CN117431149B - 一种菌体的洗涤方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种菌体的洗涤方法,该方法包括:在使用切向流过滤对含有菌体的菌液进行浓缩的过程中,使用氯化钠溶液进行菌体洗涤。通过本发明的方法进行洗涤,可以提高由洗涤所得菌体中提取的质粒质量。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程领域,涉及一种菌体的洗涤方法。
背景技术
蛋白质、质粒等产品生产通常通过微生物发酵的方式进行。发酵过程中,待目的产物富集到理想的产量后,停止发酵,进行菌体收集。常用的菌体收集方式分为2种,一种为离心收集,这种方法操作简单,能快速实现菌泥和培养液的分离,但该方法在放大工艺中设备受到挑战;另外一种为使用中空纤维柱进行菌体收集,通过切向流过滤技术,培养基通过透过端透过,菌泥通过回流端返回收集器中,通过不断浓缩,实现菌体收集。菌体收集后,进行菌体裂解,释放产物。
受发酵培养基、代谢产物、裂解死亡菌体等的干扰,若菌体收集后直接进行裂解会影响目的产物的纯度或裂解效率,进而影响质量及产量。为了避免这些干扰,需要进行菌体清洗。选择合适的清洗溶液,可以通过重悬再离心的方式进行菌体清洗,也可以通过中空纤维柱的方式不断进行洗滤换液,进行菌体清洗。菌体裂解通常采用碱裂解的方式进行,菌体重悬使用溶液I(Solution I,也称为SI溶液),其主要成分是葡萄糖(增大密度使细胞悬浮),EDTA(螯合二价金属离子Ca2+、Mg2+,降低DNase活性,防止DNA被降解),Tris-HCl(调节pH),进行菌体清洗时常使用SI溶液。
发明内容
本发明公开了一种菌体的洗涤方法,该方法包括:在使用切向流过滤对含有菌体的菌液进行浓缩的过程中,使用氯化钠溶液进行菌体洗涤;所述氯化钠溶液的浓度为0.8-1%,优选为0.9%(m/V)。
在一些具体实施方式中,所述切向流过滤在中空纤维柱中进行。
在一些具体实施方式中,所述中空纤维柱的截留分子量为750-2500 kD。
在一些具体实施方式中,所述中空纤维柱的孔径为0.8-1 mm。
在一些具体实施方式中,所述切向流过滤条件包括:跨膜压(TMP)为0.4-0.9 bar。
在一些具体实施方式中,所述切向流过滤的条件包括:剪切速率(Shear)为5000-9000 S-1。
在一些具体实施方式中,所述切向流过滤的条件包括:通量为12-30 L/m2/h。
在一些具体实施方式中,所述切向流过滤的条件包括:浓缩倍数为1-10倍。优选地,高密度发酵浓缩1-2倍,低密度发酵浓缩1-10倍。
在一些具体实施方式中,所述切向流过滤的条件包括:膜恢复率≥80%。
在一些具体实施方式中,所述氯化钠溶液的用量为所述菌液的0.5倍体积以上,优选1-10倍体积,更优选1-5倍体积。
在一些具体实施方式中,该方法还包括:在使用氯化钠溶液进行菌体洗涤后,进一步使用第一盐溶液进行菌体洗涤;其中,所述第一盐溶液含有:45-55 mM的葡萄糖、20-30mM的Tris-Cl和15-25 mM的EDTA,且所述第一盐溶液的pH为7.8-8.2。
在一些具体实施方式中,所述第一盐溶液含有:50 mM的葡萄糖、25 mM的Tris-Cl和10 mM EDTA,且所述第一盐溶液的pH为8.0。
在一些具体实施方式中,所述第一盐溶液的用量为所述菌液的0.5倍体积以上,优选1-10倍体积,更优选1-5倍体积。
在一些具体实施方式中,所述使用氯化钠溶液进行菌体洗涤的步骤,和/或所述使用第一盐溶液进行菌体洗涤的步骤,在所述浓缩的过程中通过连续导入溶液进行。
在一些具体实施方式中,所述氯化钠溶液和/或所述第一盐溶液的导入速度为300-700 mL/min,优选为400-500 mL/min。
在一些具体实施方式中,所述菌液中含有10-50wt%、优选30-50wt%的菌体。
在一些具体实施方式中,所述菌体为大肠杆菌。
发明的有益效果
本发明的方法在利用切向流过滤对菌体进行浓缩的过程中,选用适当的洗涤液进行菌体洗涤,从而能够大幅度提高由洗涤所得菌体提取得到的质粒的质量和产率,尤其是超螺旋比例和超螺旋质粒产量。
此外,本发明的洗涤方法利用切向流过滤进行连续洗涤,操作简便,洗涤效率高,洗涤过程方便可控,适用于大规模生产的需求。
附图说明
图1示出切向流过滤装置的结构示意图。
图2示出从实施例1和对比例1的洗涤方法所得的菌体中提取质粒的超螺旋比例。
附图标记说明
1、洗涤液罐;2、菌液罐;3、中空纤维柱;4、废液罐;501、第一泵;502、第二泵;6、阀;301、进液口;302、废液出口;303、滤出液出口;304、回流液出口。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步的说明。除非另有限定,本文中所使用的学术语具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。
本文陈述的数值极限或范围包括端点,具体包括在数值极限或范围内的所有值和子范围。在本发明中,氯化钠溶液的浓度均以质量体积百分浓度(m/V)计。
本发明提供了一种菌体的洗涤方法,其包括:使用氯化钠溶液进行菌体洗涤;所述氯化钠溶液的浓度为0.8-1%,优选为0.9%。
本发明的发明人意外地发现,通过使用氯化钠溶液作为菌体洗涤液,可以提高由洗涤所得菌体提取得到的质粒的超螺旋比例和超螺旋质粒产量。
进而,本发明的洗涤方法包括:在使用切向流过滤对含有菌体的菌液进行浓缩的过程中,使用氯化钠溶液进行菌体洗涤。通过在切向流过滤中利用氯化钠溶液(优选生理盐水)对菌体进行连续洗涤,从而可以进一步提高由洗涤所得菌体提取得到的质粒的超螺旋比例和超螺旋质粒产量,适用于大规模生产的需求。
根据本发明,对于菌体的种类没有特别的限定,可以适用于质粒扩增用的任意菌种,例如可以为大肠杆菌。在一些实施方式中,所述菌种可以为工程菌。在一些实施方式中,所述菌种含有质粒。
如本文所用,“工程菌”是指通过基因工程等手段人工改变的菌株,其与改造前的初始菌株相比具有一或多个改变,例如基因缺失、扩增或突变以及外源或重组核酸序列的引入等,从而具有改变的生物学性质例如改良的生产性能。在一些实施方式中,所述工程菌为经过改造而含有质粒的工程菌。
从平衡洗涤的效率以及所得质粒的质量的角度考虑,优选地,使用本发明的方法进行洗涤的菌液中含有10-50wt%、优选30-50wt%的菌体。菌体的固含量可以通过离心等方式分离得到菌体后,再将菌液溶解的方式进行调整,溶解菌体例如可以使用下文中的第一盐溶液。
在一些具体实施方式中,大肠杆菌菌种的发酵例如可以采用如下方式进行。
(1)一级种子液制备:将工作菌种按照1‰-10‰的比例接入无抗生素的培养基(如TB培养基)中,培养9-11小时,得到一级种子液;
(2)二级种子液制备:将一级种子液按照1‰-10‰的比例接入无抗生素的培养基(如TB培养基)中,培养9-11小时,得到二级种子液;
(3)菌种发酵:将二级种子液按照9%-11%的比例接入50 L发酵罐中,发酵初始条件例如可以包括:溶氧:30%;pH:7.00;温度:30℃;通气量:20 L/min,培养至6.5 h时,开启补料Ⅰ,以比生长速率为0.29~0.3的速率进行补料,培养至8.5 h时,调整补料Ⅰ,以比生长速率为0.14~0.15的速率进行补料。培养至12.5 h时,升温至37 ℃。培养至18 h时,关闭补料Ⅰ,开启补料Ⅱ,以20 mL/h的补料速率进行补料,培养至25 h,发酵结束。发酵过程中,以OD600来监测菌体的生长状态。发酵结束后,离心收集菌体。
作为上述补料Ⅰ,例如可以包含:酵母浸粉:100-150 g/L;稀释20倍的消泡剂:0.1-0.3 mL/L;一水葡萄糖:250-300 g/L;脯氨酸:1-3 g/L;亮氨酸:1-3 g/L;硫酸镁:1-3 g/L。优选地,补料Ⅰ包含:酵母浸粉:125 g/L;稀释20倍的消泡剂:0.2 mL/L;一水葡萄糖 :275g/L;脯氨酸:2 g/L;亮氨酸:2 g/L;硫酸镁:2 g/L。
作为上述补料Ⅱ,例如可以包含:一水葡萄糖:250-300 g/L;甘氨酸:5-7 g/L;天冬氨酸:3-5 g/L;谷氨酰胺:0.5-2 g/L,柠檬酸钠:40-50 g/L;优选地,补料Ⅱ包含:一水葡萄糖 :275 g/L;甘氨酸:6 g/L;天冬氨酸:4 g/L;谷氨酰胺:1 g/L,柠檬酸钠:46 g/L。
根据本发明,从与氯化钠溶液配合达到更好的洗涤效果的角度考虑,所述切向流过滤在中空纤维柱中进行。作为中空纤维柱,可以使用通常用于菌液的过滤、浓缩等的任意类型中空纤维柱。在一些实施方式中,所述中空纤维柱的材质可以为改性聚醚砜(mPES)、聚乙烯(PE)、聚砜(PS)等。在一些实施方式中,所述中空纤维柱的截留分子量可以为750-2500kD。在一些实施方式中,所述中空纤维柱截留的分子的平均直径可以为0.2 μm。在一些实施方式中,所述中空纤维柱的孔径可以为0.8-1 mm,例如0.8 mm、0.9 mm或1 mm。在一些实施方式中,所述中空纤维柱的膜面积为0.01-0.1 m2,例如0.01 m2、0.02 m2、0.03 m2、0.04 m2、0.05 m2、0.06 m2、0.07 m2、0.08 m2、0.09 m2或0.1 m2。在一些实施方式中,所述切向流过滤条件包括:跨膜压(TMP)为0.4-0.9 bar,例如0.4 bar、0.5 bar、0.6 bar、0.7 bar、0.8 bar或0.9 bar。在一些实施方式中,所述切向流过滤的剪切速率(Shear)为5000-9000 S-1,例如5000 S-1、6000 S-1、7000 S-1、8000 S-1或9000 S-1。在一些实施方式中,所述切向流过滤的通量为12-30 L/m2/h,例如12、15、17、20、25或30 L/m2/h。在一些实施方式中,所述切向流过滤的浓缩倍数为1-10倍,例如1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。优选地,高密度发酵浓缩1-2倍,低密度发酵浓缩1-10倍,例如1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些实施方式中,所述切向流过滤的膜恢复率≥80%。
在本发明中,所述切向流过滤对于使用的切向流过滤装置没有特别的限定,可以使用通常用于菌液的过滤、浓缩等的切向流装置进行。例如,可以使用图1所示的切向流过滤装置,该切向流过滤装置包括:依次流体连接的洗涤液罐1、菌液罐2、中空纤维柱3和废液罐4。中空纤维柱3包括:靠近柱体一端部(作为入口端)设置的进液口301、设置在侧壁上并连通中空纤维柱外部空间(作为透过端)的滤出液出口303、以及靠近柱体另一端部(作为回流端)设置的回流液出口304。其中,进液口301用于导入待过滤的菌液;滤出液出口303用于导出经过滤得到的滤出液;回流液出口304用于将过滤后剩余的菌泥(浓缩后的菌液)回流。洗涤液罐1的洗涤液出口经第一泵501连接菌液罐2的洗涤液入口,从而可以将洗涤液罐1中的洗涤液连续导入菌液罐2。菌液罐2的出口经第二泵502连接进液口301,从而可以将菌液连续导入中空纤维柱3中进行过滤。滤出液出口303通过滤出液导出管连接废液罐4。回流液出口304通过回流液管连接菌液罐2。
此外,该中空纤维柱还可以包括废液出口302,其设置在靠近柱体的一端部或者侧壁上,可以根据需要连通中空纤维柱的外部。废液出口302用于根据需要导出菌液。废液出口302通过废液导出管连接废液罐4,且该废液导出管上设置有用于切断液体连通的阀6。
此外,为了防止菌液罐2中的菌体沉淀,还可以在菌液罐2的下方设置磁力搅拌器,对菌液进行搅拌。
根据本发明,所述氯化钠溶液的用量例如可以为所述菌液的0.5倍体积以上,优选为1-10倍体积,更优选为1-5倍体积。具体地,氯化钠溶液的用量可以为所述菌液的0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍体积。
根据本发明,该方法还包括:在使用氯化钠溶液进行菌体洗涤后,进一步使用第一盐溶液进行菌体洗涤;其中,所述第一盐溶液含有:45-55 mM的葡萄糖、20-30 mM的Tris-Cl和15-25 mM的EDTA,且所述第一盐溶液的pH为7.8-8.2。
在一些实施方式中,所述第一盐溶液含有:42-52 mM的葡萄糖、23-27 mM的Tris-Cl和8-12 mM的EDTA;优选含有:50 mM的葡萄糖、25 mM的Tris-Cl和10 mM EDTA。在一些实施方式中,所述第一盐溶液的pH为7.9-8.1,优选为8.0。在一些实施方式中,所述第一盐溶液由上述成分构成。
在一些实施方式中,所述第一盐溶液是质粒提取工艺中使用的溶液I(SolutionI)。在一些实施方式中,所述第一盐溶液含有:50 mM的葡萄糖、25 mM的Tris-Cl和10 mMEDTA,且所述第一盐溶液的pH为8.0。
根据本发明,所述第一盐溶液的用量例如可以为所述菌液的0.5倍体积以上,优选为1-10倍体积,更优选1-5倍体积。具体地,第一盐溶液的用量可以为所述菌液的0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍体积。
在本发明中,所述洗涤的方式没有特别的限定,例如,洗涤可以连续进行,即通过连续导入洗涤液(包括上述的氯化钠溶液和第一盐溶液)与菌液混合,同时利用切向流过滤对混合后的菌液进行浓缩,从而达到洗涤效果;洗涤也可以间断方式进行,即将洗涤液与菌液混合后,再利用切向流过滤对混合后的菌液进行浓缩,从而达到洗涤效果。进一步地,间断洗涤中,可以多次(例如1-5次)混合洗涤液与菌液。
例如,在利用图1所示的切向流过滤装置进行时,可以根据需要将作为洗涤液的氯化钠溶液或第一盐溶液放入洗涤液罐1中,并利用第一泵501将洗涤液导入菌液罐2与菌液混合后,再进行切向流过滤从混合液中分离菌体,达到洗涤效果。
优选的情况下,所述使用氯化钠溶液进行菌体洗涤的步骤,和/或所述使用第一盐溶液进行菌体洗涤的步骤,在浓缩的过程中连续进行。更优选地,所述氯化钠溶液和/或所述第一盐溶液的导入速度可以各自独立地为300-700 mL/min,优选为376-678 mL/min,更优选为400-500 mL/min,例如452 mL/min。
根据本发明,通过采用上述方法进行菌体的洗涤,可以使得由洗涤所得菌体提取得到的质粒的超螺旋比例达到72%以上,优选75%以上,更优选为77~80%,同时超螺旋质粒产量为0.9 mg/g以上,优选1 mg/g以上,更优选为1.1-1.5 mg/g。并且,本发明的洗涤方法对于质粒的大小等没有特别的限定,均能达到良好的洗涤效果。
实施例
以下结合实施例对本发明的洗涤方法进行详细说明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
I. 溶液成分
(1)溶液I(Solution I,也称为SI溶液)
50 mM 葡萄糖,25 mM Tris-Cl(pH 8.0),10 mM EDTA(pH 8.0),在15 psi 压力下蒸汽灭菌15 min,4℃保存。
(2)溶液II(Solution II)
0.2 mM NaOH,1%(w/v) SDS。室温保存。
(3)溶液III(Solution III)
3M醋酸钾,5M醋酸。4℃保存,使用时置于冰浴中。
II. 试剂和仪器
(1)质粒小提试剂盒,购自US Everbright,货号UE-MN-P-250;
(2)蠕动泵,购自Masterflex,型号77200-62;
(3)离心机,购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司,货号ST16R;
(4)琼脂糖水平槽,购自北京六一生物科技有限公司,货号DYCP-31DN;
(5)凝胶成像仪,购自北京六一生物科技有限公司,货号WD-9413A。
III. 质粒提取方法
使用购自US Everbright的质粒提取试剂盒按照下述方法进行质粒提取。
(1) 取菌体1.5 OD进行小质粒提取。菌体离心弃上清后加入250 μL Buffer SI,重悬菌体。
(2) 加入250 μL Buffer SII,立即温和充分的上下翻转10次,混合均匀时菌体充分裂解,直至形成透明的溶液。此步骤不超过5min。
(3) 加入350 μL Buffer SIII,立即温和充分的上下翻转10次,12000 g离心10min。
(4)吸取步骤(3)中全部离心上清并转移到制备管中(试剂盒提供制备管),室温静置2 min,12000 g离心1 min。
(5) 将制备管置回离心管,加入500 μL Buffer W1,12000 g离心1min,弃滤液。
(6) 将制备管置回离心管,加入700 μL Buffer W2,12000 g离心1min,弃滤液;以同样方法再用700 μL Buffer W2洗涤一次,弃废液。
(7) 将制备管置回2 mL离心管中,12000 g离心2 min。
(8) 将制备管转移到新的1.5 mL离心管(试剂盒内提供)中,打开管盖,晾干4min。
(9) 在制备管膜中央加60 μL Eluent(Eluent需要提前放到70℃水浴锅加热),室温静置2 min。12000 g离心2 min。
(10) 使用微量分光光度计进行浓度测定(Eluent作为对照)。
制备例1:菌液制备
(1)一级种子液制备:从工作菌种库中取出大肠杆菌工程菌工作菌种,按照5‰的比例接入无抗生素的TB培养基中,培养10小时,得到一级种子液;
(2)二级种子液制备:将一级种子液按照5‰的比例接入无抗生素的TB培养基中,培养10小时,得到二级种子液;
(3)菌种发酵:将二级种子液按照10%的比例接入50 L发酵罐中,发酵初始条件:溶氧:30%;pH:7.00;温度:30℃;通气量:20 L/min,培养至6.5 h时,开启补料Ⅰ(酵母浸粉:125g/L;稀释20倍的消泡剂:0.2 mL/L;一水葡萄糖 :275 g/L;脯氨酸:2 g/L;亮氨酸:2 g/L;硫酸镁:2 g/L),以比生长速率为0.3的速率进行补料,培养至8.5 h时,调整补料Ⅰ,以比生长速率为0.15的速率进行补料。培养至12.5 h时,升温至37℃。培养至18 h时,关闭补料Ⅰ,开启补料Ⅱ(一水葡萄糖 :275 g/L;甘氨酸:6 g/L;天冬氨酸:4 g/L;谷氨酰胺:1 g/L,柠檬酸钠:46 g/L),以20 mL/h的补料速率进行补料,培养至25 h,发酵结束。发酵过程中,以OD600来监测菌体的生长状态。发酵结束后,离心收集菌体。
实施例1
本实施例用于说明本发明的菌体洗涤方法。
使用如图1所示的切向流过滤装置进行菌液的连续浓缩和洗涤。该切向流过滤装置包括:依次流体连接的洗涤液罐1、菌液罐2、中空纤维柱3和废液罐4。洗涤液罐1的洗涤液出口经第一泵501连接菌液罐2的洗涤液入口。在中空纤维柱3上设置有:设置在柱体底部的进液口301、设置在柱体侧下方的废液出口302、设置在柱体侧上方的滤出液出口303、以及设置在柱体顶部的回流液出口304。菌液罐2的出口经第二泵502连接进液口301,废液出口302和滤出液出口303分别通过废液导出管和滤出液导出管连接废液罐4,且废液导出管上设置有用于切断液体连通的阀6,回流液出口304通过回流液管连接菌液罐2。
该中空纤维柱3的材质为mPES,截留分子量为2500 kD,膜面积为0.02 m2。在切向流过滤中使用的条件如下:TMP :0.6 bar,剪切速率:6000 S-1,进液压<1 bar,进液流速:452.1 mL/min(对于6000 S-1计算)。菌液罐2的搅拌速度为200 rpm。
取制备例1中得到的菌体用SI溶液配制成固含量20%(w/v)的菌液,并放入菌液罐2中,关闭阀6,开启切向流过滤装置,通过第二泵502将菌液导入中空纤维柱3中以对菌液进行2倍浓缩,滤除的液体经过滤出液出口303进入废液罐4,剩余的液体经回流液出口304返回菌液罐2。待浓缩完成时(将该浓缩后的体积记为A,以管路死体积与罐中体积的合计计算),使用第一泵501连续补入5倍体积(即总体积为5A)的生理盐水,进行连续洗涤;再连续补入3倍体积(即总体积为3A)的SI溶液进行置换洗涤,在整个洗涤和浓缩过程中,每洗滤1倍体积后取样检测OD600值,然后按1.5 OD/mL取样12000 g离心1min,弃上清,保存菌体,提取质粒,使用琼脂糖凝胶电泳检测其中的超螺旋比例(%)并计算超螺旋质粒产量(mg/g),结果如图2和表1所示。
对比例1
本对比例用于说明仅用SI溶液洗涤菌体的方法。
使用与实施例1中相同的装置和方法进行菌体的洗涤,区别仅在于,将5倍体积的生理盐水和3倍体积的SI溶液替换为5倍体积的SI溶液进行连续洗涤。每洗滤1倍体积后取样检测OD600值,然后按1.5 OD/mL取样12000 g离心1min,弃上清,保存菌体,提取质粒并检测其中的超螺旋比例(%)和超螺旋质粒产量(mg/g),结果如图2和表1所示。
表1
通过图2和表1的结果可以看出,利用本发明的方法使用生理盐水进行菌体洗涤,所得质粒的超螺旋比例高于使用SI溶液进行菌体洗涤。
实施例2
本实施例用于说明本发明的菌体洗涤方法。
使用与实施例1中相同的装置,采用如下洗涤方法进行菌体洗涤:
(1)取制备例1中得到的菌体137.95 g加入542.5 g SI溶液,得到菌液的总体积为约680 mL,测得其OD600值为99.328。
(2)使用图1所示的中空纤维柱洗菌,进液流速为376.8 mL/min,跨膜压(TMP)维持在0.5 bar,菌液罐2的搅拌速度200 rpm。
(3)待菌液浓缩2倍体积时,开始用生理盐水洗涤2倍体积(以浓缩后的菌液计),进液流速为376.8 mL/min,TMP维持在0.5 bar,搅拌200 rpm。
(4)然后用SI溶液洗涤2倍体积,进液流速为376.8 mL/min,TMP维持在0.5 bar,搅拌200 rpm。
(5)收集菌液到干净的瓶中,称得重量为114 g。
(6)使用100 mL SI溶液冲洗中空纤维柱,并与所得114 g菌液混合。
(7)按1.5 OD取样12000 g离心1min,弃上清,保存菌体,提取质粒。
测得最终得到的质粒中超螺旋比例为82.45%,超螺旋质粒产量为1.5 mg/g。
上述结果说明,生理盐水洗涤2倍,SI溶液置换洗涤2倍,质粒的超螺旋比例高于仅使用SI溶液进行菌体洗涤。
实施例3
本实施例用于说明本发明的菌体洗涤方法。
使用与实施例1中相同的装置和方法进行菌体的洗涤,区别仅在于,洗涤液的种类和用量如表2所示。
表2
提取质粒并检测其中的超螺旋比例和超螺旋质粒产量,从测定结果可以看出,改变生理盐水和SI溶液的用量后,所得超螺旋质粒比例均在77~80%左右,超螺旋质粒产量在1.1~1.5 mg/g的范围内。
实施例4
使用与实施例1中相同的装置和方法进行菌体的洗涤,区别仅在于,将生理盐水分别替换为浓度为0.8%、0.85%、0.95%或1.0%的氯化钠溶液。
分别提取质粒并检测其中的超螺旋比例和超螺旋质粒产量。从测定结果可以看出,使用适当浓度的氯化钠溶液,均能达到提高所得质粒的超螺旋比例和超螺旋质粒产量的效果。
通过引用并入
本文中提到的每个专利和科学文献的全部内容为所有目的通过引用并入本文。
等同性
本公开可以以其他特定方式体现,而不背离其精神或本质特征。因此,上述实施方式在所有情况下应该被当作是说明性的,而不是对本文描述的发明的限制。因此,本公开的范围由随附的权利要求书而不是由上述描述指明,并打算将在权利要求书的等同性意义和范围之内的所有变化涵盖在其中。
Claims (9)
1.一种菌体的洗涤方法,其特征在于,该方法包括:在使用切向流过滤对含有菌体的菌液进行浓缩的过程中,使用氯化钠溶液进行菌体洗涤,然后使用第一盐溶液进行菌体洗涤;
所述切向流过滤使用中空纤维柱进行,所述中空纤维柱的截留分子量为750-2500 kD;
所述氯化钠溶液的浓度为0.9%,所述氯化钠溶液的用量为所述菌液的1-10倍体积;
所述第一盐溶液含有:50 mM的葡萄糖、25 mM的Tris-Cl和10 mM EDTA,且所述第一盐溶液的pH为8.0;所述第一盐溶液的用量为所述菌液的1-10倍体积;
所述菌液中含有10-50wt%的菌体;所述菌体为工程菌,且所述菌体含有质粒。
2. 根据权利要求1所述的洗涤方法,其中,所述切向流过滤的条件包括:跨膜压为0.4-0.9 bar,剪切速率为5000-9000 S-1;通量为12-30 L/m2/h,浓缩倍数为1-10倍。
3.根据权利要求1所述的洗涤方法,其中,所述氯化钠溶液的用量为所述菌液的1-5倍体积。
4.根据权利要求1所述的洗涤方法,其中,所述第一盐溶液的用量为所述菌液的1-5倍体积。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的洗涤方法,其中,所述使用氯化钠溶液进行菌体洗涤的步骤,和/或所述使用第一盐溶液进行菌体洗涤的步骤,在所述浓缩的过程中通过连续导入溶液进行。
6. 根据权利要求5所述的洗涤方法,其中,所述氯化钠溶液和/或所述第一盐溶液的导入速度为300-700 mL/min。
7. 根据权利要求6所述的洗涤方法,其中,所述氯化钠溶液和/或所述第一盐溶液的导入速度为400-500 mL/min。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的洗涤方法,其中,所述菌液中含有30-50wt%的菌体。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的洗涤方法,其中,所述菌体为大肠杆菌。
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GR01 | Patent grant | ||
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