ES2829701T3 - Sistema de administración de inoculantes microbianos y materiales y procedimientos relacionados - Google Patents

Abstract

Uso de un sistema inoculante microbiano para el cultivo de microbios, que comprende: una primera cámara sellada que incluye microbios en una forma de cultivo estable, en la que los microbios incluyen Pseudomonas, Mitsuaria o Azospirillum; una segunda cámara sellada que incluye un medio nutriente adecuado para hacer crecer los microbios a través de una etapa de crecimiento en fase logarítmica; en el que la primera cámara está conectada de forma desmontable a la segunda cámara; y un miembro divisor que define una pared que separa la primera cámara sellada y la segunda cámara sellada, en el que el miembro divisor está configurado para dispersar microbios en el medio nutritivo cuando se rompe la integridad del miembro divisor.

Description

DESCRIPCIÓN

Sistema de administración de inoculantes microbianos y materiales y procedimientos relacionados

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 61/914,561, presentada el 11 de Diciembre, de 2013.

Antecedentes de la invención

Los productores han utilizado durante mucho tiempo cultivos microbianos beneficiosos para semillas, plántulas, suelos y/o plantas para reducir diversos tipos de estrés bióticos y abióticos que limitan significativamente el rendimiento de los cultivos. Estos cultivos microbianos están disponibles comercialmente como productos inoculantes que se distribuyen como polvos secos o en forma líquida a granel a los productores para su uso final. Tal distribución de los productos inoculantes a menudo somete a los cultivos microbianos a un abuso ambiental que, a su vez, introduce una variabilidad indeseable en la viabilidad del cultivo y la actividad fisiológica en el momento de la aplicación. La estabilización de las células mediante la formulación y la formación de esporas no excluye adecuadamente la muerte celular durante la fabricación y distribución de tales inoculantes, lo que conduce a una disminución de la eficacia y fiabilidad de los inoculantes.

Los productos inoculantes microbianos pueden experimentar disminuciones significativas en la población durante su vida útil limitada. Esta es una fuente de una cantidad significativa de desperdicio en materiales, agua y energía en relación con los beneficios que brindan dichos productos. Los productos microbianos actuales generalmente se fermentan en grandes instalaciones de fabricación centralizadas, luego se concentran y/o centrifugan para aumentar las poblaciones por encima de los valores de la etiqueta, lo que permite a los fabricantes dar cuenta de la muerte de organismos viables durante el envío y el almacenamiento. Otras soluciones intentadas para reducir la pérdida de viabilidad del inoculante microbiano incluyen la introducción de ingredientes en el cultivo líquido a granel para retardar el metabolismo microbiano y la oxidación, poniendo las células en un estado esencialmente inactivo para el empaquetado y distribución. Por tanto, un problema significativo en el sector del mercado de productos biológicos en expansión es el rendimiento inconsistente en el campo de tales productos inoculantes como resultado de bajos niveles de actividad inicial y/o bajo porcentaje de viabilidad celular en el momento de la aplicación.

La mayoría de los productos inoculantes en el mercado actual tienden a tener un rendimiento subóptimo en muchos lugares, debido al menos en parte al hecho de que dichos productos inoculantes disponibles utilizan microbios que no están bien adaptados a las condiciones locales. A menudo, el éxito de un producto inoculante particular puede depender de la especie de planta y el cultivo al que se aplica el producto inoculante. Además, la adaptabilidad del microbio en el producto inoculante a las condiciones locales del suelo y la capacidad de establecer poblaciones de microbios beneficiosos alrededor de la zona de la planta también pueden afectar el éxito y la utilidad del inoculante. Sin embargo, los productos inoculantes microbianos utilizan microbios que se han seleccionado más sobre la base de la capacidad de sobrevivir a la cadena de suministro que el rendimiento en el campo. Por ejemplo, muchos productos inoculantes contienen formadores de esporas como Bacillus spp. y Trichoderma spp. que tienen cierta capacidad para sobrevivir a las duras condiciones de distribución y almacenamiento, pero que pueden no proporcionar los resultados óptimos deseados para las aplicaciones de uso final. Mientras que los no formadores de esporas como Pseudomonas spp. han demostrado tener efectos beneficiosos en múltiples cultivos, el uso de tales no formadores de esporas no ha logrado una distribución generalizada debido a la incompatibilidad con los procedimientos de distribución actuales.

Dado que los productos inoculantes contienen organismos vivos, la forma en que se preparan y luego se aplican los productos inoculantes puede afectar significativamente el resultado. Existe la necesidad de sistemas y procedimientos para proporcionar inoculantes microbianos viables, fiables y fáciles de usar.

Los documentos WO 90/15527 A1 y US 3068154 A describen un sistema de inoculante microbiano que comprende una primera cámara configurada para contener una cantidad predeterminada de microbios de manera sellada y una segunda cámara configurada para contener una cantidad predeterminada de un medio adecuado para hacer crecer los microbios a través de una etapa de crecimiento en fase logarítmica. La primera cámara está separada de la segunda cámara por al menos un elemento divisor, pudiendo romperse la integridad del elemento divisor para permitir que los microbios y el medio se combinen.

El documento US 6277 625 B1 describe una cepa transgénica de Pseudomonas útil para el control biológico de enfermedades de las raíces de las plantas mediante la aplicación de las bacterias sobre el tejido de la raíz o las semillas.

El documento WO 2009/02493 A2 describe un sistema de dos cámaras para la producción de microorganismos, en el que las cámaras están separadas por una membrana que puede romperse. Una de las cámaras comprende microbios, mientras que la otra comprende medio para su cultivo.

El documento WO 2004/009756 A1 describe un sistema inoculante que comprende dos cámaras que están conectadas de forma desmontable mediante una conexión de rosca. Una de las cámaras comprende inóculo, mientras que la otra comprende medio.

Sumario

En el presente documento se describen sistemas inoculantes microbianos que tienen: una primera cámara sellada que incluye microbios en una forma de cultivo estable, en la que los microbios incluyen Pseudomonas, Mitsuaria o Azospirillum; una segunda cámara sellada que incluye un medio nutriente adecuado para hacer crecer los microbios a través de una etapa de crecimiento en fase logarítmica; en el que la primera cámara está conectada de forma desmontable a la segunda cámara; y un elemento divisor que define una pared que separa la primera cámara sellada y la segunda cámara sellada, en el que el elemento divisor está configurado para dispersar microbios en el medio nutritivo cuando se rompe la integridad del elemento divisor.

En ciertas realizaciones, los microbios, cuando están presentes en la primera cámara, no están presentes en una etapa de crecimiento en fase logarítmica.

En ciertas realizaciones, los microbios, cuando están presentes en la primera cámara, están en una forma seleccionada de una o más de: plancton, biopelícula, latente, liofilizada, parcialmente latente, parcialmente liofilizada, esporulada, deshidratada y secada por congelación; y, en el que los microbios no están presentes en un crecimiento en fase logarítmica.

En determinadas realizaciones, el sistema incluye además al menos un dispositivo para romper la integridad del miembro divisor.

El miembro divisor puede configurarse para formar al menos una pared común entre la primera cámara y la segunda cámara.

En ciertas realizaciones, al menos la segunda cámara está sellada para resistir la contaminación ambiental durante la etapa de crecimiento en fase logarítmica de los microbios.

En ciertas realizaciones, al menos una de la primera cámara y la segunda cámara tiene una atmósfera modificada. En ciertas realizaciones, al menos una de la primera cámara y la segunda cámara tiene al menos un miembro permeable a los gases. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el oxígeno está presente en la segunda cámara, como porcentaje del gas total en la segunda cámara, en un porcentaje seleccionado de: aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 100 %; y aproximadamente del 5 % al 25 % de oxígeno.

En ciertas realizaciones, el medio comprende uno o más de: agua, agua no clorada, agua destilada, caldo Luria y caldo nutritivo. En ciertas realizaciones, el porcentaje de medio en la segunda cámara, en función del volumen total de la segunda cámara, es un porcentaje seleccionado de: desde aproximadamente el 10 % hasta aproximadamente el 95 %; y de aproximadamente un 35 % a aproximadamente un 65 % de líquido.

En determinadas realizaciones, al menos una de la primera cámara y la segunda cámara incluye al menos un puerto de acceso para la conexión a un dispositivo de suministro.

En determinadas realizaciones, al menos una de la primera cámara y la segunda cámara incluye al menos un puerto de acceso para la conexión a un diluyente o un pulverizador.

En ciertas realizaciones, el miembro divisor tiene una cualidad seleccionada del grupo que consiste en: desgarrable; frágil; perforable; rompible; disoluble; y movible.

En ciertas realizaciones, el sistema incluye además al menos un medio para romper la integridad del miembro divisor rasgando, perforando, rompiendo, cortando, disolviendo y/o moviendo.

Los microbios incluyen Pseudomonas, Mitsuaria o Azospirillum.

Además, se describe en el presente documento un procedimiento de cultivo de microbios, que comprende: i) romper la integridad de un elemento divisor que separa una primera cámara y una segunda cámara para introducir una cantidad predeterminada de microbios almacenados en la primera cámara en un medio almacenado en la segunda cámara, y ii) cultivar los microbios introducidos en la segunda cámara en condiciones adecuadas para el rápido crecimiento de los microbios.

El procedimiento de cultivo de microbios puede comprender: i) romper la integridad del elemento divisor para introducir la cantidad predeterminada de microbios almacenados en la primera cámara en el medio almacenado en la segunda cámara, y ii) cultivar los microbios introducidos en la segunda cámara en condiciones adecuadas para el rápido crecimiento de los microbios.

El procedimiento de cultivo de microbios puede comprender: i) proporcionar una cantidad predeterminada de microbios en una primera cámara sellada; ii) proporcionar una cantidad predeterminada de un medio adecuado para hacer crecer los microbios hasta sustancialmente una etapa de crecimiento en fase logarítmica en una segunda cámara sellada; estando separada la primera cámara de la segunda cámara por al menos un elemento divisor; iii) romper la integridad del elemento divisor para permitir que los microbios y el medio se combinen; y iv) permitir que la segunda cámara permanezca sellada tras la ruptura de la integridad del elemento divisor hasta que se logre una etapa de crecimiento en fase logarítmica de los microbios. Además, en ciertas realizaciones, el procedimiento comprende además almacenar la primera y la segunda cámaras durante un período de tiempo predeterminado antes de romper el elemento divisor. Además, en determinadas realizaciones, el procedimiento incluye un paso en el que la segunda cámara se abre después de que se alcanza la etapa de crecimiento en fase logarítmica. En otras realizaciones más, el procedimiento incluye además un paso de aplicar los microbios de crecimiento en fase logarítmica a una o más semillas, plántulas, plantas y suelo.

En determinadas realizaciones, el cultivo se realiza en un intervalo de temperatura seleccionado entre: aproximadamente 10°C y aproximadamente 60°C; de aproximadamente 20°C a aproximadamente 50°C; de aproximadamente 18°C a aproximadamente 27°C; de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C; alrededor de 37°C; aproximadamente 25°C y temperatura ambiente.

El cultivo puede durar un tiempo de: al menos aproximadamente 0,5 días a al menos aproximadamente 21 días; al menos aproximadamente 1 día hasta al menos aproximadamente 14 días; al menos aproximadamente 1 día hasta al menos aproximadamente 7 días; al menos aproximadamente 1 día; y al menos aproximadamente 7 días.

Además, se describe en el presente documento un procedimiento para tratar semillas, plántulas, plantas o suelo, que comprende: aplicar microbios cultivados producidos de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento a semillas, plántulas, plantas o suelo.

El procedimiento puede comprender además diluir los microbios cultivados antes de la aplicación.

El procedimiento puede comprender además secar las semillas y/o el suelo después de aplicar los microbios cultivados a la semilla y/o al suelo.

El cultivo de microbios se puede diluir hasta un número de células de aproximadamente 1.500 a aproximadamente 10.500.500 UFC por ml en los diluyentes diana.

La aplicación puede realizarse mediante pulverización a una tasa de aproximadamente 103 células/ml a aproximadamente 107 células/ml. Por ejemplo, el procedimiento puede incluir en el que la aplicación da como resultado aproximadamente 1000 células/semilla, plántula, planta o pulgada cuadrada de suelo, a aproximadamente 10 millones de células/semilla, plántula, planta o pulgada cuadrada de suelo.

Las semillas, plántulas o plantas pueden ser semillas de leguminosas, plántulas o plantas como la soja.

Las semillas, plántulas o plantas pueden ser cultivos de cereales, como maíz.

Las semillas, plantones o plantas pueden ser vegetales como tomate o flores como petunias.

Además, se describe en el presente documento un kit, que comprende: el sistema como se describe en el presente documento; e instrucciones sobre cómo producir microbios cultivados utilizando el sistema.

Diversos objetos y ventajas de esta invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas, cuando se lea a la luz de los dibujos acompañantes.

Breve descripción de las figuras

El archivo de patente o solicitud puede contener uno o más dibujos ejecutados en color y/o una o más fotografías para describir mejor la presente invención.

FIGURA 1: Ilustraciones esquemáticas y fotografías de un ejemplo de sistema unificado de administración de inoculante microbiano. Los diagramas (FIGURAS 1A y 1B) muestran dos configuraciones contrastantes de las dos cámaras aquí descritas. La FIGURA 1C presenta una foto que muestra un sistema antes (izquierda) y tres días después (derecha) de la activación. El crecimiento bacteriano turbio en la segunda cámara (derecha) indica el crecimiento saturado (es decir, la finalización de la fase logarítmica) del cultivo microbiano. La FIGURA 1D presenta una foto que muestra un ejemplo de una cámara 1 microbiana antes y después del sellado (izquierda), el aparato de sellado (centro) y una gama de biorreactores activados que demuestran un crecimiento microbiano turbio (derecha).

FIGURA 2: Ejemplo de etiqueta e instrucciones de uso. El formato fácil de usar del sistema descrito en el presente documento permite a un inexperto en las técnicas microbiológicas preparar fácilmente cultivos de inoculantes microbianos para su uso en agricultura.

FIGURA 3: Gráficos de barras que representan el crecimiento de dos cepas bacterianas (Woodl y Wood3) utilizadas en el sistema de biorreactor descrito en el presente documento. Los biorreactores se cargaron con diferentes bacterias en la cámara 1 sobre una matriz sólida de semillas de soja molidas. Posteriormente, los biorreactores se activaron y manipularon de acuerdo con las instrucciones de la etiqueta (FIGURA 2). Los gráficos muestran los recuentos de células recuperados del medio de la cámara 2 después de un día o siete días de incubación a temperatura ambiente para ambas cepas. Ambas cepas alcanzaron un crecimiento de saturación (es decir, finalización de la fase logarítmica) en algún momento entre 1 y 7 días después de la activación. Los ensayos repetidos con diversas bacterias ejemplares demostraron que el crecimiento saturado puede ocurrir de manera confiable entre 1 y 3 días después de la activación.

FIGURA 4: Efectos beneficiosos de los inoculantes preparados en el sistema de biorreactor descrito en el presente documento cuando se aplican a semillas de soja. Los biorreactores se construyeron con diferentes cepas bacterianas beneficiosas y se entregaron a los cooperadores para su uso como tratamientos de semillas de soja (véase la Tabla 1 para las identidades de las cepas). Los cooperadores activaron los biorreactores de 1 a 7 días antes de tratar y plantar la semilla de acuerdo con las instrucciones de la etiqueta (FIGURA 2) en seis ubicaciones diferentes (N1, N2, C1, C2, S1 y S2). Los experimentos se establecieron en un diseño de bloques completos al azar con cuatro repeticiones por tratamiento en cada ubicación. Los rodales de cultivos (x1000 plantas por 0,4 ha) y los rendimientos (kilogramos por hectárea) se midieron de forma independiente en las seis ubicaciones de campo diferentes. En este ensayo de seis sitios, las semillas de soja tratadas con inoculantes elaborados a partir de biorreactores tuvieron rodales comparables pero rendimientos más altos que el control en cinco de las seis realizaciones. Los aumentos de rendimiento para esos mismos cinco tratamientos fueron tan buenos o mejores que un tratamiento de semillas estándar de la industria (Ind Std) (TMGerm). La combinación de la cepa 1 con el tratamiento de semillas estándar de la industria resultó en mayores aumentos en el rendimiento.

FIGURA 5: Los efectos beneficiosos de los inoculantes preparados en el sistema de biorreactor descritos aquí cuando se aplican al maíz. Los biorreactores se construyeron con diferentes cepas bacterianas beneficiosas y se entregaron a los cooperadores para su uso como tratamientos de semillas de maíz (véase la Tabla 1 para las identidades de las cepas). Los cooperadores activaron los biorreactores de 1 a 7 días antes de tratar y plantar semillas de acuerdo con las instrucciones de la etiqueta (FIGURA 2) en seis ubicaciones diferentes (CR, DR, MA, VW, FA y WY). Los experimentos se establecieron en un diseño de bloques completos al azar con cuatro repeticiones por tratamiento en cada ubicación. Los rodales de cultivo (x100 plantas por 0,4 ha) y los rendimientos (kilogramos por hectárea) se midieron de forma independiente en las seis ubicaciones de campo diferentes. En las seis ubicaciones, el maíz tratado con los inoculantes elaborados a partir de los biorreactores tuvo más rodales y rendimientos que el control en al menos cuatro de las seis ubicaciones de prueba. El maíz tratado con inoculantes elaborados a partir de los biorreactores tuvo más rodales y rendimientos más altos que el control, en promedio. Los aumentos de rendimiento para tres de los cuatro tratamientos de prueba fueron tan buenos o mejores que un tratamiento de semillas estándar de la industria (Ind Std) (TMGerm). Cuando la Cepa 1 se combinó con el tratamiento de semillas estándar de la industria, se observaron aumentos adicionales en los rendimientos. Y, mientras que el formulante comercialmente disponible de la cepa 7 (Comm7) sí incrementó el promedio de rodales y rendimientos de maíz en seis sitios, se obtuvieron rodales y rendimientos más altos con la misma cepa formulada en el prototipo de biorreactor (Comm7), lo que indica que el biorreactor entrega más dosis eficaces del inoculante microbiano.

FIGURA 6: Efectos beneficiosos de los inoculantes preparados en el sistema de biorreactor descrito en el presente documento cuando se aplican al maíz en una operación agrícola típica. El agricultor activó el producto de acuerdo con las instrucciones de la FIGURA 2. El producto se aplicó durante la siembra como una tira y la ubicación se marcó con banderas de campo. En la cosecha, se midió el rendimiento tanto de la tira de prueba como de una tira de control adyacente sin tratar usando un carro de pesaje. Los datos mostraron un rendimiento de la tira de prueba un 4,6 % más alto que el del cuadro sin tratar.

Descripción detallada

En el presente documento se describe un sistema de cultivo celular conveniente y confiable que es útil para preparar semillas y plantas, incluidos inoculantes para plántulas (en adelante, "cultivo"), pero también puede usarse para una variedad de propósitos de cultivo celular. También se describen procedimientos para inocular un cultivo. Un beneficio es que un individuo puede cultivar inoculantes microbianos bajo demanda, sin conocimientos especializados de teoría o técnicas de cultivo, en un momento conveniente y en un recipiente sellado libre de contaminación externa. Además, los inoculantes que resultan del uso del presente sistema son confiables viables y activos en el momento de su uso. La naturaleza bajo demanda del presente sistema descrito reduce en gran medida el desperdicio. El uso del presente sistema descrito fomenta aplicaciones económica y ecológicamente eficientes del cultivo microbiano. Usando un diseño de biorreactor estandarizado, el cultivo microbiano se puede seleccionar más fácilmente para un microambiente, cultivo y resultado deseado en particular. Opcionalmente, los inoculantes para cultivos se pueden diluir y aplicar en un recipiente de sistema unitario, con el beneficio adicional de asegurar la aplicación del inoculante que está esencialmente libre de contaminación.

Adicionalmente en el uso, el usuario final agita la mezcla y almacena el sistema en una condición de tiempo/temperatura prescrita (por ejemplo, condiciones ambientales de 18 a 72 horas) para establecer un cultivo en fase sustancialmente estacionaria que ha completado el crecimiento activo en fase logarítmica. Luego, el operador tiene un período de tiempo prescrito (por ejemplo, 1-7 días después de la activación) en el cual distribuir el inoculante sobre la semilla, suelo o plantas deseados con o sin dilución adicional en agua. El sistema descrito en el presente documento también permite la capacidad de lograr fácilmente la dilución y distribución conectando el recipiente de reacción a un pulverizador de dilución/dispensación o sistema de goteo para una fácil aplicación a semillas, plantas o suelo.

El sistema y los procedimientos descritos en el presente documento permiten el uso en campo de microbios beneficiosos que no son capaces de sobrevivir a las típicas cadenas de suministro de fabricación y distribución que se encuentran actualmente en la industria. El uso del sistema descrito en el presente documento también aumenta la población potencial de microbios comercializados actualmente, al impulsar la etapa de crecimiento en fase logarítmica hacia abajo, mucho más cerca del uso del producto final, de modo que el cultivo microbiano no esté sustancialmente inactivo o muerto, condiciones que suelen encontrar los usuarios actuales de productos microbianos.

El sistema descrito en el presente documento es desechable, fácil de usar por un operador no calificado y asegura que la fase de crecimiento microbiano ocurra en un ambiente estéril en una proporción precisa con el medio. Esto logra un nivel de frescura previamente inalcanzable, lo cual es una característica muy deseable para los inoculantes agrícolas y, de hecho, muchos tipos diferentes de productos que involucran a un microbio vivo para lograr su eficacia.

El sistema de biorreactor, los inoculantes microbianos y los kits descritos en el presente documento pueden ser útiles en la propagación, cultivo o crecimiento de hortalizas y frutas dicotiledóneas, cultivos de cereales monocotiledóneos, cultivos de estratos ornamentales y césped.

Inoculantes microbianos

El término "microorganismos", "microbios", "inoculante microbiano" o "cultivo microbiano" como se usa en el presente documento abarca bacterias, hongos (incluyendo levaduras), algas, protozoos y virus. El término "bacteria" como se usa en el presente documento abarca bacterias, organismos similares a bacterias, y sus equivalentes, incluidos los actinomicetos.

El término "beneficioso", como se usa en el presente documento, se refiere a microbios que, en conjunto, proporcionan un mayor beneficio a la planta que cualquier daño que puedan causar. Los expertos en la técnica pueden determinar si un microorganismo de este tipo beneficiará a la planta considerando uno cualquiera o más de una multitud de factores. Estos incluyen, pero no se limitan a: 1) hacer que los nutrientes estén más disponibles o en mayores cantidades; 2) potenciar o inducir la resistencia a patógenos; 3) producir un producto químico deseado, como un pesticida, por sí mismo o por conversión de metabolitos vegetales; 4) conferir o mejorar la tolerancia al estrés; 5) aumentar la eficiencia metabólica, como la eficiencia fotosintética, y 6) inactivar toxinas.

Microbios Beneficiosos

Comprender las fortalezas, los requisitos, las limitaciones y la biología general de un microbio beneficioso es importante para obtener los mayores beneficios de su uso. En muchas prácticas agrícolas actuales, se añaden al suelo una gran cantidad de células de microbios disponibles comercialmente mezclándolos en gránulos o empapándolos antes de que la presión del patógeno sea alta. Conocer las condiciones ambientales en las que el microbio beneficioso se desempeña mejor puede ayudar a garantizar que los inoculantes promuevan la salud y la protección de la planta. Alternativamente, la adición de microbios metabólicamente activos puede ayudar a asegurar que sus actividades beneficiosas se expresen de manera oportuna. Además, se debe tener en cuenta la compatibilidad con el sistema de producción de cultivos y los insumos de los productores para el uso adecuado de los microbios beneficiosos. El pH del suelo, la temperatura, la humedad, la composición del suelo o del medio del recipiente y el tejido de la planta objetivo (raíz, tubérculo, etc.) afectan el establecimiento de microbios beneficiosos en el suelo. También es importante cómo los insumos de plaguicidas, los insumos de nutrientes, el procedimiento y la frecuencia de riego, los reguladores del crecimiento de las plantas (PGR) y similares pueden afectar el rendimiento o la longevidad de los microbios beneficiosos. La información sobre compatibilidad ambiental y de insumos de producción y fitotoxicidad también puede ser útil.

Además, en determinadas situaciones, la longevidad de un microbio o microbios beneficiosos en el suelo o en el entorno de la mezcla para macetas puede promover la salud de los cultivos durante un período de tiempo más prolongado. Las bacterias tienden a liberar sus metabolitos secundarios protectores hasta 4 semanas después de la aplicación, aunque pueden persistir en el suelo por más tiempo. Los hongos tienden a sobrevivir más tiempo con una protección documentada de hasta 12 semanas.

Los microbios mencionados anteriormente pueden expresar efectos beneficiosos cuando se aplican a suelos, semillas o plantas.

Los inoculantes pueden usar microbios nativos o no nativos. Sin embargo, es ecológicamente más sensato usar cepas que sean nativas de la región de cultivo a la que se van a aplicar como inoculantes, o al menos a los cultivos y/o condiciones del suelo que reflejen fielmente sus orígenes geográficos. Estos microbios se pueden introducir en las plantas o semillas mediante el uso de composiciones inoculantes. El proceso mediante el cual se crean las composiciones inoculantes incluye la etapa de cultivar los microbios, generalmente en un medio líquido, como se describe en el presente documento.

Cultivos microbianos estables

Los cultivos microbianos estables generalmente se refieren a una población de microbios que se encuentran en un estado en el que se conservan, lo que permite un almacenamiento a largo plazo con una muerte mínima. Los cultivos microbianos estables incluyen cultivos latentes, de plancton, en biopelícula, secados por congelación, liofilizados, esporulados o deshidratados y que no experimentan un crecimiento en fase logarítmica. Un experto en las técnicas microbiológicas tendrá la capacidad de preparar cultivos estables a partir de lotes más grandes de células microbianas cultivadas en medios sólidos o líquidos.

En general, los microbios se pueden cultivar inicialmente en una variedad de medios nutritivos adecuados. Preferiblemente, el microbio se cultiva usando una composición que haya demostrado ser óptima para ese género y especie de microorganismo en particular. Los medios de cultivo o nutrientes adecuados contienen generalmente, además de una fuente de carbono, otros nutrientes, tales como, por ejemplo: una fuente de nitrógeno; fuentes de azufre y fósforo; materiales inorgánicos como metales traza; factores de crecimiento; oxígeno y dióxido de carbono. El medio nutriente generalmente se puede preparar a partir de materiales disponibles comercialmente adecuados para los microbios que se van a estabilizar, por ejemplo, Caldo Nutriente Bacto. Tales medios nutritivos adecuados y condiciones de crecimiento aplicables a cepas microbianas particulares son evidentes para un experto en esta técnica. Por ejemplo, las bacterias generalmente son capaces de crecer en una amplia gama de condiciones físicas y son capaces de utilizar muchos nutrientes diferentes, teniendo en cuenta que el crecimiento óptimo puede requerir ciertas condiciones específicas para una especie determinada.

En una realización preferida, los microbios se cultivan en un laboratorio y, en condiciones axénicas, se estabilizan en una matriz sólida que luego se sella en una primera cámara para ser liberados, a petición del consumidor, en una segunda cámara para iniciar el crecimiento activo inmediatamente. antes de su uso. Específicamente, aquí se describe un sistema que permite el uso de cantidades precisas de medio y cultivos microbianos estables para un uso final deseado (por ejemplo, tratamiento de semillas, suelo o plantas). El medio y los cultivos microbianos estables se mantienen en cámaras selladas separadas por un miembro divisor. Cuando el usuario final necesita los inoculantes microbianos frescos para su aplicación a semillas, plantas o para otras aplicaciones de campo, una persona no capacitada en técnicas de microbiología puede romper, retirar o reposicionar el miembro o el miembro divisor de modo que los cultivos microbianos estables sean mezclados con el medio para iniciar el crecimiento (es decir, activar el biorreactor).

El sistema puede configurarse para permitir el intercambio de gases apropiado para permitir las condiciones de crecimiento apropiadas de los cultivos microbianos, o alternativamente, el sistema puede llenarse con oxígeno durante la fabricación, o el sistema puede ser provisto con un oxidante (por ejemplo, H²O² o agua superoxigenada) para proporcionar niveles de oxígeno apropiados para soportar el crecimiento en fase logarítmica de microbios aeróbicos. Además, en determinadas realizaciones, una o más de las cámaras pueden llenarse con una atmósfera modificada que tenga un tipo y una cantidad particulares de gas adecuados para el microbio particular que se va a cultivar. Un experto en la técnica sabría qué tipo y cantidad de gases son adecuados para el crecimiento rápido de diversos tipos de microbios. En realizaciones particulares, la cantidad de medio utilizado es tal que permite intercambios de gas adecuados para soportar un cultivo estable en una primera cámara y un crecimiento logarítmico en una segunda cámara después de la activación. Manteniendo todo el sistema encerrado, los inoculantes microbianos resultantes están sustancialmente libres de contaminantes que típicamente disminuirían la viabilidad y eficacia del inoculante.

Crecimiento microbiano

Para un cultivo microbiano exitoso, generalmente están presentes estas características: 1) suspensión de los microbios en el medio y 2) aireación del medio para apoyar el crecimiento del microbio. La suspensión adecuada de microbios en el medio ayuda con la aireación, es decir, un buen contacto del microbio con los gases disueltos en el medio. Una buena suspensión también es importante para el acceso de los microbios a los nutrientes y otros factores de crecimiento en los medios de cultivo. La aireación adecuada implica asegurarse de que haya suficientes gases disueltos en el medio para soportar el crecimiento del microbio. El término "aireación" se usa en la presente memoria descriptiva con referencia a organismos aeróbicos, que pueden cultivarse en el sistema descrito actualmente. Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán que el intercambio de gases adecuado para los organismos anaeróbicos también es importante, y se considera que el término "aireación" como se usa en el presente documento abarca el intercambio de gases de cualquier tipo.

Es bien sabido que hay varias fases de crecimiento microbiano. Durante una fase de retraso, los microbios se adaptan a las condiciones de crecimiento, donde el microbio está madurando pero aún no puede dividirse. La siguiente fase es una fase logarítmica, que es un período caracterizado por duplicación celular repetida, donde el número de nuevas bacterias es proporcional a la población actual. Si el crecimiento no está limitado, la tasa de aumento de la población se duplica con cada período de tiempo consecutivo. Esta fase logarítmica también se conoce como fase de crecimiento exponencial. Después de la fase logarítmica hay una fase estacionaria, a menudo causada por factores limitantes del crecimiento, como el agotamiento de los nutrientes, seguida de una fase de muerte en la que los microbios se quedan sin nutrientes y comienzan a morir. Los períodos de incubación para lograr cada etapa de crecimiento generalmente dependen de factores tales como los propios microbios, el tipo de medio utilizado para cultivar los microbios y la temperatura a la que crecen los microbios. Los microbios en las fases de crecimiento logarítmico tardío y estacionario temprano son los más robustos y los microbios serán los más eficaces si se aplican en este rango. El presente sistema descrito es capaz de proporcionar una cantidad deseada de inoculantes saludables en la fase estacionaria temprana, en comparación con otros procedimientos utilizados actualmente. Un número sustancial de inoculantes disponibles comercialmente consiste en cultivos concentrados de células formuladas y almacenadas en fases inactivas y/o de muerte.

Las condiciones de incubación para lograr un crecimiento sustancialmente logarítmico tardío/fase estacionaria temprana para proporcionar los inoculantes microbianos más efectivos generalmente variarán dependiendo del microbio en sí, la cantidad de cultivo microbiano estable que se agregará, el tipo y la cantidad de medio añadido a la cámara de cultivo celular y la temperatura a la que crecen los microbios. Un experto en la técnica podría determinar la cantidad apropiada de inoculantes y medios microbianos estables, la temperatura de incubación apropiada y el período de incubación apropiado para alcanzar sustancialmente un crecimiento logarítmico tardío/fase estacionaria temprana para un diseño de biorreactor dado. Por ejemplo, dependiendo de los factores descritos anteriormente, los períodos de incubación pueden ser de al menos medio día a 21 días, de 1 día a 15 días, o de 1 día a 7 días aproximadamente. Debe entenderse que dichos tiempos de incubación variarán dependiendo del microbio específico, el volumen final del inoculante microbiano requerido, la temperatura de incubación y el tipo de medio utilizado.

Asimismo, la temperatura de incubación también varía según el tipo de microbio involucrado; por ejemplo, las bacterias tienden a tener tasas de crecimiento máximas que oscilan entre 15 y 45°C. En varias realizaciones, la temperatura puede ser de aproximadamente 10°C a aproximadamente 60°C, incubándose las realizaciones preferidas entre 18 y 30°C. En determinadas realizaciones, la incubación se realiza a temperatura ambiente de manera que sea fácil de usar para el usuario final (que puede no tener acceso a un entorno de temperatura controlada para la incubación).

Medios

Por "medio", "medio de crecimiento", "medio de cultivo" y "medio nutritivo" se entiende un líquido que apoya el crecimiento de los microbios. Los microbios son extraordinariamente diversos en sus requisitos de crecimiento. Los microbios se ven muy afectados por las condiciones ambientales y crecerán de acuerdo con la forma en que estos nichos ambientales apoyen sus necesidades individuales. Los factores que afectan el crecimiento microbiano incluyen, pero no se limitan a, pH, osmolalidad, actividad del agua, temperatura y niveles de oxígeno. Existe una gran diversidad nutricional entre los microbios; por lo tanto, el crecimiento microbiano se ve muy afectado por los nutrientes disponibles en su entorno.

El tipo y la cantidad de medio para soportar sustancialmente el crecimiento en fase logarítmica del microbio dependerá del propio microbio. Se debe tener cuidado de no agregar demasiados nutrientes para estimular altas tasas de metabolismo en el microbio que podrían perturbar las tasas de crecimiento. Un experto en la técnica sería capaz de determinar el medio apropiado para cultivar un microbio particular a fin de lograr sustancialmente una fase logarítmica tardía/etapa temprana de crecimiento para un diseño de biorreactor dado. El tipo de medio dependerá del tipo de microbio que se esté cultivando. Los medios líquidos pueden ser agua o una solución nutritiva con factores que ayudan al crecimiento de los microbios. Deben seleccionarse las fuentes de nutrientes adecuadas para cada cepa microbiana que se produzca. Para la mayoría de los cultivos de rizobios, por ejemplo, se ha encontrado que una composición de nutrientes de extracto de levadura y manitol produce resultados ejemplares. Para otros cultivos bacterianos, se pueden usar con éxito caldos de nutrientes disponibles comercialmente. Para muchos cultivos de hongos y algunos cultivos bacterianos, la harina de trigo y salvado en general, y la harina de trigo blanca sin blanquear convencional en particular, se han encontrado ventajosos para su uso como fuentes de nutrientes y podrían proporcionarse como pastas o suspensiones axénicas.

La cantidad de medio añadido a la cámara de cultivo celular variará dependiendo de los microbios que se cultiven y la cantidad de aireación requerida para un microbio particular. El espacio suficiente en la cámara de cultivo celular permitirá el intercambio de gases en el medio para apoyar el crecimiento adecuado del microbio. El intervalo de porcentaje de medio que llena la primera cámara puede oscilar entre aproximadamente un 10 % y aproximadamente un 95 %, con realizaciones particulares que oscilan entre un 35 % y un 65 %.

Se puede encontrar información sobre diversos medios de crecimiento, tiempos de incubación y manejo de microbios en Microbiology: A Laboratory Manual (9th Edition), Benjamin Cummings, Handbook of Microbiological Media, 2nd Edition, CRC Press, y Laboratory Exercises in Microbiology, Ninth Edition, Harley, McGraw-Hill Science/Engineering/Math, que se incorporan expresamente como referencia.

Sistema unitario

El sistema descrito en el presente documento ha sido diseñado y probado para su uso por parte de personas sin conocimientos en la técnica de la microbiología (FIGURA 1). Haciendo referencia ahora a las ilustraciones esquemáticas mostradas en la FIGURA 1A, un sistema 10 de almacenamiento/cultivo microbiano unitario incluye una primera cámara 20 sellable que está configurada para almacenar un cultivo 22 microbiano estabilizado, y una segunda cámara 30 escalable que está configurada para contener un medio 32 deseado. La primera cámara 20 está separada por un elemento 40 divisor de la segunda cámara 30. En la realización mostrada en la FIGURA 1A, el elemento 40 divisor define al menos una pared de la primera cámara 20.

La segunda cámara 30 contiene oxígeno y opcionalmente otros gases así como medios, particularmente medios 32 líquidos. En ciertas realizaciones, la segunda cámara 30 puede incluir uno o más accesos al oxígeno y otros gases a través de un miembro 34 permeable a los gases. En ciertas realizaciones, al menos una de la primera cámara y la segunda cámara incluye al menos un puerto 36 de acceso para la conexión a un dispositivo de suministro, como un diluyente o un pulverizador.

El sistema 10 proporciona un procedimiento "bajo demanda" para proporcionar microbios "frescos" o “fase logarítmica tardía/etapa temprana” en el momento más ventajoso para el usuario final. En uso, cuando se rompe la integridad del elemento 40 divisor, el cultivo 22 microbiano estabilizado se dispersa en el medio 32. Debe entenderse que tal ruptura se puede lograr de diversas maneras. Por ejemplo, el elemento 40 divisor puede ser rasgable, cortable, frangible, perforable, rompible, soluble y/o móvil. En una realización, el elemento divisor puede ser un elemento frangible capaz de romperse mediante la aplicación de una fuerza. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 8,443,970 describe una copa de miembro frangible que tiene un ingrediente dentro de la copa y tiene un botón de diafragma unido operativamente a una espiga con la punta afilada de la espiga en un extremo y el botón de diafragma en el extremo opuesto. Al empujar el diafragma se mueve la espiga para romper el miembro frangible y permitir que el contenido del diafragma pase libremente a otra cámara que contenga líquido.

En otras formas de realización, una o más de la primera cámara y la segunda cámara pueden tener roscas ranuradas para permitir que la primera cámara se fije o se retire de la segunda cámara. Además, se pueden fijar o retirar otros miembros ranurados de la primera y/o segunda cámara para ayudar en la dilución y aplicación (por ejemplo, unir a un mecanismo de dilución o pulverización).

En otras realizaciones, se puede fijar un dispositivo 24 de perforación a la primera y/o segunda cámaras opuestas al elemento 40 divisor para romper el elemento 40 divisor. En otra realización alternativa, el dispositivo 24 de perforación puede ser un cojinete de perlas o de bolas que puede añadirse a una o más de la primera y segunda cámaras, de modo que cuando se agite vigorosamente, el cojinete de perlas o de bolas sea capaz de romper el elemento divisor, mezclando así el contenido de la primera cámara y la segunda cámara. El elemento divisor puede ser lo suficientemente fuerte como para resistir la manipulación normal, pero puede romperse sólo cuando se produce una sacudida vigorosa.

El elemento divisor también podría estar hecho de un material parcialmente soluble que podría resistir una pequeña exposición al medio líquido que puede ocurrir durante la manipulación normal, pero cuando se agite vigorosamente, el elemento divisor parcialmente disuelto se volvería inestable y se rompería.

Alternativamente, cuando la primera cámara y la segunda cámara están en contacto entre sí y comparten una pared común, y el elemento divisor se extiende por un espacio entre los dos, el material divisor puede estar hecho de un material maleable, con un desgarro alargado que cubre el espacio. El material divisor maleable se puede estirar para romperse y permitir que los microbios estables de la primera cámara pasen libremente a la segunda cámara.

Alternativamente, como se muestra en la realización de la FIGURA 1B, un sistema 10' unitario de almacenamiento/cultivo microbiano incluye una primera cámara 20' sellable que está configurada para almacenar un cultivo 22' microbiano estabilizado, y una segunda cámara 30' sellable que está configurada para contener un medio 32' deseado. La primera cámara 20' está separada por un elemento 40' divisor de la segunda cámara 30. En la realización mostrada en la FIGURA 1B, el elemento 40' divisor se define en toda la primera cámara 20'. En tal realización, el elemento 40' divisor puede ser de material frangible (por ejemplo, vidrio, plástico), y la segunda cámara puede ser de material maleable que permite al usuario final asir el material frangible y romperlo, liberando así los microbios 22' en el medio 32', sin exponer la segunda cámara 30 a contaminantes externos. El material maleable puede ser lo suficientemente fuerte como para no romperse ni perforarse, pero puede ser moldeado por un manipulador externo para permitir su manipulación sin exponer el interior a contaminantes.

También pueden aplicarse otras alternativas de elementos divisores móviles conocidos en la técnica, tales como elementos divisores que se pueden mover para abrir las dos cámaras entre sí para permitir la mezcla de los inoculantes microbianos estables y el medio líquido.

La FIGURA 1C es una fotografía que muestra un sistema 10 antes de su uso (izquierda) y dos días después de la activación (derecha) que muestra turbidez que es una indicación de crecimiento microbiano logarítmico tardío/fase estacionaria temprana.

Miembro permeable a gases

Generalmente se entiende que un miembro permeable a los gases es un material biocompatible capaz de permitir la transferencia de gas dentro y fuera de un espacio cerrado. El miembro permeable a los gases puede ser permeable a los líquidos o impermeable, hidrófobo o hidrófilo, poroso o no poroso. El espesor puede oscilar por encima o por debajo de 0,25 mm. La elección depende de la aplicación específica. En una realización, el miembro 34 permeable a los gases es impermeable a los líquidos para evitar fugas de medios y evitar que entren contaminantes en las cámaras. Como pauta general, la permeabilidad al gas de un miembro dado debe considerarse además de la interacción del miembro con células o estructuras proteicas. Los elementos impermeables a los líquidos de espesor equivalente establecerán diversas tensiones de oxígeno en estado estable en la interfaz célula/película. Los copolímeros FEP de Teflón, silicona y policarbonato de silicona establecerán una mayor tensión de oxígeno que el polietileno, policarbonato, polipropileno, polisulfona o polipropileno.

Tamaño y forma del recipiente de envasado

Las dimensiones y la forma del sistema en sí, y la primera cámara y la segunda cámara, se pueden variar para adaptarse a las necesidades de gasto, fabricante y aplicaciones específicas. Junto con el intercambio y la mezcla de gases, otros criterios para seleccionar una forma incluyen la fuerza de corte y el rendimiento de la celda. En ciertas realizaciones, se prefiere un sistema que sea más largo que ancho. Se contempla una amplia gama de volúmenes interiores, que van desde 0,1 L hasta 200 L o más. En determinadas realizaciones, la segunda cámara tiene un volumen interior de aproximadamente 0,055 L-100 L. En una realización, dicho volumen interior es 1 L. En otra realización, el volumen interior de la segunda cámara es de aproximadamente 50 mL a aproximadamente 500 mL. La segunda cámara de tamaño más pequeño es especialmente apropiada para uso a pequeña escala, como jardinería personal, paisajismo y viveros. La segunda cámara de mayor tamaño es especialmente apropiada para operaciones agrícolas a gran escala y otras aplicaciones comerciales. El tamaño de la primera y/o la segunda cámara, la cantidad de medios y cultivos microbianos se pueden adaptar al consumidor objetivo y su aplicación de uso final prevista. Aunque en las figuras se ilustran formas rectangulares y en forma de botella, estas formas pretenden ser ilustrativas y no limitantes. También se pueden utilizar otras formas.

Materiales y técnicas de fabricación

El recipiente de envasado se forma preferiblemente a partir de un sustrato plástico adecuado, tal como, únicamente a modo de ejemplo, polipropileno o polietileno, y con suficiente rigidez estructural para evitar deformaciones, roturas y/o roturas del mismo durante la fabricación y uso. Se prefieren los plásticos que no eliminan el oxígeno. Alternativamente, también se puede usar un formato de bolsa en caja donde la caja externa proporciona una rigidez adecuada para la bolsa flexible interior.

Los componentes del sistema descrito en el presente documento se pueden fabricar a partir de materiales o sustratos que se seleccionan generalmente de acuerdo con propiedades, tales como inercia de reacción, durabilidad, costo o similares. En determinadas realizaciones, por ejemplo, los componentes se fabrican a partir de diversos materiales poliméricos tales como politetrafluoroetileno (TEFLON™), polipropileno, poliestireno, polisulfona, polietileno, polimetilpenteno, polidimetilsiloxano (PDMS), policarbonato, cloruro de polivinilo (PVCMA), polimetilmetacrilato (PMMA), o similar. Las piezas poliméricas son típicamente económicas de fabricar, lo que permite que la cámara de cultivo sea desechable. Además, los componentes se pueden fabricar opcionalmente a partir de otros materiales que incluyen, por ejemplo, vidrio, metal (por ejemplo, acero inoxidable, aluminio anodizado, etc.), silicio o similares. Por ejemplo, las cámaras primera y segunda se pueden ensamblar opcionalmente a partir de una combinación de materiales unidos o ajustados de forma permanente o desmontable.

Otros componentes que forman el sistema descrito en el presente documento pueden formarse opcionalmente mediante diversas técnicas de fabricación o combinaciones de tales técnicas que incluyen, por ejemplo, moldeo por inyección, moldeo por fundición, mecanizado, estampado, extrusión, grabado u otras técnicas. Estas y otras técnicas de fabricación adecuadas se conocen generalmente en la técnica y se describen, por ejemplo, en Rosato, Injection Molding Handbook, 3rd Ed., Kluwer Academic Publishers (2000), Fundamentals of Injection Molding, W.J.T. Associates (2000), Whelan, Injection Molding of Thermoplastics Materials, Vol. 2, Chapman & Hall (1991), Fisher, Extrusion of Plastics, Halsted Press (1976), y Chung, Extrusion of Polymers: Theory and Practice, Hanser-Gardner Publications (2000), todos los cuales se incorporan expresamente aquí como referencia. Después de fabricar las cámaras u otros componentes, pueden procesarse adicionalmente, por ejemplo, revistiendo superficies con, por ejemplo, un revestimiento hidrófilo, un revestimiento hidrófobo o similares.

Dispensación de inoculantes microbianos

Diversos procedimientos son útiles para la dispensación real del inoculante microbiano del sistema descrito actualmente. Por tanto, dependiendo de la configuración del sistema, se pueden emplear procedimientos alternativos para fijar y/o separar la primera cámara de la segunda cámara. Por ejemplo, después de mezclar e incubar el cultivo microbiano en el medio para formar el "inoculante microbiano" líquido, la primera cámara puede retirarse opcionalmente de la segunda cámara desenroscando una cámara de la otra. En un ejemplo alternativo, la primera y la segunda cámaras se pueden unir y quitar cuando sea necesario.

Los inoculantes microbianos se pueden diluir directamente de la primera o segunda cámara. En una realización, la primera cámara o la segunda cámara pueden configurarse para acoplarse a un diluyente o pulverizador para dilución y aplicación a semillas, suelo, plantas o para cualquier aplicación para la cual se vaya a utilizar el inoculante.

También debe entenderse que el inoculante microbiano se puede aplicar de diversas formas. Por ejemplo, el inoculante microbiano se puede aplicar directamente a las semillas. Por ejemplo, las leguminosas forman un gran grupo de plantas que incluyen vegetales de importancia económica como soja, lucerna (alfalfa), cacahuete, guisantes, judías y similares, y los inoculantes rizobianos aplicados a dichas semillas de leguminosas pueden colonizar la rizosfera e infectar las raíces de las plantas, ya que penetran en los pelos radiculares y colonizan la raíz, produciendo nódulos. Como resultado de esta relación simbiótica, las plantas pueden convertir nitrógeno gaseoso en compuestos orgánicos de nitrógeno mediante la fijación de nitrógeno. Las plantas pueden utilizar estos compuestos orgánicos para crecer.

Por tanto, en otro aspecto, se proporcionan aquí procedimientos para tratar semillas o plantas con un inoculante microbiano. El procedimiento puede incluir generalmente: producir un inoculante microbiano líquido "nuevo" o en "fase logarítmico tardía/estacionaria temprana", diluir dichos inoculantes microbianos a una densidad celular deseada y aplicar los inoculantes microbianos a una velocidad deseada para una eficacia máxima. En ciertas realizaciones, el procedimiento también puede incluir dejar que las semillas se sequen hasta un contenido de humedad aceptable, para no interferir con la germinación de las semillas, y plantar las semillas.

También debe entenderse que la cantidad de inoculantes microbianos frescos, o en etapa de crecimiento logarítmico, que se aplicará a las semillas varía. En aplicaciones ejemplares, las tasas de aplicación pueden oscilar entre aproximadamente 103 y aproximadamente 107 células/semilla. Las velocidades de pulverización pueden variar desde aproximadamente 103 células/ml hasta aproximadamente 107 células/ml. Antes de la aplicación de los inoculantes microbianos a las semillas, el inoculante líquido se puede diluir hasta un número de células de 1.000 a aproximadamente 10.000.000 de unidades formadoras de colonias (UFC) por ml en el diluyente objetivo.

También debe entenderse que la cantidad deseada de humedad añadida a las semillas después de la aplicación de los inoculantes líquidos puede variar de 0,1 % a aproximadamente 2 %, con realizaciones particulares que varían de 0,3 a 0,8 %. Demasiada humedad en las semillas puede interrumpir la germinación. Un experto en la técnica sabría la cantidad ideal de inoculantes que se agregarán a las semillas dependiendo del microbio utilizado, las especies de semillas por tratar y las condiciones del suelo donde se plantarán las semillas, para asegurar la máxima eficacia. Kits para cultivar inoculantes microbianos frescos

También se proporcionan aquí kits para cultivar inoculantes microbianos frescos. El kit puede incluir generalmente un sistema descrito aquí que tiene una cantidad específica de inoculante microbiano estable y medio, e instrucciones de uso, tiempos de incubación, temperaturas de incubación, tasas de crecimiento, tasas de aplicación, diluciones y tasas de pulverización preferidos. Los kits pueden tener microbios y/o medios tanto registrados como no registrados, microbios específicos de un suelo o región particular en la que se van a plantar semillas, o se cultivan plantas que están siendo tratadas. Los kits se pueden preparar a medida para las necesidades específicas del productor. Por tanto, los kits proporcionan un procedimiento simple y listo para usar para que un operador no capacitado en las técnicas microbiológicas produzca inoculantes microbianos frescos y eficientes para su aplicación en semillas, plantas, suelos y otros usos previstos de los inoculantes microbianos en el campo.

Aplicaciones adicionales de inoculantes microbianos frescos

También debe entenderse que el sistema y los procedimientos descritos en el presente documento proporcionados en el presente documento no están limitados para su uso en aplicaciones relacionadas con la agricultura, jardinería y paisajismo, sino que se pueden usar para cualquier aplicación en la que se deseen microbios de crecimiento rápido que tengan mayor viabilidad y eficacia. Ejemplos de tales aplicaciones incluyen, pero no se limitan a, inoculantes de ensilaje, probióticos animales y humanos, producción de alimentos, remediación ambiental de químicos tóxicos y compuestos radioactivos, compostaje de una amplia gama de materiales de desecho y control biológico de plagas. Algunos géneros microbianos comunes que podrían beneficiarse de esta metodología incluyen, pero no se limitan a: Achromobacter, Aerococcus, Atopobium, Bifidobactrium, Brevundimonas, Brochothrix, Carnobacterium, Enterococcus, Galactomyces, Lactobacillus, Pseudomonas, Saccharomyces, Stentotrophomonas, Streptococcus y Weisella.

Ciertas realizaciones de la presente invención se definen en los Ejemplos de este documento. Debe entenderse que estos Ejemplos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, se dan únicamente a modo de ilustración.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes demuestran una realización del sistema, procedimiento y kit reivindicados a continuación, en el que los microbios utilizados fueron cepas phlD+ de pseudomonas, un grupo de bacterias beneficiosas del suelo que previamente han demostrado poder afectar significativamente el crecimiento y la salud de diferentes especies de plantas (Weller et al 2002, McSpadden Gardener et al. 2005, Raudales and McSpadden Gardener 2009). Otras bacterias beneficiosas del suelo pertenecientes a los géneros Azospirillum, Bacillus, Mitsuaria, y Pseudomonas se han probado en este sistema con resultados similares.

Ejemplo 1 - Crecimiento de bacterias en un biorreactor.

Se cultivaron varias bacterias diferentes en medios líquidos hasta la fase estacionaria y se inocularon en una matriz sólida de semillas de soja molidas. En condiciones axénicas, las bacterias se aplicaron por separado a la matriz sólida a una tasa de 1 ml por 100 g de semilla molida con agitación y se sellaron en una cámara de plástico con un 20 % de espacio libre de aire ambiental. La primera cámara estaba unida a una segunda cámara que contenía agua mineral pura. Después de cuatro días de almacenamiento, el contenido de la cámara 1 se liberó en la cámara 2 mediante la rotura de la membrana plástica interpuesta en virtud de una espiga interna. La suspensión se mezcló suavemente y el biorreactor se colocó de lado a temperatura ambiente. Después de 1 a 3 días, se observó un crecimiento turbio en la cámara 2 (FIGURA 1C).

La FIGURA 3 proporciona datos cuantitativos representativos sobre el número real de recuentos de células cultivables obtenidos de biorreactores no inoculados (NC) así como inoculados (Wood1 y Wood3) en medios semiselectivos después de 1 y 7 días. Los recuentos microscópicos directos confirmaron el número de células cultivadas que se saturan a ~108 células por ml. La actividad de los cultivos se puso de manifiesto por la aparición de células nadantes activamente durante hasta dos semanas después de la activación. El número real de células obtenidas depende de la cepa, la cantidad de matriz sólida utilizada y su composición. Dichos datos demuestran que un biorreactor como se describe en el presente documento puede usarse para desarrollar cultivos bacterianos activos bajo demanda.

Ejemplo 2 - Respuestas de judías de soja a la aplicación de tratamientos de semillas bacterianas beneficiosos utilizando el biorreactor descrito en el presente documento.

Los biorreactores se prepararon utilizando diferentes cepas de bacterias que previamente demostraron tener efectos beneficiosos sobre el crecimiento, la salud y/o el rendimiento de las plantas (véase Tabla 1). La inoculación de la cámara 1 y el montaje de los biorreactores se realizaron como se describe anteriormente. Los biorreactores se almacenaron a temperatura ambiente durante cinco a nueve semanas antes de su uso, dependiendo de la fecha de siembra. Se activaron cada semana seis biorreactores diferentes, cada uno de los cuales contenía una única cepa inoculante perteneciente al género Pseudomonas, Mitsuaria, Bacillus o Azospirillum, y su contenido se utilizó para tratar la semilla entre tres y siete días después de la activación de acuerdo con las instrucciones de la etiqueta (FIGURA 2). Las semillas tratadas se plantaron en un diseño de bloques replicado (n=4) junto con tratamientos de control en seis ubicaciones diferentes en todo Ohio. Se realizaron comparaciones de recuentos de rodales y rendimientos durante la temporada de crecimiento y en la cosecha, respectivamente (FIGURA 4).

Los resultados de este ensayo de campo en múltiples sitios se resumen en la FIGURA 4. Cinco de los seis experimentos (Cepa 1 a 6) superaron al control sin inocular (Control). El porcentaje de sitios donde se observó una respuesta positiva en relación con el control negativo osciló entre el 50 y el 83 %, que se comparó favorablemente con la respuesta del 50 % al tratamiento químico de semillas. Las mejoras promedio de rodales en los seis sitios de prueba, en relación con el control no tratado, variaron de 0,2 a 3,3 %.

Tabla 1. Descripciones de cepas bacterianas que tienen efectos beneficiosos sobre el crecimiento, la salud y/o el rendimiento de las plantas.

Los rendimientos promedio de 5 de los 6 tratamientos de semillas suministrados por el biorreactor excedieron los del control en un 1,2 a 2,5 %. Dichos aumentos de rendimiento fueron tan grandes o mayores que los proporcionados por un tratamiento de semillas estándar de la industria (Ind Std) llamado TMGerm. Además, un tratamiento de semillas suministrado por un biorreactor combinado de forma aditiva con el tratamiento de semillas estándar de la industria proporcionó aumentos de rendimiento aún mayores de un 2,5 % más que la semilla tratada con TMGerm solo y un 3,2 % más de rendimiento que el control sin tratar. Estos datos demuestran la utilidad del prototipo de biorreactor en la administración de bacterias beneficiosas del suelo a los cultivos de leguminosas.

Ejemplo 3 - Respuestas del maíz a la aplicación de tratamientos de semillas bacterianas beneficiosos utilizando el biorreactor descrito en el presente documento.

Se realizó un estudio separado, similar al descrito anteriormente para la soja, en maíz. Los biorreactores se prepararon utilizando diferentes cepas de bacterias que previamente demostraron tener efectos beneficiosos sobre el crecimiento, la salud y/o el rendimiento de las plantas. La inoculación, ensamblaje y almacenamiento de los biorreactores se llevaron a cabo como se describe anteriormente en el Ejemplo 2. Se activaron cada semana cuatro biorreactores diferentes, cada uno de los cuales contenía una única cepa inoculante perteneciente al género Pseudomonas, Mitsuaria o Azospirillum, y su contenido se utilizó para tratar la semilla entre tres y siete días después de la activación según las instrucciones de la etiqueta (FIGURA 2). Se plantaron semillas tratadas y se evaluó la cosecha de maíz en crecimiento en seis lugares diferentes en todo Ohio.

En maíz, los biorreactores inoculados con las cepas bacterianas experimentales (Cepas 1, 2, 3 y 7) superaron al tratamiento de control en términos de rodales y rendimientos (FIGURA 5). En promedio, el maíz tratado con inoculantes hechos de biorreactores tuvo rodales más altos (0,8 a 8,1 x100 plantas por 0,4 ha) y rendimientos más altos (4,575 a 8,975 hL/ha). Estos representan aumentos en el rodal de 0,2 a 2,3 % y aumentos de rendimiento de 2,0 a 4,6 % en los seis sitios de prueba.

Además, el biorreactor arrojó resultados que superaron los de los inoculantes disponibles comercialmente. Por ejemplo, los aumentos de rendimiento para tres de los cuatro tratamientos de prueba fueron tan buenos o mejores que un tratamiento de semillas estándar de la industria (Ind Std) (TMGerm). Además, cuando la cepa 1 se combinó con el tratamiento de semillas estándar de la industria, se observaron aumentos adicionales en los rodales y rendimientos promedio. Además, mientras que el formulante comercialmente disponible de la cepa 7 (Comm7) sí aumentó el promedio de rodales y rendimientos de maíz en seis sitios, se obtuvieron rodales y rendimientos aún más altos con la misma cepa formulada en el prototipo de biorreactor (Strain7) demostrando que el biorreactor puede entregar una dosis más eficaz de un inoculante microbiano beneficioso. Estos datos demuestran la utilidad del prototipo de biorreactor para llevar bacterias beneficiosas del suelo a los cultivos de cereales.

En general, estos Ejemplos indican que los inoculantes microbianos frescos, usando el sistema descrito en el presente documento, cuando se aplican a semillas, pueden usarse para mejorar en general el rendimiento del cultivo.

Ejemplo 4 - Tratamiento de semillas de maíz en el cultivo.

Debido a la viabilidad limitada de muchos tipos de bacterias beneficiosas, en períodos prolongados de sequedad, el tratamiento de semillas a nivel de embolsado y distribución de semillas puede no ser práctico. En tales situaciones, una metodología alternativa al tratamiento biológico de semillas puede ser más apropiada para un gran desarrollo comercial. Por ejemplo, el uso de un mezclador rotatorio más grande (por ejemplo, un mezclador de 50 galones) en el sitio podría acelerar el tratamiento y asegurar una buena cobertura para lotes de semillas más grandes para uso en todo el cultivo.

Alternativamente, el cultivador podría diluir la solución bacteriana en un líquido que se aplica en el surco de la sembradora, como agua o fertilizante líquido de inicio. Una de tales aplicaciones (FIGURA 6) dio como resultado un aumento del rendimiento de la cosecha de maíz del 4,6 % en comparación con el control sin tratar.

Por tanto, el sistema y los procedimientos descritos en el presente documento proporcionan un procedimiento efectivo y de bajo coste para producir inoculados microbianos frescos, libres de contaminantes y más eficaces en el campo que puede ser ejecutado por un trabajador no cualificado en las técnicas microbiológicas.

Por lo tanto, se pretende que la invención no se limite a la realización particular aquí descrita contemplada para llevar a cabo esta invención, sino que la invención incluirá todas las realizaciones que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Uso de un sistema inoculante microbiano para el cultivo de microbios, que comprende:

una primera cámara sellada que incluye microbios en una forma de cultivo estable, en la que los microbios incluyen Pseudomonas, Mitsuaria o Azospirillum;

una segunda cámara sellada que incluye un medio nutriente adecuado para hacer crecer los microbios a través de una etapa de crecimiento en fase logarítmica; en el que la primera cámara está conectada de forma desmontable a la segunda cámara; y

un miembro divisor que define una pared que separa la primera cámara sellada y la segunda cámara sellada, en el que el miembro divisor está configurado para dispersar microbios en el medio nutritivo cuando se rompe la integridad del miembro divisor.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los microbios, cuando están presentes en la primera cámara, están en una forma seleccionada entre una o más de: en plancton, en biopelícula, latente, liofilizada, parcialmente inactiva, parcialmente liofilizada, esporulada, deshidratada y secada por congelación; y en el que dichos microbios no están presentes en un crecimiento en fase logarítmica.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que al menos una de la primera cámara y la segunda cámara tiene una atmósfera modificada o tiene al menos un miembro permeable a los gases.

4. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los microbios comprenden Azospirillum.

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que al menos una de la primera cámara y la segunda cámara incluye al menos un puerto de acceso para la conexión a un dispositivo de suministro.