CN116836856B - 一种枯草芽孢杆菌、病原菌拮抗剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌、病原菌拮抗剂及其应用，涉及微生物技术领域。本发明提供的枯草芽孢杆菌对植物病原菌、食用菌病原菌或药用菌病原菌都有较强的拮抗活性，对病原菌的菌丝生长有很强的抑制性，对病原菌的侵染循环有很强的阻断作用。因此，本发明提供的枯草芽孢杆菌具有较高的应用开发潜力，可以用于制备菌剂、生物农药或浸种剂。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种枯草芽孢杆菌、病原菌拮抗剂及其应用。
背景技术
内生真菌是一类有待开发的新型微生物资源，具有广阔的应用前景。目前，研究最多的领域是内生真菌的拮抗作用。大量研究表明，内生真菌对多种病原真菌具有较强的拮抗作用和广谱作用，通常表现为对生存空间和营养资源的竞争，并产生拮抗活性物质抑制病原真菌的生长。目前，以生物防治取代化学防治是未来农业生产的重要措施，而生物防治菌的筛选是发展生物防治疾病的技术核心和关键。生防菌主要通过分泌抗病物质、空间和营养竞争以及诱导食用菌产生抗病能力来抑制食用菌病害。具有多种作用方式的拮抗菌株在病害防治中具有较好的应用潜力。近年来应用拮抗菌及其代谢物防控作物真菌病害的研究较为热门。
芽孢杆菌属是众所周知的生物制剂，其作用方式包括促进植物生长、抗真菌代谢产物、竞争、真菌寄生和诱导目标植物的防御反应。芽孢杆菌通常存在于土壤、水和空气等多种自然环境中，对多种植物病原真菌具有抗菌作用，研究表明，抗菌活性是芽孢杆菌作为生防菌抑制病原真菌的主要机制之一，芽孢杆菌能产生一系列的抗菌脂肽。抗菌活性被描述为一种拮抗菌株产生抗菌物质来抑制或杀死潜在病原体的生物过程，显示了对真菌性病害的防治能力。目前，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种较为理想的生防微生物，广泛应用于真菌性病害的生物防治，它是一类嗜温、好氧或兼性厌氧、能产生抗逆性内生孢子的G+杆状腐生细菌，其生理特征丰富多样，分布广泛，极易分离培养。枯草芽孢杆菌在自然界中广泛存在，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。由于产生对热、紫外线、电磁辐射和某些化学药品有很强抗性的芽抱，所以可以耐受各种不良的环境条件，如可以在80℃以上的地方生长，也可以在PH为2～3的酸性环境生存，在许多极其恶劣的环境中也能发现它们的踪迹。枯草芽孢杆菌富含蛋白酶、淀粉酶、脂酶等酶类以及其他丰富的代谢产物，部分菌还可以分解土壤中的不溶性磷酸盐，与其他微生物一起在土壤中起着重要作用。
因此，筛选出高效广谱的有益微生物防治植物病害、食用菌或药用菌病害，是目前急需解决的问题。目前，高效拮抗菌株较少。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌以防治植物病害、食用菌病害以及药用菌病害。
芽孢杆菌是最常见的内生细菌，对植物病害具有显著的防治作用。芽孢杆菌被认为是植物病害化学防治的有效替代品，它可以减少合成杀虫剂的使用，对环境的影响很小。微生物拮抗菌剂分泌脂肽、抗生素和其他直接抑制植物病原菌的抗真菌代谢产物，研究表明，抗菌活性是芽孢杆菌作为生防菌抑制植物病原真菌的主要机制之一，芽孢杆菌能产生一系列的抗菌脂肽。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏的培养物的名称及鉴别特征为：枯草芽孢杆菌SAAS-A9(Bacillus subtilis SAAS-A9)，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。保藏编号为CCTCCNO:M20221704，保藏日期为2022年10月31日，鉴定结果为存活。
发明人从羊肚菌组织中分离筛选出一株对病原菌防治效果较好的菌株，经鉴定为枯草芽孢杆菌属。其对羊肚菌真菌病原菌有较强的拮抗活性，对病原真菌的菌丝生长有很强的抑制性，对病原菌的侵染循环有很强的阻断作用。经验证，该枯草芽孢杆菌还有着较为广泛的抗菌特性，尤其对镰刀菌属，拮抗效果显著，因此，本发明提供的枯草芽孢杆菌具有较高的应用开发潜力。
在平板对峙实验中，本发明分离鉴定的枯草芽孢杆菌对病原菌的生长具有显著抑制作用，推测枯草芽孢杆菌可能产生防治病原真菌生长的抗菌物质，诱导食用菌(如羊肚菌)或药用菌产生抗逆性，提高食用菌的抗性，促进食用菌生长，可进一步开发为生防菌剂，应用于农业生产，以实现生物防治。生防菌剂在农业生产、农药研究中成了研究热点，也慢慢成为了绿色防控的重要防治手段，生物防治为我国农业生产、环境的可持续发展带来了极大的希望。
第二方面，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌在防治植物病原菌病害、食用菌病原菌病害或药用菌病原菌病害中的应用。
发明人研究表明，本发明提供的枯草芽孢杆菌对于植物病原菌病害、食用菌病原菌病害或药用菌病原菌病害均有良好的防治效果，可以用于制备生物农药、浸种剂等。
在本发明应用较佳的实施方式中，植物病原菌病害选自植物细菌病害、植物真菌病害或植物土传病害；
在本发明应用较佳的实施方式中，食用菌病原菌病害或药用菌病原菌病害包括由冻土毛霉(Mucor hiemalis)、丝枝蜡蚧霉(Lecanicillium aphanocladii)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、藤黑镰孢菌(Fusarium fujikuroi)、粉红粘帚霉(Clonostachysrosea)、油疤病菌(Scytalidium lignicola)、蛛网病菌(Cladobotryum semicirculare)、粘菌病菌(Comatrichapulchell(C.Bab)Rost sp.)、绿色木霉(Trichodermapleuroticola)、青霉(Penicillium cyclopium)和黄色霉菌(Disporotrichumdimorphosporum)中的至少一种引起的食用菌病原菌病害或药用菌病原菌病害。
在本发明应用较佳的实施方式中，食用菌病原菌病害或药用菌病原菌病害选自白腐病。
在本发明应用较佳的实施方式中，食用菌选自羊肚菌、香菇、草菇、蘑菇、木耳、银耳、猴头、竹荪、松口蘑、口蘑、红菇、灵芝、虫草、松露、白灵菇或牛肝菌。
第三方面，本发明还提供了一种菌剂，其包括上述的枯草芽孢杆菌。需要说明的是，上述菌剂包括不限于液体制剂、固态菌剂、膏状菌剂、悬浮剂、乳液、喷雾剂或半固态菌剂。
第四方面，本发明还提供了一种菌剂的制备方法，其包括将上述的枯草芽孢杆菌接种于细菌培养基中，在28℃～37℃下培养。
第五方面，本发明还提供了一种病原菌拮抗剂，其包括上述的枯草芽孢杆菌，病原菌选自植物病原菌、食用菌病原菌或药用菌病原菌。
本发明提供的枯草芽孢杆菌具有广谱的抗菌性，能够对多种病原菌起到拮抗作用。
第六方面，本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌在制备防治植物病原菌病害、食用菌病原菌病害或药用菌病原菌病害的生物农药或浸种剂中的应用。
上述浸种剂用于作物的种子浸种。使用时，将种子浸泡于浸种剂的溶液中。经过浸种剂处理，作物的种子抗病害能力有了显著的提升。作物例如选自经济作物和粮食作物，经济作物选自如下经济作物中的至少一种：茄科、蔷薇科、芸香科、芭蕉科、葫芦科、蝶形花科、菊科、百合科、姜科、西番莲科、凤梨科、五加科和仙人掌科；粮食作物选自禾本科作物；禾本科作物为玉米、小麦、水稻、高粱或大麦。
上述的浸种剂的剂型包括不限于液体制剂、固态菌剂、膏状菌剂、悬浮剂、乳液、喷雾剂或半固态菌剂。
此外，浸种剂中可以根据需要选择添加防腐剂、抗氧化剂、增色剂等添加剂。
浸种剂为上述枯草芽孢杆菌的发酵液或枯草芽孢杆菌的冻干粉。上述发酵液为枯草芽孢杆菌在细菌培养基上培养的发酵液。
在其他实施方式中，上述的枯草芽孢杆菌也可作为一种肥料的添加剂，例如肥料包括上述的枯草芽孢杆菌或菌剂。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述肥料为叶肥或根肥。上述的叶肥或根肥可以是水溶性肥，也可以其他溶解性质的肥料。
上述的肥料可以作为基肥使用，也可以与其他的有机肥、无机肥或有机-无机肥复混施用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的枯草芽孢杆菌对病原菌的菌丝生长有很强的抑制性，对病原菌的侵染循环有很强的阻断作用。经验证，该枯草芽孢杆菌还有着较为广泛的抗菌特性，尤其对镰刀菌属，拮抗效果显著，因此，本发明提供的枯草芽孢杆菌具有较高的应用开发潜力。
在平板对峙实验中，本发明分离鉴定的枯草芽孢杆菌对病原菌的生长具有显著抑制作用，推测枯草芽孢杆菌可能产生防治病原真菌生长的抗菌物质，诱导食用菌(如羊肚菌)或药用菌产生抗逆性，提高食用菌的抗性，促进食用菌生长，可进一步开发为生防菌剂，应用于农业生产，以实现生物防治。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为编号为A9的拮抗优势菌株对5种病原菌的拮抗效果图；
图2为羊肚菌内生细菌A9对羊肚菌病原菌L.aphanocladii生长的抑制结果图；
图3为对内生细菌的16srDNA片段进行扩增后的电泳结果图；
图4为对内生细菌的ITS区进行扩增后的电泳结果图；
图5为进化树分析结果图；
图6为羊肚菌内生细菌对羊肚菌病原菌L.aphanocladii温室实验下的生防效果展示图；
图7为A9优势拮抗菌对羊肚菌温室实验的相关抗氧化酶活性指标数据的检验结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
NB培养基的配方：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、琼脂18g/L、
氯化钠(NaCl)5g/L，加灭菌水至最终体积。
PDA培养基的配方：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂18g/L，加灭菌水至最终体积。
实施例1
本实施例进行羊肚菌内生菌的分离纯化。
将新鲜羊肚菌用无菌水冲洗约5分钟。用过滤纸把表面的水分吸去，用无菌水清洗2遍，75％酒精浸泡3分钟，用无菌水清洗3遍，用3％次氯酸钠浸泡3分钟，最后用无菌水清洗4遍，将最后一次清洗液涂在NB和PDA培养基上作为对照。
使用研磨法进行内生菌的分离，用无菌手术刀将消毒后的羊肚菌表皮剥去，把里面的组织转移到研钵中，再加适量的消毒砂和无菌水，进行研磨。待一段时间后，将其上清液涂于NB和PDA培养基平板上，于37℃和28℃的恒温箱中进行培养，并设置三个重复。
在培养过程中，逐天进行观察，并将生长出来的细菌和真菌分别放入相应新鲜的固态培养基中进行纯化。纯化后的羊肚菌内生细菌、内生放线菌和内生真菌分别转接到NB斜面、高氏一号斜面和PDA斜面上编号并放在4℃冰箱中保存备用。
经过上述分离纯化，从羊肚菌组织中分离出的28株内生细菌和2株内生真菌作为供试菌株(即为初筛菌株)。
实施例2
本实施例筛选拮抗羊肚菌病原真菌的内生菌。
采用供试菌株与病原菌对峙培养的方法，筛选抑菌效果较强的优势拮抗拮抗菌株，从而获得抑菌活性最强且具有广谱性的内生菌株。
本实验选用的供试病原菌，为从羊肚菌发病株上分离得到的5种病原菌，分别为：冻土毛霉Mucor hiemalis、丝枝蜡蚧霉Lecanicillium aphanocladii、禾谷镰刀菌Fusarium graminearum、藤黑镰孢菌Fusarium fujikuroi、粉红粘帚霉Clonostachysrosea，保存于上海农科院微生物实验室。
1.菌株的活化
将实施例1从羊肚菌中分离出的28株内生菌以及5种病原菌在NB和PDA平板培养基上进行活化。其中细菌在NB平板培养基上进行活化，真菌在PDA平板培养基上进行活化。
2.拮抗实验
采用平板对峙法测定羊肚菌内生菌对冻土毛霉Mucor hiemalis(YG-1)、丝枝蜡蚧霉Lecanicillium aphanocladii(YG-2)、禾谷镰刀菌Fusarium graminearum(YG-4)、藤黑镰孢菌Fusarium fujikuroi(YG-5)、粉红粘帚霉Clonostachys rosea(YG-6)病原菌的抑制效果，筛选出具有抑菌活性的内生菌。经鉴定YG-2与YG-3为同一株菌株，故上述实验选择其中的YG-2进行平板对峙实验。
2.1初筛拮抗菌
将待测内生菌在NB平板上重新活化，挑取单菌落接种到NB培养基中，28℃培养24h，获得活化内生菌。将羊肚菌病原菌接种于PDA平板上进行活化，25℃培养7d后打取5mm的菌丝块接种到新的PDA培养基平板中心。培养48h后，在接种病原菌的PDA平板上用接种环对称接种6株内生菌，每株内生菌接种一环菌种，每株菌种距离病原菌30mm，28℃恒温培养。以病原菌平板作为对照，重复3次。初筛获得具有拮抗效果的菌株备用。
2.2复筛拮抗菌
利用平板对峙试验进行拮抗菌复筛，将上述初筛获得有拮抗效果的菌株在NB平板上重新活化，挑取单菌落接种到NB培养基中，在28℃下培养24h。将病原菌菌丝块与拮抗菌菌等距离对称接种，病原菌接种于PDA固体培养基中心，拮抗菌等距接种于平板中心四角，28℃培养7-10d。以病原菌平板作为对照，重复3次，待菌落长满平板时观察结果。
2.3羊肚菌病原真菌与内生菌的拮抗结果
对从羊肚菌中分离出的28株内生菌抑制病原菌的初步筛选结果显示有2株羊肚菌内生菌抑菌性较强且具有广谱抑菌性，拮抗优势菌株编号分别为：A9、D44。病原菌对照组与对峙培养实验组同时进行实验，培养7d后观察发现，对照组病原真菌生长情况正常，实验组中A9、D44对5种病原菌均出现明显抑制其生长的现象，出现了明显的抑菌带。
编号为A9的拮抗优势菌株对5种病原菌的拮抗效果图参照图1所示。
如下图所示：图1中a1 a2分别为对照组YG-1病原菌的正面和背面生长情况，b1 b2为对照组YG-3病原菌的正面和背面生长情况，c1 c2为对照组YG-4病原菌的正面和背面生长情况，d1 d2为对照组YG-5病原菌的正面和背面生长情况，e1 e2为对照组YG-6病原菌的正面和背面生长情况。
a3 a4是A9株优势拮抗内生菌与YG-1病原菌的正面和背面的对峙情况，b3b4是A9株优势拮抗内生菌与YG-3病原菌的正面和背面的对峙情况，c3 c4是A9株优势拮抗内生菌与YG-4病原菌的正面和背面的对峙情况，d3 d4是A9株优势拮抗内生菌与YG-5病原菌的正面和背面的对峙情况，e3 e4是A9株优势拮抗内生菌与YG-6病原菌的正面和背面的对峙情况。
由图1可知，本发明筛选出的A9株优势拮抗内生菌对于5种病原菌均具有明显的拮抗效果。
如下表1为分离纯化出的28株内生菌与5种病原菌的拮抗效果统计结果。表1显示，本发明筛选出的优势拮抗内生菌A9对于5种病原菌均具有明显的拮抗效果。√即为有拮抗效果，×为无拮抗效果。
表1不同28株内生菌对5种病原菌的拮抗实验统计结果表。
实施例3
本实施例对前述筛选出的A9优势接抗菌进行丝枝蜡蚧霉Lecanicilliumaphanocladii菌丝体生长的抑制效果研究实验。
1.PDA固体培养皿的预处理
在PDA固体培养皿反面上画十字，在距离中心点2.5cm的四条线画标记，在距离中心点0.5cm的四条线画标记。
2.接种羊肚菌内生细菌和病原菌L.aphanocladii。
在PDA固体培养皿距离中心点2.5cm四个标记处，接种27株不同种属的羊肚菌内生细菌，每种羊肚菌内生细菌进行3个重复，在每个接种过羊肚菌内生细菌的PDA固体培养皿距离中心点0.5cm的四个标记处，采用5mm打孔器取羊肚菌病原菌L.aphanocladii菌饼，作为实验组，在28℃恒温培养箱正面放置培养。采用5mm打孔器取羊肚菌病原菌L.aphanocladii菌饼，作为对照组，在28℃恒温培养箱正面放置培养。
待对照组羊肚菌病原菌L.aphanocladii菌丝长满PDA培养皿表面，测量实验组与对照组的病原菌菌丝生长直径。
抑制率公式＝(对照组菌丝生长直径-实验组菌丝生长直径)/对照组菌丝生长直径×100％。
3.羊肚菌内生细菌对L.aphanocladii菌丝体生长的抑制效果
通过平板对峙方法筛选对其病原菌生长有抑制效果的羊肚菌内生细菌，部分结果见图1。不同羊肚菌内生细菌对羊肚菌病原菌L.aphanocladii菌丝生长抑制效果不同，编号为A9的菌株枯草芽孢杆菌对于病原菌L.aphanocladii菌丝生长的平均抑制率高达66.2±9.45i。
表2羊肚菌内生细菌对病原菌L.aphanocladii菌丝生长的平均抑制率
羊肚菌内生细菌A9，D44对羊肚菌病原菌L.aphanocladii生长的抑制结果参照图2所示。A：对照组羊肚菌白腐病病原菌L.aphanocladii生长情况，E：接种羊肚菌内生细菌A9后羊肚菌白腐病病原菌L.aphanocladii生长情况。
由图2可知，羊肚菌内生细菌A9对羊肚菌白腐病病原菌L.aphanocladii有较强的拮抗活性，对病原真菌的菌丝生长有很强的抑制性，对病原菌的侵染循环有很强的阻断作用。
实施例4
本实施例对羊肚菌内生菌的形态特征和分子生物学鉴定如下。
A9呈不规则形状，颜色为乳白色，边缘状况为锯齿状，表面形态为：无光泽，粗糙，不透明，蜡状，扁平。
对内生细菌的16srDNA片段进行扩增，得到长度约为1500bp的条带(图3)；从上到下依次为：15000、8000、5000、3000、2000、1500、1000bp；a:1-10样品，分别是内生细菌YD01-YD03，A9，YD04-YD10；b：11-26样品，分别是内生细菌YD11-YD23,YD25,YD26,YD28。对羊肚菌所分离的内生真菌的ITS区进行扩增，得到长度约为500bp的条带(图4)。
将羊肚菌内生菌的16srDNA和羊肚菌所分离的内生真菌的ITS序列在NCBI中进行BLAST比对，28株内生菌隶属于10个属；其中26株羊肚菌内生细菌中，YD01-YD03、A9、YD06-YD12、YD14-YD16属于Bacillus属，YD05属于Lysinibacillus属，YD17属于Paenibacillu属，YD19，YD22、YD25、YD26属于Pseudomonas属，YD18属于Curtobacterium属，YD20属于Rhizobium属，YD21属于Phyllobacterium属，YD28属于Enterobacter属；2株内生真菌中，YD24属于Chaetomium属，YD27属于Clonostachys属(表3)。编号YD14即为D44菌株。
进化树分析结果显示，A9菌株为枯草芽孢杆菌属。
表5羊肚菌内生菌的BLAST比对
续
表5
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实施例5
本实施例对筛选出的优势拮抗内生菌A9进行生理生化指标的检测。
测定项目包括：淀粉水解、V-P实验、明胶液化、柠檬酸盐、丙酸盐、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、pH5.7生长、硝酸盐还原
结果如下：
| 生化反应 | V-P实验 | 柠檬酸盐 | 丙酸盐 | D-木糖 | L-阿拉伯糖 |
| 结果 | － | － | － | + | + |
| 生化反应 | D-甘露醇 | 明胶液化 | 淀粉水解 | pH5.7 | 硝酸盐还原 |
| 结果 | + | + | + | － | + |
-表示反应阴性，+表示反应阳性。
实施例6
本实施例对前述筛选出的A9优势拮抗菌进行丝枝蜡蚧霉Lecanicilliumaphanocladii温室实验的抑制效果研究实验。
实施例3通过平板对峙方法筛选出了对病原菌L.aphanocladii菌丝生长的平均抑制率达到66.2±9.45i的编号为A9的菌株枯草芽孢杆菌，进一步通过温室实验验证该菌株的生防效果。实验采用单因素变量设计，设置了四个组别分别是(1)健康羊肚菌接种病原菌L.aphanocladii G1；(2)健康羊肚菌接种病原菌L.aphanocladii G1后施用羊肚菌内生细菌A9；(3)健康羊肚菌只施用羊肚菌内生细菌A9；(4)健康羊肚菌做对照组。
羊肚菌内生细菌对羊肚菌病原菌L.aphanocladii温室实验下的生防效果结果参照图6所示。标注G1：健康羊肚菌接种病原菌L.aphanocladii G1后第7天的生长情况。标注A9+G1：健康羊肚菌接种病原菌L.aphanocladii G1后施用羊肚菌内生细菌A9的第7天的生长情况。标注A9：健康羊肚菌只施用羊肚菌内生细菌A9后第7天的生长情况。标注CK：做对照组的健康羊肚菌第7天的生长情况。
由图6可知，羊肚菌内生细菌A9在温室实验中对羊肚菌白腐病病原菌L.aphanocladii有明显的生防效果，羊肚菌侵染白腐病病原菌L.aphanocladii后，施用羊肚菌内生细菌A9的实验组别，病害程度明显较只侵染白腐病病原菌L.aphanocladii的实验组别低。与健康羊肚菌的对照组相比，单独施用羊肚菌内生细菌A9的组别无明显差别，说明羊肚菌内生细菌A9对羊肚菌无明显伤害。综上所述，在温室实验中再次验证羊肚菌内生细菌A9对羊肚菌白腐病病原菌L.aphanocladii有较好的生防效果。
实施例7
本实施例对前述筛选出的A9优势拮抗菌进行相关抗氧化酶活性指标数据的检验。以超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)4种防御酶作为植物抗病性反应指标。因SOD是非常重要的自由基清除酶，可将O2-歧化为H2O2和O2，减轻O2-对植物体的毒害作用；CAT主要负责清除H2O2等过氧化物；PPO通过分子氧可将酚和多酚氧化形成醌，保护植物细胞的完整性；苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)是苯酚合成途径中的关键酶，是许多重要次生代谢产物合成的起始酶。
实验采用单因素变量设计，设置了三个组别分别是(1)健康羊肚菌接种病原菌L.aphanocladii G1；(2)健康羊肚菌施用羊肚菌内生细菌A9；(3)健康羊肚菌做对照组。
采用GraphPad Prism 8软件对不同组别的羊肚菌的抗氧化酶活性指标数据进行单因素方差检验(One-way ANOVA)，所有数据均在显著水平p<0.05上进行检验并采用GraphPad Prism 8软件整理绘图。
本实施例分别施用对前述筛选出的A9优势拮抗菌、丝枝蜡蚧霉Lecanicilliumaphanocladii G1对羊肚菌温室实验的相关抗氧化酶活性指标数据的检验的结果参照图7所示。结果表明，2个处理组防御酶活性均比对照组高，说明无论接种羊肚菌内生菌A9或是丝枝蜡蚧霉Lecanicillium aphanocladii G1病菌，都能刺激羊肚菌体内防御酶活性的增加，从而达到抵御病害侵染的效应。在酶活性增加幅度上，羊肚菌内生细菌A9喷施处理后3种防御酶活性高于Lecanicillium aphanocladii G1病菌接种，表明羊肚菌内生细菌A9的诱导抗性作用较病原菌表现更为显著，进一步检验了羊肚菌内生细菌A9的生防效果，其作为生防农药有很好的应用前景。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏的培养物的名称及鉴别特征为：枯草芽孢杆菌 SAAS-A9（Bacillus subtilis SAAS-A9），保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为CCTCC NO:M20221704，保藏日期为2022年10月31日，鉴定结果为存活。
2.一种如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在防治食用菌病原菌病害或药用菌病原菌病害中的应用，所述食用菌病原菌病害或药用菌病原菌病害包括由冻土毛霉（Mucor hiemalis）、丝枝蜡蚧霉（Lecanicillium aphanocladii）、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、藤黑镰孢菌（Fusarium fujikuroi）、粉红粘帚霉（Clonostachys rosea）中的至少一种引起的食用菌病原菌病害或药用菌病原菌病害。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述食用菌病原菌病害或药用菌病原菌病害选自白腐病。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述食用菌选自羊肚菌。
5.一种菌剂，其特征在于，其包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。
6.一种菌剂的制备方法，其特征在于，其包括将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌接种于细菌培养基中，在28℃~37℃下培养。
7.一种病原菌拮抗剂，其特征在于，其包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，所述病原菌选自食用菌病原菌或药用菌病原菌；所述食用菌病原菌病害或药用菌病原菌病害包括由冻土毛霉（Mucor hiemalis）、丝枝蜡蚧霉（Lecanicillium aphanocladii）、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、藤黑镰孢菌（Fusarium fujikuroi）、粉红粘帚霉（Clonostachys rosea）中的至少一种引起的食用菌病原菌病害或药用菌病原菌病害。
8.一种如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备防治食用菌病原菌病害或药用菌病原菌病害的生物农药或浸种剂中的应用，其特征在于，所述食用菌病原菌病害或药用菌病原菌病害包括由冻土毛霉（Mucor hiemalis）、丝枝蜡蚧霉（Lecanicillium aphanocladii）、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、藤黑镰孢菌（Fusarium fujikuroi）、粉红粘帚霉（Clonostachys rosea）中的至少一种引起的食用菌病原菌病害或药用菌病原菌病害。
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