CN115340966A - 一种戈登氏菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种戈登氏菌及其应用。具体是戈登氏菌(Gordonia cholesterolivorans)在降解拟除虫菊酯类杀虫剂或制备降解拟除虫菊酯类杀虫剂菌剂方面的应用。本发明研究得到，戈登氏菌(Gordonia cholesterolivorans)A16对多种拟除虫菊酯类杀虫剂具有高效降解作用，对浓度为50mg·L‑1的胺菊酯、炔丙菊酯、丙烯菊酯的降解率分别达到95.1％、91.6％、94.7％；对土壤中胺菊酯、炔丙菊酯、丙烯菊酯的降解率分别达到82.9％、81.5％、83.0％。因此，戈登氏菌可用于制备降解拟除虫菊酯类杀虫剂菌剂产品，对被拟除虫菊酯类杀虫剂污染的自然环境的修复有重大应用价值。

Description

一种戈登氏菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域。更具体地，涉及一种戈登氏菌及其应用。
背景技术
拟除虫菊酯类杀虫剂被广泛用于国内卫生害虫的早期防治。它们的作用机制是干扰神经钠离子通道，阻断神经信号传递。由于拟除虫菊酯类杀虫剂活性高、残留低，至今仍是农药领域的支柱之一，并且使用量逐年增加，从2010年占全球农药市场的25％上升到2018年的30％以上。
随着拟除虫菊酯类杀虫剂的广泛使用以及由于使用过程的操作不规范，拟除虫菊酯类杀虫剂在环境中的残留也越来越多。拟除虫菊酯类杀虫剂通过地表水流、渗入土壤等途径进入自然水循环，对生活用水和河床沉积物造成污染，并对动植物造成不良影响。研究表明，拟除虫菊酯类杀虫剂可诱导大鼠红细胞膜发生变化，导致红细胞膜磷脂显著增加，胆固醇水平降低。溴氰菊酯在50μg·L-1浓度下显著抑制鲤鱼的孵化率(仅为9％)。拟除虫菊酯对人体虽没有剧毒，但长期暴露在低剂量环境中会破坏精子DNA，影响人类精子质量。这些结果揭示了拟除虫菊酯对人类健康和生态系统的潜在危害。拟除虫菊酯类杀虫剂的持续使用及其环境残留已引起严重关注。因此，迫切需要制定有效的策略来解决拟除虫菊酯类杀虫剂残留的问题。
通过微生物降解环境中的有机污染物，与物理和化学方法相比，具有更有效、更安全、成本更低、不会造成二次污染的优点，已经引起了广泛关注。近年来，报道了许多使用拟除虫菊酯作为其唯一碳源或在其他营养物质的帮助下降解拟除虫菊酯的微生物。如CN201911277810.0公开的琥珀葡萄球菌(Staphylococcus succinus)菌株HLJ-10以及CN201911407410.7公开的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas trueperi)菌株CW3都具有降解拟除虫菊酯类杀虫剂的作用。
然而，目前为止还未见可以高效快速降解胺菊酯、炔丙菊酯的拟除虫菊酯降解菌的报道。微生物也可能因为细菌钝化、菌株变异、退化等问题失去降解能力，因此扩充降解菌库的成员具有相当的必要性。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，旨在提供一种戈登氏菌及其应用，实现对拟除虫菊酯类杀虫剂的快速高效降解，修复被胺菊酯残留污染的土壤和水体等环境。
本发明的首要目的是提供戈登氏菌(Gordonia cholesterolivorans)在降解拟除虫菊酯类杀虫剂或制备降解拟除虫菊酯类杀虫剂菌剂方面的应用。
本发明的另一目的是提供戈登氏菌(Gordonia cholesterolivorans)在修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的自然环境方面的应用。
本发明的再一目的是提供一种戈登氏菌(Gordonia cholesterolivorans)A16。
本发明的再一目的是提供所述戈登氏菌(Gordonia cholesterolivorans)A16在降解拟除虫菊酯类杀虫剂或制备降解拟除虫菊酯类杀虫剂菌剂方面的应用。
本发明的再一目的是提供所述戈登氏菌(Gordonia cholesterolivorans)A16在修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的自然环境方面的应用。
本发明的再一目的是提供一种降解拟除虫菊酯类杀虫剂的菌剂。
本发明的再一目的是提供一种降解拟除虫菊酯类杀虫剂或修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的自然环境的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明首次发现戈登氏菌(Gordonia cholesterolivorans)对胺菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂的降解作用，并筛选得到一株高效快速降解胺菊酯、炔丙菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂的戈登氏菌(Gordonia cholesterolivorans)A16。
该菌株是从广东省广州市某农药厂废水处理池的活性污泥中经人工富集培养、分离纯化得到，本发明发现该菌株对胺菊酯、丙烯菊酯、炔丙菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯、氯烯炔菊酯、联苯菊酯、氰戊菊酯和右旋苯醚氰菊酯具有高效降解作用；在分别含有50mg·L-1胺菊酯、炔丙菊酯的基础盐培养基(MSM)中培养11天，对胺菊酯、炔丙菊酯、丙烯菊酯的降解率分别达到95.1％、91.6％、94.7％；可耐受800mg·L-1高浓度胺菊酯。将该菌株接种到土壤中11天后，对土壤中胺菊酯、炔丙菊酯、丙烯菊酯的降解率达到82.9％、81.5％、83.0％，降解能力优异，可高效快速去除水体和土壤中残留的拟除虫菊酯类杀虫剂。戈登氏菌A16可以作为优良的生物降解菌应用于胺菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂污染的生物修复。
因此，以下技术方案均应在本发明的保护范围之内：
本发明提供了戈登氏菌(Gordonia cholesterolivorans)在降解拟除虫菊酯类杀虫剂或制备降解拟除虫菊酯类杀虫剂菌剂方面的应用。
本发明还提供了戈登氏菌(Gordonia cholesterolivorans)在修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的自然环境方面的应用。
本发明还提供了一种戈登氏菌(Gordonia cholesterolivorans)A16，该菌株于2021年7月21日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:61814，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明还提供了上述戈登氏菌A16在降解拟除虫菊酯类杀虫剂或制备降解拟除虫菊酯类杀虫剂菌剂方面的应用。
本发明还提供了上述戈登氏菌A16在修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的自然环境方面的应用。
优选地，所述拟除虫菊酯类杀虫剂为胺菊酯、丙烯菊酯、炔丙菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯、氯烯炔菊酯、联苯菊酯、氰戊菊酯和右旋苯醚氰菊酯。
具体的，所述自然环境为水体、土壤或土壤-水混合系统。
本发明还提供了一种降解拟除虫菊酯类杀虫剂的菌剂，其含有戈登氏菌(Gordonia cholesterolivorans)。
优选地，所述戈登氏菌(Gordonia cholesterolivorans)为戈登氏菌A16。
本发明还提供了一种降解拟除虫菊酯类杀虫剂或修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的自然环境的方法，具体是使用上述使用戈登氏菌制备的菌剂降解环境中的拟除虫菊酯类杀虫剂。
根据研究结果显示，降解条件对降解虽有一定的影响，但影响不显著，对环境条件要求不苛刻。对于降解温度，在20～40℃的常温下、pH为5.0～9.0条件下，降解效果均十分优异。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次公开了戈登氏菌(Gordonia cholesterolivorans)对胺菊酯、丙烯菊酯、炔丙菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯、氯烯炔菊酯、联苯菊酯、氰戊菊酯和右旋苯醚氰菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂具有降解作用。并筛选得到一株高效降解胺菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂的戈登氏菌A16，该菌株对浓度为50mg·L-1的胺菊酯、炔丙菊酯、丙烯菊酯的降解率分别达到95.1％、91.6％、94.7％；对土壤中胺菊酯、炔丙菊酯、丙烯菊酯的降解率达到82.9％、81.5％、83.0％以上。
戈登氏菌A16的分离和鉴定丰富了农药降解菌的种质资源库，对拟除虫菊酯类杀虫剂污染的自然环境的修复有重大应用价值，为打破现有治理农药残留污染瓶颈提供了新的开发途径。
附图说明
图1为戈登氏菌A16的菌落形态图。
图2为戈登氏菌A16扫描电镜图。
图3为戈登氏菌A16的16S rDNA系统进化树。
图4为戈登氏菌A16降解胺菊酯的响应曲面图。a～c图为温度、pH和接菌量三种影响因子两两交互作用对菌株A16降解胺菊酯效果的影响；d图为三个自变量的降解速率预测模型。
图5三种自变量单因素对菌株A16降解胺菊酯的影响。
图6为戈登氏菌A16降解胺菊酯的降解曲线。
图7为戈登氏菌A16对不同浓度胺菊酯的降解效果。
图8为不同浓度底物对戈登氏菌A16降解速率的抑制曲线。
图9为戈登氏菌A16对其他拟除虫菊酯类杀虫剂的降解效果。
图10为戈登氏菌A16对土壤中的胺菊酯的降解效果。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例来进一步详细阐述本发明。以下实施例为本发明较佳的实施方式，但并不对本发明的保护范围做任何形式的限定。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中所使用的培养基配方如下：
基础盐培养基(MSM，g/L)：(NH4)2SO4，2.0；CaCl2·2H2O，0.01；FeSO4·7H2O，0.001；Na2HPO4·12H2O，1.5；MgSO4·7H2O，0.2；KH2PO4，1.5。
Luria-Bertani培养基(LB，g/L)：酵母提取物，5.0；蛋白胨，10.0；氯化钠，10.0。
种子培养基和发酵培养基的配方与LB培养基一致。
以上培养基以蒸馏水配成，pH为7.2，于高压湿热灭菌锅121℃灭菌20分钟。配制固体培养基，则在上述培养基的基础上，每1L培养基加入15～20g琼脂粉。
实施例1菌株的分离与鉴定
一、胺菊酯降解菌株的筛选分离
在广东省广州某农药厂的废水处理池采集活性污泥样品，将总共5g活性污泥样品加入到100mL的MSM液体培养基中，添加胺菊酯母液(丙酮为溶剂)使培养基中胺菊酯的终浓度为50mg·L–1。
于30℃、200rpm的条件下培养7天后，按50mg·L–1、100mg·L–1、200mg·L–1、400mg·L-1、800mg·L-1的浓度设置，逐步增加MSM液体培养基中胺菊酯的浓度，每次以5％的接种量将上一个浓度梯度的菌液接菌至下一更高浓度梯度的培养基中，培养7天后，再进行下一次的转移培养。
最后一次转移后菌落在含有800mg·L-1胺菊酯的MSM液体培养基中进行培养，培养7天后，以10、102、103、104倍的梯度进行稀释，稀释后涂布在含有50mg·L-1胺菊酯的MSM固体平板上，置于30℃培养箱中倒置培养2天。
平板上长出单菌落后，挑取不同形态的单菌落在LB固体平板上进行至少3次划线纯化。
通过高效液相色谱(HPLC)(Waters，USA)检测纯化后的菌株对MSM液体培养基中胺菊酯的降解能力，从中得到一株对胺菊酯具有最高降解能力的菌株，将其编号为A16。
使用菌株A16进行进一步的研究。
二、菌株A16的鉴定
1、形态学鉴定：
如图1所示，菌株A16在LB固体培养基上的菌落呈白色，圆形，边缘规则，不透明。
2、扫描电镜观察
如图2所示，扫描电镜观察下，菌株A16细胞呈杆状，没有孢子和鞭毛。
3、16S rDNA分子生物学鉴定：
根据制造商的说明，用Master Pure DNA Purification Kit(EpicentreBiotechnologies，USA)提取总基因组DNA。用通用引物对，正向引物(27F：5'-TGACGAGTGGCGGACGGGTG-3')和反向引物(1492R：5'-CCATGGTGTGACGGGCGGTGTG-3')对菌株A16的16S rDNA序列进行PCR扩增。该序列基因以登录号MW872315在线提交至GenBank数据库中，通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)对菌株A16扩增的1405bp 16S rDNA序列在GenBank核苷酸库中进行BLAST比较分析。选取同源性高的相关序列进行多序列比对后，利用MAGA X软件进行系统发育分析和系统发育树构建(系统发育树如图3所示)。系统发育分析显示菌株A16与戈登氏菌菌株Gordonia cholesterolans Chol-3显示99％以上的相似性。
基于上述鉴定结果，将本发明分离得到的菌株A16鉴定为戈登氏菌(Gordoniacholesterolivorans)，菌株分类命名为Gordonia cholesterolivorans A16，并于2021年7月21日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:61814，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例2戈登氏菌A16菌剂的制备
使用实施例1分离得到的戈登氏菌A16制备菌剂的生产工艺流程为：斜面菌种——摇瓶种子液——种子罐培养——生产罐发酵——产品(剂型可为悬浮剂或粉剂)。具体步骤如下：
(1)将戈登氏菌A16在LB固体平板上活化，菌种于LB试管斜面上，培养试管种备用。
(2)将戈登氏菌A16的试管种接种于含250mL LB培养基的1000mL摇瓶中，30℃恒温振荡至对数期，然后按10％的接种量接种于装有灭菌的种子培养基的种子罐(装液量为70％)，通入无菌空气(通气量为0.8m3/min)，在200rpm的转速下搅拌，培养至对数生长期，得到种子液备用。
(3)将到达对数期的种子液按照10％的接种量投入装有发酵培养基的生产发酵罐(装液量为70％)，投料后的生产发酵罐，在1.1Kg/cm3的压力下、121℃条件下高压湿热灭菌，冷却至30℃后，通无菌空气，通气量为0.8m3/min，在200rpm/min的速度下搅拌，控制培养温度为30℃，发酵培养48小时，发酵结束后培养液中菌体数量≥1.0×109CFU/mL。
(4)发酵完成后将培养液用塑料包装桶或包装瓶分装即可制备得到液体剂型的戈登氏菌A16菌剂；或者采用泥炭吸附后用包装袋分装成固体剂型的戈登氏菌A16菌剂。
实施例3戈登氏菌A16对胺菊酯的最优降解条件
一、实验方法
(1)基于响应曲面法(RSM)的Box-Behnken设计优化戈登氏菌A16对胺菊酯的降解条件
通过单因素实验确定影响戈登氏菌A16降解胺菊酯的关键因素，即温度、pH、接种量。
以温度(X1)、pH(X2)和接种量(X3)为自变量，以胺菊酯降解率为响应值(Y1)，正交实验自变量取值和对应的响应值如表1所示。建立二次多项式回归方程，根据二次多项式回归方程进行绘图分析，得到如图4所示的回归方程的响应曲面图。
表1 Box-Behnken随机设计矩阵和因变量对胺菊酯降解的响应
Figure BDA0003760280350000071
通过响应面对相关降解数据进行多项式回归分析，拟合胺菊酯的降解实验值，得到如下二次多项式回归方程：
Y＝98.28+1.76X1+14.94X2+5.06X3+7.68X1X2+4.00X1X3+10.66X2X3–7.22X1 2–38.27X2 2+0.7213X3 2
(2)二次多项式模型的方差分析(ANOVA)
二次多项式模型的方差分析结果见表2。
表2戈登氏菌A16降解胺菊酯的ANOVA分析结果
Figure BDA0003760280350000081
注：X1代表温度；X2代表pH；X3代表接种量；P<0.05表示模型项显著。
二、实验结果
对多元二次回归方程求一阶偏导，通过解方程得到该模型的极值点，即为戈登氏菌A16对胺菊酯的最优降解工艺条件，即三个自变量的最佳取值分别为：温度(X1)38.3℃，pH(X2)8.5，接种量(X3)OD600为0.8，即为1.0×107CFU/mL。
表2的结果中，模型项的F值为15.3，P值<0.05，表明该方程显著拟合了胺菊酯的降解过程。模型的决定系数R2为0.9650，说明本次实验的实际值与模型的预测值具有较高的吻合度。低变异系数(C.V.＝1.67％)表明该模型准确可靠。
回归分析表明，温度(X1)和pH(X2)的单因素及其平方项，即X1、X2、X1 2和X2 2对戈登氏菌A16降解胺菊酯有显著影响(P<0.05)，接种量(X3)对戈登氏菌A16降解胺菊酯也有显著影响(P<0.05)。更直观地，可从图5可以看出，随着温度(X1)和pH(X2)、和接种量(X3)的提高，菌株A16对胺菊酯的代谢提高，然而当提高至一定程度之后，降解率呈下降趋势。而接种量(X3)的平方项X3 2对戈登氏菌A16降解胺菊酯没有显著影响(P>0.05)，温度(X1)和pH(X2)、温度(X1)和接种量(X3)、接种量(X3)和pH(X2)的交互作用项(即X1X2、X1X3、X2X3)对戈登氏菌A16的代谢活性也没有显着影响(P>0.05)。
实施例4戈登氏菌A16对胺菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂的降解效果
一、实验方法
(1)MSM培养基萃取方法：将2mL收集的样品添加到50mL离心管中，并添加10mL乙酸乙酯。将离心管涡旋10s后，超声处理20min。然后，继续涡旋2min，并将试管静置在室温下大约20min，直到水相和有机相清晰分层为止。随后用移液枪精确吸取1mL上层有机相于5mL一次性离心管中，舍弃原50mL离心管。最后，将装有1mL有机相的5mL离心管置于真空离心浓缩仪中或则利用氮气进行吹干浓缩。各种拟除虫菊酯残留物通过1mL色谱乙腈进行涡旋回收。使用1mL注射器和0.22μm滤膜进一步纯化回收样品，并在进行HPLC检测之前将其保存在4℃的棕色瓶中。
(2)拟除虫菊酯类杀虫剂含量的检测方法
通过通过高效液相色谱(HPLC)测量拟除虫菊酯类杀虫剂的含量，色谱条件如下所述：
HPLC型号：2690型(Waters，USA)；
色谱柱：C18反相柱(Phenomenex，250nm×4.60mm，5μm)；
柱温：常温(30±1℃)；
流动相：乙腈:水(v:v)＝65:35；
流速：1mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：250nm；
运行时间：10min。
在上述条件下，胺菊酯的保留时间为5.0min。
按照下式计算拟除虫菊酯类杀虫剂的降解率：
Figure BDA0003760280350000091
式中，A1为戈登氏菌A16处理后拟除虫菊酯类杀虫剂残留浓度，A0为处理前的拟除虫菊酯类杀虫剂初始浓度。
质量控制：采用外标法校正标准物质制作标准曲线。
(3)种子液制备
将纯化后的戈登氏菌A16接入含有5mL的LB液体培养基中过夜活化培养至对数期，4000rpm离心后，菌体沉淀用无菌生理盐水(0.9％NaCl)冲洗两次，所得菌体作为接种体。
(4)戈登氏菌A16对胺菊酯的降解
将1mL OD600为1.0的戈登氏菌A16菌液接种到50mL含有浓度为50mg·L-1胺菊酯的MSM培养基中；不接种戈登氏菌A16的含有相同浓度胺菊酯的MSM培养基为对照组，所有实验三次重复。
在30℃、200rpm条件下培养11天，分别于1、3、5、7、9、11天定期取样，通过HPLC测定对照组和实验组培养基中胺菊酯的浓度，通过紫外可见分分光光度计监测戈登氏菌A16的生长情况。
二、实验结果
实验结果如图6所示，图中标注为对照组的曲线表示对照组培养基中胺菊酯浓度的变化；标注为胺菊酯的曲线表示实验组培养基中胺菊酯浓度的变化；标注为A16的曲线表示实验组培养基中戈登氏菌A16数量的变化。
可见，随着时间的推移，培养基中戈登氏菌A16的数量增加，胺菊酯的浓度降低。与对照相比，接种戈登氏菌A16提高了胺菊酯的降解率。胺菊酯的降解速率受戈登氏菌A16生长的影响，微生物密度达到对数阶段时，降解速率达到最大，而一旦戈登氏菌A16生长曲线达到静态阶段，降解速率下降。培养7天和11天后，胺菊酯分别降解了70％和95％以上。可以假设戈登氏菌A16可以利用胺菊酯作为生长的唯一碳源，揭示了其在生物修复被胺菊酯污染的环境方面的巨大潜力。
四、戈登氏菌A16对不同浓度的胺菊酯的降解效果
1、实验方法
将1mL OD600为1.0的戈登氏菌A16菌液接种到分别含有25mg·L-1、50mg·L-1、100mg·L-1、200mg·L-1、400mg·L-1、800mg·L-1胺菊酯的50mL MSM培养基中。在30℃、200rpm条件下培养11天，分别于1、3、5、7、9、11天定期取样，测定各浓度条件下戈登氏菌A16对胺菊酯的降解率，绘制胺菊酯降解动力学曲线，同时采用安德鲁斯方程进行不同浓度的胺菊酯生物降解过程的动力学分析。
2、实验结果
不同浓度胺菊酯的降解实验结果如图7所示，可见，戈登氏菌A16对各浓度的胺菊酯(25-800mg·L-1)均具有降解作用，在含25mg·L-1、50mg·L-1、100mg·L-1、200mg·L-1、40mg·L-1和800mg·L-1的MSM培养基中培养11天后，降解效率分别为100％、95.1％、89.6％、72.6％、65.0％和56.7％。上述结果表明，戈登氏菌A16可以耐受高浓度的胺菊酯，并表现出高效的降解能力。
但是，戈登氏菌A16对不同浓度的胺菊酯的降解速率不同，当胺菊酯浓度为25mg·L-1时，培养7d降解效率达到95.7％，培养9d降解达到100％。当培养基中胺菊酯的浓度为100mg·L-1时，培养11天的降解效率为89.6％；当培养基中胺菊酯的浓度上升至200mg·L-1时，培养11天的降解效率下降至72.6％。上述结果表明，戈登氏菌A16在低浓度(<100mg·L-1)下具有良好的降解效果。
随着胺菊酯浓度的增加，降解率下降，这可能是由于高浓度的胺菊酯的强毒性所致。
采用安德鲁斯方程进行不同浓度胺菊酯生物降解过程的动力学分析结果如图8所示。由安德鲁斯方程建立的模型理论值与实际值吻合较好(R2＝0.9424)，胺菊酯的最大比降解率(qmax)为0.4561d-1，半速率常数(Ks)为7.3mg·L-1，抑制系数(Ki)为75.2mg·L-1。通过进一步求导，得在qmax时对应的浓度(Smax)为23.5mg·L-1，该浓度为戈登氏菌A16降解胺菊酯的最佳预测浓度。
五、戈登氏菌A16对拟除虫菊酯类杀虫剂的降解效果
一、实验方法
将1mL OD600为1.0的戈登氏菌A16菌液接种到分别含有50mg·L-1胺菊酯、丙烯菊酯、炔丙菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯、氯烯炔菊酯、联苯菊酯、氰戊菊酯和右旋苯醚氰菊酯的灭菌MSM培养基中。在30℃、200rpm条件下培养11天，并于第11天取样测定戈登氏菌A16对各拟除虫菊酯类杀虫剂的降解率。
二、实验结果
戈登氏菌A16对各拟除虫菊酯类杀虫剂的降解效果实验结果如图9所示，可见，戈登氏菌A16对胺菊酯、丙烯菊酯、炔丙菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯、氯烯炔菊酯、联苯菊酯、氰戊菊酯、右旋苯醚氰菊酯都具有显著的降解效果。这表明参与降解过程的降解酶不是底物特异性的。
此外，戈登氏菌A16对不同拟除虫菊酯的降解效果存在显著差异。在相同条件下处理11天后，戈登氏菌A16对氯菊酯、氯烯炔菊酯、高效氯氰菊酯、右旋苯醚氰菊酯、炔丙菊酯和丙烯菊酯表现出高效的降解作用(降解率分别达到52.8％、60.7％、65.0％、68.3％、91.6％和94.7％)。而戈登氏菌A16对氰戊菊酯和联苯菊酯的降解作用则分别仅为33.9％和35.8％。
实施例5土壤修复实验
采用土浆法研究戈登氏菌A16在田间降解菊酯的情况。
一、实验方法
(1)土壤样品的采集及处理
从广东省华南农业大学农业试验场近五年无农药使用记录的土壤表层(3-10cm)采集土壤。该土壤的物理化学属性为：有机质含量10.5g/kg；硝酸根离子含量20mg/kg；有效磷和有效钾含量分别为37.5mg/kg和105mg/kg；土壤电导率和pH值分别为375μS/cm和6.9；土壤由65.0％砂土、28.0％壤土和7.0％黏土组成。将样土置于阴凉通风处，自然风干。干燥后，将土壤研磨并通过2毫米筛子。取部分土壤在121℃下灭菌120分钟，另一部分不做灭菌处理。
(2)戈登氏菌A16对泥水中菊酯的降解
使用经过灭菌和未进行灭菌处理的土壤进行实验，两种土壤下均设置对照组和实验组，对照组不接种戈登氏菌A16，实验组接种戈登氏菌A16。
进行实验时，将10g经过灭菌或未经过灭菌的土壤转移到装有50mL MSM的250mL烧瓶中，同时在培养基中添加胺菊酯、炔丙菊酯、丙烯菊酯并使终浓度为50mg·L-1。根据实验分组，对照组不接种戈登氏菌A16，实验组接种戈登氏菌A16，并且戈登氏菌A16在培养基中的初始数量约为1.0×107CFU/mL。
在30℃、200rpm的条件下培育11天，在培养的第1、3、5、7、9、11天取样，从样品中萃取出胺菊酯、炔丙菊酯、丙烯菊酯，测定各组别培养基中胺菊酯、炔丙菊酯、丙烯菊酯的浓度(测定方法同实施例4)。
其中从样品中萃取出胺菊酯、炔丙菊酯、丙烯菊酯的方法为：均匀取10mL样品添加到50mL离心管中，并添加10mL丙酮。将离心管涡旋10s，然后超声处理20min。然后，将30mL乙酸乙酯加入到离心管中并涡旋2min。将离心管保持在室温下大约30min，直到水相和有机相分层为止。随后将上层有机相通过无水硫酸钠除水后转移进250mL平底烧瓶中，舍弃原50mL离心管。最后，将装有有机相的平底烧瓶置于水泵循环式真空浓缩仪中进行浓缩。加入10mL色谱乙腈进行涡旋回收。取1mL回收液利用1mL注射器和0.22μm滤膜进一步纯化回收样品，并在进行HPLC检测之前将其保存在4℃的棕色瓶中。
二、实验结果
各组别中胺菊酯在不同时间点的浓度如图10所示。可见，在培养11天后，各组别泥水中胺菊酯的浓度都发生了下降。具体而言，接种戈登氏菌A16的实验组，胺菊酯的浓度在第1天就发生明显的下降，培养11天后，实验组的胺菊酯降解效率明显高于对照组；实验组中，在未灭菌泥水中戈登氏菌A16对50mg·L-1的胺菊酯的降解率达到82.9％，在灭菌泥水中戈登氏菌A16对50mg·L-1的胺菊酯的降解率为74.1％；无论在对照组还是实验组中，使用未灭菌土壤的组别，胺菊酯的降解效率都要高于使用灭菌土壤的组别。上述结果表明，接种戈登氏菌A16可以提高胺菊酯的降解效率，原生土壤微生物群落在胺菊酯的降解中也发挥了积极作用。
各组别胺菊酯降解过程遵循一级动力学方程，戈登氏菌A16在泥水中降解胺菊酯的动力学参数如表3所示。
表3菌株A16在泥水中降解胺菊酯的动力学参数
Figure BDA0003760280350000131
从表3中的降解常数(k)、半衰期(t1/2)等动力学参数可以看出，使用戈登氏菌A16处理被胺菊酯污染的环境，可以极大地加快胺菊酯的降解速度，降低胺菊酯降解的半衰期(t1/2)，与未接种戈登氏菌A16的泥水相比，戈登氏菌A16处理组在灭菌泥水和未灭菌泥水中t1/2分别缩短了125.8和110.8天。
此外，培养11天后，在未灭菌泥水中戈登氏菌A16对泥水中炔丙菊酯、丙烯菊酯的降解率达到81.5％、83.0％。戈登氏菌A16在泥水降解实验中没有观察到明显的滞后期。对降解过程的观察表明，戈登氏菌A16在模拟污染环境中具有较强的菊酯农药降解能力。戈登氏菌A16的降解性能稳定，具有修复被拟除虫菊酯类杀虫剂破坏的环境的潜力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.戈登氏菌(Gordonia cholesterolivorans)在降解拟除虫菊酯类杀虫剂或制备降解拟除虫菊酯类杀虫剂菌剂方面的应用。
2.戈登氏菌(Gordonia cholesterolivorans)在修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的自然环境方面的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述自然环境为水体、土壤或土壤-水混合系统。
4.一种戈登氏菌(Gordonia cholesterolivorans)A16，其特征在于，于2021年7月21日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:61814，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
5.权利要求4所述戈登氏菌A16在降解拟除虫菊酯类杀虫剂或制备降解拟除虫菊酯类杀虫剂菌剂方面的应用。
6.权利要求4所述戈登氏菌A16在修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的自然环境方面的应用。
7.根据权利要求1～3、5～6任一所述应用，其特征在于，所述拟除虫菊酯类杀虫剂为胺菊酯、丙烯菊酯、炔丙菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯、氯烯炔菊酯、联苯菊酯、氰戊菊酯、右旋苯醚氰菊酯中的一种或几种。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述自然环境为水体、土壤或土壤-水混合系统。
9.一种降解拟除虫菊酯类杀虫剂的菌剂，其特征在于，含有戈登氏菌。
10.根据权利要求9所述的菌剂，其特征在于，所述戈登氏菌为权利要求3所述的戈登氏菌A16。
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