ES2311389A1 - Producto solido eficaz para el control biologico de la fusariosis vascular del melon, su procedimiento de obtencion y metodo de aplicacion del mismo. - Google Patents
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Abstract
Producto sólido eficaz para el control biológico de la fusariosis vascular del melón, su procedimiento de obtención y método de aplicación del mismo. La invención se encuadra dentro del campo técnico de la agricultura convencional y ecológica, y es aplicable tanto en semillero como en campo. Proporciona un producto sólido eficaz para el control biológico de fusariosis vascular de melón basado en el uso de una cepa de T. harzianum, hongo antagonista del patógeno (F. oxysporum sp. melonis), sobre una matriz sólida inerte e incorpora factores adicionales que mejoran la capacidad biocontrol del producto. La invención también se refiere al procedimiento de obtención del producto y a su método de aplicación
Description
Producto sólido eficaz para el control biológico
de la fusariosis vascular del melón, su procedimiento de obtención y
método de aplicación del mismo.
La presente invención se encuadra dentro del
campo técnico de la agricultura convencional y ecológica, y es
aplicable tanto en semillero como en campo. En concreto se refiere
a un producto sólido eficaz para el control biológico de fusariosis
vascular en melón, su procedimiento de obtención y método de
aplicación del mismo.
La fusariosis vascular del melón es una
enfermedad muy común, ocasionada por diferentes razas de Fusarium
oxysporum que produce importantes pérdidas en cultivos,
principalmente en zonas con temperaturas elevadas. La fusariosis es
un problema grave en el campo de cultivo pero sobre todo resulta
importante en los semilleros, ya que las condiciones de cultivo en
éstos favorecen el desarrollo y dispersión del patógeno debido a la
producción de un gran número de plantas en un espacio reducido y
cerrado.
Los métodos habituales para control de
fitopatógenos incluyen el uso de grandes cantidades de sustancias
químicas como los fungicidas, sustancias que en algunos casos están
clasificadas como cancerígenas y/o tóxicas y que en muchos países
están prohibidas. Estas sustancias químicas además, en multitud de
ocasiones resultan ineficaces.
Contra la fusariosis de melón no hay un control
químico efectivo, únicamente es posible la desinfección del suelo
utilizando productos altamente nocivos tanto para el medioambiente
como para la salud humana. Por este motivo son muchos los esfuerzos
encaminados a investigar métodos alternativos.
El control biológico de la fusariosis mediante
el empleo de microorganismos antagonistas es una de las
alternativas más prometedoras. Entre los agentes de control
biológico más importantes se encuentran los hongos pertenecientes al
género Trichoderma que son capaces de controlar un amplio
abanico de microorganismos patógenos de plantas de interés agrícola.
Cinco especies de Trichoderma (T. hamatum, T. harzianum, T.
koningii, T. polysporum y T. viride) son las más
importantes para biocontrol (Hoitink y Boehm, 1999). Sin embargo,
aunque han tenido un éxito relativo, todavía no ha sido posible
alcanzar un nivel suficiente en el control de fitopatógenos.
En la actualidad existen diferentes métodos de
control biológico de fitopatógenos basados en la utilización de
diversas especies y cepas del hongo Trichoderma. La mayor
parte de los métodos relacionados con el control de enfermedades
mediante el uso de Trichoderma están basadas en el uso de
diferentes especies de este género tales como T. asperellum, T.
artroviride, T. inhamatum para el control biológico de
fitopatógenos como Rhizoctonia solani (ES 2200602; 2000, y
ES 2219523; 2004), T. harzianum por si solo para el control
de Botritis. cinerea y de Sclerotinia sclerotiorum
(IL2103758; 1997), o en combinación con T viride para el
control de Rhizhoctonia solani (ES 2109182; 1995). También
se ha descrito el uso de T. viridae por si sólo (US
6,808,917; 2002) o bien T hamatum, con otros microorganismos
complementarios como Flavobacterium balustinum, para el
control de R. solani y Pythium ultimun (US 4.900.348;
1987). Además, existen productos comerciales basados en el uso de
Trichoderma tanto en formulación líquida (Stimulase (Ecocert
Francia nº 08-884, SCPA Agronutrición), Trichomic
(AMC Chemical y Trichodex) y Trianum-G (Koppert)
como sólida en forma de polvo (Tricho-tec
Ecocert-SHC nº
VA-22P-2, Técnicas de control
biológico), Trianum-P (Koppert), Trichotem (BCS
Öko-Garantie
QUIM_MERI_8244/02.04/4215-ES, Químicas Meristem),
T. harzianum DIB-32 (Productos Flower). No
obstante ninguno de estos productos está descrito de forma
específica para el control de la fusariosis vascular de melón y en
los casos en que se hace mención al control de F. oxysporum
es en una gama de microorganismos fitopatógenos.
La tendencia generalizada del mercado es la
oferta de productos de amplio espectro, pero hay que tener en cuenta
que cada tipo de patógeno tiene un mecanismo de infección distinto,
por lo que son necesarios mecanismos de control diferenciados.
Se ha propuesto un método específico para el
control de la fusariosis vascular de melón que está basado en la
utilización de compost supresivos previamente inoculados con T.
harzianum cepa T-34 (ES 188385 Al). Sin
embargo, el uso de compost supresivos tiene la desventaja de que
sólo se pueden aplicar a los suelos y no a los sustratos de
semilleros ya que pueden inhibir la germinación y desarrollo de las
plántulas. La patente US0285987; 1985 describe un método de control
de fitopatógenos de cuello tales como Pythium sp y
Rhizoctonia sp mediante la utilización de protoplastos
obtenidos de diferentes géneros de Trichoderma, que se
embeben en las semillas por si solos o en matrices orgánicas que,
una vez germinadas, adquieren resistencia. Su desventaja principal
es el bajo contenido final de Trichoderma en el substrato de
germinación que es crítico en el control de la fusariosis de
melón.
La mayor parte de las tecnologías disponibles
hasta el momento para el control biológico de fitopatógenos se
presentan bajo una formulación líquida, lo que facilita su
aplicación pero condiciona su eficacia dada la baja capacidad de
supervivencia que muestran los microorganismos al pasar de un medio
líquido (forma suministrada) a uno sólido (lugar donde debe
realizar su acción, bien sea suelo o substrato orgánico). Otra
limitación importante de dichas tecnologías es el tiempo de
adaptación al nuevo medio y la necesidad de encontrar un nicho
ecológico del microorganismo inoculado, que limita enormemente su
potencial supervivencia en el suelo o substrato orgánico, cuestión
que no ha sido resuelta por ninguna de las tecnologías disponibles
hasta el momento.
Por todo ello, y dada la problemática específica
de la fusariosis del melón, es necesario desarrollar productos y
procedimientos específicos para el control biológico de la
fusariosis vascular de melón basados en el uso de microorganismos
antagonistas con alta capacidad como agentes biocontrol (Inbar
et al., 1994), que sean aplicables tanto en semillero como en
campo, capaces de sobrevivir en el sustrato y que la inoculación se
realice sobre soporte sólido. Este ha sido el objeto de la presente
invención y su novedad radica en que proporciona un producto
específico para el control de la fusariosis vascular en melón, con
elevada especificidad y alta capacidad como agente biocontrol,
hasta ahora inexistente. Además, el producto objeto de la presente
invención, es sólido, el agente muestra altos niveles de
supervivencia en el sustrato y es aplicable tanto en semillero como
en campo. Una ventaja adicional de la presente invención, que se
basa en el uso de un producto natural, es que aumenta el conjunto
de remedios biológicos para luchar contra los agentes causantes de
enfermedades de plantas, encaminado siempre a disminuir, en la
medida de lo posible, el uso indiscriminado de sustancias
químicas.
La presente invención proporciona un producto
sólido eficaz para el control biológico de fusariosis vascular de
melón, su procedimiento de obtención y método de aplicación del
mismo.
En un aspecto particular la invención se refiere
a un producto sólido eficaz para el control biológico de la
fusariosis vascular de melón caracterizado porque comprende (i) un
microorganismo antagonista de F. oxysporum con capacidad
biocontrol sobre éste. (ii) Un soporte sólido para la inoculación
del microorganismo antagonista (iii) y factores adicionales que
mejorar la capacidad biocontrol del producto.
En otro aspecto particular la invención se
relaciona con un producto sólido eficaz para el control biológico
de la fusariosis vascular de melón basado en el uso de T.
harzianum como microorganismo antagonista.
En otro aspecto particular la invención se
relaciona con un producto sólido eficaz para el control biológico
de la fusariosis vascular de melón que utiliza como soporte sólido
bentonita.
En otro aspecto particular la invención se
relaciona con un producto sólido eficaz para el control biológico
de la fusariosis vascular de melón que incorpora como factores
adicionales CO_{3}Ca y quitosano como corrector de pH e inductor
de la síntesis de quitinasas, respectivamente.
En otro aspecto particular la invención se
relaciona con un procedimiento de obtención de un producto sólido
eficaz para el control biológico de la fusariosis vascular de melón
caracterizado porque sus componentes se incuban a temperaturas entre
20-30ºC por un tiempo entre 1 y 10 días.
En otro aspecto particular la invención se
relaciona con un procedimiento para la obtención de un producto
sólido eficaz para el control biológico de la fusariosis vascular
de melón caracterizado porque sus componentes se mezclan, trituran
e incuban durante 5 días a 25-28ºC.
En otro aspecto particular la invención se
relaciona con un procedimiento para la obtención de un producto
sólido eficaz para el control biológico de la fusariosis vascular
de melón caracterizado porque comprende la preparación de un
soporte sólido como bentonita, que incorpora como factores
adicionales CO_{3}Ca y quitosano como corrector de pH e inductor
de la síntesis de quitinasas, respectivamente, todo ello mezclado y
homogeneizado en seco. A dicha mezcla se inocula un cultivo
biológicamente puro de la cepa de T. harzianum T78 Nº CECT
20714, y se mezcla e incuba durante 5 días a
28-25ºC. El producto resultante se mezcla con turba
al 10% mediante le uso de una mezcladora estándar de las utilizadas
en los semilleros comerciales.
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye un procedimiento para inducir resistencia sistémica a
enfermedades causadas por organismos fitopatógenos que comprende
aplicar una cantidad eficaz del producto objeto de la invención
sobre el suelo o la planta a la que se desea inducir resistencia
sistémica a enfermedades.
En otro aspecto particular la invención se
relaciona con un procedimiento para estimular el crecimiento de
plantas que comprende aplicar una cantidad eficaz del producto
objeto de la invención sobre suelo o planta cuyo crecimiento se
desea estimular.
Otro aspecto particular de la invención es la
utilización del producto objeto de la invención para el control
biológico de esta enfermedad en semillero.
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye la utilización del producto objeto de la invención para
el control biológico de la fusariosis vascular en campo de
cultivo.
En otro aspecto particular la invención se
relaciona con el uso de Trichoderma harzianum, cepa
T-78, CECT Nº 20714 para el control biológico de la
fusariosis vascular.
\newpage
Figura 1: Gráfico de barras dónde se refleja el
crecimiento en placas Petri sobre ensayo en placa dual de F.
oxysporum enfrentadas a diferentes cepas de Trichoderma.
En el eje de abscisas se representan las cepas de Trichoderma
sp. que mostraron un mejor resultado para los intereses y/o
objetivos a desarrollar (C (Control de Fusarium), TC (cepa
comercial) y cepas T82, T78, T010, T190 y T1) y en el eje de
ordenadas el crecimiento final a los siete días sobre la placa
Petri en centímetros.
Figura 2: Crecimiento sobre turba de las cepas
de Trichoderma sp. atendiendo al criterio de supresividad
frente a F oxysporum (A) y supervivencia en turba de la cepa
T78 (B). En el eje de abscisas de la Figura 2 (A) se representan las
diferentes cepas estudiadas, (T78; T82, T1, T010; T190 y TC
(comercial)) y en la Figura 2 (B) se representa la cepa de
Trichoderma T78 inoculada en turba y turba sin inocular. En
el eje de ordenadas de la Figura 2 (A) se muestra el número de
unidades formadoras de colonias (ufc) x 10^{6} por gramo de turba
analizado y en la Figura 2 (B) se muestra el porcentaje de CO_{2}
desprendido en el medio.
Figura 3: Evolución de F. oxysporum
sometido a los diferentes tratamientos pasados 15, 37 y 48 días de
su inoculación respectivamente. En el eje de abscisas se
representan cada una de las formas en que se inoculó la solución de
la cepa T. harzianum T78 en la turba. (C: control sin
inocular, 1: solución de esporas, 2: embebiendo a la semilla con
una solución de esporas en carboximetilcelulosa, 3: embebiendo a la
semilla con una solución de esporas en goma arábiga, 4: bentonita
previamente inoculada con la suspensión de esporas, 5: vermiculita
previamente inoculada con la suspensión de esporas, 6:
incorporación de esporas con una fuente carbonada rica en
lignocelulosa, 7: tratamiento similar al tratamiento 5 pero en este
caso la vermiculita se incorporó en la parte superior de las bandeja
de germinación y el eje de ordenadas muestra el número de ufc F.
oxysporum x 10^{6} por gramo de turba analizado.
Figura 4: Evolución de la cepa de T.
harzianum T78 en turba, tras su aplicación en los diferentes
soportes. En el eje de abscisas se representan los diferentes
tratamientos del 1 al 7 y el control (C). En el eje de ordenadas se
muestra el número de ufc de T. harzianum T78 x 10^{6} por
gramo de turba analizado a los 0, 2, 15, 37 y 48 días.
Figura 5: Porcentaje de infección por F.
oxysporum (A) y Peso seco (g.) (B) de las plantas de melón
tratados con los distintos soportes, después de 15, 33 y 48 días de
cultivo en semillero. En el eje de abscisas se representan los
diferentes tratamientos, del 1 al 7 y el control (C). En el eje de
ordenadas de la Figura A se muestra el porcentaje de infección por
F. oxysporum de un total de 20 plantas y en la Figura B los
gramos de peso seco de las plantas de melón.
Figura 6: Efecto de la aplicación de bentonita
complementada con carbonato cálcico y quitosano sobre el peso seco
(g.) (A) y porcentaje de infección por F. oxysporum de las
plantas de melón (B), después de 48 días de cultivo en semillero.
En el eje de abscisas se representan los tratamientos T: Turba; Ti:
Turba inoculada con la cepa T78 en Bentonita y TiQ: Turba inoculada
con la cepa T78 en bentonita complementada con CO_{3}Ca y
quitosano. En el eje de ordenadas de la Figura 6(A) se
muestra los gramos de peso seco de las plantas de melón y de la
Figura 6(B) el porcentaje de infección por F.
oxysporum de un total de 20 plantas.
Figura 7: Efecto de la aplicación sobre turba de
bentonita complementada con carbonato cálcico y quitosano sobre la
cepa de T. harzianum T78 (A) y F. oxysporum (B) y el
porcentaje de infección por F. oxysporum de las plantas de
melón (C) después de 48 días de cultivo de plantas de melón en
semillero. En el eje de abscisas se representan los tratamientos,
(T: Turba; Ti: Turba inoculada con la cepa T78 en Bentonita y TiQ:
Turba inoculada con la cepa T78 en bentonita complementada con
CO_{3}Ca y quitosano), mientras que el eje de ordenadas muestra
el número de ufc (escala logarítmica) por gramo de turba analizado
de T. harzianum T78 (A), de F. oxysporum (B) y en (C)
se representa el porcentaje de infección por F.
oxysporum.
La presente invención proporciona un producto
sólido eficaz para el control biológico de fusariosis vascular de
melón basado en el uso de una cepa de T. harzianum, hongo
antagonista del patógeno (F. oxysporum sp. melonis), sobre
una matriz sólida inerte. La invención también se refiere al
procedimiento de obtención del producto y a su método de
aplicación.
La invención se basa en el uso de una cepa
natural de T. harzianum aislada de sustratos orgánicos de
similares características a las turbas que se utilizan en
semilleros, lo que aumenta su capacidad de supervivencia y
disminuye la frecuencia de aplicación del producto.
Como soporte sólido se utiliza bentonita que
tiene alta capacidad de retención de humedad, permite fijar tanto
formas reproductoras como vegetativas activas (miceliares) del
hongo, a una concentración adecuada para facilitar que el agente
antagonista empiece a actuar desde el momento de la aplicación, y
mantiene altas concentraciones de éste en el sustrato. Además, por
su elevada capacidad de adherencia, la bentonita actúa como
protector físico de la raíz evitando la entrada de patógenos, de
este modo potencia el efecto biocontrol y permite inmovilizar
enzimas producidas por T. harzianum capaces de degradar la
pared celular de ciertos patógenos como F. oxysporum,
incrementando la eficacia del producto objeto de la presente
invención.
\newpage
La invención utiliza carbonato cálcico para
corregir el pH de la bentonita natural, hasta un pH próximo al
óptimo para el crecimiento de la cepa de T. harzianum
inmovilizada, lo que mejora su capacidad de colonización, optimiza
su crecimiento vegetativo y se consigue mayor cantidad de título en
el mismo volumen de soporte para la inoculación.
El producto objeto de la presente invención
incorpora quitosano como fuente nutritiva para la cepa inoculada,
compuesto que, en algunos casos, se utiliza por si solo en el
control preventivo de fitopatógenos, (Chitomer, BCS
Öko-Garantie
QUIM_MERI_8244/01.04/4161-ES, Químicas Meristem. La
presencia de quitosano en el inóculo induce la activación de la
actividad quitinasa, enzima responsable de la degradación de quitina
presente en la pared celular de algunos microorganismos patógenos
como F. oxysporum, de forma que cuando se produce una
infección por patógenos, la actividad quitinasa generada
previamente evitaría la instauración de estos en el suelo. La
capacidad de biocontrol de este producto está en función del grado
de acetilación, cuanto menor es éste mayor es su capacidad de
biocontrol. No obstante su empleo directo no ofrece resultados
concluyentes, puesto que, si bien en determinadas circunstancias
tiene un efecto preventivo, en otras tiene un efecto activador de
la infección del patógeno, ya que puede ser utilizado por éste como
fuente de carbono y nutrientes.
Por tanto, la presente invención combina la
incorporación de quitosano de bajo grado de acetilación, carbonato
cálcico con la cepa de T. harzianum, inmovilizadas en un
substrato sólido inerte a base de bentonita, que contiene fijadas
estructuras tanto reproductivas como miceliares activas del hongo.
Estos componentes se incuban durante un tiempo, previo a su
preparación como inóculo, de manera que las densidades eficaces del
microorganismo, así como de sus metabolitos (enzimas hidrolíticas),
se mantienen durante el periodo de tiempo en el que la planta es
susceptible de contraer la enfermedad. Todo ello permite optimizar
el control biológico de cultivos de melón tanto en semillero como
en campo, con la consecuente obtención de cultivos de calidad que
mantienen y mejoran la calidad del suelo, con lo que en último
término se evolucionará hacia una agricultura respetuosa con el
medio ambiente y la salud de los seres vivos. Además todos los
componentes utilizados para conseguir el formulado final son
adecuados para su utilización en agricultura ecológica, por lo que
el formulado propuesto permite controlar la fusariosis vascular de
melón tanto en agricultura convencional como ecológica, mucho más
restrictiva en cuanto insumos.
Para desarrollar la presente invención, en
primer lugar se procedió a la selección y aislamiento del agente
biocontrol a utilizar, en segundo lugar a estudiar su capacidad de
supervivencia en los substratos orgánicos tipo turba habituales en
semillero. En tercer lugar se procedió a desarrollar el soporte
adecuado para implementar su acción tras la inoculación y, una vez
seleccionados los aspectos anteriores, se procedió a mejorar la
acción de T. harzianum mediante adición en el soporte de
compuestos capaces de darle una mayor y más rápida capacidad de
acción, por último, se validó el producto final y se establecieron
las condiciones de aplicación.
Para la selección y aislamiento de
microorganismos biofungicidas frente al fitopatógeno, se seleccionó
el género Trichoderma sp, independientemente de su especie,
por las excelentes cualidades para la lucha contra diversos hongos
fitopatógenos, su capacidad bioestimulante y biorreguladora
(Samuels, 1996), además de su adaptabilidad, facilidad de manejo y
su alta capacidad de colonización (Hoitkin y Boehm, 1999). Una vez
seleccionado el conjunto de cepas de Trichoderma, y
realizados los ensayos para demostrar el grado de control sobre
F. oxysporum, su capacidad de supervivencia y adaptación en
los sustratos tipo turba que se utilizan comúnmente en los
semilleros, se procedió a elegir aquella que aunase ambas
características.
Las cepas de Trichoderma sp,
independientemente de su especie, se aislaron a partir de turbas,
compost verdes y suelos del sureste español, evaluando un total de
11 cepas designadas T010, T1, T3, T10, T75, T76, T78, T82, T85, T86
Y T190. También se ensayó un producto comercial que contenía
Trichoderma harzianum y estaba recomendado para el control
preventivo de la fusariosis vascular de melón (designado T
comercial). Para realizar la evaluación las cepas se sometieron a
las siguientes pruebas:
- (i)
- Evaluación de la capacidad biofungicida in vitro de las cepas de Trichoderma frente a F. oxysporum mediante ensayo en placa dual, que consiste en enfrentamientos equidistantes de cuatro centímetros de las cepas aisladas frente a F. oxysporum, en placa petri en medio de cultivo PDA, cuantificando el crecimiento de este último con cada una de las cepas (Rupela et al., 2003). Estos análisis mostraron que las cepas con mayor capacidad biofungicida eran T78 y la T190 (Fig. 1 (A)) pero el crecimiento presentado por las diferentes cepas de Trichoderma sp. frente al patógeno en estudio (Figura 1 (B)) mostró la existencia de una cierta influencia negativa de F. oxysporum sobre el desarrollo de la cepa T190 hecho que hizo descartarla y seleccionar la cepa T1 debido a la gran capacidad de crecimiento presentada por esta cepa en presencia de Fusarium oxysporum.
- (ii)
- Evaluación de la capacidad de crecimiento y supervivencia sobre turba, sustrato utilizado en los semilleros durante todo el proceso de germinación y crecimiento de las plántulas de melón. Este análisis se realizó incubando las cepas en turba con las condiciones habituales de germinación y crecimiento aplicadas al cultivo de melón. Los resultados pusieron de manifiesto que la cepa T78 presentaba mayor capacidad de crecimiento en este sustrato (Fig. 2 (A)).
\newpage
- (iii)
- Evaluación del estado y actividad de la cepa T78 en turba: para ello se analizó si su estado era en forma miceliar o activa y/o en forma de esporas, es decir latente. La determinación del estado del microorganismo es importante a la hora de evaluar su actividad, ya que es posible que tenga capacidad de supervivencia, pero que no sea activa y, por lo tanto, no desarrolle la actividad para la que se utiliza. Las esporas son estructuras de resistencia para la supervivencia del microorganismo, pero no son activas y es necesario que éstas germinen y den lugar al micelio para que se desarrolle su actividad (Papadivas y Lumsden, 1982; Harman, 2004). Para determinar la capacidad de germinación de las esporas de la cepa T78 inoculadas sobre turba se midió la respiración basal una vez inoculada, comparándola con la turba sin inocular con la cepa T78, mediante la medida del desprendimiento de CO_{2}, en el medio inoculado como medida de su actividad (Pascual et al., 2002). Los resultados obtenidos mostraron que la cepa T78 tenía buena capacidad para germinar y desarrollarse en la turba.
De todo ello se concluyó que del conjunto de
cepas aisladas la cepa T78 presentaba una gran capacidad de
crecimiento y adaptación en turba, además de presentar una mas que
considerable capacidad biofungicida frente a F. oxysporum.
El DNA de esta cepa fue extraído y secuenciado determinando que la
cepa elegida, por homología de secuencia, pertenecía a la especie de
T. harzianum, presentando algunas variaciones respecto a las
incluidas en las bases de datos genómicas, motivo suficiente para su
registro en la Colección española de cultivos tipo bajo el Nº
20714.
Tras la selección de la cepa se procedió a la
selección del soporte de inoculación más apropiado que permitiese a
la cepa T78 permanecer el tiempo necesario en el sustrato en
contacto con la planta y que impidiese la actuación del patógeno.
Para llevar a cabo esta selección se analizaron dos soportes
líquidos: disolución de la cepa de Trichoderma T78 en goma
arábiga y carboximetilcelulosa (CMC) al 2%, dos compuestos con la
capacidad de conferir efecto impregnante, también se utilizó una
suspensión de esporas de la cepa T78 obtenida a partir de cultivo
en placa petri; y tres soportes sólidos: bentonita, vermiculita y
salvado de trigo, que se prepararon embebiendo en ellos una solución
de Trichoderma T78. También se utilizó vermiculita inoculada
superficialmente, es decir vermiculita previamente inoculada con la
suspensión de esporas que se incorporó en la parte superior de la
bandeja y una suspensión de esporas pulverizada durante el
cultivo.
El análisis de los soportes se realizó
incorporándolos a la turba que se utilizó para germinar semillas de
melón, sobre las que, una vez germinadas, se inoculó una suspensión
de esporas del patógeno F. oxysporum a la concentración
habitual de infección en semillero, que está entorno a
10^{3}-10^{5} ufc por gramo de turba (Agrios,
1998). Tras la infección se tomaron muestras sobre las que se evaluó
el desarrollo de las plantas, la evolución de la población del
patógeno (Fusarium) y de la cepa T. harzianum T78
inoculada con los distintos soportes. La toma de muestras se realizó
a lo largo de todo el periodo habitual de cultivo de melón en
semillero (48 días). Los resultados mostraron que los tratamientos
en los que se produjo una mayor reducción de la población de
Fusarium sp., fueron los tratamientos con bentonita,
(tratamiento 4) y con vermiculita superficial (tratamiento 7)
inoculada previamente con T. harzianum y aplicada
superficialmente para recubrir los pocillos de las bandejas de
siembra (Figuras 3, 4 y 5). La reducción en la población de F.
oxysporum fue progresiva en el tiempo, siendo el tratamiento con
bentonita el que presentó una mayor eficacia, posiblemente debido a
su capacidad de adherencia a las raíces lo que permite una mayor
protección de Trichoderma sobre el sistema radicular de la
planta. Asimismo, estos dos tratamientos fueron los que mostraron
una mejor evolución de la cepa de T. harzianum T78 ya que
presentaron el número más elevado de ufc/g, destacando el
tratamiento con bentonita que mostró mayor concentración de T.
harzianum al final del experimento (Fig. 4). También se analizó
el efecto de los distintos soportes utilizados sobre el desarrollo
de las plantas al final del cultivo en semillero y su efecto sobre
el posible riesgo de movimiento de patógeno de semillero a campo al
trasplantar plantas sin síntomas, pero portadoras del patógeno, al
campo de cultivo. En todos los casos los tratamientos que mostraron
menor porcentaje de infección fueron los que incluían bentonita y
vermiculita como soporte del inóculo.
Por tanto, de los soportes utilizados para
inocular la cepa T. harzianum T78 en la turba, tanto líquidos
como sólidos, los más efectivos fueron los sólidos, en particular
bentonita y la vermiculita aplicada superficialmente,
fundamentalmente debido a la capacidad de estos de protección de los
microorganismos inoculados en el sustrato. Estos tratamientos,
además de tener un efecto biocontrol tienen un efecto
bioestimulante y biofertilizante sobre las plantas no infectadas por
F. oxysporum.
Tras la selección de la cepa y el soporte a
utilizar: bentonita, se procedió a incorporar otros factores al
producto objeto de la invención que permitiesen aumentar la
capacidad de supervivencia de T. harzianum y su efecto
antagonista frente a microorganismos patógenos, especialmente frente
a F. oxysporum. Para ello se corrigió el pH de la bentonita
mediante la adición de carbonato cálcico natural que eleva el pH
consiguiendo un pH más adecuado para el desarrollo de la cepa de
T. harzianum T78.
Otro factor que mejora la actividad biocontrol
del producto objeto de la invención es el quitosano, que induce una
respuesta inmediata por parte de T. harzianum, debido al
aumento en la producción de enzimas tipo quitinasa, enzima
responsable de la degradación de la pared celular del patógeno. La
incorporación de quitosano durante el proceso de inmovilización de
la cepa T78 en bentonita, evita el que éste pueda ser utilizado por
el microorganismo patógeno, como ocurre en los casos en que se
utiliza directamente, puesto que cuando el producto final vaya a ser
inoculado, el quitosano habrá sido ya utilizado por T.
harzianum. De este modo se consigue que cuando T.
harzianum sea inoculado este pueda presentar un
"micro-nicho" ecológico tanto por las
condiciones de pH y la presencia de compuestos orgánicos capaces de
ser utilizados, como por la protección física por la arcilla, que
mejorarán su supervivencia y aseguraran la acción para la que se ha
inoculado.
Una vez establecido el producto prototipo se
procedió a validar el mismo a escala comercial para lo cual se
estableció el volumen mínimo necesario, se optimizó la dosificación
del mismo en la turba y las condiciones de aplicación.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención
pero no deben considerarse en sentido limitativo de la misma.
Los experimentos se llevaron a cabo en unos
semilleros comerciales, aplicando las condiciones habituales de
germinación y crecimiento utilizadas para el cultivo de melón.
Para seleccionar la cepa de Trichoderma
más adecuada se aislaron cepas de diferentes fuentes: turbas,
compost, suelos agrícolas y forestales. También se estudiaron
algunas cepas aisladas previamente por el grupo de Investigación.
Se ensayaron un total de 11 cepas, designadas T010, T1, T3, T10,
T75, T76, T78, T82, T85, T86 y T190. Así como un producto
comercial que contenía Trichoderma sp., designado T
comercial. En el etiquetado del producto se indicaba su
composición y se recomendaba su aplicación para el control
preventivo de la fusariosis de melón, entre otros.
Se evaluó la capacidad fungicida de las cepas
frente a F. oxysporum para lo que se utilizó un aislado de
F. oxysporum f. sp. Melonis raza 1,2 (De Cara et
al., 2004) obtenido de plantones diversos capaces de manifestar
la fusariosis de melón, se eligió la que presentaba una virulencia
alta-muy alta, con el fin de que la manifestación
de la enfermedad no fuese factor limitante en la experimentación,
esta cepa fue la que se utilizó en los siguientes ejemplos. La
evaluación se realizó mediante cultivo dual, que permite determinar
las habilidades de las distintas cepas de Trichoderma sp. a
la hora de inhibir el crecimiento de F. oxysporum. El ensayo
de cultivo dual consiste en enfrentamientos equidistantes de cuatro
centímetros de las cepas aisladas frente a Fusarium
oxysporum, en placa petri en medio de cultivo PDA,
cuantificando el crecimiento de este último con cada una de las
cepas (Bell et al., 1982).
Los resultados obtenidos se recogen en la Tabla
1 y en la Figura 1. Las cepas que presentaron mayor capacidad
biofungicida fueron las cepas T1 y T78 (Figura 1).
A continuación se evaluó la capacidad de
crecimiento y supervivencia en turba de las cepas, para determinar
cuales eran capaces de crecer en turba y cual de ellas lo haría con
mayor rapidez y eficacia. Para ello se prepararon varios
recipientes con turba y se inocularon con las distintas cepas,
pasados 48 días, que es el tiempo de permanencia de las plantas de
melón en semillero, desde su germinación hasta su disposición en el
campo, se procedió a realizar el recuento de los microorganismos
presentes en la turba. Los resultados mostraron que la cepa T78
presenta mayor capacidad de crecimiento en turba, mientras que las
cepas T1 y T comercial presentan la menor capacidad de crecer en
este sustrato (Figura 2). La cepa T1, a pesar de presentar una gran
capacidad biofungicida, mostró una muy baja capacidad de crecimiento
en turba; por este motivo fue descartada y se optó por la cepa T78
que presentó la mayor capacidad de inhibir a F. oxysporum y
la mayor capacidad de crecer sobre turba.
El DNA de esta cepa fue extraído y secuenciado
determinando que la cepa elegida, por homología de secuencia,
pertenecía a la especie de T. harzianum, presentando algunas
variaciones respecto a las incluidas en las bases de datos
genómicas, motivo suficiente para su registro en la Colección
española de cultivos tipo bajo el Nº de registro 20714.
Para completar la selección de la cepa de T.
harzianum se determinó su estado y su actividad mediante la
medida de la respiración en el medio inoculado como respuesta a la
actividad del inóculo. Para ello se prepararon recipientes con
turba estéril al 60% de su capacidad de retención hídrica,
adicionando una suspensión de esporas de la cepa T78 equivalente a
10^{7} ufc por gramo de turba, se incubaron a 28ºC, y se
determinó la cantidad de CO_{2} desprendido de forma periódica
durante 25 días, el desprendimiento de CO_{2} es una medida de
actividad biológica del microorganismo inoculado (Pascual et
al., 2002). Estos análisis mostraron que la cepa T78 era capaz
de germinar y desarrollarse en la turba, con alto nivel de
adaptación a ésta, pues después de un corto periodo de tiempo (7
días), presentó el máximo de respiración, disminuyendo su actividad
con el tiempo debido a la consumición de los nutrientes, llegando a
un equilibrio en el resto del tiempo de incubación (Figura 2
(B).
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez seleccionada la cepa de T.
harzianum, se procedió a estudiar la forma de inoculación que
resultara más adecuada para facilitar su incorporación a la turba,
que permitiera dotar a las plantas de una protección suficiente
frente a los fitopatógenos. La suspensión de esporas se preparó
mediante cultivo de la cepa en placa petri con PDA durante 7 días,
tras lo cual se recogieron las esporas de la superficie de las
placas con agua destilada, realizando un recuento de esporas
totales mediante hematocitómetro en cámara Neubauer, este recuento
resultó entorno a 10^{8}-10^{9} ufc de la cepa
T78 por mililitro. A continuación, estas esporas se inmovilizaron
utilizando dos tipos de soportes de inoculación:
1) Soportes Líquidos: se utilizó una solución de
T harzianum T78 tal cual, obtenida a partir de cultivo en
placa petri y soluciones de esporas disueltas o bien en goma arábiga
y o en carboximetilcelulosa (CMC), al 2%, con el fin de conferir
efecto impregnante a la solución de T. harzianum. La goma
arábiga y la CMC se inocularon directamente en la semilla, dada su
capacidad de fijación, al actuar como sustancias cementantes,
mientras que la suspensión de esporas se inoculó en la turba en el
momento anterior a la preparación de las bandejas de poliestireno
para la germinación y crecimiento de las plántulas de melón. Una
vez inoculadas las semillas y secadas durante 7 días para
estabilizar el inoculo, se cuantificó el número de unidades
formadoras de colonias de la cepa T78, mediante
PDA-rosa bengala por semilla, que resultó de
10^{4} ufc de la cepa T78, y que coincide con el grado de
inoculación de cada uno de los pocillos de las bandejas de
poliestireno. Para el caso de la inoculación líquida directa de la
suspensión de esporas en la turba, se calculó la cantidad de
inóculo necesario para que la cantidad final por gramo de turba
estuviese en el rango de 10^{6}-10^{7} ufc de la
cepa T78.
2) Soportes Sólidos: bentonita natural,
vermiculita y el salvado de trigo sobre 1 los que se embebió la
suspensión de esporas de la cepa de T. harzianum T78,
obtenidas siguiendo el método anteriormente propuesto. Para la
preparación de estos soportes se les incorporó una suspensión de
esporas de la cepa de T. harzianum T78, de forma que el
contenido final de esporas por gramo de soporte sólido fuese igual.
Una vez estabilizados en los substratos sólidos, cuya duración
aproximada es de 10-15 días, y cuantificado el
número de ufc por gramo de substrato mediante
PDA-rosa bengala, los inóculos se mezclaron con la
turba para que la cantidad de inóculo estuviese en el rango de
10^{6}-10^{7} ufc de la cepa T78 por gramo de
turba.
También se utilizó vermiculita inoculada
superficialmente, es decir vermiculita previamente inoculada con la
suspensión de esporas que se incorporó en la parte superior de la
bandeja y una suspensión de esporas pulverizada durante el
cultivo.
El experimento constó de 8 tratamientos y 2
controles, cada uno con cinco réplicas, sobre bandejas de
poliestireno utilizada en la germinación y crecimiento de plántulas
en semillero, cada una de ellas con 150 plántulas de melón. Durante
los ensayos preliminares se utilizó la variedad de melón tendral,
por su elevada susceptibilidad a F oxysporum. Una vez
desarrollado el protocolo del prototipo, este fue testado sobre
otras variedades comerciales para lo que se eligieron aquellas más
utilizadas y sensibles al ataque del patógeno según el Vademécum de
semillas hortícolas (Portagrano 2003-2004). Los
distintos tratamientos se sometieron a las condiciones habituales de
semillero, con la única diferencia del soporte seleccionado para la
inoculación de la cepa de T. harzianum T78. Con el fin de
poder evaluar el efecto biocontrol, se duplicó el experimento,
infectando una mitad con la misma cepa que en el ejemplo 1 y la
otra se mantuvo sin infectar para poder detectar el efecto de los
soportes líquidos o sólidos aplicados en el desarrollo de la planta
de melón sin presión de patógeno introducido.
El inóculo de la cepa T. harzianum T78
fue de 10^{6}-10^{7} ufc por gramo de turba en
todos los tratamientos. Estas concentraciones son las más
ampliamente utilizadas en la bibliografía (Batta, 2004). La única
excepción fueron los tratamientos con soportes 1, 2 y 3 (solución
de esporas líquida, CMC y Goma Arábiga) debido a su peculiaridad de
inoculación, por adhesión a las semillas de melón, por lo que no
fue posible alcanzar estos niveles, alcanzando 10^{4} ufc por
gramo de turba. En todos los casos una vez preparados los inóculos
se procedió a su recuento en PDA-rosa bengala,
comprobando que el nivel de ufc era el adecuado para que al inocular
sobre la turba estuviese en el rango establecido.
Una vez preparados los diferentes soportes
inoculados con T. harzianum se mezclaron con turba. Cada
tratamiento se colocó en bandejas de poliestireno de 150 pocillos
cada una y seguidamente fueron sembradas con semillas de melón,
recubiertas con vermiculita y humedecidas. Las bandejas sembradas se
colocaron en cámara de germinación comercial acondicionada para la
germinación del melón, a una temperatura de 25ºC y humedad del 75%,
pasados dos días se sacaron de la cámara de germinación y se
extendieron en el semillero.
A los 15 días de haber sacado las bandejas de la
cámara de germinación, y coincidiendo con la aparición de la
segunda hoja verdadera de la plántula de melón, las bandejas
seleccionadas para el tratamiento con el fitopatógeno (tratamientos
C) se inocularon con una suspensión de esporas de F.
oxysporum para que la cantidad en cada uno de los pocillos,
estuviese entorno a 10^{4} ufc por gramo de turba (dosis de
infección habitual en semillero). Sobre el material orgánico (turba)
se realizaron un total de cuatro muestreos periódicos para conocer
la evolución de las poblaciones de los microorganismos inoculados:
cepa T. harzianum T78 y F. oxysporum. Las muestras se
sometieron a análisis microbiológicos mediante el medio selectivo
correspondiente (Papavizas et al., 1982 y Komada, 1975,
respectivamente). Sobre el material vegetal recolectado se analizó
el tamaño de las hojas, la longitud y el peso del tallo. También se
evaluó el porcentaje de infección de las plántulas de melón
mediante siembra de una porción de tallo de melón, con una longitud
de 1 cm previamente esterilizada, sobre un medio general de hongos
(PDA), tomándose como tallos positivos aquellos que tras cinco días
de incubación presentaran crecimiento de F. oxysporum a su
alrededor.
Los tratamientos en los que se produjo una mayor
reducción de la población de F. oxysporum, fueron los
tratamientos en los que el soporte lo constituía bentonita
(tratamiento 4) y vermiculita aplicada superficialmente para
recubrir los pocillos de las bandejas de siembra (tratamiento 7),
ambos inoculados con la cepa T78 (Figuras 3, 4 y 5). La reducción
en la población de F. oxysporum fue progresiva en el tiempo,
si bien el que presentó una mayor rapidez en la disminución de las
mismas en la turba fue el tratamiento con bentonita, posiblemente
debido a su capacidad de adherencia a las raíces, permitiendo así
una mayor protección sobre el sistema radicular de la planta.
En cuanto a la evolución de la cepa de T.
harzianum T78, los tratamientos con bentonita (tratamiento 4) y
vermiculita superficial (tratamiento 7) presentaron el número más
elevado de ufc, destacando de forma significativa el tratamiento 4
que mostró un mayor número de ufc de la cepa T. harzianum T78
al final del estudio (Figura 4). A lo largo del tiempo la cepa T.
harzianum T78 mostró una disminución del 50% en los
tratamientos 1 (inoculación esporular), 4 (bentonita) y 7
(vermiculita superficial); si bien el tratamiento 1, a pesar de
mostrar un comportamiento similar en cuanto a la supervivencia de
la cepa T. harzianum T78, su efecto sobre Fusarium
oxysporum fue menor que en los tratamientos 4 y 7, lo que indica
que las esporas no han germinado y por tanto no han podido
desarrollar la actividad antagónica frente a F. oxysporum.
Lo que pone de manifiesto la importancia del soporte y del nivel de
inoculo presente en el efecto sobre F. oxysporum. En el resto
de tratamientos, la cantidad de inoculo existente, tan solo después
de dos días, era del 1% del valor inoculado. Los tratamientos en
los que la cepa de T. harzianum T78 se embebió en la
semilla, a pesar de que el descenso observado fue menos
pronunciado, dado que no fue posible alcanzar un nivel de inoculo
elevado, éste no fue suficiente para el control de F.
oxysporum (Fig. 3, 4 y 5). Con el paso del tiempo, se observa
que las poblaciones de la cepa de T. harzianum T78 capaces
de sobrevivir los primeros dos días después de la inoculación
muestran una mayor capacidad de adaptación, puesto que el descenso
observado es menos pronunciado en los distintos tratamientos,
destacando la capacidad de supervivencia de la cepa T.
harzianum T78 inmovilizada con bentonita que no presenta
disminución alguna. También es de destacar como la inoculación en
forma esporular (tratamiento 1), que en los primeros 15 días se
mantenía en niveles similares a los tratamientos 4 y 7, presentó
una evolución descendente a partir de los 37 días (Fig. 4), lo que
vuelve a poner de manifiesto la necesidad de un soporte sólido que
permita al microorganismo mantenerse y evitar las pérdidas por
lavado durante el riego diario que se aplica a los semilleros. Esto
explica que a los 15 días las ufc de F. oxysporum eran
mayores en la turba tratada con este último tratamiento que en la
tratada con los tratamientos 4 y 7, debido a que posiblemente T.
harzianum estaba latente en forma de espora, sin posibilidad de
germinar y por tanto sin capacidad de controlar al patógeno.
Del conjunto de plantas que no mostraban
síntomas aparentes de afección por F. oxysporum, se tomaron
20 en cada uno de los puntos de muestreo (a los 15, 33 y 48 días)
para evaluar el porcentaje de infección de las plantas que iban a
ser transplantadas y el potencial riesgo de movimiento de patógeno
de semillero a campo (Figura 5A). De nuevo, los tratamientos con
menor porcentaje de infección fueron aquellos en los que el soporte
del inóculo lo constituían bentonita, si bien el porcentaje de
infección mostró un aumento considerable en el transcurso de la
última fase del cultivo, lo que sugiere la necesidad de complementar
la cepa de T. harzianum T78 de alguna forma con el fin de
que el control de la infección pueda mantenerse durante todo el
tiempo de cultivo en semillero, evitando así la salida de plantas
del mismo que, sin presentar síntomas aparentes, sean portadoras
del patógeno.
Tras los 48 días de la periodo habitual de
cultivo de las plántulas de melón en semillero, se pesaron 20
plantas de cada uno de los tratamientos, observando que el
desarrollo de las plantas a las que se les había aplicado la cepa
T. harzianum T78, bajo presión de F. oxysporum fue
mayor en los tratamientos con bentonita y vermiculita superficial,
mientras que el resto presentó un peso similar al control,
mostrando todos ellos síntomas de afección además de clorosis, y
manchas necróticas en las hojas (Figuras 5B).
Las plantas tratadas con la cepa T.
harzianum T78, sin presión adicional de patógeno, en general,
presentaron un mayor peso y por tanto mayor desarrollo que las
plantas sin inocular, de nuevo los tratamientos 1, 4 y 7 fueron los
que mostraron los mejores resultados, lo que demuestra que el
inóculo además de tener un efecto biocontrol, también presenta
efectos biofertilizantes y/o bioestimulantes a tener en cuenta.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez seleccionada la bentonita como soporte
óptimo para la inoculación de la cepa de T. harzianum T78, se
procedió a mejorar su capacidad biocontrol mediante la incorporación
de carbonato cálcico (CO_{3}Ca) y quitosano de bajo grado de
acetilación, incubando la cepa de T. harzianum T78 en estas
condiciones a 25-28ºC durante 5 días, previo a la
preparación del producto, al igual que se ha descrito anteriormente.
Con este tratamiento se potencia por un lado el crecimiento de la
cepa de T. harzianum T78, al conseguir un pH próximo a 7, su
óptimo de crecimiento, mediante adicción de CO_{3}Ca al 5% y por
otro la inducción de la producción de quitinasas por T.
harzianum, con la presencia de quitosano. Las quitinasas son
enzimas responsables de la degradación de quitina presente en la
pared celular de algunos microorganismos patógenos como F.
oxysporum, parte de estas enzimas quedarían inmovilizadas en la
bentonita, junto a las estructuras reproductivas y miceliares de
T. harzianum de forma que cuando se produjera una infección
por patógenos, la actividad quitinasa generada previamente ayudaría
a su control.
Para ello, en primer lugar se calculó la
cantidad de CO_{3}Ca necesario para subir el pH hasta 7,
incorporando distintas cantidades desde 1 a 20 gramos por cada 100
gramos de bentonita (Tabla 3). Se evaluó su incidencia sobre el
aumento en la población de la cepa de T. harzianum T78, en
turba en condiciones de semillero. También se evaluó su efecto
sobre la germinación y crecimiento de plántulas de melón ya que
puede estar afectado por el aumento de la conductividad eléctrica
con el CO_{3}Ca. El valor óptimo encontrado fue de 5 gramos de
CO_{3}Ca por cada 100 gramos de bentonita, puesto que a partir de
este valor se observó una disminución del desarrollo vegetal. La
incidencia de CO_{3}Ca sobre la cepa de T. harzianum T78
fue positiva, produciendo un aumento superior a un orden de
magnitud (Tabla 3).
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La cantidad de quitosano se determinó añadiendo
distintas cantidades desde 1 a 20 gramos por cada 100 gramos de
bentonita (Tabla 4), la mezcla se preinoculó con la cepa de T.
harzianum T78, como en los experimentos anteriores, con la
salvedad de que se incubó a 25-28ºC durante 5 días
para permitir el desarrollo de T. harzianum en el soporte
junto con el quitosano. Posteriormente se realizó un ensayo en
turba, inoculando las distintas mezclas, evaluando su incidencia
sobre el aumento en la población de la cepa de T. harzianum
T78 y su efecto sobre la germinación y crecimiento de plántulas de
melón. La cantidad máxima de quitosano a inocular sin producir
incidencia negativa sobre la planta fue de 5 gramos por 100 gramos
de bentonita. La incorporación de quitosano produjo un aumento
considerable de crecimiento de la cepa de T. harzianum T78
(Tabla 4).
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez establecidos los valores máximos de
CO_{3}Ca (5 gramos) y quitosano (5 gramos) se procedió a
ensayarlos de forma conjunta bajo presión de F. oxysporum,
siguiendo el modelo de trabajo ya descrito anteriormente: una vez
preparado el inoculo en bentonita, CO_{3}Ca y quitosano, se mezcló
con turba, se rellenaron bandejas de poliestireno de 150 pocillos y
se sembraron las semillas de melón. En este caso además de utilizar
la variedad tendral de melón se utilizaron otras variedades
comerciales que se caracterizan por ser mas susceptibles al ataque
de F. oxysporum. Una vez sembradas, las bandejas se
colocaron en cámara de germinación acondicionada y pasados dos días
se sacaron de la cámara de germinación y llevaron al semillero
donde se extendieron. A los 15 días de haber sacado las bandejas de
la cámara de germinación, y coincidiendo con la aparición de la
segunda hoja verdadera de la plántula de melón, las bandejas
seleccionadas para el tratamiento con el fitopatógeno se inocularon
con una suspensión de esporas de F. oxysporum para que la
cantidad en cada uno de los pocillos fuese de
10^{3}-10^{4} ufc por gramo de turba (dosis de
infección habitual en semillero). Sobre el material orgánico
(turba) se realizó un análisis final para conocer la evolución de
las poblaciones de los microorganismos inoculados: cepa T.
harzianum T78 y F. oxysporum (Papavizas et al.,
1982 y Komada, 1975, respectivamente). Sobre el material vegetal
recolectado se analizaron el tamaño de las hojas, la longitud y el
peso del tallo. También se evaluó el porcentaje de infección de las
plántulas de melón mediante siembra de una porción de tallo de
melón, con una longitud de 1 cm previamente esterilizada sobre un
medio general de hongos (PDA), tomándose como tallos positivos
aquellos que tras cinco días de incubación presentaran crecimiento
de F. oxysporum a su alrededor. Los resultados obtenidos
mediante la inoculación de la cepa de T. harzianum T78 en
bentonita con CO_{3}Ca y quitosano todo ello incubado previamente
a la aplicación, demostraron un aumento en el peso seco de las
plantas de melón al final del experimento en comparación con la
turba, significativamente mayor al obtenido con la inoculación de
la cepa de T. harzianum T78 con bentonita únicamente (Figura
6(A)). El porcentaje de tallos infectados en la turba tratada
con la cepa de T. harzianum T78 en bentonita previamente
incubada con carbonato cálcico y quitosano mostró un considerable
descenso (20%) en comparación con la tratada con la cepa de T.
harzianum T78 en bentonita únicamente (50%) (Figura
6(B)), lo que pone de manifiesto la mejora en la capacidad de
controlar el ataque de F. oxysporum. La adición de quitosano
y CO_{3}Ca a la bentonita muestra una mejora en la población de
T. harzianum T78, que está íntimamente relacionada con la
disminución de las poblaciones de F. oxysporum en dos
ordenes de magnitud de lo conseguido con bentonita únicamente
(Figura 7 (A) y (C). Es de destacar que el aumento de la cepa de
T. harzianum T78 no es tan destacado, como la disminución de
F. oxysporum lo que pone de relieve de nuevo la importancia
de la combinación propuesta, que mantiene la actividad frente a
F. oxysporum de forma mas efectiva, debido a la capacidad de
mantener en su estructura las quitinasas producidas durante la
incubación de T. harzianum con la mezcla de bentonita,
CO_{3}Ca y quitosano.
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Una vez establecido el producto prototipo se
procedió a validar el mismo a escala comercial para lo cual se
estableció el volumen mínimo necesario, se optimizó la dosificación
del mismo en la turba y las condiciones de aplicación.
Para ello se partió de un volumen equivalente a
500 kg de bentonita comercial, 50 litros de suspensión de esporas
de T harzianum T78 (3 10^{9} ufc/ml), 25 kg de CO_{3}Ca
y 25 kg de quitosano. Se mezclaron en seco los 500 kg de bentonita
con los 25 kg de CO_{3}Ca y 25 kg de quitosano, y una vez
homogenizada la mezcla, se procedió a incorporar los 50 litros de la
suspensión de esporas. Con el fin de incorporarla de forma
homogénea, esta solución de esporas se disolvió en agua destilada
en una proporción 1:10, de forma que la mezcla final tuviera la
suficiente humedad para permitir una buena homogenización, y
estuviera suficientemente hidratada para permitir el desarrollo y
crecimiento de las esporas incorporadas durante los 5 días de
incubación a 25-28ºC. Después de la incubación, el
producto obtenido, tenía una concentración de Trichoderma
harzianum T78 de 1,3 10^{8} ufc por gramo de bentonita, se
dejó secar hasta un 10-15% de humedad con el fin de
poder triturar el producto y embasarlo, para su posterior
incorporación en la turba, obteniendo una concentración de
Trichoderma harzianum T78 de 0,3 10^{8} ufc por gramo de
bentonita.
El inoculo obtenido se utilizó en la turba en la
proporción del 10% con el fin de obtener en el substrato T78 de
10^{7} ufc de Trichoderma harzianum T78 por gramo de
turba. Para ello se realizó una mezcla del inoculo
(bentonita+CO_{3}Ca +quitosano+Trichoderma) en la turba
mediante el uso de una mezcladora característica de semillero,
durante al menos 15 minutos para asegurar la distribución homogénea
del inóculo en la turba. A partir de este momento, el tratamiento
del substrato inoculado fue el realizado de forma rutinaria y
automatizada de un semillero comercial: llenado de bandejas de
poliestireno de forma automática con el substrato, siguiendo de la
siembra de las semillas de melón, humectación, incubación en cámara
oscura y extensión de bandejas en el semillero. Las variedades de
melón ensayadas fueron la utilizada en el experimento (Tendral),
así como variedades híbridas susceptibles al ataque de Fusarium
oxysporum (Giotto (Ramiro Arnedo)), (Doral y Cyrano
(Séminis)).
El volumen total de bandejas ensayadas fue de
1000, cada una de ellas con 150 alvéolos, donde 500 bandejas se
llenaron con la mezcla turba- producto inoculado y la otra mitad con
la misma turba sin el producto, realizándose a esta última los
tratamientos fitosanitarios característicos con fungicidas
específicos frente a la fusariosis.
En este experimento, se buscaron las condiciones
más propicias para el desarrollo de la fusariosis vascular en melón
a nivel de semillero, si bien por el volumen del experimento y la
necesidad de estudiar la eficacia del producto en condiciones de
semillero reales, no se infectaron con el patógeno. Los resultados
obtenidos (Tabla 5) demostraron la eficacia de la inoculación en
cuanto al porcentaje de infección con patógeno, ufc de Fusarium
oxysporum en el substrato, además de demostrar un mayor
crecimiento de las plantas no afectadas, debido al efecto
bioestimulante y biofertilizante de la cepa de Trichoderma
utilizada. Todo ello, viene a demostrar que el uso de este inoculo
no solo beneficia en cuanto al control de la fusariosis de melón
sino también a un menor tiempo de estancia de la plántula de melón
en semillero, con el consiguiente ahorro económico.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (24)
1. Producto sólido eficaz para el control
biológico de la fusariosis vascular de melón caracterizado
porque comprende los siguientes componentes:
- (i)
- Un microorganismo antagonista de F. oxysporum con capacidad biocontrol sobre éste.
- (ii)
- Un soporte sólido para la inoculación del microorganismo antagonista.
- (iii)
- Factores adicionales que mejorar la capacidad biocontrol del producto.
2. Producto sólido eficaz para el control
biológico de la fusariosis vascular de melón según reivindicación 1
caracterizado porque como dicho microorganismo antagonista
(i) se utiliza una especie del género Trichoderma con
capacidad biocontrol sobre F. oxysporum.
3. Producto sólido eficaz para el control
biológico de la fusariosis vascular de melón según reivindicación
anterior caracterizado porque dicho microorganismo
antagonista (i) es una cepa de T. harzianum aislada de
turbas, compost verdes o suelos.
4. Producto sólido eficaz para el control
biológico de la fusariosis vascular de melón según reivindicación
anterior caracterizado porque como dicho microorganismo
antagonista (i) se utiliza la cepa T-78 de T.
harzianum Nº CECT 20714.
5. Producto sólido eficaz para el control
biológico de la fusariosis vascular de melón según reivindicación
anterior caracterizado porque dicha cepa de T.
harzianum CECT 20714 se inocula para que resulte una
concentración final de 10^{6}-10^{7} ufc por
gramo de turba.
6. Producto sólido eficaz para el control
biológico de la fusariosis vascular de melón según reivindicación 1
caracterizado porque como dicho soporte sólido (ii) para la
inoculación del microorganismo se usa cualquiera de los
comprendidos entre diversos tipos de arcillas naturales como la
bentonita, vermiculita bien mezclada o inoculada superficialmente o
el salvado de trigo.
7. Producto sólido eficaz para el control
biológico de la fusariosis vascular de melón según reivindicación
anterior caracterizado porque como dicho soporte sólido (ii)
para la inoculación del microorganismo se utiliza bentonita.
8. Producto sólido eficaz para el control
biológico de la fusariosis vascular de melón según reivindicación 1
caracterizado porque como dichos factores adicionales (iii)
para mejorar la capacidad biocontrol del producto se utilizan
correctores de pH, para obtener un pH final en el producto próximo
a 7, entre 6 y 8.
9. Producto sólido eficaz para el control
biológico de la fusariosis vascular de melón según reivindicación
anterior caracterizado porque como dicho factor (iii)
corrector de pH se utiliza CO_{3}Ca.
10. Producto sólido eficaz para el control
biológico de la fusariosis vascular de melón según reivindicación
anterior caracterizado porque como dicho corrector de pH
(iii) se utiliza CO_{3}Ca a una concentración entre 1 y 20 gramos
por 100 g de bentonita.
11. Producto sólido eficaz para el control
biológico de la fusariosis vascular de melón según reivindicación
anterior caracterizado porque como dicho corrector de pH
(iii) se utiliza CO_{3}Ca a una concentración de 5 gramos por 100
g de bentonita.
12. Producto sólido eficaz para el control
biológico de la fusariosis vascular de melón según reivindicación 1
caracterizado porque como dichos factores adicionales (iii)
para mejorar la capacidad biocontrol del producto se utilizan
inductores de la biosíntesis de quitinasas.
13. Producto sólido eficaz para el control
biológico de la fusariosis vascular de melón según reivindicación
anterior caracterizado porque como dicho factor (iii)
inductor de la síntesis de quitinasas se utiliza quitosano.
14. Producto sólido eficaz para el control
biológico de la fusariosis vascular de melón según reivindicación
anterior caracterizado porque como dicho factor inductor de
síntesis de quitinasas (iii) se utiliza quitosano a una
concentración entre 1 y 20 g por 100 g de bentonita.
15. Producto sólido eficaz para el control
biológico de la fusariosis vascular de melón según reivindicación
anterior caracterizado porque como dicho factor inductor de
síntesis de quitinasas (iii) se utiliza quitosano a una
concentración de 5 g por 100 gramos de bentonita.
\newpage
16. Producto sólido eficaz para el control
biológico de la fusariosis vascular de melón según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 15 caracterizado porque sus
componentes una vez mezclados, se incuban a temperaturas entre
20-30ºC por un tiempo entre 1 y 10 días.
17. Producto sólido eficaz para el control
biológico de la fusariosis vascular de melón según reivindicación
anterior caracterizado porque dicha incubación se realiza a
una temperatura entre 25-28ºC durante 5 días.
18. Procedimiento para la obtención de un
producto sólido eficaz para el control biológico de la fusariosis
vascular de melón según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17
caracterizado porque comprende la preparación de un soporte
sólido como bentonita que contiene 5 g de CO_{3}Ca y 5g de
quitosano/100 g de bentonita, mezclado y homogeneizado en seco,
inoculado con 1 ml de un cultivo biológicamente puro de T.
harzianum T-78 CECT 20714 a una concentración
en torno a 10^{9} ufc/ml, todo ello mezclado y preincubado
durante 5 días a 25-28ºC.
19. Método de aplicación de un producto sólido
eficaz para el control biológico de la fusariosis vascular según
reivindicación 18, caracterizado porque se mezcla con la
turba al 10% mediante el uso de una mezcladora estándar de las
utilizadas en los semilleros comerciales.
20. Procedimiento para inducir resistencia
sistémica a enfermedades causadas por organismos fitopatógenos que
comprende aplicar una cantidad eficaz del producto obtenido según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o por el procedimiento
según reivindicación 18 sobre el suelo o la planta a la que se
desea inducir resistencia sistémica a enfermedades.
21. Procedimiento para estimular el crecimiento
de plantas que comprende aplicar una cantidad eficaz del producto
obtenido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o por el
procedimiento según reivindicación 18 sobre suelo o planta cuyo
crecimiento se desea estimular.
22. Utilización de un producto sólido eficaz
para el control de la fusariosis vascular de melón según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 17 o por el procedimiento según
reivindicación 18 para el control biológico de esta enfermedad en
semillero.
23. Utilización de un producto sólido eficaz
para el control de la fusariosis vascular de melón según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 17 o por el procedimiento según
reivindicación 18 para el control biológico de la fusariosis
vascular en campo de cultivo.
24. Uso de Trichoderma harzianum, cepa
T-78, CECT 20714. para el control biológico de la
fusariosis vascular.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| ES200603290A ES2311389B1 (es) | 2006-12-27 | 2006-12-27 | Producto solido eficaz para el control biologico de la fusariosis vascular del melon, su procedimiento de obtencion y metodo de aplicacion del mismo. |
| PCT/ES2007/070198 WO2008077982A1 (es) | 2006-12-27 | 2007-12-04 | Producto sólido eficaz para el control biológico de la fusariosis vascular del melón, su procedimiento de obtención y método de aplicación del mismo |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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- 2006-12-27 ES ES200603290A patent/ES2311389B1/es not_active Expired - Fee Related
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2311389B1 (es) | 2009-12-01 |
| WO2008077982A1 (es) | 2008-07-03 |
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