CN114774301A - 一株拮抗食用菌病原真菌的内生枯草芽孢杆菌jl-b16及其应用 - Google Patents

一株拮抗食用菌病原真菌的内生枯草芽孢杆菌jl-b16及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株拮抗食用菌病原真菌的内生枯草芽孢杆菌JL‑B16及其应用，属于微生物技术领域。该内生枯草芽孢杆菌JL‑B16的分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JL‑B16，已于2021年12月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24215。该菌株能有效地抑制食用菌病原菌生长及孢子萌发。该菌株的挥发性物质对病原菌生长具有强的抑制作用。该菌株在食用菌病原菌的的防治中有巨大应用价值。

Description

一株拮抗食用菌病原真菌的内生枯草芽孢杆菌JL-B16及其 应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株拮抗食用菌病原真菌的内生枯草芽孢杆菌JL-B16及其应用。
背景技术
食用菌（Edible fungi）是一种可供人类食用的大型真菌的统称，或是形成可食用子实体的大型真菌，俗称蘑菇。食用菌具有高蛋白、低脂肪，含人体所需多种氨基酸和微量元素，兼有荤食和素食的优势，同时在作为人类主粮、保健和药用方面前景广泛。
食用菌的栽培要求适宜的生长环境，在其所能适应的环境条件下才能正常生长发育。如果在食用菌生长发育过程中遭受到了其它生物的侵害或遇到不良环境条件，就会发生病害，其生长发育就会受到影响，发病较轻时影响食用菌的外观口感等，发病严重时则造成食用菌彻底死亡。从食用菌病理性危害发病的原因来看可分成两大类:侵染性病害和非侵染性病害。非侵染性病害是在其生长发育所需要的条件不适宜或生长过程中遭受有害物质影响，并无病原物的侵染，不会在食用菌之间相互传染更不会造成大片污染。对食用菌造成严重影响的是侵染性病害，即因为别的生物寄生或侵染而引发的病害。
在我国食用菌栽培过程中，由于病虫的危害导致减产10%-30%，严重的情况下甚至会颗粒无收。近年来研究发现有关食用菌侵染性真菌病害的病原物包括链孢霉（Fusarium）、疣孢霉(Mycogone)形成的病害表现常见的有蘑菇褐腐病、湿泡病、白腐病等；轮枝霉（Verticillium）形成的病害常见的有蘑菇褐斑病、蘑菇干泡病等；树枝状轮枝孢霉（Dactlium denoides）形成的病害常见的有蘑菇软腐病、蛛网病等。食用菌竞争性真菌病害的病原物包括有毛霉(Mucor)、青霉（Penicillium）、木霉（Trichoderma）、曲霉（Aspergillus）、根霉（Rhizopus）等。侵染性细菌病害的主要病原物包括有欧文氏菌（Erwinia）和假单胞杆菌（Pseudomonas），形成的病害常见的有蘑菇细菌性斑点病、蘑菇细菌凹点病、蘑菇干腐病等。
食用菌病害的防治是食用菌生产成败的关键，目前主要的防治方法有抗病菌株的筛选、化学防治、物理防治及生物防治。最常见的方法就是化学防治，但长时间使用单一的化学药剂会使病原菌的抗性增强，防治效果下降，而且药品的残留量大会对人的身体健康造成威胁，也会导致严重的环境污染。生物防治则具有许多优点，因此近些年来受到了世界各地的普遍重视。其中生物防治所用的微生物菌剂能够促进作物生长，增强抗病性，提高产量，改善品质，在许多农作物生产上已取得较好的应用效果。微生物菌剂具有无毒、安全、高效的特点，符合发展生态农业的方向。但微生物菌剂在食用菌栽培中的应用还很少，因此，针对食用菌病害开展生物防治，探索微生物菌剂在食用菌病害防治上的应用是确保食用菌产业良性、健康发展的重要方向之一，应加以大力鼓励与支持。
发明内容
本发明的目的在于针对食用菌生防菌稀缺的问题，而提供一株拮抗食用菌病原真菌的内生枯草芽孢杆菌JL-B16及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明首先提供了一株拮抗食用菌病原真菌的内生枯草芽孢杆菌JL-B16，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JL-B16，已于 2021年12月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24215，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
上述内生枯草芽孢杆JL-B16的菌落特征及菌体形态为：
将JL-B16在NA平板培养基上培养24h后形成的菌落为黄色，无光泽，菌落呈圆形、边缘不整齐，菌落直径4-5mm；菌体杆状，革兰氏染色阳性，有芽孢，无荚膜。
上述内生枯草芽孢杆JL-B16的生理生化特征为：
JL-B16 接触酶反应呈阴性，V．P测定呈阳性，甲基红测定呈阴性，葡萄糖产酸试验阴性，葡萄糖产气试验阴性，柠檬酸盐试验阴性，硝酸盐还原反应呈阳性，淀粉水解呈阴性，需氧性测定呈阳性，吲哚试验呈阴性，丙二酸呈阴性，产H2S试验呈阳性。
将上述内生枯草芽孢杆JL-B16的16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明: JL-B16与Bacillus subtilis 同处于一个分支上，其16S rDNA序列与Bacillus subtilis（AP012495）的相似度达99%。结合菌落形态，生理生化特征和16S rDNA序列分析，最终将JL-B16鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
上述内生枯草芽孢杆菌JL-B16对食用菌病原菌具有强的拮抗效果，能有效地抑制食用菌病原菌菌丝生长及孢子萌发，内生枯草芽孢杆菌挥发性物质对病原菌菌丝生长具有较强的抑制作用。
本发明还提供了一种含上述内生枯草芽孢杆菌JL-B16的生物制剂。
本发明还提供了一种含上述内生枯草芽孢杆菌JL-B16的发酵过滤液的生物制剂，其制备方法为：取内生枯草芽孢杆菌JL-B16，用无菌接种环挑取单菌落，接种于装液量为100 mL的LB液体培养基的250 mL三角瓶中，在28 ℃，180r/min的条件下培养3d，4℃，10000r/min离心15 min得上清液，经 0.22 μm 微孔滤膜过滤后，制得所述发酵过滤液。
本发明还提供了一种含上述内生枯草芽孢杆菌JL-B16的发酵灭菌液的生物制剂，其制备方法为：取内生枯草芽孢杆JL-B16，用无菌接种环挑取单菌落，接种于装液量为100mL的LB液体培养基的250 mL三角瓶中，在28 ℃，180r/min的条件下培养3d，菌液放入高压灭菌锅，121℃条件下灭菌30min，制得所述发酵灭菌液。
本发明还提供了上述生物制剂在食用菌病原菌防治中的应用。
本发明的有益效果：
本发明的内生枯草芽孢杆菌JL-B16能够有效地抑制食用菌病原菌菌丝生长及孢子萌发，内生枯草芽孢杆菌挥发性物质对病原菌菌丝生长具有较强的抑制作用。20%的内生枯草芽孢杆菌过滤液对疣孢病菌的抑制率达到64.68%，对油疤病菌的抑制率为60.47%，对蛛网病菌的抑制率为71.75%。浓度为40%内生枯草芽孢杆菌过滤液对病原菌孢子萌发抑制率在97%以上。内生枯草芽孢杆菌挥发性物质对病原菌菌丝生长表现出较强的抑制作用。因此，本发明为将来开发食用菌病害生物防治的微生物菌剂提供了良好的菌株资源。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
一株内生枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JL-B16，已于 2021年12月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24215，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例1 内生枯草芽孢杆菌JL-B16的筛选
（1）筛选过程：
通过梯度稀释法，从福建省武夷山市、长汀县、将乐县毛竹中心产区I度毛竹中分离出82株分离物。通过三区划线法对分离到的内生细菌进行纯化，并通过镜检判断菌株是否纯化，对纯化后的细菌进行编号，挑取单菌落，转移到NA斜面上保存备用。通过平板对峙法对6种食用菌病原菌（油疤病菌（Scytalidium lignicola）、蛛网病菌（Cladobotryum semicirculare）、粘菌病菌（Comatrichapulchell(C.Bab)Rost sp.）、绿色木霉（Trichoderma pleuroticola）、青霉（Penicillium cyclopium）、黄色霉菌（Disporotrichum dimorphosporum））进行对峙培养，初步筛选对食用菌病原菌具有拮抗作用的内生细菌。并通过平板对峙法、滤纸片法、牛津杯法等不同处理方法对食用菌病原菌的拮抗效果进行复筛。最终筛选出一株具有良好拮抗效果的内生细菌，标记为JL-B16。
（2）菌落特征及菌落形态：
将JL-B16在NA平板培养基上培养24h后形成的菌落为黄色，无光泽，菌落呈圆形、边缘不整齐，菌落直径4-5mm。菌体杆状，革兰氏染色阳性，有芽孢，无荚膜。
（3）生理生化特征：
JL-B16 接触酶反应呈阴性，V．P测定呈阳性，甲基红测定呈阴性，葡萄糖产酸试验阴性，葡萄糖产气试验阴性，柠檬酸盐试验阴性，硝酸盐还原反应呈阳性，淀粉水解呈阴性，需氧性测定呈阳性，吲哚试验呈阴性，丙二酸呈阴性，产H2S试验呈阳性。
（4）16SrDNA测序
将JL-B16的16S rDNA序列（SEQ ID NO.1）与GenBank数据库中的序列比对，结果表明: JL-B16与Bacillus subtilis 同处于一个分支上，其16S rDNA序列与Bacillus subtilis（AP012495）的相似度达99%。结合菌落形态，生理生化特征和16S rDNA序列分析，最终将JL-B16鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
实施例2 内生枯草芽孢杆菌发酵过滤液对病原菌菌丝生长抑制效果实验
内生枯草芽孢杆菌发酵过滤液的制备：选取内生枯草芽孢杆菌菌株JL-B16，用无菌接种环挑取单菌落，接种于装液量为100mL的LB液体培养基的250mL 三角瓶中，每个处理3 次重复。在28 ℃，180r/min的条件下培养3d，通过离心（4℃，10000r/ min，15min）取得上清液，在无菌条件下，经 0.22μm 微孔滤膜过滤后，收集滤液备用。
采用菌落生长法测定内生枯草芽孢杆菌发酵过滤液的抑菌活性，将上述内生枯草芽孢杆菌发酵过滤液按不同体积百分比加入到与PDA培养基中，制成混合平板，以不加过滤液的PDA平板为对照。分别在平板中央接入病原菌菌饼，,每个处理3次重复，置于28℃恒温培养，然后观察病原菌的生长状况，待对照CK满板时采用十字交叉法测量菌落直径。
采用下公式计算抑制率：
相对抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%
通过对病原菌生长情况进行观察，统计不同浓度内生枯草芽孢杆菌发酵过滤液对不同病原菌的抑制率，结果如表1。可以看出内生枯草芽孢杆菌JL-B16对病原菌的抑制率分别为疣孢病菌>蛛网病菌>油疤病菌，其对疣孢病菌的抑制效果最好，且效果最佳时内生枯草芽孢杆菌发酵过滤液在PDA培养基中的浓度为20vol%。
表1不同浓度内生枯草芽孢杆菌过滤液对病原菌菌丝生长的抑制率
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例3 内生枯草芽孢杆菌发酵灭菌液对病原菌菌丝生长抑制效果实验
内生枯草芽孢杆菌发酵灭菌液的制备：选取内生枯草芽孢杆菌菌株JL-B16，用无菌接种环挑取单菌落，接种于装液量为100mL的LB液体培养基的250mL 三角瓶中，每个处理3 次重复。在28℃，180r/min的条件下培养3d；将培养得到的JL-B16菌液放入高压灭菌锅，121℃条件下灭菌30min，即得到内生枯草芽孢杆菌发酵灭菌液。
采用菌落生长法测定内生枯草芽孢杆菌发酵灭菌液的抑菌活性，将上述内生枯草芽孢杆菌发酵灭菌液按不同浓度加入到PDA培养基中制成混合培养基平板，以不加灭菌液的PDA平板为对照。分别在平板中央接入病原菌菌饼,每个处理3次重复，置于28℃恒温培养，然后观察病原菌的生长状况，待对照CK满板时采用十字交叉法测量菌落直径。
采用下公式计算抑制率：
相对抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%
通过对病原菌生长情况进行观察，统计不同浓度内生枯草芽孢杆菌发酵灭菌液对不同病原菌的抑制率，结果如表2可以看出浓度为20vol%的内生枯草芽孢杆菌JL-B16发酵灭菌液对于病原菌的抑制效果最佳，且对于疣孢病菌的抑制效果最好，其次是油疤病菌。
表2不同浓度内生枯草芽孢杆菌灭菌液对病原菌菌丝生长的抑制率
Figure 762814DEST_PATH_IMAGE002
实施例4 内生枯草芽孢杆菌发酵过滤液对病原菌孢子萌发抑制效果实验
取实施例2制备的内生枯草芽孢杆JL-B16发酵过滤液，将过滤液按照不同体积百分比加入到PDA培养基中，制成混合培养基平板。在生长成熟的三个病原菌的培养皿中加入无菌水，收集病原菌孢子，制成1×107个/mL孢子悬浮液。然后用移液枪将100 μl孢子悬浮液加入上述混合培养基平板上，用涂布棒涂抹均匀。每个处理3次重复，置于28℃恒温培养，然后观察病原菌的孢子萌发状况。
通过对病原菌孢子萌发生长情况进行观察，统计不同浓度内生枯草芽孢杆菌发酵过滤液对不同病原菌的抑制率，结果如表3。可以看出，浓度为40vol%的内生枯草芽孢杆菌JL-B16发酵过滤液对于三种病原菌都具有较好的孢子萌发抑制效果。
表3 不同浓度内生枯草芽孢杆菌过滤液对病原菌孢子萌发的抑制率
Figure DEST_PATH_IMAGE003
实施例5 内生枯草芽孢杆菌发酵灭菌液对病原菌孢子萌发抑制效果实验
取实施例3所制得的内生枯草芽孢杆JL-B16发酵灭菌液，将灭菌液按照体积百分比为20%、40%两个比例分别与PDA培养基混合，制成混合培养基平板。在生长成熟的三个病原菌的培养皿中加入无菌水，收集病原菌孢子，制成1×107个/mL孢子悬浮液。然后用移液枪将100 ul孢子悬浮液加入上述混合培养基平板上，用涂布棒涂抹均匀。每个处理3次重复，置于28℃恒温培养，然后观察病原菌的孢子萌发状况。
通过对病原菌孢子萌发生长情况进行观察，统计不同种不同比例内生菌灭菌液对不同病原菌孢子萌发的抑制效果。结果如表4，可以看出，浓度为40vol%内生枯草芽孢杆JL-B16发酵灭菌液对病原菌的抑制效果较好，对疣孢病菌和油疤病菌的抑制效果好于蛛网病菌。
表4 不同浓度内生枯草芽孢杆菌发酵灭菌液对病原菌孢子萌发的抑制率
Figure 368370DEST_PATH_IMAGE004
实施例6 内生枯草芽孢杆菌挥发性物质对病原菌菌丝生长抑制效果实验
将三种病原菌菌株（油疤病菌、疣孢病菌、蛛网病菌）和内生枯草芽孢杆菌菌株JL-B16分别点种转接到PDA平板上，并分别在28℃恒温培养2d，随后在无菌条件下，去掉平板盖，将接有病原菌的培养皿与接有内生枯草芽孢杆菌菌株JL-B16的培养皿相对扣合，并用封口膜沿边缘封口，防治挥发性物质漏出。以不接内生枯草芽孢杆菌的作为对照，置于28℃恒温培养，每个处理3个重复。观察病原菌的生长情况并计算抑菌率。
采用下公式计算抑制率：
相对抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%
通过观察病原菌与内生枯草芽孢杆菌对接密封的培养皿中病原菌的生长状况，结果表明内生，内生枯草芽孢杆菌挥发性物质对病原菌菌丝生长具有一定的抑制作用。从表5可以看出，内生枯草芽孢杆菌JL-B16挥发性物质对于油疤病菌、蛛网病菌的抑制效果比较好。
表5内生枯草芽孢杆菌挥发性物质对病原菌菌丝生长的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE005
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学，闽江学院
<120> 一株拮抗食用菌病原真菌的内生枯草芽孢杆菌JL-B16及其应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1421
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis JL-B16
<400> 1
tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60
acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120
atggttgttt gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180
ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag 240
ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300
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ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540
tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600
aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660
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gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780
agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840
gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900
catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960
tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020
gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg 1080
ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140
tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atgggcagaa 1200
caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc 1260
gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320
cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1380
cccgaagtcg gtgaggtaac ctttatggag ccagccgccg a 1421

Claims (6)

1.一株拮抗食用菌病原真菌的内生枯草芽孢杆菌JL-B16，其特征在于：所述内生枯草芽孢杆菌JL-B16的分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JL-B16，已于 2021年12月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.24215，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的内生枯草芽孢杆菌JL-B16，其特征在于 ：所述食用菌病原真菌为疣孢病菌（Mycogone perniciosa magn.）、蛛网病菌（Cladobotryum mycophilum）、油疤病菌（Scytalidium lignicola）。
3.一种含权利要求1所述内生枯草芽孢杆菌JL-B16的生物制剂。
4.一种含权利要求1所述内生枯草芽孢杆菌JL-B16的发酵过滤液的生物制剂。
5.一种含权利要求1所述内生枯草芽孢杆菌JL-B16的发酵灭菌液的生物制剂。
6.如权利要求3至5任一项所述的生物制剂在食用菌病原菌防治中的应用，其特征在于：所述食用菌病原菌为疣孢病菌（Mycogone perniciosa magn.）、蛛网病菌（Cladobotryum mycophilum）、油疤病菌（Scytalidium lignicola）。
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