CN103013980A

CN103013980A - 一种提取枯草芽孢杆菌基因工程菌质粒的方法

Info

Publication number: CN103013980A
Application number: CN2012105105496A
Authority: CN
Inventors: 王金斌; 唐雪明; 李文; 陈大超; 祝子坪; 何建华; 蒋玮; 白蓝; 刘华; 李鹏; 吴潇
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-12-03
Filing date: 2012-12-03
Publication date: 2013-04-03

Abstract

本发明公开一种提取枯草芽孢杆菌基因工程菌质粒的方法，包括以下步骤：1）枯草芽孢杆菌菌体的培养与收集；2）原生体的制备；3）细胞的裂解和提取；4）质粒的纯化。应用该方法得到的质粒DNA可直接用来限制性内切酶消化、PCR扩增等多种分子生物学实验。本发明操作简便、安全、质量高，可同时适用于多种革兰氏阳性细菌质粒DNA的提取，因此具有广泛的适用性。

Description

一种提取枯草芽孢杆菌基因工程菌质粒的方法

技术领域

本发明涉及一种提取枯草芽孢杆菌基因工程菌质粒的方法。

背景技术

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，简称B.subtilis）是芽孢杆菌的一个种，枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性细菌，该种在自然界分布极为广泛，是一种重要的工业微生物，最早关于B.subtilis应用的纪录是采用该种的一个变种B.subtilis var.natto（旧称Bacillus natto）发酵大豆以便生产细菌型发酵食品“纳豆（Natto）”。这种食品是亚洲国家的传统发酵食品，在中国，这种发酵食品被称为“豆豉”。枯草芽孢杆菌酶的主要应用领域之一是食品工业，全世界食品工业用酶约占总量的60％，我国则更是高达85%以上。由于它的细胞壁不含内毒素，对人畜安全，是非致病的，不产毒素和致热致敏蛋白质，故为一种食品安全的菌种，美国食品药物管理局（FDA）和中国农业部等均批准为安全菌株，是发酵工业中常用的菌种，被归为食品级微生物范畴。

枯草芽孢杆菌为芽孢杆菌属的模式菌种，其菌株168的全基因组序列已于1997年发表（GI:50812173），基因组信息可以从数据库SubtiList（http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/）搜索得到。其遗传学和生理学已得到深入研究，人们对其遗传背景和生理特性的了解仅次于大肠杆菌（E.coli）。

对于外源蛋白表达的研究，枯草芽孢杆菌还远远落后于大肠杆菌。但是在表达和分泌活性蛋白方面枯草芽孢杆菌则要明显优于大肠杆菌，枯草芽孢杆菌作为外源基因表达的宿主，有以下一些优点：1）非致病性微生物，不产生内毒素；2）没有明显的密码子偏好性，同时表达产物也不容易形成包涵体；3）分泌蛋白能力强，特别是对一些源于革兰氏阳性菌的蛋白，可直接将功能性胞外蛋白分泌到培养基中（目前，大约60%的市售酶由芽孢杆菌生产），这有利于目的蛋白的回收和纯化等后续操作；4）遗传背景研究比较清楚，以及多年的工业生产技术基础。但是，也存在以下一些不足：1）存在限制和修饰系统，重组质粒不稳定；2）能自发形成感受的菌株极少，感受态持续时间短暂，分子克隆效率低；3）能够产生大量的胞外蛋白酶，往往造成表达产物的大量降解。总之，随着研究的不断深入，相信不久的将来枯草芽孢杆菌表达系统存在的问题会很好地被解决。

获得高质量的质粒DNA是构建枯草芽孢杆菌表达体系的前提条件。目前用于细菌质粒DNA抽提的方法不少，如常规的碱裂解法、SDS裂解法等，但枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，胞壁较厚，且多数易形成芽孢，使用常规的质粒提取方法实验结果不理想。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种提取枯草芽孢杆菌基因工程菌质粒的方法，以解决现有提取方法存在的破壁不完全、质粒DNA质量低、产量不高、重复性差等缺陷。本发明利用普通琼脂糖凝胶电泳即可分析枯草芽孢杆菌的质粒图谱、且操作简便、安全、质粒图谱清晰、重复性好，为枯草芽孢杆菌分子克隆以及表达系统的建立创造了有利条件。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现。

所述的提取枯草芽孢杆菌质粒DNA的方法，包括以下步骤：

1）菌体的培养与收集：挑取枯草芽孢杆菌的单菌落于2-10ml LB液体培养基中28-35℃振荡培养10-15小时，0.5-5wt%转接到40-150ml新鲜LB液体培养基中继续振荡培养，至细菌生长密度为OD₆₀₀＝0.5-1.2，收集40-150mg菌体于离心管中；

2）原生体的制备：向收集的菌体中加入1-1.5ml预冷的洗涤液A悬浮细胞，12000g离心，弃上清，菌体重悬于200-300μl细胞裂解液B，37℃温育1.5-2h；

3）细胞的裂解和质粒的提取：向制备好的上述溶液中加入200-300μlC，缓慢混匀，68℃处理10min，裂解细胞，向裂解液中加入100-150μl溶液D，轻轻混匀，于-20℃中放20-30min；4℃离心，将上清液转移至新l离心管内，加入无水乙醇，-20℃过夜；4℃离心弃上清，70wt％乙醇洗涤沉淀，真空干燥沉淀，加入无菌纯水溶解沉淀；

4）质粒的纯化：将制备好的上述溶液转移到一个干净的离心管中，加入2-5倍体积DNA联接液E到离心管中，用手颠倒1-5分钟混匀；将联接混合液加入一个含结合柱的收集管中，室温放置1-5分钟，3000-10000rpm离心1-3分钟，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入离心管中，再次加入联接混合液离心，直至所有联接混合液离心完毕；将含结合柱的收集管放置在一个新的离心管中，加入300-700μl洗涤液F到结合柱中，离心，倒掉收集管中的废液；将结合柱重新放回收集管，8000-18000rpm离心1-5分钟；将结合柱装入新的离心管中，室温放置，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入30-50μl洗脱液G，不戳破膜，室温放置，8000-15000rpm离心1-3分钟，离心管中即为分离的DNA，贮存于-20℃；其中洗脱液G为0.1mM的Tris-HCl，pH=9.0。

其中，上述提取方法中，所述洗涤液A由20-30mM Tris-HCl、1-5mMEDTA、30-50mM NaCl、2-20%的焦磷酸钠组成，pH＝8.0。其中焦磷酸钠的单位为g/L。

所述细胞裂解液B由20-30mM Tris-HCl、1-5mM EDTA、30-50mM NaCl、20wt%葡萄糖和2mg/ml溶菌酶组成，pH=8.0。

所述溶液C由20-30mM Tris-HCl、1-5mM EDTA、30-50mM NaCl和8wt%SDS溶液组成，pH=8.0。

所述溶液D为3M的NaAc，pH＝4.8。

所述DNA联接液E由5-10M异硫氰酸胍、200-600mM醋酸钾组成，pH=4.5-6.0。

所述洗涤液F由70%乙醇、150mM醋酸钾组成，pH=5.0。

本发明的提取方法，具有以下优点：

1）本发明所述的枯草芽孢杆菌质粒DNA提取方法操作简单，不需要较为复杂的设备，常规分子生物学或微生物学实验室就可完成。

2）本发明所述的枯草芽孢杆菌质粒DNA提取方法，选择适宜的条件进行细菌培养及合适体积的菌液进行质粒提取，可最大限度的提高提取的效率；同时提取的质粒图谱清晰、重复性好、结构完整，A₂₆₀/A₂₈₀均达到了1.80，完全可以满足常规分子生物学实验的要求，为枯草芽孢杆菌分子生物学的研究创造了有利条件。

3）本发明所述的枯草芽孢杆菌质粒DNA提取方法，应用范围广，同样适用于其它革兰氏阳性细菌质粒DNA的提取。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌质粒电泳图，其中：M为超螺旋DNA分子量标准，1为枯草芽孢杆菌标准菌株168质粒PHY300a图谱，2为枯草芽孢杆菌表达宿主菌株WB600质粒PHY300a图谱，3为枯草芽孢杆菌表达宿主菌株WB800N质粒PHY300a图谱，4为枯草芽孢杆菌标准菌株168质粒PHT43图谱，5为枯草芽孢杆菌表达宿主菌株WB600质粒PHT43图谱，6为枯草芽孢杆菌标准菌株168质粒PHT43图谱。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。

1、选用材料为枯草芽孢杆菌宿主菌株及质粒（表1）。

表1枯草芽孢杆菌宿主菌株及质粒

2、试剂和仪器

琼脂糖，EDTA（乙二胺四乙酸）、SDS（十二烷基磺酸钠）、Tris（三羟甲基氨基甲烷）均为上海生工生物工程公司产品；溶菌酶和RNase A为日本TaKaRa公司产品；其它试剂均为国产分析纯。凝胶电泳分析系统和凝胶成像分析系统为美国Bio-Rad公司产品。

实施例1

1、枯草芽孢杆菌质粒DNA的分离提取

1）枯草芽孢杆菌的培养与收集：分别挑取已转化不同质粒的工程菌枯草芽孢杆菌菌株的单菌落于5ml LB液体培养基中30℃振荡培养15小时，1wt％转接到50ml新鲜LB液体基中继续振荡培养，至细菌生长密度为OD₆₀₀＝0.9-1.1，收集5ml菌体于1.5ml离心管中。

2）原生体的制备：向收集的菌体中加入1.2ml预冷的洗涤液A悬浮细胞，4℃12000g离心5min，弃上清，菌体重悬于200μl细胞裂解液B中，37℃温育1.5-2h。

3）细胞的裂解和质粒的提取：向制备好的上述溶液中加入300μl溶液C，缓慢混匀，68℃处理10min，裂解细胞。向裂解液中加入150μl溶液D，轻轻混匀，于-20℃中放30min；4℃12000g离心20min，将上清液转移至新1.5ml离心管内，加入1ml无水乙醇，-20℃过夜；4℃12000g离心20min，弃上清，70wt%乙醇洗涤沉淀，真空干燥沉淀；加入200μl无菌纯水溶解沉淀。

4）质粒的纯化：将制备好的上述溶液转移到一个干净的离心管中，加入3倍体积DNA联接液E到离心管中，用手颠倒1-5分钟混匀；将联接混合液加入一个含结合柱的收集管中，室温放置2分钟，6000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入离心管中，再次加入联接混合液离心，直至所有联接混合液离心完毕；将含结合柱的收集管放置在一个新的离心管中，加入500μl洗涤液F到结合柱中，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液；将结合柱重新放回收集管，13000rpm离心2分钟；将结合柱装入新的离心管中，室温放置，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入30μl洗脱液G，不戳破膜，室温放置，13000rpm离心1分钟，离心管中即为分离的DNA，贮存于-20℃。

2、质粒DNA的浓度及纯度分析

用分光光度计测定质粒DNA的OD₂₆₀和OD₂₈₀，结果见表2，发现各菌株提取的质粒DNA浓度在50-90ng/μl之间；样品OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8-2.0之间（注：OD₂₆₀/OD₂₈₀标准值范围为1.8-2.0）。说明获得的质粒DNA纯度较高，完全可以满足基因克隆、鉴定等分子生物学研究需求。

表2枯草芽孢杆菌菌株及不同血清型标准菌株的DNA的浓度分析

3、电泳分析

将上述提取到的质粒DNA用0.7%琼脂糖凝胶进行电泳，电压60v，电泳后紫外下拍照分析，结果见图1。M泳道是超螺旋DNA分子量标准MARK，泳道1、2、3分别是工程菌168-PHY300a、WB600-PHY300a、WB800-PHY300a提取纯化获得的质粒PHY300a，泳道4、5、6分别是工程菌168-PHT43、WB600-PHT43、WB800-PHT43提取纯化获得的质粒PHT43，图中质粒条带单一，清晰，明亮，说明获得的质粒DNA纯度较高、得率高，完全可以满足基因克隆、鉴定等分子生物学研究需求。

Claims

1.一种提取枯草芽孢杆菌基因工程菌质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2）原生体的制备：向收集的菌体中加入1-1.5ml预冷的洗涤液A悬浮细胞，离心弃上清，菌体重悬于200-300μl细胞裂解液B，37℃温育1.5-2h；

3）细胞的裂解和质粒的提取：向制备好的上述溶液中加入200-300μl溶液C，缓慢混匀，68℃处理10min，裂解细胞，向裂解液中加入100-150μl溶液D，轻轻混匀，于-20℃中放20-30min；4℃离心，将上清液转移至新离心管内，加入无水乙醇，-20℃过夜；4℃离心，弃上清，70wt%乙醇洗涤沉淀，真空干燥沉淀，加入无菌纯水溶解沉淀；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗涤液A由20-30mMTris-HCl、1-5mM EDTA、30-50mM NaCl、2-20%的焦磷酸钠组成，pH＝8.0，其中焦磷酸钠的单位为g/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞裂解液B由20-30mM Tris-HCl、1-5mM EDTA、30-50mM NaCl、20wt%葡萄糖和2mg/ml溶菌酶组成，pH=8.0。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶液C由20-30mMTris-HCl、1-5mM EDTA、30-50mM NaCl和8wt%SDS溶液组成，pH=8.0。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶液D为3M的NaAc，pH＝4.8。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA联接液E由5-10M异硫氰酸胍、200-600mM醋酸钾组成，pH=4.5-6.0。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗涤液F由70%乙醇、150mM醋酸钾组成，pH=5.0。