备得到的降解菌剂，具有生产成本低、使用方便、去除效果明显等优点，适合治理水体或土壤等自然环境中右旋苯醚菊酯等拟除虫菊酯类农药造成的残留污染。
本发明进一步还采用响应曲面法Box-Behnken设计对菌剂降解工艺条件进行了优化，获得的最优降解工艺条件为：温度29.5℃，pH 7.3和接种量0.3g/L，在此工艺条件下菌剂降解效果明显提高，具有重要的理论和应用价值。
附图说明
图1为菌株P31的菌落图(A)和扫描电镜图(B)。
图2为菌株P31的16S rRNA系统进化树。
图3为菌株P31降解50mg/L右旋苯醚菊酯的HPLC色谱图，12h(A)和60h(B)。
图4为菌株P31降解右旋苯醚菊酯的响应曲面图。
图5为菌株P31对不同浓度右旋苯醚菊酯的降解。
图6为菌株P31对不同拟除虫菊酯类农药的降解。
图7为菌株P31降解右旋苯醚菊酯的途径分析。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1菌株P31的分离与鉴定
1、菌株分离筛选
(1)样品：采集自广西某化工厂污水排放口及周边的活性污泥。
(2)分离筛选方法采用富集培养法，具体如下：
将100mL基础无机盐培养基(MSM)加入到250mL三角瓶中，灭菌(121℃20min)。培养基冷却后在无菌条件下加入右旋苯醚菊酯样品母液(丙酮为溶剂)，使右旋苯醚菊酯最终质量浓度为100mg/L，同时加入环境样品10g，并于30℃、200r/min摇床培养7d后，按10％的接种量转接到第二批含200mg/L右旋苯醚菊酯的MSM培养基中。相同条件培养7d后，再按10％的接种量转接到含400mg/L右旋苯醚菊酯的基础培养基中，继续培养7d。以此类推，不断增加右旋苯醚菊酯的质量浓度，直到浓度为800mg/L为止。培养结束后，取0.1mL样液均匀涂抹到含有100mg/L右旋苯醚菊酯的MSM固体培养基上，于30℃温度下培养2d后，挑取形态不同的单菌落在含200mg/L右旋苯醚菌酯的MSM固体平板上划线分离。相同条件培养2d后，再挑取单菌落于含400mg/L右旋苯醚菊酯的MSM固体平板上，继续培养2d。如此重复，不断增加右旋苯醚菊酯的质量浓度，直至分离出耐药能力较强的高活性优势单菌落，并使用高效液相色谱法(HPLC)验证其降解效果。
其中，所述MSM培养基的配方为：(NH4)2SO4 2g、MgSO4·7H2O 0.2g、CaCl2·2H2O0.01g、FeSO4·7H2O 0.001g、Na2HPO4·12H2O,1.5g、KH2PO4,1.5g、水1000mL，pH 7.2～7.5。
HPLC测定条件如下：
HPLC型号：2690型(Waters,USA)；色谱柱：C18反相柱(Phenomenex,250nm×4.60mm,5μm)；流速：1mL/min；柱温：常温(28±1℃)；流动相：乙腈:水＝90:10(含0.1％乙酸)；扫描波长：全扫描；进样量：10μL。在上述条件下，右旋苯醚菊酯峰存在同分异构体，故峰形由2个峰组成，且峰尖锐、稳定，保留时间分别为6.75min和7.03min。
(3)采用上述方法从环境样品中成功分离获得一株右旋苯醚菊酯高效降解菌株，命名为P31，该菌株可以利用右旋苯醚菊酯作为唯一碳源生长，60h内对50mg/L右旋苯醚菊酯的降解率达到96.1％，72h内可完全降解右旋苯醚菊酯，具有较好的生物降解效果，HPLC色谱图见图3。
2、菌株鉴定
(1)菌株P31在LB固体平板中生长快，极富运动性。菌落在LB固体平板中呈现淡黄色，菌落圆形，边缘光滑，不透明(图1中A图)。主要生物学特性为：该菌株属于革兰氏阴性菌，好氧，富有运动性；无芽胞、有荚膜，细胞呈杆状，大小为(1.5～4.0)×(0.5～1.0)微米，具端鞭毛，可以运动(图1中B图)；接触酶、氧化酶、柠檬酸盐试验、硝酸盐还原试验、溶血试验和精氨酸双水解酶试验呈阳性；明胶液化试验、脲酶试验、吲哚试验和七叶苷试验呈阴性；菌株P31可耐40℃和5％NaCl生长，在pH 5.0～10.0营养肉汤中生长良好。
(2)进一步设计PCR引物通过16S rRNA鉴定，菌株P31的16S rRNA基因序列与BLAST在线数据库中比对分析，结果显示菌株P31与菌株Pseudomonas sp.SRZ19(登录号：KU877341)相似性达96％以上。菌株P31的系统进化分析见图2。
(3)根据《伯杰氏系统鉴定手册》进行菌株P31生理生化特性测定，鉴定结果见表1。
表1降解菌株P31生理生化特征结果
注：+,代表反应阳性；－,代表反应阴性
(4)菌株P31进一步通过Biolog微生物自动分析系统鉴定。菌株P31培养16-24h后置于Biolog Microstation System读数仪进行读数。Biolog系统鉴定结果如表2所示。
表2菌株Biolog系统鉴定结果
注：－：阴性反应；+：阳性反应。
综上所述，经形态学特征、生理生化特性、16S rRNA系统发育分析及Biolog微生物自动分析系统鉴定该降解菌株P31为黄褐假单胞菌(Pseudomonas fulva)。并已于2017年5月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017256；保藏地址：中国武汉，武汉大学。
实施例2菌株P31降解菌剂的制备
1、使用上述菌株P31制备降解菌剂的生产工艺流程为：
斜面种——摇瓶种子液——种子罐培养——生产罐发酵——产品(包装剂型为液体剂型或固体菌剂剂型)。
2、具体地，制备所述降解菌剂的方法如下：
(1)将菌株P31的菌种在LB固体平板上活化，接种于LB试管斜面上备用；
(2)将菌株P31的试管种接种于含250mL LB培养基(培养基配方为：酵母膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 1％，pH值为7.2～7.5)的1000mL摇瓶中，30℃恒温振荡至对数期，获得菌种；
(3)获得的菌种接种于种子罐：种子罐中装有种子培养基，装液量为70％，投料完成后在1.1Kg/cm3的压力下、121℃条件下高压湿热灭菌，冷却至30℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接种于装液量为70％的种子罐，无菌空气的通气量为0.6～1.0m3/min，搅拌速度为180～240r/min，培养至对数生长期备用。
(4)将到达对数期的种子液按照10％的接种量投入装有发酵培养基的生产发酵罐(装液量为70％)发酵培养。投料后的生产罐，在1.1Kg/cm3的压力下、121℃条件下高压湿热灭菌，冷却至30℃后接种，通无菌空气，通气量为0.6～1.0m3/min，搅拌速度为180～240r/min，培养温度控制为28～30℃，整个工艺培养流程时间为24～36h，发酵结束后菌体数量≥1.0×109CFU/mL，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
其中，种子培养基和发酵培养基的配方均为：酵母膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 1％，pH值为7.2～7.5。
实施例3菌株P31菌剂的最优降解工艺条件筛选优化
1、利用单因子实验和响应曲面法相结合的方法，测定菌株P31降解右旋苯醚菊酯的特性，同时优化菌株的降解条件。
将P31菌剂进行单因素降解试验，通过依次改变影响生长和降解的因素，如温度、pH值、接种量、振荡速率、装液量等，测定P31菌剂的降解率，确定影响P31菌剂降解率的关键因素。利用SAS 9.0统计软件根据响应曲面法Box-Behnken设计原则进行试验设计(表3)，以影响菌株P31生长与降解的关键因子温度值(X1)、pH(X2)和接种量(X3)为自变量，以右旋苯醚菊酯降解率为响应值(Y1)，建立多元二次回归方程。根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应曲面图。最后对多元二次回归方程求一阶偏导，通过解方程得到该模型的极值点，即P31菌剂最优降解工艺条件。
表3响应曲面Box-Behnken设计试验结果
通过SAS统计软件分析，获得P31菌剂降解的多元二次回归方程如下：
Y1＝-494.163+22.1325X1+75.125X2-24.125X3–0.3795X1 2+0.04X1X2-0.15X1X3-5.5625X2 2+14.5X2X3-113.75X3 2
2、统计分析结果表明，pH值(X1)、温度(X2)和接种量(X3)对菌株P31降解效果的一次效应均达到显著水平(P<0.05)；二次效应X1 2和X2 2对菌株P31降解效果也达到显著水平(P<0.05)。为了能更直观的反映出各因素及其交互效应，利用SAS软件程序作出响应曲面图，见图4。为了获得P31菌剂降解工艺条件的最佳组合，对所得的多元二次回归模型方程求一阶偏导，通过解方程得到该模型的临界值，即菌剂最优降解工艺条件：温度29.5℃，pH 7.3和接种量0.3g/L。
实施例4实验室降解实验
1、在基础培养基(同实施例1)中分别加入不同浓度的右旋苯醚菊酯(25、50、100、200、400和800mg/L)；接种浓度为1.0×107CFU/mL的P31菌剂，并设不接菌的培养基为对照，30℃培养72h，定期取样，应用HPLC法测定农药的残留量，并计算降解率。
2、在基础培养基(同实施例1)中分别加入右旋苯醚菊酯、氯菊酯、氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯和联苯菊酯等拟除虫菊酯类农药，使其终浓度为50mg/L；接种浓度为1.0×107CFU/mL的P31菌剂，并设不接菌的培养基为对照，30℃培养72h，定期取样，应用HPLC法测定农药的残留量，并计算降解率。
降解率计算方法如下：
3、结果分别如图3、图5、图6及表4所示。
表4 P31对拟除虫菊酯类农药的降解效果
实验结果表明，菌株P31可耐受和降解800mg/L的右旋苯醚菊酯，并且在降解过程中没有明显的滞后效应产生，说明菌株P31可耐受更大浓度的右旋苯醚菊酯。当初始浓度低于50mg/L时，菌株P31培养72h内可完全降解右旋苯醚菊酯；当初始浓度在100～800mg/L时，降解率随着浓度增加逐渐降低，但降解率依然达到80％以上。菌株P31降解右旋苯醚菊酯的HPLC色谱图见图3。
菌株P31可在短时间内快速降解各拟除虫菊酯类农药，48h内对50mg/L右旋苯醚菊酯的降解率达到86.4％，72h内完全降解右旋苯醚菊酯，具有较好的生物降解效果。菌株P31对其他拟除虫菊酯类农药也具有较好的生物降解效果，72h内对氯菊酯、氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯和联苯菊酯的降解率分别达到96.7％、89.2％、86.6％、83.1％、71.4％和57.9％，降解效果见图6。
实施例5降解途径及产物分析
1、在基础培养基(同实施例1)中加入右旋苯醚菊酯，使其终浓度为50mg/L；接种浓度为1.0×107CFU/mL的P31菌剂，并设不接菌的培养基为对照，30℃培养72h，定期取样，使用二氯甲烷萃取培养液，应用GC-MS法检测右旋苯醚菊酯降解产物，并根据降解产物化学结构分析降解途径。
GC-MS测定条件如下：
GC-MS型号：6890N/5975型(Agilent,USA)；HP-5MS石英毛细管柱(30.0m×250μm×0.25μm)；载气：氦气，纯度≥99.999％；流量1.5mL/min，不分流进样，进样量均为1μL；电离电压：70eV，全扫描模式，扫描范围30～500nm；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；MS传输线温度：280℃；进样口温度：250℃；检测器温度：320℃；升温程序：初温90℃(2min)，6℃每分钟升温至150℃(1min)，10℃每分钟升温至180℃(4min)，20℃每分钟升温至260℃(10min)。
2、GC-MS分析结果表明，P31菌剂降解右旋苯醚菊酯主要产生间苯氧基苯甲醛及1,2-苯二甲酸酯，出峰保留时间分别为17.035和20.643min，其中间苯氧基苯甲醛为主要中间产物。这些中间产物最终都被P31菌剂完全降解。72h后均检测不出右旋苯醚菊酯及其中间产物。根据这些实验结果，对P31菌剂降解右旋苯醚菊酯的途径进行分析，见图7。
实施例6土壤修复实验
1、供试土样
农田表层土(5～20cm)，取自华南农业大学教学农场试验田，属红壤土，超过5年未施用右旋苯醚菊酯等化学农药。
土壤样品取回后首先置于阴凉通风处自然风干，风干后碾磨，过2mm筛，分别取一定量的右旋苯醚菊酯溶于丙酮中，然后浸泡硅藻土，使右旋苯醚菊酯被完全吸附。浸泡后的硅藻土置于通风橱中吹干，将其拌入土壤中，使土壤中右旋苯醚菊酯的浓度约为50mg/kg。
取600g土样于30℃恒温恒湿培养箱中培养，按1.0×107CFU/g的接种量接入P31降解菌剂，以加蒸馏水的作为对照，土壤的持水量保持在40％。
连续培养10天，并定期取样，HPLC法测定右旋苯醚菊酯残留量并计算降解率。降解率计算方法如实施例4。
2、测定结果如表5。
表5 P31降解菌剂对土壤中右旋苯醚菊酯的降解效果
| 时间(d) | 对右旋苯醚菊酯的降解率(％) |
| 2 | 14.6 |
| 4 | 32.4 |
| 6 | 55.8 |
| 8 | 67.4 |
| 10 | 77.0 |
实验结果表明，培养10d后，P31降解菌剂对土壤中的右旋苯醚菊酯降解率达到77.0％。
以上结果说明，P31降解菌剂在直接施入土壤中后，能快速降解土壤农药，没有出现降解滞后效应现象，其降解性能稳定，这就为菌株P31对右旋苯醚菊酯等拟除虫菊酯类农药的土壤生物修复提供了科学依据。
Claims (10)
1.一株可降解拟除虫菊酯类农药的黄褐假单胞菌（Pseudomonas fulva）菌株P31，其特征在于，该菌株于2017年5月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2017256。
2.权利要求1所述菌株P31在制备拟除虫菊酯类农药降解菌剂方面的应用。
3.一种拟除虫菊酯类农药的降解菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述菌株P31和/或其发酵液。
4.根据权利要求3所述的降解菌剂，其特征在于，所述降解菌剂由包括如下步骤的方法生产而成：
S1.将所述菌株P31接种于LB培养基振荡培养至对数期，获得菌种；
S2.将所得菌种按照体积比5%～10%的接种量接入种子培养基，培养至对数生长期，获得种子液；
S3.将所得种子液按照体积比5～10%的接种量接种入发酵培养基进行发酵培养，发酵完成后培养液分装成液体剂型或采用泥炭吸附后分装成固体菌剂剂型。
5.权利要求1所述菌株P31或权利要求3所述降解菌剂在降解拟除虫菊酯类农药方面的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，可应用于自然环境中拟除虫菊酯类农药残留的降解。
7. 根据权利要求2、 5或6所述的应用，其特征在于，所述拟除虫菊酯类农药为右旋苯醚菊酯、氯菊酯、氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯或联苯菊酯。
8.根据权利要求2、5或6所述的应用，其特征在于，所述拟除虫菊酯类农药为右旋苯醚菊酯。
9. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述自然环境为水体或土壤，应用方法为：将权利要求3所述降解菌剂稀释后喷洒到水体或土壤中，稀释后的降解菌剂中菌体的数量不低于1.0×107 CFU/mL。
10. 权利要求1所述菌株P31或权利要求3所述降解菌剂降解拟除虫菊酯类农药的降解工艺，其特征在于，温度28～30℃，pH 7～7.5，接种量0.1～0.5g/L。
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