JPH0823976A - ス−パ−コイル状のプラスミドｄｎａの精製方法 - Google Patents
ス−パ−コイル状のプラスミドｄｎａの精製方法Info
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- JPH0823976A JPH0823976A JP16191794A JP16191794A JPH0823976A JP H0823976 A JPH0823976 A JP H0823976A JP 16191794 A JP16191794 A JP 16191794A JP 16191794 A JP16191794 A JP 16191794A JP H0823976 A JPH0823976 A JP H0823976A
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Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】平均孔径が１０ｎｍ〜３５ｎｍである濾過フィ
ルタ−により不純物を除去することを特徴とするス−パ
−コイル状のプラスミドＤＮＡの精製方法。 【効果】プラスミド混合液からス−パ−コイル状のＤＮ
Ａを有害な試薬を使わずに、短時間で精製することがで
きる。
ルタ−により不純物を除去することを特徴とするス−パ
−コイル状のプラスミドＤＮＡの精製方法。 【効果】プラスミド混合液からス−パ−コイル状のＤＮ
Ａを有害な試薬を使わずに、短時間で精製することがで
きる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、プラスミドＤＮＡの精
製方法、更に詳しくは遺伝子工学分野において用いるこ
とができるプラスミドＤＮＡの精製方法に関する。
製方法、更に詳しくは遺伝子工学分野において用いるこ
とができるプラスミドＤＮＡの精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子工学分野の進歩に伴い、遺伝子組
み替えに用いるために細菌や大腸菌からプラスミドＤＮ
Ａを精製することが必要な技術として位置付けられてい
る。プラスミドＤＮＡの精製方法としては、従来、大腸
菌をアルカリ溶菌した後にこれを中和してフェノ−ル抽
出により脱タンパクし、エタノ−ル沈殿によりＤＮＡを
濃縮し、プラスミドサンプルとする方法が用いられてい
るが、この方法には遠心操作が複雑であるという欠点が
ある。そのためこの方法に代わる方法として種々の方法
が検討されている。
み替えに用いるために細菌や大腸菌からプラスミドＤＮ
Ａを精製することが必要な技術として位置付けられてい
る。プラスミドＤＮＡの精製方法としては、従来、大腸
菌をアルカリ溶菌した後にこれを中和してフェノ−ル抽
出により脱タンパクし、エタノ−ル沈殿によりＤＮＡを
濃縮し、プラスミドサンプルとする方法が用いられてい
るが、この方法には遠心操作が複雑であるという欠点が
ある。そのためこの方法に代わる方法として種々の方法
が検討されている。
【０００３】例えば特開平４−３６０６８６号公報に
は、界面活性剤処理で溶菌後メンブレンフィルタ−で不
純物を除去し、次いで限外濾過により不純物を除去する
ことによりプラスミドＤＮＡを得る方法が開示されてい
る。しかし、この方法によって得られたプラスミド中に
はＤＮＡの凝集体、宿主大腸菌由来の直鎖状のＤＮＡ、
プラスミドの多形、すなわちス−パ−コイル状、オ−プ
ンサ−キュラ−状といったものが混合して含まれている
ため、プラスミドＤＮＡをさらに純度よく精製するため
には臭化エチル（ＥｔＢｒ）を用いて超高速遠心分離を
行なう必要があった。この超高速遠心分離では、形状の
異なるＤＮＡに対するＥｔＢｒの結合量の違いにより各
形状のＤＮＡは比重が異なる結果、形状に応じてＤＮＡ
を分離すること、すなわちス−パ−コイル状のプラスミ
ドＤＮＡを他のＤＮＡと分離することが可能となる。し
かし、この方法では発癌性の高いＥｔＢｒを多量に使用
しなければならないため危険であること、超高速遠心分
離を行なう場合には時間が非常にかかり遠心装置が非常
に高価であることなどの問題があった。
は、界面活性剤処理で溶菌後メンブレンフィルタ−で不
純物を除去し、次いで限外濾過により不純物を除去する
ことによりプラスミドＤＮＡを得る方法が開示されてい
る。しかし、この方法によって得られたプラスミド中に
はＤＮＡの凝集体、宿主大腸菌由来の直鎖状のＤＮＡ、
プラスミドの多形、すなわちス−パ−コイル状、オ−プ
ンサ−キュラ−状といったものが混合して含まれている
ため、プラスミドＤＮＡをさらに純度よく精製するため
には臭化エチル（ＥｔＢｒ）を用いて超高速遠心分離を
行なう必要があった。この超高速遠心分離では、形状の
異なるＤＮＡに対するＥｔＢｒの結合量の違いにより各
形状のＤＮＡは比重が異なる結果、形状に応じてＤＮＡ
を分離すること、すなわちス−パ−コイル状のプラスミ
ドＤＮＡを他のＤＮＡと分離することが可能となる。し
かし、この方法では発癌性の高いＥｔＢｒを多量に使用
しなければならないため危険であること、超高速遠心分
離を行なう場合には時間が非常にかかり遠心装置が非常
に高価であることなどの問題があった。
【０００４】一方、特開昭６２−１５５０９０号公報等
には電気泳動法を用いて形状による泳動速度の違いによ
りゲル上で分離し、ゲルからＤＮＡを回収する方法が開
示されている。しかしながら、この方法も発癌性の高い
ＥｔＢｒを使用しなければならないこと、微量のＤＮＡ
しか処理できないことなどの問題があった。
には電気泳動法を用いて形状による泳動速度の違いによ
りゲル上で分離し、ゲルからＤＮＡを回収する方法が開
示されている。しかしながら、この方法も発癌性の高い
ＥｔＢｒを使用しなければならないこと、微量のＤＮＡ
しか処理できないことなどの問題があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、危険
な試薬を使わずに、できるだけ短時間に簡単な操作で大
量のス−パ−コイル状のプラスミドＤＮＡを純度よく精
製することにある。
な試薬を使わずに、できるだけ短時間に簡単な操作で大
量のス−パ−コイル状のプラスミドＤＮＡを純度よく精
製することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は上記課題を解
決すべく鋭意努力した結果、本発明に至った。すなわ
ち、本発明は平均孔径が１０ｎｍ〜３５ｎｍである濾過
フィルタ−によりプラスミド混合液から不純物を除去す
ることを特徴とするス−パ−コイル状のプラスミドＤＮ
Ａの精製方法である。以下、その内容について説明す
る。
決すべく鋭意努力した結果、本発明に至った。すなわ
ち、本発明は平均孔径が１０ｎｍ〜３５ｎｍである濾過
フィルタ−によりプラスミド混合液から不純物を除去す
ることを特徴とするス−パ−コイル状のプラスミドＤＮ
Ａの精製方法である。以下、その内容について説明す
る。
【０００７】本発明の精製法は、プラスミドとしてｐＵ
Ｃ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２等の精製
に用いることができる。プラスミド混合液を得る方法と
しては、従来のアルカリ、界面活性剤、又は加熱処理で
溶菌後フェノ−ル抽出で脱タンパクして得る方法や、例
えば特開平４−３６０６８６号公報に開示されているよ
うな、界面活性剤処理で溶菌後メンブレンフィルタ−で
不純物を除去し、次いで限外濾過により不純物を除去
し、プラスミドＤＮＡを得る方法が採用できる。
Ｃ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２等の精製
に用いることができる。プラスミド混合液を得る方法と
しては、従来のアルカリ、界面活性剤、又は加熱処理で
溶菌後フェノ−ル抽出で脱タンパクして得る方法や、例
えば特開平４−３６０６８６号公報に開示されているよ
うな、界面活性剤処理で溶菌後メンブレンフィルタ−で
不純物を除去し、次いで限外濾過により不純物を除去
し、プラスミドＤＮＡを得る方法が採用できる。
【０００８】本発明者らは、プラスミド混合液からさら
にプラスミドＤＮＡを精製する濾過フィルタ−は、以下
の特性を備えている必要があることを見いだした。 １）ＤＮＡを吸着する素材ではないこと。 ２）ＤＮＡの分画分子量範囲が１万〜１億であること。 ３）混在している細菌断片や大きな凝集物を除去できる
こと。
にプラスミドＤＮＡを精製する濾過フィルタ−は、以下
の特性を備えている必要があることを見いだした。 １）ＤＮＡを吸着する素材ではないこと。 ２）ＤＮＡの分画分子量範囲が１万〜１億であること。 ３）混在している細菌断片や大きな凝集物を除去できる
こと。
【０００９】４）処理容量が高いこと。 ５）処理時間が短いこと。 上記１）の素材として再生セルロース、セルロ−ス、セ
ルロースアセテート、ポリエステル、ビニルクロライ
ド、ポリスルフォン、ナイロン、ビニルクロライド等が
あり、これらのうち特に銅アンモニア再生セルロースが
好ましい。
ルロースアセテート、ポリエステル、ビニルクロライ
ド、ポリスルフォン、ナイロン、ビニルクロライド等が
あり、これらのうち特に銅アンモニア再生セルロースが
好ましい。
【００１０】本発明で使用する濾過フィルタ−は上記
２）、３）、４）、５）を達成し、２０ｎｍ以上の粒子
状の物質や細胞片を効果的に除去するために、フィルタ
ーは平均孔径１０ｎｍ〜３５ｎｍであることが肝要であ
る。本発明でいう濾過フィルタ−の平均孔径はフィルタ
−の透水量から、次式により導かれる。 ２ｒ ＝ ２．０（Ｊ・ｄ・η／ΔＰ・Ａ・Ｐｒρ）
1/2 ２ｒ：平均孔径（ｎｍ） Ｊ：透水量（ｍｌ／ｍｉｎ） ｄ：膜圧（μｍ） η：水の粘度（ｃｅｎｔｉｐｏｉｓｅ） ΔＰ：膜間差圧（ｍｍＨｇ） Ａ：濾過面積（ｍ2） Ｐｒρ：空孔率（％） また、目詰まりが少なく高い処理容量・高い濾過速度を
有するには、多孔からなる多層構造を有する濾過フィル
タ−を使用することが好ましく、中空糸膜、特に銅アン
モニア法再生セルロ−ス多孔性中空糸膜が好ましい。
２）、３）、４）、５）を達成し、２０ｎｍ以上の粒子
状の物質や細胞片を効果的に除去するために、フィルタ
ーは平均孔径１０ｎｍ〜３５ｎｍであることが肝要であ
る。本発明でいう濾過フィルタ−の平均孔径はフィルタ
−の透水量から、次式により導かれる。 ２ｒ ＝ ２．０（Ｊ・ｄ・η／ΔＰ・Ａ・Ｐｒρ）
1/2 ２ｒ：平均孔径（ｎｍ） Ｊ：透水量（ｍｌ／ｍｉｎ） ｄ：膜圧（μｍ） η：水の粘度（ｃｅｎｔｉｐｏｉｓｅ） ΔＰ：膜間差圧（ｍｍＨｇ） Ａ：濾過面積（ｍ2） Ｐｒρ：空孔率（％） また、目詰まりが少なく高い処理容量・高い濾過速度を
有するには、多孔からなる多層構造を有する濾過フィル
タ−を使用することが好ましく、中空糸膜、特に銅アン
モニア法再生セルロ−ス多孔性中空糸膜が好ましい。
【００１１】更に、ＤＮＡの分離と凝集物の除去を効果
的に行う点から中空糸膜の内径は２００〜８００μｍ、
膜厚は１０〜１００μｍ、空孔率は０．３〜０．６であ
ることが好ましい。ここで、空孔率（Ｐr ）は以下の方
法で算出するものである。 Ｐr ＝（１−ρa ／ρ p） ρa ＝Ｗd ／Ｖw ＝４Ｗd ／π・ｌ（Ｄo 2 −Ｄi 2 ） Ｐr ：空孔率 Ｗd ：中空糸膜の絶乾重量 （ｇ） Ｖw ：中空糸膜の体積 （ｃｍ3 ） ｌ ：中空糸膜の長さ （ｃｍ） Ｄo ：中空糸膜の外径 （ｃｍ） Ｄi ：中空糸膜の内径 （ｃｍ） ρ p：セルロ−スの密度 （ｇ／ｃｍ3 ） 以上の特性を満たすものとして、特開平４−３７１２２
１号公報記載の方法等によって得られる銅アンモニア法
再生セルロ−ス多孔性中空糸膜が好ましい。
的に行う点から中空糸膜の内径は２００〜８００μｍ、
膜厚は１０〜１００μｍ、空孔率は０．３〜０．６であ
ることが好ましい。ここで、空孔率（Ｐr ）は以下の方
法で算出するものである。 Ｐr ＝（１−ρa ／ρ p） ρa ＝Ｗd ／Ｖw ＝４Ｗd ／π・ｌ（Ｄo 2 −Ｄi 2 ） Ｐr ：空孔率 Ｗd ：中空糸膜の絶乾重量 （ｇ） Ｖw ：中空糸膜の体積 （ｃｍ3 ） ｌ ：中空糸膜の長さ （ｃｍ） Ｄo ：中空糸膜の外径 （ｃｍ） Ｄi ：中空糸膜の内径 （ｃｍ） ρ p：セルロ−スの密度 （ｇ／ｃｍ3 ） 以上の特性を満たすものとして、特開平４−３７１２２
１号公報記載の方法等によって得られる銅アンモニア法
再生セルロ−ス多孔性中空糸膜が好ましい。
【００１２】本発明によると、夾雑ＤＮＡが混入したプ
ラスミドＤＮＡ液を平均孔径１０〜３５ｎｍの濾過フィ
ルタ−で濾過することにより、ス−パ−コイル状のプラ
スミドＤＮＡを高い割合で含んだ溶液を得ることができ
る。また、濾過処理を繰り返しおこなえば、さらに高い
割合でス−パ−コイル状のプラスミドを含んだ溶液を得
ることができる。
ラスミドＤＮＡ液を平均孔径１０〜３５ｎｍの濾過フィ
ルタ−で濾過することにより、ス−パ−コイル状のプラ
スミドＤＮＡを高い割合で含んだ溶液を得ることができ
る。また、濾過処理を繰り返しおこなえば、さらに高い
割合でス−パ−コイル状のプラスミドを含んだ溶液を得
ることができる。
【００１３】
【実施例】以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を制限しない。
するが、これらは本発明の範囲を制限しない。
【００１４】
【実施例１および比較例１】プラスミドｐＵＣ９で形質
転換した大腸菌ＪＭ８３をアンピシリンを含んだＬロス
中で３７℃、１晩培養した。培養液からアルカリ溶菌法
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｅｃｏｎｄ
ｅｄｉｔｉｏｎ １９８９参照）でプラスミドＤＮＡ
を精製した。さらに、銅アンモニア法再生セルロ−ス多
孔膜中空糸膜（旭化成工業株式会社製「ＰＬＡＮＯＶ
Ａ」１５；平均孔径１５ｎｍ、膜厚２７μｍ、空孔率
０．５、内径３３０μｍ、膜面積０．００１ｍ2 、ＤＮ
Ａの分画分子量範囲１万〜１億）を用いてアルカリ溶菌
法で得られたプラスミド液１０ｍｌを圧力２００ｍｍＨ
ｇで濾過し、１時間でその濾液を回収した。得られたプ
ラスミドＤＮＡについて定法に従いアガロ−ス電気泳動
を行なった。泳動写真を撮影し、デンシトメ−タ−（常
光、デンシトロン ＰＡＶ−ＦＶ）で写真上のＤＮＡバ
ンド量の解析を行なった。その泳動結果を表１に示す。
転換した大腸菌ＪＭ８３をアンピシリンを含んだＬロス
中で３７℃、１晩培養した。培養液からアルカリ溶菌法
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｅｃｏｎｄ
ｅｄｉｔｉｏｎ １９８９参照）でプラスミドＤＮＡ
を精製した。さらに、銅アンモニア法再生セルロ−ス多
孔膜中空糸膜（旭化成工業株式会社製「ＰＬＡＮＯＶ
Ａ」１５；平均孔径１５ｎｍ、膜厚２７μｍ、空孔率
０．５、内径３３０μｍ、膜面積０．００１ｍ2 、ＤＮ
Ａの分画分子量範囲１万〜１億）を用いてアルカリ溶菌
法で得られたプラスミド液１０ｍｌを圧力２００ｍｍＨ
ｇで濾過し、１時間でその濾液を回収した。得られたプ
ラスミドＤＮＡについて定法に従いアガロ−ス電気泳動
を行なった。泳動写真を撮影し、デンシトメ−タ−（常
光、デンシトロン ＰＡＶ−ＦＶ）で写真上のＤＮＡバ
ンド量の解析を行なった。その泳動結果を表１に示す。
【００１５】また、比較のため上記のアルカリ溶菌法で
得られたプラスミド液（濾過フィルタ−を通さないも
の）についても上記方法で電気泳動を行った。その泳動
結果を表１に併せて示す（比較例１）。
得られたプラスミド液（濾過フィルタ−を通さないも
の）についても上記方法で電気泳動を行った。その泳動
結果を表１に併せて示す（比較例１）。
【００１６】
【比較例２】実施例１と同様のアルカリ溶菌法でプラス
ミドＤＮＡを精製した後、濾過フィルタ−を通す代わり
に、アルカリ溶菌法で得られたプラスミド液１０ｍｌ
を、容量５ｍｌのシ−ルチュ−ブ２本に入れ、ＣｓＣｌ
−ＥｔＢｒ平衡遠心法で ６７０００回転ｘ１６．５時
間遠心した。紫外光下、チュ−ブに２つのＤＮＡバンド
が現われるが、上側のバンドには大腸菌由来の直鎖状の
ＤＮＡやオ−プンサ−キュラ−状のプラスミドＤＮＡが
含まれ、下側のバンドにはス−パ−コイル状のプラスミ
ドＤＮＡが含まれているので、そのうち下側のバンドを
回収し、イソアミルアルコ−ルでＥｔＢｒを抽出除去
後、ＴＥ緩衝液中で１昼夜透析処理した。
ミドＤＮＡを精製した後、濾過フィルタ−を通す代わり
に、アルカリ溶菌法で得られたプラスミド液１０ｍｌ
を、容量５ｍｌのシ−ルチュ−ブ２本に入れ、ＣｓＣｌ
−ＥｔＢｒ平衡遠心法で ６７０００回転ｘ１６．５時
間遠心した。紫外光下、チュ−ブに２つのＤＮＡバンド
が現われるが、上側のバンドには大腸菌由来の直鎖状の
ＤＮＡやオ−プンサ−キュラ−状のプラスミドＤＮＡが
含まれ、下側のバンドにはス−パ−コイル状のプラスミ
ドＤＮＡが含まれているので、そのうち下側のバンドを
回収し、イソアミルアルコ−ルでＥｔＢｒを抽出除去
後、ＴＥ緩衝液中で１昼夜透析処理した。
【００１７】得られたプラスミドＤＮＡについて実施例
１と同様にアガロ−ス電気泳動を行なった。結果を表１
に示す。表１の結果より、本方法によれば簡便でかつ短
時間に多量のプラスミドＤＮＡを精製できることがわか
った。
１と同様にアガロ−ス電気泳動を行なった。結果を表１
に示す。表１の結果より、本方法によれば簡便でかつ短
時間に多量のプラスミドＤＮＡを精製できることがわか
った。
【００１８】
【表１】
【００１９】
【発明の効果】本発明の方法によれば、平均孔径１０ｎ
ｍ〜３５ｎｍの濾過フィルタ−で濾過することによりプ
ラスミド混合液からス−パ−コイル状のＤＮＡを有害な
試薬を使わずに、短時間で精製することができる。
ｍ〜３５ｎｍの濾過フィルタ−で濾過することによりプ
ラスミド混合液からス−パ−コイル状のＤＮＡを有害な
試薬を使わずに、短時間で精製することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｍ 1/00 Ａ
Claims (3)
- 【請求項１】 平均孔径が１０ｎｍ〜３５ｎｍである濾
過フィルタ−によりプラスミド混合液から不純物を除去
することを特徴とするス−パ−コイル状のプラスミドＤ
ＮＡの精製方法。 - 【請求項２】 濾過フィルタ−は、ＤＮＡの分画分子量
範囲が１万〜１億である請求項１記載のス−パ−コイル
状のプラスミドＤＮＡの精製方法。 - 【請求項３】 濾過フィルタ−は、銅アンモニア法再生
セルロ−ス多孔膜中空糸膜である請求項１又は２記載の
ス−パ−コイル状のプラスミドＤＮＡの精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16191794A JPH0823976A (ja) | 1994-07-14 | 1994-07-14 | ス−パ−コイル状のプラスミドｄｎａの精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16191794A JPH0823976A (ja) | 1994-07-14 | 1994-07-14 | ス−パ−コイル状のプラスミドｄｎａの精製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0823976A true JPH0823976A (ja) | 1996-01-30 |
Family
ID=15744489
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16191794A Withdrawn JPH0823976A (ja) | 1994-07-14 | 1994-07-14 | ス−パ−コイル状のプラスミドｄｎａの精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0823976A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0395777A (ja) * | 1990-04-18 | 1991-04-22 | Toshiba Corp | ヘツドスライダ支持機構 |
| WO1999007458A1 (en) * | 1997-08-06 | 1999-02-18 | Genentech, Inc. | Hollow fiber co-flow filtration device |
| US5989431A (en) * | 1995-06-08 | 1999-11-23 | Progen Industries Ltd | Method and apparatus for DNA extraction |
| US6969603B2 (en) | 1997-09-22 | 2005-11-29 | Riken | Method for isolating DNA |
| CN117431149A (zh) * | 2023-12-22 | 2024-01-23 | 北京艺妙神州医药科技有限公司 | 一种菌体的洗涤方法 |
-
1994
- 1994-07-14 JP JP16191794A patent/JPH0823976A/ja not_active Withdrawn
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0395777A (ja) * | 1990-04-18 | 1991-04-22 | Toshiba Corp | ヘツドスライダ支持機構 |
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| WO1999007458A1 (en) * | 1997-08-06 | 1999-02-18 | Genentech, Inc. | Hollow fiber co-flow filtration device |
| US6969603B2 (en) | 1997-09-22 | 2005-11-29 | Riken | Method for isolating DNA |
| CN117431149A (zh) * | 2023-12-22 | 2024-01-23 | 北京艺妙神州医药科技有限公司 | 一种菌体的洗涤方法 |
| CN117431149B (zh) * | 2023-12-22 | 2024-03-08 | 北京艺妙神州医药科技有限公司 | 一种菌体的洗涤方法 |
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