CN110484439B - 一种筛选生防菌的装置及筛选生防菌的方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种模拟生态的生防菌的筛选装置及筛选方法，将微孔滤膜夹心上下玻片小培养初步筛选生防菌；采用海绵固定靶标真菌，将树段固定在土壤中，将透析袋固定于海绵中间的孔中，透析袋中培养的待筛菌的代谢产物扩散出来，显著地抑制海绵与树段上的靶标真菌，取阳性结果的透析袋样本，镜检、分离，常规对峙实验证实。分离的生防菌制造生物农药，生产出的农产品质优，保证了植物、人畜、土壤、环境的绿色、可持续发展。

Description

一种筛选生防菌的装置及筛选生防菌的方法
技术领域
本发明涉及微生物筛选和生物农药的领域，尤其涉及一种模拟生态的生防菌的筛选方法装置及筛选方法。
背景技术
土壤微生物在土壤生物中占据主导地位。土壤中存在着数目庞大、结构复杂的微生物群落。土壤微生物在与植物共进化过程中形成共生关系，在促进植物生长、防控植物疾病、减少土壤与农作物有机无机污染、调节酸碱度等方面发挥重要作用。
生物农药生产的农产品质优，保证了植物、人畜、土壤、环境的绿色、可持续发展。
生防菌的获得有很多方法，常用方法为：含微生物样本的采集、微生物菌株分离、培养及对不同病、虫、草靶标生物活性测定，有效菌株及其代谢活性物质的精制鉴别。
微孔滤膜
生防菌的筛选涉及到生态学、过程工程、系统工程涉及的诸多因素，因而生物农用品研发过程的实验室与田间筛选不一致的问题较为严重。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题，提供一种模拟生态的生防菌的筛选装置及筛选方法，采用反向筛选模型的方法筛选生防菌，并采用海绵固定靶标真菌，将树段固定在土壤中，将透析袋固定于海绵中间的孔中，透析袋中培养的待筛菌的代谢产物扩散出来，显著地抑制海绵与树段上的靶标真菌，取阳性结果的透析袋样本，镜检、分离，常规对峙实验证实。
本发明的目的在于提供一种生防菌筛选装置，本发明的另一目的是为提供一种生防菌的筛选方法。
本发明提供的装置包括组织培养瓶、位于瓶底的土壤、浮于上部的带孔海绵、固定于土壤与海绵间的树段，固定于海绵孔的透析袋。
优选的，所述装置的工作温度为20-40℃；
优选的，所述装培养液的pH为5.0-7.0；
优选的，所述培养液由微生物(马铃薯培养基PDB)与植物培养基MS组成；
本发明中筛出的微生物，有放线菌、真菌，具有较好的拮抗靶标真菌的效果。
使用上述生防菌筛选装置与筛选方法筛出生防菌，生防菌在透析袋中液态培养代谢产物生成种类多，生防菌与靶标菌以透析袋(孔径14000道尔顿)隔开，既不互相污染，又保留了生态关系，不仅省时省力，而且模拟了田间的生态环境，减少了实验室与大田的不一致性，提高了成功率。
带孔海绵对病原真菌、树段及透析袋均起到固定作用，真菌有固着生长的特性。
区别于权利要求4的固态培养的筛选装置，权利要求1的筛选装置采用液态培养，生长周期缩短，加快实验进度。
权利要求9微孔滤膜夹心上下玻片小培养，上下玻片的培养基面贴合微孔滤膜，培养基根据微生物的种类可以分别是培养真菌的PDA或察氏、细菌的NA、放线菌的高氏培养基，三者中的一种。微孔滤膜孔径0.45微米，可以阻隔病原真菌进入待分类的拮抗菌中，但抑菌物质仍可到达，避免了拮抗菌被病原真菌污染，简化实验步骤，加快进度。
附图说明
图1、本发明权利要求1生防菌组织培养瓶筛选装置示意图；
附图1标识：组织培养瓶；1.封口夹 2.带孔海绵 3.透析袋 4.树段 5.液体培养基6.MS固体培养基 7.土壤
图2、本发明权利要求4锥形瓶中构建的苹果腐烂病生长模型
图3、组织培养瓶中构建黄曲霉菌生长模型
图4、微孔滤膜初筛拮抗黄曲霉菌模型
图5、组织培养瓶中透析袋样本1600倍油镜镜检图
图6、组织培养瓶生态筛选苹果腐烂病菌的拮抗菌图
图7、本发明筛出的真菌与苹果腐烂病菌对峙实验
图8、本发明筛出的放线菌平板菌落图
具体实施方式
实施例1
生测模型建立。
在锥形瓶中构建模拟原生态的树段、土壤、微生物筛选模型。土壤(土壤:MS＝1:1)、以总体积土壤浸出液10％-20％配置MS,灭菌，接种苹果腐烂病菌(河北农大植物保护学院王树桐赠送)于表面消毒树段上，树段为3年生以上的苹果树或海棠树段，树段表面以0.1％-0.2％升汞、75％乙醇依次消毒；无菌水清洗三处，打孔器在树段表面打孔，接种病原菌菌饼于树段打孔处，28℃培养，至树段表面长出黑点，灯芯草切片，镜检见到分生孢子器与子囊，与苹果腐皮壳菌的显微镜检图一致。结果见图2
实施例2
生测模型建立。采用已知拮抗菌与已知病原菌进行实验。在组织培养瓶中构建模拟原生态的树段、土壤、微生物筛选模型。土壤、带孔海绵、混合培养基置于组织培养瓶中灭菌，接种黄曲霉菌于海绵及表面消毒树段，采用海绵固定化的方法接种黄曲霉菌，将树段插于灭菌土壤中，组织培养瓶中培养基分别由三倍浓度等量的NB、PDB、MS组成；观察树段的病变面积与厚度等形状。结果见图3
实施例3
微孔滤膜初筛模型建立。
孔径0.45微米的微孔滤膜夹心上下两层载玻片小培养。下层玻片加入NA培养基、接种CGMCC No.5155，上层玻片加入PDA培养基、接种黄曲霉菌，将上下玻片的培养基面与滤膜贴合，置于甘油保湿的无菌培养皿中培养，观察黄曲霉菌生长的长势，在出现空斑、或菌丝透明处挑取对应位置的下层玻片培养的菌，保藏初步筛选的生防菌；结果见图4。
实施例4
已知拮抗菌的验证筛选模型。
在组织培养瓶中构建模拟原生态的树段、土壤、微生物筛选模型。土壤、带孔海绵、混合培养基置于组织培养瓶中灭菌，接种病原真菌于海绵及常规表面消毒树段，采用海绵固定化的方法接种苹果腐烂病菌，透析袋中加入微孔滤膜筛出的拮抗菌与培养基，将树段插于灭菌土壤中，组织培养瓶中培养基分别由三倍浓度等量的NB、PDB、MS混合组成；观察树段的病变面积与厚度等形状、树段上病原真菌与对照比显弱势，图6为组织培养瓶筛选模型图；
实施例5
孔径0.45微米的微孔滤膜夹心上下两层载玻片小培养。下层玻片加入PDA培养基、接种待分离拮抗真菌的目标样本，上层玻片加入PDA培养基、接种苹果腐烂病菌，将上下玻片的培养基面与滤膜贴合，置于无菌培养皿中保湿培养，观察苹果腐烂病菌生长的长势，在出现空斑、或菌丝透明处挑取对应位置的下层玻片培养的菌，保藏初步筛选的生防菌；在组织培养瓶中构建模拟原生态的树段、土壤、微生物筛选模型。土壤、带孔海绵、混合培养基置于组织培养瓶中灭菌，接种病原真菌于海绵及表面消毒树段，采用海绵固定化的方法接种苹果腐烂病菌，透析袋中加入微孔滤膜筛出的拮抗菌与培养基，将树段插于灭菌土壤中，组织培养瓶中培养基分别由两倍浓度等量的PDB、MS组成；观察树段的病变面积与厚度等形状、树段上病原真菌与对照比显弱势时，从透析袋中取样分离，得到抑制苹果腐烂病菌的XZL20190628真菌，对峙实验证实抑菌效果，如图7。
实施例6
平山土壤样本拮抗苹果腐烂病菌实验。
孔径0.45微米的微孔滤膜夹心上下两层载玻片小培养。下层玻片加入PDA培养基、接种待分离拮抗真菌的目标样本，上层玻片加入PDA培养基、接种黄曲霉，将上下玻片的培养基面与滤膜贴合，置于无菌培养皿中培养，观察病原真菌生长的长势，在出现空斑、或菌丝透明处挑取对应位置的下层玻片培养的菌，保藏初步筛选的生防菌；在组织培养瓶中构建模拟原生态的树段、土壤、微生物筛选模型。土壤、带孔海绵、混合培养基置于组织培养瓶中灭菌，接种病原真菌于海绵及表面消毒树段，采用海绵固定化的方法接种苹果腐烂病菌，透析袋中加入微孔滤膜筛出的拮抗菌与培养基，将树段插于灭菌土壤中，组织培养瓶中培养基分别由两倍浓度等量的PDB、MS组成；观察树段的病变面积与厚度等形状、树段上病原真菌与对照比显弱势时，从透析袋中取样镜检，如图5，未见真菌菌丝，分离，以对峙实验验证得到抑制苹果腐烂病菌的XZL20190528放线菌，高氏培养基上菌落如图8。

Claims (2)

1.一种进行生防菌筛选的方法，其特征在于，所述方法采用反向筛选模型的方法筛选生防菌，并采用海绵固定靶标真菌，将树段固定在土壤中，将透析袋固定于海绵中间的孔中，透析袋中培养的待筛菌的代谢产物扩散出来，显著地抑制海绵与树段上的靶标真菌；所述方法按如下步骤操作：
利用一个筛选生防菌的装置，所述装置是组织培养瓶，瓶内上部为带孔海绵，中部为卡在带孔海绵孔里的透析袋，下部为培养基固定的灭菌的土壤，树段固定于土壤、倚靠于海绵上，待筛样本接种于预置有培养基的透析袋中；并采用如下处理步骤：
1)将靶标菌接种于海绵及树段；
2)将待筛样本接种于预置有培养基的透析袋中；
在组织培养瓶中构建模拟原生态的树段、土壤、微生物筛选模型；土壤、带孔海绵、混合培养基置于组织培养瓶中灭菌，接种病原真菌于海绵及常规表面消毒树段，所述树段为3年生以上的苹果树或海棠树段，树段表面以0 .1％-0 .2％升汞、75％乙醇依次消毒；无菌水清洗三次，打孔器在树段表面打孔，接种病原菌菌饼于树段打孔处；采用海绵固定化的方法接种苹果腐烂病菌，透析袋中加入微孔滤膜筛出的拮抗菌与培养基，所述微孔滤膜为微孔滤膜夹心上下玻片小培养；将树段插于灭菌土壤中，所述组织培养瓶中培养基分别由三倍浓度等量的营养肉汤NB、马铃薯培养基PDB和植物培养基MS混合组成；观察树段的病变面积与厚度，树段上病原真菌与对照组比较；
所述装置是锥形瓶；所述植物与微生物培养液的培养基为加入10-20％土浸液的植物培养基MS与马铃薯培养基PDB；
所述透析袋中待筛生防菌的培养基为加入10-20％土浸液的肉汤培养基NB、高氏培养基、马铃薯培养基PDB中的一种；
靶标菌是苹果腐烂病菌、黄曲霉菌；
所述透析袋中接入的微生物是CGMCC5155或苹果腐烂病拮抗菌。
2.根据权利要求1所述进行生防菌筛选的方法，其特征在于，在组织培养瓶中构建模拟原生态的树段、土壤、微生物筛选模型之前，选择孔径0 .45微米的微孔滤膜夹心上下两层载玻片小培养，其中，下层玻片加入马铃薯培养基PDA，接种待分离拮抗真菌的目标样本，上层玻片加入马铃薯培养基PDA，接种黄曲霉，将上下玻片的培养基面与滤膜贴合，置于无菌培养皿中培养，观察病原真菌生长的长势，在出现空斑或菌丝透明处挑取对应位置的下层玻片培养的菌，保藏初步筛选的生防菌；然后，在组织培养瓶中构建模拟原生态的树段、土壤、微生物筛选模型。
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Study of the three-way interaction between Trichoderma atroviride, plant and fungal pathogens by using a proteomic approach;Roberta Marra等;《Current Genetics》;20060829;第307-321页、具体参见Abstract、第308-310页、Fig.1 *

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