CN108048326A - 原位生物定向分离培养植物根际促生菌的装置及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种原位生物定向分离培养植物根际促生菌的装置及方法。本发明的方法包括：提供微孔板；高温高压灭菌微孔板、固体培养基和微孔滤膜；无菌水稀释根际土样品，得稀释液；将稀释液和经过高温高压灭菌后温度降低至55‑45℃的培养基迅速混合均匀，将微孔板浸没；在无菌环境中，待培养基凝固后取出，将灭菌滤膜覆盖在微孔板微孔区域两侧，再以两块微孔板将浸没过培养基的微孔板夹在中间，固定，放到植物根附近培养；在无菌环境中，取出培养后的微孔板微孔中的固体培养基柱、切碎，涂布观察、检查验纯；对培养物以液体培养基扩繁、保菌和分类鉴定。本发明的技术可分离获得大量针对既定植物的根际促生菌。

Description

原位生物定向分离培养植物根际促生菌的装置及方法
技术领域
本发明是关于一种筛选植物根际促生菌的装置及方法，具体地说，是关于一种原位生物定向高通量分离培养植物根际促生菌的装置，以及利用该装置筛选植物根际促生菌的方法。本发明涉及农业环境和资源微生物技术领域。
背景技术
微生物在生物地球化学循环中的作用举足轻重。分离培养微生物是认识其多样性并加以利用的最基础和最主要的方式。目前，微生物分离培养的常规方法为涂布划线分离纯化、培养。但是，自然环境中大多数的微生物以此方法不能获得纯培养物。现在，科学研究中也采用了一些其它方法来获得传统涂布划线方法难以获得一些细菌，如利用流式细胞仪分选、微囊包埋等可以获得；但这些方法普遍存在需要特殊设备、成本高、不宜操作等缺点，未能被广泛使用。
植物根际促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)是指在植物根际或根面和根内存在的可以促进植物生长的细菌的总称。现在普遍利用固氮和溶磷选择性培养基、以传统涂布划线进行PGPR的分离培养。这样揭示出的PGPR多样性非常有限，比基于分子生物学方法揭示的多样性要低很多。这就意味着有非常多的PGPR需要用其它方法分离培养。而PGPR与植物存在密切的互作关系，现有分离培养方法都不能将植物根的影响纳入到分离过程，以致分离得到的PGPR种类都较少，不能针对目标植物获得相关PGPR，不能充分揭示PGPR多样性、限制了它们的实践利用。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种原位生物定向高通量分离培养植物根际促生菌的方法。
本发明的另一目的在于提供一种原位生物定向高通量分离培养植物根际促生菌的装置。
一方面，本发明提供了一种原位生物定向分离培养植物根际促生菌的方法，该方法包括步骤：
(1)提供微孔板；所述微孔板为设置微孔区的基板，微孔区设有多个贯穿基板的微孔；
(2)微孔包含单细胞：高温高压灭菌微孔板、固体培养基和微孔滤膜；无菌水稀释根际土样品，得稀释液；在无菌环境中，将稀释液和经过高温高压灭菌后温度降低至55-45℃的培养基混合均匀，将微孔板浸没；
(3)微孔板封闭和培养：在无菌环境中，待培养基凝固后取出，将灭菌滤膜覆盖在微孔板微孔区域两侧，再以两块微孔板将浸没过培养基的微孔板夹在中间，固定，得三块一体的微孔板，将该三块一体的微孔板放到植物根附近培养；
(4)微孔内微生物的涂布划线分离：在无菌环境中，取出培养后的微孔板微孔中的固体培养基柱、切碎，涂布观察、检查验纯；对培养物以液体培养基扩繁、保菌和分类鉴定。
本发明的方法，可有效解决植物根际促生菌(plant growth-promotingrhizobacteria，PGPR)分离培养时获得纯菌种类较少和缺乏针对性的问题，可促进对PGPR多样性认识，加速生态农业发展。
根据本发明的具体实施方案，本发明的方法还包括步骤：
(5)具多种促生属性分离物确定：将步骤(4)中得到的纯培养物分别涂布于固氮、溶磷和溶钾培养基中培养；观察是否能生长和/或其生长速率；在某种培养基上可以生长的判断为该菌种具有相应促生属性，生长较迅速的判断为该菌具有较强的相应促生能力的植物根际促生菌。其中，所述的“较迅速”、“较强”是筛选出的菌种之间相互比较而言。
根据本发明的具体是十分安敢，本发明的方法，在具多种促生属性分离物确定步骤中，在判断所述菌种是否具有相应促生属性之后，可进一步再分析具有固氮和溶磷能力菌种的产激素能力和/或产ACC脱氨酶能力等，确定是否具多种促生属性。
根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，步骤(1)中，所述微孔板基板厚度约为2～4mm，微孔体积15～30μL。优选地，本发明中通常控制微孔直径约为1～3mm。优选地，本发明中通常在基板中央区域设置30～400个微孔，相邻微孔之间的间距可为0.5～3mm。
根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，步骤(2)中，培养基为1/2R2A。
根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，步骤(2)中，滤膜为水系滤膜。滤膜孔径不大于0.22μm，优选为0.1μm～0.22μm。本发明中对水系滤膜的更具体材质无特殊要求，采用所属领域中的已知水系滤膜即可，通常为混合纤维素酯膜。
根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，步骤(2)中，按照0.5g根际土样品：4.5mL无菌水的比例将根际土样品与水混合，再梯度稀释至108倍，得稀释液。
根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，步骤(2)中，按照所述稀释液与培养基的体积比为1～5:100的比例，将稀释液和经过高温高压灭菌后温度降低的培养基(未凝固)迅速混合均匀，将微孔板浸没。
根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，步骤(3)中，所述植物为与取根际土相同的植物(即，同种植物)。将所述三块一体的微孔板放到植物根附近培养，“附近”是指距离植物根尽可能近，距离植物根的距离通常不大于0.5m，最好微孔板表面与植物根有直接接触。本发明中，将所述三块一体的微孔板放到植物根附近培养，培养时间不低于30天。
根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，步骤(4)中，所述验纯是观察细胞形态是否一致、涂布培养后菌落形态是否相同、分类鉴定测序16S rRNA基因产物时是否有杂峰，都为否的为纯培养物。验纯的具体手段可采用所属领域的常规手段，如以高倍显微镜观察细胞形态和菌落形态等。对于有杂菌的培养物，可抛弃或尝试划线纯化。
根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，步骤(5)中，所述多种促生属性包括同时具有固氮属性、溶磷属性(同时具有溶有机磷和无机磷能力)，并且具有产至少一种植物生长相关激素能力。
根际本发明的具体实施方案，本发明的方法中，所述固氮培养基不含氮。
根际本发明的具体实施方案，本发明的方法中，所述溶磷培养基不含溶解性磷但含难溶性磷；所述溶钾培养基不含溶解性钾但含难溶性钾。
另一方面，本发明还提供了一种原位生物定向分离培养植物根际促生菌的装置，该装置包括：
中间微孔板；所述中间微孔板为设置微孔区的基板，微孔区设有多个贯穿基板的微孔；优选地，所述微孔板基板厚度约为2～4mm，微孔体积15～30μL；优选地，本发明中通常控制微孔直径约为1～3mm；
微孔滤膜；所述微孔滤膜用于覆盖微孔板微孔区域两侧；优选地，滤膜为水系滤膜，滤膜孔径不大于0.22μm，优选为0.1μm～0.22μm；
将中间微孔板及微孔滤膜固定的两侧夹板。
根据本发明的具体实施方案，本发明的装置还包括：将中间微孔板、微孔滤膜及两侧夹板予以固定的固定装置。
本发明将植物土梯度稀释、使得微孔中至多只有一个细胞，置放在同种植物根际土、利用微生物-植物互作起到原位定向筛选针对目标植物的微生物；微孔体积小、孔数多，为高通量筛选；对筛选到的微生物进行促生属性分析确定具多种促生属性菌种。本发明的技术充分利用微生物-植物之间存在的紧密互作关系，可分离获得大量针对既定植物的根据促生菌，为微生物肥料开发提供高效的植物根际促生菌种，对于认识植物根际促生菌多样性、促进绿色高效植物生产产业的发展和生态环境保护具有重要理论意义和实践价值。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、微孔板成本低廉、取材易、制作易。
2、高通量分离培养，可获得比传统方法更多种类、植物促生功能更强的菌种。
3、利用了微生物-植物互作，易获得目标植物有专一性促生作用的菌种。
附图说明
图1为微孔板结构示意图。
图2为微孔板与覆膜及组装结构示意图。
图3A、图3B显示筛选到的菌株KMB05、KMB04的固氮能力的实验结果。
图4A、图4B显示筛选到的菌株KMB05、KMB04的解无机磷和解有机磷能力的实验结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的特点和应用中所具有的技术效果，但本发明并不因此而受到任何限制。实施例中未详细注明的操作方法，可按照所属领域中的现有操作进行。
实施例中所用到的各培养基配方，配方中的各材料均可商购获得：
1、1/2R2A全营养培养基：可溶性淀粉1.25g，葡萄糖1.25g，细菌学蛋白胨1.25g，酸水解酪素1.25g，酵母提取物1.25g，K2HPO3·3H2O 0.75g，丙酮酸钠0.75g，MgSO4·7H2O0.125g,琼脂10g，蒸馏水1000mL。
2、固氮培养基：KH2PO4 0.2g，CaCO3 5g，MgSO4·7H2O 0.2g，葡萄糖10g，NaCl 1.2g，CaSO4·2H2O 0.1g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然。
3、无机磷培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O0.3g，Ca3(PO4)2 25g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.03g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然。
4、有机磷培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O0.3g，植酸钙25g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.03g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然。
5、ADF盐培养基:KH2PO4 4.0g，Na2HPO4 6.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，葡萄糖2.0g，葡萄糖酸2.0g，柠檬酸2.0g，(NH4)2SO4 2.0g，去离子水1000mL，pH7.2，加入抽滤除菌的ACC(终浓度为3.0mmol/L)，用于ACC脱氨酶菌株筛选培养。
实施例1：微孔板的制备
以激光雕刻机在如图1所示不锈钢基板(80mm*80mm*3mm)上雕刻微孔(微孔直径为3mm左右)，紧固螺丝孔直径为5mm左右。
实施例2：微孔包含单细胞
取出苗期番茄根际土0.5g，于灭菌20min后的超净台中加入盛有100mL无菌水的三角瓶中、震荡30min；之后取1mL(100倍)加入盛有9mL无菌水的离心管中、混匀稀释，再从此10ml液体中取1mL(10-1倍)加入到另外一个盛有9mL无菌水的离心管中、混匀；以此类推，稀释至10-8倍、记为A液。
高温高压灭菌1/2R2A固体培养基100mL、微孔板3块、不锈钢螺丝4枚、0.1μm微孔水系滤膜2张；待培养基温度降低至40℃以下且未凝固时，在灭菌超净台中，加入2ml的A液至培养基、迅速混匀；培养基未凝固前，迅速将1块微孔板放入、浸没；培养基凝固后取出微孔板，在微孔板两侧以各1张滤膜覆盖微孔区；之后，再以两侧各1块未浸没培养基的微孔板夹住、以螺丝紧固(位置对应，参见图2)，得到原位生物定向分离培养植物根际促生菌的装置；最后，将整套装置放到番茄根际土中。
实施例3：水培根际植物和微孔板培养
在普通土壤中育苗并培养番茄等根际植物，待番茄苗高度生长到20～30cm时取出，移苗至薄泡沫孔中后一并放入培养池中，根系自然垂下；培养池高度约40cm，底部装有10cm厚的土壤，加自来水约至池上沿，以家庭养鱼用小通气泵通气。在培养池底部放入实施例2的整套原位生物定向分离培养植物根际促生菌的装置，微孔区接触植物根，常温下培养，培养时间不小于30天。
培养第30天，在无菌环境中，取出培养后的微孔板微孔中的固体培养基柱、切碎，涂布观察、检查验纯，对于有杂菌的抛弃或尝试划线纯化；对培养物以液体培养基扩繁、保菌和分类鉴定。
实施例4：对获得的培养物进行鉴定
刮取平板上菌体，以碱裂解法提取其DNA，并选用16S rRNA基因通用引物27F和1492R：
27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，见SEQ ID NO：1；
1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，见SEQ ID NO：2；
对其16S rDNA进行PCR扩增，PCR产物经上海生物工程有限公司测序，测序结果分别经Blast和EzTaxon进行序列比对和分类地位分析，同源性为99％-100％。分离得到的番茄根际菌记录于表1。得到的菌株种类较传统培养方法多，传统培养方法得到的菌株类别见表2。本发明进一步对其他植物根际菌进行分离培养，得到结果见表3。
表1
表2
菌株编号 最近源模式种
T2D2 Arthrobacter pityocampae
Bhlm1 Massilia plicata
BLcDT4 Sphingomonas aquatilis
T2M3 Sphingomonas kaistensis
N111 Paenibacillus mucilaginosus
P302 Paenibacillus thailandensis
N321 Pseudomonas geniculata
hll2 Arthrobacter flavus
T2D50 Arthrobacter pityocampae
表3
菌株编号 最近源模式种
mp-35 Microbacterium azadirachtae
mp35-1 Microbacterium azadirachtae
mp-35-2 Microbacterium azadirachtae
mp-45 Streptomyces caelestis
mp01 Arthrobacter pascens
mp-1 Brachybacterium phenoliresistens
mp2 Lechevalieria xinjiangensis
mp-45 Ochrobactrum anthropi
mp66 Streptomyces anulatus
mp082 Streptomyces caelestis
mp82 Streptomyces asterosporus
mp122 Bacillus endophyticus
mp-145 Pseudomonas aeruginosa
mp15 Promicromonospora iranensis
实施例5：多种促生属性分析
分别配制固氮、解磷(无机磷、有机磷两种)和ADF固体(琼脂浓度1.2％)培养基(ADF固体(琼脂浓度1.2％)培养基是前面ADF盐培养基的基础上加1.2％琼脂)用于固氮、解磷和产ACC脱氨酶促生属性的检测。在灭菌超净台中，将获得纯培养物菌液各100μL涂布于三种固体培养基，每种培养基重复涂布3个平板；涂布均匀后，以封口膜封住底和盖之间的缝隙，放入温度为30℃的生化培养箱中培养1周，分别观察是否生长。如果在某种培养基上生长，说明具有该种属性；生长较快的(1～2天形成1～2mm的较大菌落)、其该种促生能力较强。在3种以上培养基上可生长的，为具多种促生属性。实验结果表明，在促生属性方面，菌株KMB05、KMB04具有较强的固氮能力(图3A、图3B)；同时，这两株菌的解无机磷和解有机磷能力也相对较强(图4A、图4B)。

Claims (10)

1.一种原位生物定向分离培养植物根际促生菌的方法，该方法包括步骤：
(1)制备微孔板；所述微孔板为设置微孔区的基板，微孔区设有多个贯穿基板的微孔；
(2)微孔包含单细胞：高温高压灭菌微孔板、固体培养基和微孔滤膜；无菌水稀释根际土样品，得稀释液；在无菌环境中，将稀释液和经过高温高压灭菌后温度降低至55-45℃的培养基混合均匀，将微孔板浸没入；
(3)微孔板封闭和培养：在无菌环境中，待培养基凝固后取出，将灭菌滤膜覆盖在微孔板微孔区域两侧，再以两块微孔板将浸没过培养基的微孔板夹在中间，固定，得三块一体的微孔板，将该三块一体的微孔板放到植物根附近培养；
(4)微孔内微生物的涂布划线分离：在无菌环境中，取出培养后的微孔板微孔中的固体培养基柱、切碎，涂布观察、检查验纯；对培养物以液体培养基扩繁、保菌和分类鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括步骤：
(5)具多种促生属性分离物确定：将步骤(4)中得到的纯培养物分别涂布于固氮、溶磷和溶钾培养基中培养；观察是否能生长和/或其生长速率；在某种培养基上可以生长的判断为该菌种具有相应促生属性，生长较迅速的判断为该菌具有较强的相应促生能力的植物根际促生菌；
优选地，进一步分析具有固氮和溶磷能力菌种的产激素能力和/或产ACC脱氨酶能力，确定是否具多种促生属性。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(1)中，所述微孔板基板厚度为2～4mm，微孔体积15～30μL；优选地，微孔直径为1～3mm。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(2)中，培养基为1/2R2A；优选地，所述滤膜为水系滤膜，滤膜孔径不大于0.22μm。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(2)中，按照0.5g根际土样品：4.5mL无菌水混合，再梯度稀释至10-8倍，得稀释液。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(3)中，所述植物为与取根际土相同的植物，培养时间不低于30天。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(4)中，所述验纯是观察细胞形态是否一致、涂布培养后菌落形态是否相同、分类鉴定测序16S rRNA基因产物时是否有杂峰，都为否的为纯培养物。
8.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤(5)中，所述多种促生属性包括同时具有固氮属性、溶有机磷和无机磷属性，并且具有产至少一种植物生长相关激素能力；
其中，优选地，所述固氮培养基不含氮；所述溶磷培养基不含溶解性磷但含难溶性磷，所述溶钾培养基不含溶解性钾但含难溶性钾。
9.一种原位生物定向分离培养植物根际促生菌的装置，该装置包括：
中间微孔板；所述中间微孔板为设置微孔区的基板，微孔区设有多个贯穿基板的微孔；优选地，所述微孔板基板厚度为2～4mm，微孔体积15～30μL；更优选地，微孔直径为1～3mm；
微孔滤膜；所述微孔滤膜用于覆盖微孔板微孔区域两侧；优选地，滤膜为水系滤膜，滤膜孔径不大于0.22μm；
将中间微孔板及微孔滤膜固定的两侧夹板。
10.根据权利要求9所述的装置，该装置还包括：
将中间微孔板、微孔滤膜及两侧夹板予以固定的固定装置。
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