CN102796678A - 一种生物复合钾肥及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生物复合钾肥及其制备方法，以耐12.5％钾、具几丁质酶活的抑制病原真菌CGMCC No.5155发酵得到生物钾肥，将上述生物钾肥8-15份、磷酸氢二钾1-5份与腐植酸钾肥10-15份混合，制成生物复合钾肥。本发明具有制备方法简单，产品复合性强、互补性强，具有均衡提供营养、培肥地力、增强作物的抗逆性、减少作物病害，提高农产品品质和降低农产品中的有害物质等作用。

Description

一种生物复合钾肥及其制备方法

技术领域

本发明属于肥料领域，涉及一种生物复合钾肥及其制备方法。

背景技术

肥料生产和技术开发不仅是农业生产的核心问题，也关系着环境、生态以及人类社会的生存与发展。中国是世界钾肥消费大国之一，钾肥消费量占到世界钾肥消费的20％左右。国内钾肥消费量逐年上升，年均消费递增率达到12％。中国钾肥仅能满足国内钾肥需求的30％左右，每年大概有500万～600万吨的钾肥需要进口。随着国内平衡施肥技术推广和种植结构调整，进口量将进一步增长。同时我国土地缺钾现象正从南方向北方扩展，缺钾面积逐年增大，已达0.23亿hm²，缺钾已成为许多地区农作物优质增产的主要制约因素。单纯发展硅酸盐菌剂，靠硅酸盐细菌分解土壤粘土钾是不可取的。

用钾细菌复合钾矿粉、菌渣研制的新型生物复合钾肥，集速效、迟效和长效肥料于一体，集有机肥、无机肥和生物肥于一身，既能缓解钾肥短缺的矛盾，又能解决化学钾肥对环境的污染和破坏，还可避免钾细菌菌剂(生物钾肥)迟效、仅适用于富钾土壤与稳定性差的缺点，使农业生产赖以发展的土地和水资源得以永续利用。但是该肥增加养分的效果不是太高，很难满足高产作物一生的总需肥量。

我国的泥炭、褐煤和风化煤资源丰富，利用泥炭、褐煤、风化煤生产腐植酸类有机无机肥生产工艺也比较成熟，肥效较好而且稳定。目前国内生产的腐植酸类有机无机复混肥，一般有机质在50％，腐植酸20％，(N+P₂O₅+K₂O)4％-20％。此外，腐植酸中的有效成分对农作物，尤其是对设施栽培的果树、蔬菜增产提质作用以及提高抗逆性的作用突出，它能调节作物内源激素的分泌和运送，提高酶的生理活性，强烈刺激根系、茎叶、花和果实的生长，增产幅度一般在10％～20％，而且可以提高农产品的生理品质及外观品质。

在现代肥料生产中，针对化肥、传统有机肥和生物肥的优缺点，把它们进行有机结合开发出新型三元复合肥，具有广阔的市场前景。有机无机生物复合肥以功能性生物活性菌为主体，以菌糠等肥料型有机质为载体，配合无机元素，集微生物独特的生理调节功能、无机化肥的高效性和有机肥的长效性于一体，从而达到种养结合和农业可持续发展的效果。有机无机生物复合肥既是生物肥、有机肥和无机肥的“三肥合一”；同时也是高效、长效、增效为一身的“三效合一”。它与普通复混肥相比，具有减少化肥用量、提高化肥利用率、改善农产品品质、降低生产成本、保护生态环境和作为绿色食品生产资料等优点；具有均衡提供营养、培肥地力、增强作物的抗逆性、提高农产品品质和降低农产品中的有害物质等作用。

但是，三元复合肥中有效活性菌很难存活。其中化肥的加入量受到明显的限制，从而不能充分满足作物生长。因此针对这一现状进行突变菌株的筛选、提高复合肥中化肥的加入量，并进行相关产品研究和开发，拓展复合肥的应用范围，对我国农业的可持续发展将具有举足轻重的作用。

另外，我国低品位含钾矿物，即钾矿石的储量巨大，如果能够采用高效解钾的硅酸盐菌分解钾矿石，促使其释放活性钾素，制成硅酸盐菌肥，不仅可以合理利用我国非常丰富的非溶性钾资源，解决我国钾肥资源不足的问题，而且带动了以钾长石为主的矿石采掘运输业，形成新的产业链。

困扰农业生产的另一核心问题是病虫害。化学农药的危害人所共知。几丁寡糖能刺激作物提高对病原微生物的抗性，同时又促进益生菌的定植和增殖；能抑制病菌产生的毒性、启动自身免疫系统，甲壳素酶与壳聚糖酶可抗植物病原真菌感染，去病除害，减少杀菌农药的使用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种环状芽孢杆菌(Bacillus Circulans)，利用该菌株制备生物复合钾肥的方法，制备的生物复合钾肥，以及所述的环状芽孢杆菌(Bacillus Circulans)在制备生物复合钾肥中的用途，具体涉及：

1、一种环状芽孢杆菌(Bacillus Circulans)，保藏编号为CGMCC No.5155。所述的环状芽孢杆菌(Bacillus Circulans)于2011年8月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.5155。

2、一种生物复合钾肥的制备方法，按重量计，包括以下步骤：

1)将钾矿石1-5份、农副加工废料5-15份和发酵辅料0.5-5份与水10-25份混合，得到发酵底料；

2)将权利要求1所述的环状芽孢杆菌CGMCC No.5155接种后，得液态种子或固态种子；其中，液态种子液的活菌数不小于2亿/mL，固态种子的活菌数不小于5亿/g。

3)加入占上述发酵底料重量百分比1-2％的上述环状芽孢杆菌CGMCC No.5155的液态种子或固态种子，经固态发酵得生物钾肥；

4)将上述生物钾肥8-15份、磷酸氢二钾1-5份与腐植酸钾肥10-15份混合，制成生物复合钾肥。

3、根据项2的制备方法，其中步骤1)的钾矿石、农副加工废料、发酵辅料与水的重量比为2.5∶10.5∶1∶17。

4、根据项2或3的制备方法，其中步骤1)的钾矿石选自钾长石、蒙脱石或海绿石之一或其混合物，农副加工废料包括食用菌菌渣以及虾壳、麸皮、玉米皮渣或酒糟中的至少一种，发酵辅料为面粉、玉米粉或豆饼粉之一以及硫酸铵和MgSO₄。

5、根据项2或3的制备方法，其中步骤3)固态发酵的发酵周期为5-7天。

6、根据项2或3的制备方法，其中的生物复合钾肥由生物钾肥11重量份，磷酸氢二钾2重量份和腐植酸钾肥12重量份混合而成。

7、一种生物复合钾肥的制备方法，包括以下步骤：

1)将项1的环状芽孢杆菌CGMCC No.5155接种后，得种子液；

2)种子液接种，液态发酵，得生物钾肥；

3)将生物钾肥11重量份、磷酸氢二钾2重量份与腐植酸钾肥12重量份混合，制成生物复合钾肥。

8、根据项6的制备方法，其中步骤2)的液态发酵周期为2-3天。

9、根据项2～8任一所述的方法制备的生物复合钾肥。

10、项1的环状芽孢杆菌CGMCC No.5155在制备生物复合钾肥中的用途。

环状芽孢杆菌CGMCC No.5155具有解钾、耐钾、产几丁质酶/壳聚糖酶能力强等优点，其制备方法为：将从石家庄栾城玉米根际分离得到的环状芽孢杆菌(钾细菌)(Bacillus Circulans Xue-97316)以紫外线诱变，获得单菌落300个，经菌落挖块法高通量筛选获得解钾率高达40％、芽孢形成率75％的5株菌，再次以紫外线诱变，以8％NaCl筛选，获得耐钾率高达8％的3株菌。再将3株菌分别进行→2.27％ K₂O摇瓶摇育→2.27％ K₂O摇瓶摇育→4.54％-5％ K₂O摇瓶摇育→7.5％ K₂O摇瓶摇育→10％ K₂O摇瓶摇育→12.5％ K₂O摇瓶摇育→15％ K₂O摇瓶摇育→含12.5％-15％ K₂O平板分离单菌落→留种、耐钾菌种连续传代30次。将耐钾12.5％环状芽孢杆菌接种于以胶状几丁质为唯一碳源的摇瓶，培养后离心测发酵液几丁质酶的活性大小，筛选出具有几丁质酶活的菌株CGMCC No.5155。

本发明实现了生物肥、有机肥、无机肥等多元肥料的良好结合，解决了“四肥合一”存在的技术难题。本发明制备的生物复合钾肥符合复合微生物肥NY798-2004标准，并在大田试验中取得了优异的技术效果。

具体实施方式

腐植酸钾肥购自石家庄宇镈肥业有限公司，其它物料均为市购。

实施例1固态发酵制备生物复合钾肥(一)

1)发酵底料的制备

将1重量份的钾长石，5重量份的农副加工废料(食用菌菌渣、虾壳、麸皮、酒糟按照4∶1∶1∶1的比例混合)，0.5重量份的面粉、硫酸铵和MgSO4的混合物(面粉、硫酸铵和MgSO4的重量比为100∶10∶1)，与10重量份的水分别采用旋转式蒸锅在100℃下灭菌30分钟后，混合均匀，得发酵底料。

2)种子制备

将环状芽孢杆菌CGMCC No.5155接种于下列种子培养基中，得液态种子，其活菌数不小于2亿/mL。种子培养基如下：

3)生物钾肥的制备

加入占上述发酵底料重量百分比1％的上述环状芽孢杆菌CGMCC No.5155的液态种子，经固态发酵5天后，得生物钾肥。发酵条件如下：

接种及发酵：曲池：长方形水泥池，宽2m，深1m，料层厚30-50cm，保证通风均匀，曲池底高于地面，有8～10度倾斜，池底上方有层假底筛板，料放在筛板上，曲池低端和风机相连，中间设有闸门，调节风量。通风采用部分循环，保证室内二氧化碳含量在2～5％，通风量400～1000m³/m².h，根据繁殖阶段等条件确定，空气通风道风速10～15m/s。变温控制：前期35-37℃，中期32-34℃，后期35-37℃。

固态发酵pH靠配方自动控制：菌生长过程解钾，水分减少诱导芽胞生成。变温式控制，前期35℃，中期30℃、后期35℃，翻料1-3次。湿度控制，前中期调节为：RH50-60％，后期不调节，自然形成芽孢，其芽孢形成率为90％。

将上述生物钾肥8-15份、磷酸氢二钾1-5份与腐植酸钾肥10-15份混合，制成生物复合钾肥。

4)生物复合钾肥的制备

将步骤3)制得的生物钾肥8份、磷酸氢二钾1.5份、腐植酸钾肥10份混合，55℃烘干，即得本发明的生物复合钾肥，其质量指标如下：

实施例2固态发酵制备生物复合钾肥(二)

1)发酵底料的制备

将5重量份的蒙脱石，15重量份的农副加工废料(按照食用菌菌渣、虾壳、玉米皮渣4∶1∶2的比例混合)，5重量份的玉米粉、硫酸铵和MgSO4的混合物(面粉、硫酸铵和MgSO4的重量比为100∶8∶0.8)，25重量份的水分别采用旋转式蒸锅在120℃下灭菌30分钟后，装入耐高压灭菌的聚丙烯塑料袋，(例如，每袋装干物料250g)，即制得发酵底料。

2)种子制备

将环状芽孢杆菌CGMCC No.5155接种于种子培养基中，得固态种子，其活菌数不小于5亿/g。种子培养基的配方为：食用菌菌渣∶面粉∶硫酸铵∶MgSO4＝100∶30∶3∶0.3。

3)生物钾肥的制备

加入占上述发酵底料重量百分比2％的上述环状芽孢杆菌CGMCC No.5155的液态种子，经固态发酵7天后，即制成生物钾肥，其芽孢形成率为90％。发酵条件同实施例1。

4)生物复合钾肥的制备

将步骤3)制得的生物钾肥15份、氯化钾5份、腐植酸钾肥15份混合，55℃烘干，即得本发明的生物复合钾肥，其质量指标如下：

实施例3固态发酵制备生物复合钾肥(三)

1)发酵底料的制备

将2重量份的海绿石，11重量份的农副加工废料(按照食用菌菌渣、虾壳、麸皮4∶1∶2的比例混合)，1重量份的豆饼粉、硫酸铵与MgSO₄的混合物(面粉、硫酸铵和MgSO4的重量比为100∶9∶0.9)，与17重量份的水分别采用旋转式蒸锅在120℃下灭菌30分钟后，混合均匀，即制得发酵底料。

2)种子制备

将环状芽孢杆菌CGMCC No.5155接种于种子培养基(同实施例1)中，得液态种子，其活菌数不小于2亿/mL。

3)生物钾肥的制备

加入占上述发酵底料重量百分比1.5％的上述环状芽孢杆菌CGMCC No.5155的液态种子，经固态发酵6天后，即制成生物钾肥，其芽孢形成率为88％。发酵条件同实施例1。

4)生物复合钾肥的制备

将步骤2)制得的生物钾肥11份、磷酸氢二钾2份、腐植酸钾肥12份混合，55℃烘干，即得本发明的生物复合钾肥，其质量指标如下：

实施例4液态发酵制备生物复合钾肥

1、种子液的制备

将环状芽孢杆菌CGMCC No.5155接种于如下配方的种子培养基中，培养10h，得种子液。种子培养基如下：

2、生物钾肥的制备

将步骤1的种子液接种于如下配方的发酵培养基中，发酵2-3天，得生物钾肥。

发酵条件：发酵温度30-37℃，变温控制，前期35-37℃，中期32-34℃，后期35-37℃，通用式发酵罐发酵，不调节pH，芽孢形成率80％结束发酵，芽孢数2亿/ml。

3、生物复合钾肥的制备

将步骤2制备的生物钾肥18重量份、50％磷酸氢二钾水溶液17重量份与腐植酸钾肥10重量份混合，制成生物复合钾肥，其质量指标如下：

实施例5实施例1制得的生物复合钾肥对富硒冬枣产量及产值的影响

小区面积9米×10米＝90米²，每个小区共计6株枣树。小区产量统计如下表(产量单位：千克)。

处理1：常规施肥；处理2：常规施肥+供试肥料；处理3：常规施肥+供试肥料基质灭活。

由上表可以看出，处理2比处理1亩增产333.58千克，增产率18.3％，处理2比处理3亩增产347.28千克，增产率18.4％。施复合微生物菌剂，枣树锈病明显减轻，果实脱落率降低，果实着色均匀红润。10月8日调查处理2平均单果重约10.9克，处理1、处理3均为9.8克。处理间其它性状无明显差异。

实施例6实施例2制备的生物复合钾肥对冬枣树产量及产值的影响

小区面积11米×10米＝110米²，每个小区共计8株枣树。小区产量统计表如下(产量单位：千克)。

处理1：常规施肥；处理2：常规施肥+供试肥料；处理3：常规施肥+供试肥料基质灭活。

由上表可以看出，处理二比处理一亩增产263.08千克，增产率15.54％，处理二比处理三亩增产281.41千克，增产率16.81％。施用供试肥料枣树单果重增加，较处理一、处理三平均增加0.4克。枣树患炭疽病株数明显减少，果实脱落率降低，果实着色均匀。

实施例7实施例3制备的生物复合钾肥对番茄产量及产值的影响

小区产量统计表如下(产量单位：千克)。

处理1：常规施肥；处理2：常规施肥+供试肥料；处理3：常规施肥+供试肥料基质灭活。

由上表可以看出，处理2比处理1亩增产748.28千克，增产率20.46％，处理2比处理3亩增产741.06千克，增产率20.22％。植株生长旺盛，根系发达，茎叶健壮，叶色浓绿；后期果实大而整齐，植株病害减轻。

实施例8实施例4制备的生物复合钾肥对番茄产量及产值的影响

小区产量统计表(产量单位：千克)

处理1：常规施肥；处理2：常规施肥+供试肥料；处理3：常规施肥+供试肥料基质灭活。

由上表可以看出，处理2比处理1亩增产638.56千克，增产率20.27％，处理2比处理3亩增产638.58千克，增产率19.25％。植株根系发达，叶色浓绿，花叶少，病害明显轻于其它两个处理，果实着色均匀，不能成熟的青果较少。

实施例9高解钾、产几丁质酶、拮抗病原真菌的CGMCC NO.5155的选育

将环状芽孢杆菌Bacillus circulans Xue-97316以紫外线诱变，获得单菌落300个，经菌落挖块法高通量筛选获得解钾率高达40％、芽孢形成率75％的5株环状芽孢杆菌，再次以紫外线诱变，以8％NaCl筛选，获得耐钾率达8％的3株菌。再将3株菌分别→2.27％ K2O摇瓶摇育→2.27％ K2O摇瓶摇育→4.54％-5％ K₂O摇瓶摇育→7.5％ K₂O摇瓶摇育→10％ K₂O摇瓶摇育→12.5％ K₂O摇瓶摇育→15％ K₂O摇瓶摇育→含12.5％-15％ K₂O平板分离单菌落→留种、耐钾菌种连续传代30次。每个梯度重复2次经过10轮驯化，在含5mM谷氨酸钠、12.5％K2O平板上分离并纯化单菌落留种。进行固态发酵，解钾率稳定在42％。

生物复合钾肥在37℃高温、饱和NaCl的高湿环境中放置1个月测定，生物复合钾肥中钾细菌数与加入前比没有下降，说明该菌可耐受12.5％钾。

将耐钾12.5％环状芽孢杆菌接种于灭菌后的仅以1％虾壳胶体几丁质为碳源富集培养基中，30℃培养7d，驯化后的菌液在分离培养基平板上梯度稀释和平板涂布，培养72h，将在胶体几丁质平板上出现透明降解圈的菌落，纯化，保存。然后在唯一以胶体几丁质为碳源的培养基中液态培养后离心，加入胶状几丁质温育，运用斐林法测还原糖的方法测定，以不加胶体几丁质底物的发酵上清液与加入胶状几丁质温育的发酵上清液还原糖差值计算几丁质酶活。通过底物选出具有产几丁质酶活66.7μg/ml的环状芽孢杆菌CGMCC No.5155。

双层琼脂平板法测定CGMCC No.5155对病原真菌抑制作用。将含有1.8％琼脂的PDA培养基20ml分装到试管中，灭菌后倾倒平板，静置至凝；分装含1.0％琼脂的PDA培养基10ml至试管，灭菌后待冷却至50℃左右时，混入1ml病原真菌孢子液，倾倒至上述PDA平板中，制成混菌平板；静置至凝后，将直径较小的无菌钢笔帽(代替牛津杯)置于上层培养基打孔，用微量注射器注入稀释10倍的200μl发酵离心上清液。能拮抗小麦赤霉菌、水稻稻曲病菌、黄瓜枯萎病菌，抑菌圈直径均大于15mm。

Claims (10)

1.一种环状芽孢杆菌(Bacillus Circulans)，保藏编号为CGMCC No.5155。

2.一种生物复合钾肥的制备方法，按重量计，包括以下步骤：

1)将钾矿石1-5份、农副加工废料5-15份和发酵辅料0.5-5份与水10-25份混合，得到发酵底料；

2)将权利要求1所述的环状芽孢杆菌CGMCC No.5155接种后，得液态种子或固态种子；

3)加入占上述发酵底料重量百分比1-2％的上述环状芽孢杆菌CGMCC No.5155的液态种子或固态种子，经固态发酵得生物钾肥；

4)将上述生物钾肥8-15份、磷酸氢二钾1-5份与腐植酸钾肥10-15份混合，制成生物复合钾肥。

3.根据权利要求2的制备方法，其中步骤1)的钾矿石、农副加工废料、发酵辅料与水的重量比为2.5∶10.5∶1∶17。

4.根据权利要求2或3的制备方法，其中步骤1)的钾矿石选自钾长石、蒙脱石或海绿石之一或其混合物，农副加工废料包括食用菌菌渣以及虾壳、麸皮、玉米皮渣或酒糟中的至少一种，发酵辅料为面粉、玉米粉或豆饼粉之一以及硫酸铵和MgSO₄。

5.根据权利要求2或3的制备方法，其中步骤3)固态发酵的发酵周期为5-7天。

6.根据权利要求2或3的制备方法，其中的生物复合钾肥由生物钾肥11重量份，磷酸氢二钾2重量份和腐植酸钾肥12重量份混合而成。

7.一种生物复合钾肥的制备方法，包括以下步骤：

1)将权利要求1的环状芽孢杆菌CGMCC No.5155接种后，得种子液；

2)种子液接种，液态发酵，得生物钾肥；

3)将生物钾肥11重量份、磷酸氢二钾2重量份与腐植酸钾肥12重量份混合，制成生物复合钾肥。

8.根据权利要求7的制备方法，其中步骤2)的液态发酵周期为2-3天。

9.根据权利要求2～8任一所述的方法制备的生物复合钾肥。

10.权利要求1的环状芽孢杆菌CGMCC No.5155在制备生物复合钾肥中的用途。