CN109294968B - 一种动物核酸疫苗的大规模生产技术 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种动物核酸疫苗的生产方法。本发明对动物疫苗生产所用的培养基和补料的组合、生长条件、诱导时的温度、菌体密度和时间都进行优化，提供了一种高密度生物发酵工艺技术，并通过测试不同规模发酵容积和不同类型的核酸质粒，证明本发明的高密度生物发酵工艺的通用性和这一平台的广泛用途。本发明的高密度生物发酵工艺技术可用于大规模生产，生产的动物疫苗不仅产量高、稳定，而且成本低。

Description

一种动物核酸疫苗的大规模生产技术
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种动物核酸疫苗的大规模生产技术。
背景技术
现有核酸疫苗生产规模较少，纯化多使用层析柱纯化，在产量和成本上都无法和传统疫苗竞争。而传统疫苗也有其缺点，传统疫苗利用鸡胚蛋制造疫苗是一项已有50年历史的技术，但生产疫苗过程中的鸡胚蛋供应量、接种鸡胚蛋能力、病毒增殖率等因素均可影响疫苗生产能力，生产周期长也导致更多的人或动物未有及时免疫导致感染，尤其是没有疫苗生产能力的国家可能因产能问题要较时间才能得到疫苗。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种核酸疫苗的生产方法，包括如下步骤：
(1)将重组菌在发酵罐中进行分批发酵培养，培养11-13小时至碳源全部消耗后，加入补料溶液进行补料，当发酵液OD600为50-100时，分阶段提升培养温度至37-42℃，再培养8-9小时后，得到发酵后菌体；
所述发酵罐中的发酵培养基包括甘油、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、酵母提取物、氯化钠、微量元素溶液、七水硫酸镁、氨芐青霉素和硫胺素盐酸；
所述补料溶液包括甘油、酵母提取物、微量元素溶液和七水硫酸镁；
(2)使用超滤系统将所述发酵后菌体进行裂解纯化，得到核酸疫苗。
上述方法中，所述发酵培养基由甘油、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、酵母提取物、氯化钠、微量元素溶液、七水硫酸镁、氨芐青霉素、硫胺素盐酸和水组成；
所述甘油在所述发酵培养基中的浓度为(20-30)g/L；优选为20g/L；
所述磷酸二氢钾在所述发酵培养基中的浓度为13.3g/L；
所述磷酸氢二铵在所述发酵培养基中的浓度为4g/L；
所述酵母提取物在所述发酵培养基中的浓度为4g/L；
所述氯化钠在所述发酵培养基中的浓度为2g/L；
所述微量元素溶液在所述发酵培养基中的浓度为10ml/L；
所述七水硫酸镁在所述发酵培养基中的浓度为1.2g/L；
所述氨芐青霉素在所述发酵培养基中的浓度为150mg/L；
所述硫胺素盐酸在所述发酵培养基中的浓度为4.5mg/L。
上述方法中，所述补料溶液由甘油、酵母提取物、微量元素溶液、七水硫酸镁和水组成；
所述甘油在所述补料溶液中的浓度为995.2g/L；
所述七水硫酸镁在所述补料溶液中的浓度为40g/L；
所述酵母提取物在所述补料溶液中的浓度为10g/L；
所述微量元素溶液在所述补料溶液中的浓度为14.9ml/L。
本发明以甘油作为补料内的碳源，对菌体密度及质粒量都有着正面的影响。以甘油作为补料在准备工作及实际应用层面上都比用葡萄糖有优势。首先，葡萄糖本身是固体，必先经过溶解才能用作补料，且葡萄糖的水溶性始终有限，大约只可以维持在60％的浓度。如果为了控制发酵量而需要比较高浓度的补料，葡萄糖并不适合。但是，甘油本身就是液态，作为补料，浓度可以达至99％以上，这个特性对于要限制发酵容量以达至高菌体密度的发酵尤为重要。其次，在高压灭菌的过程中，甘油比葡萄糖较为稳定，不容易降解。
上述方法中，步骤(1)中，所述发酵液OD600优选为50；所述分阶段提升培养温度至37-42℃，再培养8-9小时，具体为提升培养温度至37℃，培养4小时后，再次提升培养温度至40℃，再培养4–5小时。
上述方法中，所述步骤(2)包括如下步骤：
1)将发酵后菌体稀释至(20-35)OD600，用裂解液裂解发酵后菌体，将发酵后菌体内的质粒释放在裂解液中，得到裂解后菌体；
2)将所述裂解后菌体依次经过过滤澄清、浓缩和生理盐水透析后，再进行硫酸铵沉淀作用，得到沉淀后的质粒液；
3)将所述沉淀后的质粒液依次经过过滤和PBS透析，得到透析后的质粒液；
4)将所述透析后的质粒液依次经过浓缩和除菌过滤，得到疫苗成品。
上述方法中，步骤1)中将发酵后菌体优选稀释至30 OD600。
上述方法中，所述裂解液由溶液一、溶液二、溶液三和溶液四组成。所述溶液一由蔗糖(0.15M)、Tris(0.05M)、EDTA(0.01M)和水组成，所述溶液二由氢氧化钠(0.2M)、SDS(质量分数为1％)和水组成；所述溶液三由醋酸钾(3M)、冰醋酸(质量分数为18％)和水组成；所述溶液4为浓度为2M的氯化钙水溶液。
上述方法中，步骤1)前还包括通过1000K超滤系统将所述发酵后菌体中的培养基交换为溶液一的步骤；所述1000K超滤系统使用Biomax膜包。
上述方法中，所述生理盐水透析和所述PBS透析均使用Ultracel膜包。
上述方法中，所述重组菌为将含有编码某种抗原蛋白的外源基因的质粒导入宿主菌中得到的菌；所述重组菌OD600值为2-3。所述重组菌OD600值优选为2。
上述方法中，所述重组菌在加入发酵罐前还包括如下步骤：将所述重组菌接种至LB培养基中培养，过夜培养至OD600值为2-3时，得到一级种子液；将所述一级种子液接种至LB培养基中继续培养，培养8-9小时至OD600值为2-3时，得到二级种子液；将所述二级种子液离心，去上清液，收集菌体沉淀，用LB培养基将所述菌体沉淀进行重悬，得到离心后的菌液，将所述离心后的菌液加入发酵罐中。其中，所述离心后的菌液与所述发酵罐内的发酵培养基的体积比为1:1。所述OD600值优选为2。
上述方法中，所述硫酸铵的浓度为3-3.8M，优选为3.5M；所述硫酸铵沉淀作用的时间为20-40min，优选为30min。
上述方法中，所述宿主菌为大肠杆菌；所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌E.coliDY330或大肠杆菌E.coli DH5α。在本发明的一个具体实施例中，所述大肠杆菌为大肠杆菌E.coli DH5α。
本发明的另一个目的是提供上述方法的新用途。
本发明提供了上述方法在大规模生产动物核酸疫苗中的应用。
本发明还提供了上述方法在提高核酸疫苗产量中的应用。
本发明还有一个目的是提供上述发酵培养基和上述补料溶液。
本发明的最后一个目的是提供一种用于生产核酸疫苗的产品。
本发明提供的用于生产核酸疫苗的产品包括上述发酵培养基和/或上述补料溶液。
上述发酵培养基或补料溶液或上述产品在大规模生产动物核酸疫苗中的应用也属于本发明的保护范围；
上述发酵培养基或补料溶液或上述产品在提高核酸疫苗产量中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明纯化工艺技术所使用的超滤系统包括1000K超滤系统(Biomax膜包)和100K超滤系统(Ultracel膜包)，可向Millipore公司定制获得。
本发明对动物疫苗生产所用的培养基和补料内碳源、生长条件、诱导时的温度、菌体密度和时间都进行优化，提供了一种高密度生物发酵工艺技术，并通过测试不同规模发酵容积和不同类型的核酸质粒，证明本发明的高密度生物发酵工艺的通用性和这一平台的广泛用途。本发明的高密度生物发酵工艺技术和纯化工艺技术可用于大规模生产，生产的动物疫苗不仅产量高、稳定，而且成本低。
附图说明
图1为裂解仪的结构图。
图2为物质去除仪的结构图。
图3为操作物质去除仪的结构图。
图4为超滤的原理。
图5为超滤系统的管道分布图。
图6为化学裂解菌前体浓度和质粒回收量关系。注：虚线为菌体浓度和裂解液质粒总量假设同步上升线。
图7为不同浓度的氯化钙对沉淀RNA的影响(1％琼脂糖凝胶电泳/染色1XGelRed)。注:S–上清；P–沉淀物；对照(Control)–裂解液上清。
图8为不同浓度的氯化锂对沉淀RNA的影响(1％琼脂糖凝胶电泳/染色1XGelRed)。注:S–上清；P–沉淀物；对照(Control)–裂解液上清。
图9为不同浓度的硫酸胺对沉淀RNA的影响(上清)(1％琼脂糖凝胶电泳/染色1XGelRed)。
图10为不同浓度的硫酸胺对沉淀RNA的影响(沉淀物)(1％琼脂糖凝胶电泳/染色1X GelRed)。
图11为重组DNA质粒在大肠杆菌DH5菌种中生产的密度变化。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的1升的微量元素溶液的配方如下(微量元素溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水)：
溶质 质量
柠檬酸(C<sub>5</sub>H<sub>8</sub>O<sub>7</sub>H<sub>2</sub>O) 170g
Titriplex III(EDTA)(二水合乙二胺四乙酸二钠盐) 0.84g
CoCl<sub>2</sub>6H<sub>2</sub>O 0.25g
CuCl<sub>2</sub>2H<sub>2</sub>O 0.15g
CaCl<sub>2</sub>2H<sub>2</sub>O 4g
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub> 0.3g
MnCl<sub>2</sub>4H<sub>2</sub>O 1.5g
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>2H<sub>2</sub>O 0.25g
Zn(CH<sub>3</sub>COO)<sub>2</sub>2H<sub>2</sub>O 1.3g
Fe(III)citrate hydrate(三水合柠檬酸铁) 10g
下述实施例2中的溶液配方(各个溶液均由溶剂和溶质组成，溶剂均为水)：
Figure BDA0001359362480000041
Figure BDA0001359362480000051
下述实施例中的物质去除仪为格兰柏生化公司自主研发和生产，在专利号为ZL201120231958.3的专利中公开过。
下述实施例中的生物反应器为德国贝朗公司的产品。
下述实施例中的裂解仪是格兰柏生化科技有限公司的产品，型号为GP-LM16。
下述实施例中的大肠杆菌E.coli DH5α，为人工培养致弱菌种，由美国Invitrogen公司提供。
下述实施例中的酵母提取物购自Oxoid公司，产品目录号为LP0021，硫胺素盐酸购自VWR公司，产品目录号为28605.180。
下述实施例中的H5N1亚型Re-1株质粒(pCAGGoptiAH)在文献“AntiviralResearch”中以题目“Enhanced protective efficacy of H5subtype avian influenzaDNA vaccine with codon optimized HA gene in a pCAGGS plasmid vector(2007)”公开过，公众可从申请人(格兰柏生化科技有限公司)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的猪生长素释放因子(pUPAGRF)由领前基因有限公司自主研发，在美国专利号：US6486134B2和中国专利号：CN1288754A公开过，公众可从申请人(格兰柏生化科技有限公司)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的猪白介素12(pCMVIL-2)和猪瘟(pSFV1CS-E2)质粒均在文献“Vaccine”中以题目“Enhancement of the immunogenicity of an alphavirusreplicon-based DNA vaccine against classical swine fever by electroporationand coinjection with a plasmid expressing porcine interleukin 2(2012)”公开过，公众可从申请人(格兰柏生化科技有限公司)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、动物核酸疫苗的高密度生物发酵工艺-发酵
(一)动物核酸疫苗的高密度生物发酵工艺中的发酵方法
一、培养基和溶液的配置
1、一/二级种子摇瓶培养基的配置
一/二级种子摇瓶培养基(LB培养基)的溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度为：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L。经过121℃的高温加压消毒30分钟后即可使用。
2、发酵罐培养基的配置
发酵罐培养基(下述实施例中的GP01/07)是将表1中的各溶质溶解在0.95公升水中得到的培养基，各溶质在培养基中的浓度如表1所示。经过121℃的高温加压消毒30分钟后即可使用。
表1、发酵罐培养基配方
Figure BDA0001359362480000061
注：#–七水硫酸镁溶解在50ml水，高温121℃，消毒30分钟，加进已消毒的发酵罐；*–氨芐青霉素和硫胺素盐酸用0.22m过滤器过滤后，加进已消毒的发酵罐。
3、补料溶液的配置
补料溶液(下述实施例中的GP01/07补料)的溶剂为水，溶质及其在补料溶液中的浓度分别为甘油995.2g/L、七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)40g/L、酵母提取物10g/L、微量元素溶液14.9ml/L。
二、发酵方法
1、种子库的制备
将重组DNA质粒转化大肠杆菌DH5α，在30℃温箱中培养过夜，挑选一个单菌落，接种于氨芐青霉素阳性的LB培养基中培养到对数生长期OD600值为2-3时，加入最终体积分数为15％的已进行高温灭菌程序的甘油内，以每瓶1ml的分量分装在2ml的小瓶内并存放在-80C的冷藏库内作为种子库。
2、种子液的一级/二级培养
(1)一级培养
准备50毫升一级种子培养基，装入250毫升的带挡板摇瓶内，高温121℃消毒30分钟后，接种前加入150mg/L氨芐青霉素，加入种子库中甘油冻存的种子液，放在30℃摇床，200rpm，过夜培养后OD600大约为2-3，得到一级种子液。
(2)二级培养
准备500毫升一级种子培养基，装入2升的带挡板摇瓶内，接种摇瓶数量根据发酵罐培养基容积决定，高温121℃消毒30分钟后，接种前加入150mg/L氨芐青霉素，过夜培养的菌液(一级种子培养液)的OD600大约为2-3时，按照1.5％的接种量加入到2升摇瓶内，放在30℃摇床，200rpm，培养8-9小时，OD600大约为2-3，得到二级种子液。
3、批次发酵
待二级种子液的OD600值大约为2-3时，将二级种子液离心，去上清，收集沉淀并接种于含有发酵培养基的发酵罐内。设定实验反应条件为30℃，溶氧(DO)20％，pH6.8，搅拌速度和溶氧级联，培养细菌生长到达稳定期后收获，其间测量菌液的OD值，并按Promega公司的Wizard Plus Minipreps DNA Purification System说明书提取质粒，用紫外分光光度计测量样本在波长260nm时的吸收值。吸收值、稀释倍数和系数50的乘积就是质粒的浓度(mg/L)。
根据需要，可以选择在不同工作容积发酵罐中进行发酵培养。不同工作容积发酵罐的发酵方法分别如下：
(1)5升工作容积发酵罐的种子培养
准备发酵罐培养基，连发酵罐一起高温121℃消毒30分钟，接种前加入150mg/L氨芐青霉素和4.5mg/L硫胺素盐酸。二级种子瓶培养8-9小时后，待种子液OD600值大约为2-3时，离心，去上清，收集沉淀并使用约50–100毫升无菌的摇瓶培养基进行悬浮，然后加入已消毒的发酵罐培养基内，加入发酵罐的离心菌液的体积与发酵罐内培养基的容积相同，接种后的开始OD600值也是接近2-3。温度控制在30℃，加入最少1vvm的空气，搅拌和溶氧关联，维持最少20％溶氧，如果菌液密度高时，无法用空气控制溶氧，可以混和氧气来控制，使用25-28％氨水维持发酵罐培养基酸碱度为6.8，过夜培养。当培养基碳源甘油消耗完后，开始进行补料，补料速度是经特定计算，当菌液OD600到达50，将菌液温度在1.5小时内降到10℃或以下，然后将菌液在无菌操作下收取到预先4℃冷冻的无菌接种瓶内，接种瓶内有定量的甘油，并已预早121℃高温消毒30分钟，收取的菌液在混和后放到4℃一小时，每10分钟混和一次，最后放到零下20℃储存，最多储存一个月。
(2)100升工作容积发酵罐的种子培养
准备发酵罐培养基，连发酵罐一起高温121℃消毒30分钟，接种前加入150mg/L氨芐青霉素和4.5mg/L硫胺素盐酸。然后加入5升发酵罐中收获的甘油冻存种子液，接种后的开始OD600值也是接近2-3。温度控制在30℃，加入最少1vvm的空气，搅拌和溶氧关联，维持最少20％溶氧，如果菌液密度高时，无法用空气控制溶氧，可以混和氧气来控制，使用25–28％氨水维持发酵罐培养基酸碱度为6.8，培养11–13小时后，培养基碳源甘油会消耗完，然后开始进行补料，当菌液OD600到达50，将菌液温度在1.5小时内降到10℃或以下，然后将菌液在无菌操作下收取到预先4℃冷冻的无菌接种瓶内，接种瓶内有定量的甘油，并已预早121℃高温消毒30分钟，可以收取多个种子，收取的菌液在混和后放到4℃一小时，每10分钟混和一次，最后放到零下20℃储存，最多储存一个月。
(3)1000升工作容积发酵罐的生产发酵
跟100升发酵罐一样，准备发酵罐培养基，连发酵罐一起高温121℃消毒30分钟，接种前加入150mg/L氨芐青霉素和4.5mg/L硫胺素盐酸。然后加入100升发酵罐中收获的部份甘油冻存种子液，接种后的开始OD600值也是接近2-3。温度控制在30℃，加入最少1vvm的空气，搅拌和溶氧关联，维持最少20％溶氧，如果菌液密度高时，无法用空气控制溶氧，可以混和氧气来控制，使用25–28％氨水维持发酵罐培养基酸碱度为6.8，培养11–13小时后，培养基碳源甘油会消耗完，然后开始进行补料，补料的速度根据生长速率来计算，当菌液OD600到达50，提升培养温度至37℃，培养4小时后，再次提升培养温度至40℃，再培养4–5小时后完成发酵，将菌液温度在1.5小时内降到10℃或以下，然后进入纯化阶段。其间测量菌液的OD值，并按Promega公司的Wizard Plus Minipreps DNA Purification System说明书提取质粒，用紫外分光光度计测量样本在波长260nm时的吸收值。吸收值、稀释倍数和系数50的乘积就是质粒的浓度(mg/L)。
(二)动物核酸疫苗的高密度生物发酵工艺中发酵方法的优化
一、发酵培养基的优化
培养基的优化过程分为三个部分进行，首先以摇瓶实验对比LB培养基、2XYT培养基及复合培养基对菌株生长的影响，其次是探讨培养基及补料内不同的原料成份对菌株生长的影响，最后是优化培养基作为培植重组DNA质粒转化大肠杆菌DH5α菌种的专用培养基。具体优化步骤如下：
1、LB培养基、2XYT培养基及复合培养基对菌株生长的影响
筛选及优化培养基最初都会以摇瓶进行，采用摇瓶的好处是可以在短时间内筛选合适的化合物作为培养基的组合。组成培养基的化合物必须能够完全溶解在水里，化合物之间不能相互产生化学作用，并且不会在高温的环境下分解。本发明采用摇瓶实验对比LB培养基、2XYT培养基及GP01/06复合培养基对菌株生长的影响，以LB及2XYT培养基作为参考，测试复合培养基GP01/06对菌株生长的影响，相比起LB及2XYT这两种普遍用于培植细菌的培养基，GP01/06复合培养基加入了葡萄糖为碳源，并且加了一个磷酸缓冲液来减少酸碱对菌株生长的影响。
将0.1％甘油冻存的E.coli DH5α菌株(带有H5N1亚型Re-1质粒)分别接种于LB培养基、2XYT培养基及GP01/06复合培养基中进行培养，实验设定培养条件为37℃，摇床转速为200rpm。LB培养基、2XYT培养基及复合培养基的配方如表2所示。
表2、LB培养基、2XYT培养基及GP01/06复合培养基的配方
Figure BDA0001359362480000091
采用分光光度计，波长600nm测定菌体密度。另外质粒量则抽取4OD600的菌液[菌液(毫升)＝4/菌液的OD600]，离心并去除上清，按Promega公司的Wizard Plus Minipreps DNAPurification System说明书提取质粒，并使用分光光度计测量质粒量。
结果如表3所示。LB培养基、2XYT培养基及GP01/06复合培养基培养菌株后的菌体密度相差不多，但2XYT培养后在菌内的质粒量明显高于其他培养基。这个结果表明：质粒量与加入的碳源浓度或碳源的性质有关。
表3、以摇瓶实验测试不同培养基对菌株及质粒量的影响
培养基 生长时间(小时) 温度(℃) 菌体密度(OD<sub>600</sub>) 质粒量(mg/L)
LB 15 37 3.24 12.07
2XYT 8 37 4.74 18.41
GP01/06 12 37 3.34 8.55
2、碳源的选择与菌体生长密度及质粒量的关系
将步骤1中的GP01/06复合培养基的葡萄糖替换为甘油，且保持其他组分和浓度不变，得到以甘油作为碳源的GP01/06复合培养基。按照步骤1中的方法，在发酵参数相同的条件下，观察以甘油作为碳源的GP01/06复合培养基对菌体密度及质粒产量的影响。
表4、碳源料的选择与菌体生长密度及质粒量的关系
碳源 生长时间(小时) 温度(℃) 菌体密度(OD<sub>600</sub>) 质粒量(mg/L)
葡萄糖 12 37 3.34 8.55
甘油 12 37 7.63 27.16
结果如表4所示。在相同的生长环境之下，以甘油作为碳源的GP01/06复合培养基的菌体密度比以葡萄糖作为碳源的GP01/06复合培养基多出一倍，而质粒量更是多出三倍。这是由于高浓度的葡萄糖会抑制菌体的生长。这种碳源抑制菌体生长的现象较常出现在使用葡萄糖的情况之下，而且可使用的葡萄糖浓度很低，抑制生长的情况一般在20g/L以上的葡萄糖浓度便会发生。虽然使用甘油亦会面对相同的问题，但相对葡萄糖而言，可使用的浓度较高，一般要到40g/L以上的浓度才会出现抑制菌体生长的情况，因此，下面培养基的优化实验中都以甘油为主要的碳源。
3、培养基及填料内不同原料的选择
为了使菌株有更佳的生长环境，利用三个小型发酵罐(500ml)取代摇瓶实验将以甘油作为碳源的GP01/06复合培养基作为培养基对E.coli DH5α菌株(带有H5N1亚型Re-1质粒)进行发酵培养，根据GP01/06复合培养基中各组分浓度的不同分为批次甲、批次乙和批次丙(不同批次的培养基的配方如表5所示)，发酵条件均为35℃，溶氧(DO)20％，pH6.8，搅拌速度由程序根据溶氧调节。观察化合物浓度的改变对菌体密度及质粒量的影响。
表5、发酵实验所选用的培养基内化合物的浓度
Figure BDA0001359362480000101
结果如表6所示。结果表明：批次丙的菌体密度及质粒量明显高于其他批次。这可能与减少了培养基内的硫化镁有关。其实，培养基内的化合物浓度是有一定限制的。浓度太少，就起不了支持生长的作用；太多，又会抑制菌体的生长。以镁而言，一般在培养基内的浓度都不能超过8.7g/L，超过了这个浓度，不但不能支持菌体的生长，反过来还会加以抑压。故此，为了进一步增加菌体密度，在高密度发酵的时候，一般都会采用补料的方法来进行，其中的好处是可以减少批次发酵时某些有助生长的主要化合物的浓度不至于过高而抑制菌体生长，其次是透过填料的速度来延长发酵的时间以达至高菌体密度。
表6、改变培养基内化合物浓度与菌体生长密度及质粒量的关系
批次 发酵时间(小时) 温度(℃) 菌体密度(OD<sub>600</sub>) 质粒量(mg/L)
甲 29 35 16.44 56.22
乙 29 35 17.12 59.06
丙 29 35 37.2 145.8
4、指定培养基GP01/07
为了确保质粒量的稳定生产，一般在正式生产时都会采用指定培养基取代复合培养基。故此，根据以甘油作为碳源的GP01/06复合培养基，本发明设计了一个指定培养基GP01/07作为以填料发酵来培植重组DNA质粒转化大肠杆菌DH5α菌种的专用培养基。指定培养基GP01/07除去了GP01/06复合培养基中的复合化合物蛋白胨，简化了磷酸缓冲液的结构，并加入(NH4)2HPO4弥补复合化合物内的氮源，进一步减少了硫化镁在培养基内的浓度，转移以补料的方式加入。并且加入了维生素和微量元素，使菌体在批次发酵其间能够得到最有利的生长条件，指定培养基GP01/07内化合物的成份和浓度如表7所示。
表7、指定培养基内化合物的成份和浓度
GP01/07 浓度(g/L) GP01/07补料 浓度(g/L)
甘油 20 甘油 995.2
磷酸二氢钾KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 13.3 MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 40
磷酸氢二铵(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 4 酵母提取物 10
酵母提取物 4 微量元素溶液 14.9(ml/L)
氯化钠 2
微量元素溶液 10(ml/L)
#MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 1.2
*硫胺素盐酸 4.5(mg/L)
5、GP01/07培养基的生产验证
将重组质粒pCAGGoptiHA(pCAGGoptiHA在文献“Enhanced protective efficacyof H5subtype avian influenza DNA vaccine with codon optimized HA gene in apCAGGS plasmid vector”中公开过)转化大肠杆菌DH5α菌种，并用指定培养基GP01/07来进行生产验证。发酵培养条件如表8所示。
表8、以指定培养基培植重组DNA质粒转化大肠杆菌DH5α菌种的实验结果
Figure BDA0001359362480000121
结果如表8所示。结果证明经优化后的指定培养基GP01/07的菌体密度能够达到100OD附近。因此核酸质粒生产的发酵培养基选择指定培养基GP01/07。
二、不同发酵温度的比较试验
按照步骤(一)的二中的发酵方法进行发酵培养，发酵温度分别设为30℃、35℃、37℃、40℃及42℃，测量在不同温度条件下发酵培养后的菌液OD值，并按Promega公司的Wizard Plus Minipreps DNA Purification System说明书提取质粒，用紫外分光光度计测量样本在波长260nm时的吸收值。吸收值、稀释倍数和系数50的乘积就是质粒的浓度(mg/L)。
在补料发酵方式下，不同的发酵温度对菌体密度影响很大，以发酵温度30℃时OD600值最高，OD600值为190.0。然而，质粒量在发酵温度为40℃时最高，达438.5mg/L(表9)。
表9、发酵温度与菌体生长密度及质粒量的关系
发酵方法 时间(小时) 温度(℃) 菌体密度(OD<sub>600</sub>) 质粒量(mg/L)
补料发酵 23 30 190.0 275.0
补料发酵 23 35 81.0 263.0
补料发酵 23 37 110.4 396.8
补料发酵 29 40 93.4 438.5
补料发酵 23 42 67.6 223.9
上述结果可以看出：在温度较高的条件下，细胞所含的质粒量有所提升。由于长时间的42℃培养导致E.coli无法在高温下维持活性，以至菌种密度及质粒量都有所回落。发酵温度为30℃时OD600值最高，但产量则最低，因此采用二段培养，菌体先在30℃培养，目的是提升菌体密度，当密度达到要求，才提升发酵温度诱导质粒生产，提高质粒产量。
在生产上，为避免长时间高温导致E.coli死亡，及考虑高温对生产批次间产量的不稳定性，当然也要平衡高温有利于质粒的最终产量，最后选择质粒诱导在37-42℃分阶段提升温度培养8-9小时至收取菌液，既提高最终质粒产量，也减少高温对菌体的影响。
三、不同菌体密度诱导质粒生产的比较试验
按照步骤(一)的二中的发酵方法进行发酵培养，当细菌生长到不同OD600时诱导升温，达稳定期后收获，其间测量菌液的OD值，将收获的菌液按Promega公司的Wizard PlusMinipreps DNA Purification System说明书提取质粒，用紫外分光光度计测量样本在波长260nm时的吸收值。吸收值、稀释倍数和系数50的乘积就是质粒的浓度(mg/L)(表10)。
表10、不同诱导的菌液密度和质粒量的关系
发酵方法 时间(小时) 升温(OD<sub>600</sub>) 菌体密度(OD<sub>600</sub>) 菌质粒量(mg/L)
补料发酵 26 ～50 106.4 576
补料发酵 31 ～75 136 551
补料发酵 34 ～100 186.4 545
二级培养首先是在30℃培养增加菌体密度，然后再提升温度增加质粒产量。本发明为了找出适合升温的菌体密度，对三个不同的OD值均进行了实验，虽然高OD值升温，最后得到较高的菌体密度，但从表10中可以看出：OD值为100时升温时，最后个体的质粒量较低。但整体每升的质粒量还是比较接近，所以选择50-100 OD值作为升温条件。
四、测试核酸疫苗生产诱导时间
由于太长时间的高温诱导也会对细菌生长和质粒有负面影响，而大量菌体死亡会增加下游纯化的难度和成品的杂质。因此选择优化后的生产参数，按照步骤(一)的二中的发酵方法对E.coli DH5α菌株(带有H5N1亚型Re-1质粒)进行发酵培养，观察质粒产量在整个发酵过程中的菌体密度变化，确定最佳收获菌液时间。
结果如图11所示(批次1和批次2为相同条件下的重复试验)。从图中可见，菌体密度在诱导9小时后会下降，菌体开始因高温而死亡，因此选择在升温诱导后8-9小时就要冷却收获，避免因菌种死亡增加下游纯化的困难。
五、测试不同规模的H5亚型禽流感核酸疫苗生产
选择优化后的生产参数，按照步骤(一)的二中的发酵方法对E.coli DH5α菌株(带有H5N1亚型Re-1质粒)进行不同规模(L)的多批次生产，检测本发明的工艺产量在不同规模的质粒生产上是否一致。
结果如表11所示。结果表明：不同规模(L)的多批次生产获得的质粒产量至少可达400mg/L以上。说明本发明的高密度生物发酵生产核酸质粒的工艺技术是成熟和可以规模化的。
表11、不同规模的重组DNA质粒验证结果
时间(h) 规模(L) 菌体密度(OD<sub>600</sub>) 质粒量(mg/L)
28.5 1 135.2 426
26 3 106.4 576
26.5 3 96.0 466
30 30 113 494
25 40 98.8 598
26 60 100.4 432
25 70 112 542
27 150 108 465
24 300 128.8 453
六、测试不同重组核酸疫苗生产
高密度生物发酵生产核酸质粒的工艺技术是一个生产平台，为了验证本发明的工艺技术是否适用于不同核酸质粒，选择优化后的生产参数，按照步骤(一)的二中的发酵方法验证带有不同重组DNA质粒的E.coli DH5α菌株生产疫苗这一平台的广泛用途。
结果如表12所示。从表中可以看出：高密度生物发酵生产核酸质粒的工艺在不同质粒中是通用的，菌体密度普遍能超过100 OD，产量普遍每升的质粒量都接近或超过400mg，个别较低产量的质粒主要是因为质粒的架构不同，使质粒的套数(copy number)较低。
表12、不同重组DNA质粒的生产验证结果
质粒 菌体密度(OD<sub>600</sub>) 质粒量(mg/L)
H5N1亚型Re-1株(pCAGGoptiAH) 106.4 576
猪瘟(pSFV1CS-E2) 89.4 376
猪生长素释放因子(pUPAGRF) 114.4 460
猪白介素12(pCMVIL-2) 133.8 430
实施例2、动物核酸疫苗的高密度生物发酵工艺-纯化
(一)动物核酸疫苗的高密度生物发酵工艺中的纯化方法
动物核酸疫苗的高密度生物发酵工艺中的纯化方法如下：先用超滤系统把发酵后菌体的大部分培养基清除。然后用化学反应把发酵后的菌体裂解，菌体内的质粒会被释放在裂解液中。经过一系列的过滤澄清后，用超滤系统将裂解液浓缩及透析。大部分的杂质会透过沉淀作用作进一步清除。再经过一系列的过滤后，用超滤系统将质粒液浓缩及透析。最后把透析后的质粒液进行除菌过滤，制成最后产品。本发明以1000升发酵后的菌体为纯化规模进行纯化，具体步骤如下：
1、发酵后菌体的处理
将发酵后菌体中的培养基交换为溶液一，得到处理后的菌体。具体步骤如下：完成发酵后的菌体充满发酵时用的培养基，这些培养基带有杂质和高盐度，所以会先把菌体由发酵罐传送到一个交换罐里，用1000K超滤系统(Millipore CUF600System with 1000KMILLIPORE PELLICON 2系列的膜包，整个超滤系统可向Millipore公司订制)进行三个体积的溶液一透析(缓冲液交换)，把培养基交换成溶液一，有利于之后的菌体裂解。因为溶液一的电导值是3mS/cm，所以完成透析后，要量度超滤透过液的电导值，确定数值低于5mS/cm，证明大部分的培养基已被溶液一换去。使用的溶液一要预先冷冻，亦要启动交换罐的冷冻系统。在使用1000K超滤系统前已把膜包清洗干净，再用溶液一平衡系统。完成发酵后的菌体浓度通常是100 OD600或以上(OD600是菌体浓度的单位)。如果浓度高于100 OD600，要用溶液一进行稀释；相反如果浓度低于100 OD600，就先以超滤浓缩菌体至相等于100 OD600的体积，再进行透析。
2、稀释菌体
用溶液一将处理后的菌体稀释至30 OD600，得到稀释后的菌体。具体步骤如下：量度交换罐里的菌体体积，计算稀释菌体到30 OD600时的总体积，总体积(L)计算方法为发酵完成时的体积×发酵完成时OD600/稀释菌体的OD600值。将超滤系统的进口管道连接到溶液一，关掉透过液阀门。开动系统抽入溶液一，把吸附在膜包的膜上的菌体冲刷到交换罐里。当菌体体积到达计算的体积后，关掉系统。取样量度OD600，确定菌体浓度是30 OD600。
3、菌体裂解
裂解稀释后的菌体，得到裂解后的菌体。具体步骤如下：
(1)清洗裂解仪
整个过程以裂解仪(图1)进行，所以使用前要清洗好。把裂解仪的溶液一、二、三及四的管道连接到0.5M氢氧化钠和出口管道连接到排污。开动泵，把裂解仪管道内的空气排走。四台泵的操作稳定后，启动「自动清洗」。一小时后，用纯化水冲洗，直到量度出口废水的pH值是跟进口的纯化水一样。取样检测内毒素含量，之后用压缩空气清除所有水，吹干备用。
(2)菌体裂解
菌体裂解时，除了菌体外，会使用溶液二、三及四。溶液三和四要预先冷冻。溶液二在使用前现配，以确保效能。而且不能冷冻，否则配方内的SDS会沉淀出来。
准备好30 OD600的稀释菌体后，把连接交换罐到超滤的管道阀门关掉，同时连接交换罐到裂解仪的溶液一泵管道。之后把溶液二、三及四的管道也连接好。把裂解仪出口的管道连接到一个裂解储罐，预先启动冷冻系统。
启动菌体裂解程序，溶液一、二、三及四的泵会以6:6:3:3的流速运作。菌体和溶液二的流速是6L/min；溶液三及四的流速是3L/min。裂解时，交换罐的底搅拌要长开，确保菌体的浓度一致。当菌体和溶液二接触后，会进入管道混合器混合。管道混合器增加菌体与溶液二混合及反应时间。混合后，系统会加入溶液三，并以6吋的管道混合器混合，最后加入溶液四。完成的裂解液会从高处加入裂解储罐，储存一个晚上。裂解液中的固体废物，絮状物，会在储存期间从裂解液慢慢地分离到裂解液的上面，以便之后的过滤澄清，减少过滤器压力过大的机会。裂解储罐的冷冻系统一定要预先启动。因为质粒对温度很敏感，适宜用低温储存。常温或高温会把质粒的超螺旋开环。
4、过滤及澄清
将裂解后的菌体进行过滤澄清，得到过滤澄清后菌体。具体步骤如下：
(1)分离絮状物
1)清洗物质去除仪
分离絮状物的过程以物质去除仪(图2)进行，所以使用前要清洗好。物质去除仪主要由滚筒分离器、不锈钢筛网、搜集床及罩盖组成。如果物质去除仪是第一次使用，就要用5％SDS溶液把所有不锈钢表面洗刷，不锈钢筛网亦要拆下来洗刷，之后再用纯化水冲清干净。把所有不锈钢筛网泡在0.5M氢氧化钠一个晚上；同时亦要把0.5M氢氧化钠加到搜集床，启动「清洗模式」，让滚筒分离器转动一小时，再浸泡一个晚上。浸泡完了，用纯化水冲清所有不锈钢筛网和滚筒分离器及搜集床。把不锈钢筛网重新装上滚筒分离器，启动「清洗模式」，并以20mM Tris,pH 7.4浸泡至少三小时。浸泡后要取样量度pH值，如果pH值还是7.4左右，就可以重新用纯化水冲洗，再取样检测内毒素含量。之后排走所有纯化水，保持罩盖打开，让去除仪自然风干。
2)操作物质去除仪
连接裂解储罐出口到物质去除仪进料口的管道，把搜集床出口连接到中间罐。把固体搜集口配件装在滚筒分离器的固体搜集口(图3)。
启动物质去除仪，同时开始把裂解液传送到物质去除仪进料口。裂解液会穿过不锈钢筛网到搜集床上，再慢慢流到搜集床出口及中间罐。相反，固体的絮状物穿不过不锈钢筛网，会随着滚筒分离器的转动，运到固体搜集口，最后收集在外加的桶内。
(2)深层过滤
分离了固体絮状物的裂解液会再经过一系列的深层过滤，去除微小的杂质。第一个过滤滤芯是PALL的T2600，孔径是40μm。过滤到一个中间罐后，第二个过滤滤芯是PALL的PDK5，孔径是20μm。再过滤到一个中间罐后，第三个过滤滤芯是Millipore的MILLIGARD，孔径是0.22μm。要把套筒清洗干净才装上滤芯。在过滤时，要控制压力不超过1bar；如果压力开始接近1bar，要减低进料的流速。如果还没有改善，就要更换滤芯。
最后，裂解液会被过滤到第一台100K超滤系统的交换罐。交换罐的冷冻系统一定要预先启动，确保质粒在过滤后实时有低温保护。
5、100K超滤—生理盐水透析
将过滤澄清后的菌体进行透析，得到透析后的质粒液。具体步骤如下：裂解液除了有质粒外，更有RNA和高盐度。在使用100K超滤系统前已把膜包清洗干净，再用生理盐水平衡系统。裂解液的质粒浓度是0.04mg/ml左右。为了有效的去除RNA和减少生理盐水的使用量，会先用超滤系统把裂解液浓缩到质粒浓度是1mg/ml的体积，才进行6个体积的生理盐水透析(缓冲液交换)，把裂解液交换成生理盐水，有利之后的硫酸铵沉淀。100K超滤进行时，要留意搅拌流速，不可过快，以免产生泡沫，令质粒的超螺旋开环。因为生理盐水的电导值是15mS/cm，所以完成透析后，要量度超滤透过液的电导值，确定数值是15mS/cm左右。
完成透析后，用生理盐水把交换罐内的回流液两倍稀释，将质粒浓度稀释到0.5mg/ml左右。将超滤系统的进口管道连接到生理盐水，关掉透过液阀门。开动系统抽入生理盐水，把吸附在膜包的膜上的质粒冲刷走到交换罐里。当回流液体积到达计算的体积后，关掉系统。交换罐的冷冻系统要一直启动，确保质粒有低温保护。
6、硫酸铵沉淀
用硫酸铵沉淀透析后的质粒液中的RNA，得到沉淀后的质粒液。具体步骤如下：
(1)硫酸铵沉淀的计算方法
硫酸铵沉淀的计算方法如表13所示。
表13、硫酸铵沉淀的计算方法
成分 计算方法 理论上的份量
100K超滤回流液(A) --- L
硫酸铵 A x 0.502 kg
(2)硫酸铵沉淀
一直开动交换罐的底搅拌，再慢慢地加入固体的硫酸铵，加入的时间限定在45分钟之内。完成后，孵育30分钟。该过程可把大分子RNA及内毒素沉淀走。在孵育30分钟后要马上进行下一步的过滤，以免质粒在高盐度的环境太耐，影响其质素。
7、深层过滤
将沉淀后的质粒液进行深层过滤，得到深层过滤后的质粒液。具体步骤如下：硫酸铵沉淀后的质粒液会再经过两重的深层过滤，去除沉淀物。第一个过滤滤芯是Millipore的POLYGARD，孔径是0.3μm。过滤到一个中间罐后，第二个过滤滤芯也是Millipore的POLYGARD，但孔径是0.1μm。把套筒清洗干净后，要浸泡在0.5M氢氧化钠一小时，再用纯化水冲洗好，才可装上滤芯。在过滤时，要控制压力不超过1bar；如果压力开始接近1bar，要减低进料的流速。如果还没有改善，就要更换滤芯。
质粒液最后会被过滤到第二台100K超滤系统的交换罐。交换罐的冷冻系统一定要预先启动，确保质粒在过滤后实时有低温保护。
8、100K超滤—PBS透析
将深层过滤后的质粒液(此时的质粒液除了有质粒外，还有小分子RNA和高盐度)进行PBS透析，得到PBS透析后的质粒液。具体步骤如下：在使用Millipore的100K超滤系统前已把膜包清洗干净，再用PBS平衡系统。为了有效的去除RNA和减少PBS的使用量，会先用超滤系统把质粒液浓缩到质粒浓度是1mg/ml的体积，才进行6个体积的PBS透析(缓冲液交换)，把裂解液交换成PBS。100K超滤进行时，要留意搅拌流速，不可过快，以免产生泡沫，令质粒的超螺旋开环。因为PBS的电导值是16mS/cm，所以完成透析后，要量度超滤透过液的电导值，确定数值是16mS/cm左右。
9、浓缩及除菌过滤
将PBS透析后的质粒液进行浓缩及除菌过滤，得到疫苗成品。具体步骤如下：
(1)完成透析后，先取样量度OD260，确定质粒浓度。此时的质粒液已没有其他杂质，所以可以直接取样量度OD260。如果质粒浓度未达1mg/ml，要再浓缩，直至质粒浓度达1mg/ml为止。交换罐的冷冻系统要一直启动，确保质粒有低温保护。
(2)完成最后浓缩进行除菌过滤，得到疫苗成品。在过滤时，要控制压力不超过1bar；如果压力开始接近1bar，要减低进料的流速。如果还没有改善，就要更换滤芯。除菌过滤用的套筒要预先洗干净，再浸泡0.5M氢氧化钠一小时，再用纯化水冲洗好，才可装上滤芯。装好所有配件后，要经过高温消毒才可使用。
在使用超滤系统前，要考虑安装的膜包的孔径。整个纯化流程中使用的有1000KBiomax膜包和100K Ultracel膜包(K是膜包孔径的单位)；1000K膜包是用于处理菌体，菌液超滤，而100K膜包是用于处理裂解液和质粒液，生理盐水透析和PBS透析超滤。在超滤运作时，比膜包孔径大的透不过孔，会从回流液回到交换罐；而比膜包孔径小的透过了孔，会从透过液排走(图4)。
在使用1000K超滤系统前，因为膜的材质是Biomax，要先用0.5M氢氧化钠把膜包清洗一小时，再用纯化水冲洗膜包，把系统的pH值变回中性。进行水通量测试，确定已把膜包清洗干净，才可以使用。100K超滤系统的清洗方法大致相同，但因为膜的材质是Ultracel，清洗用的溶液会改为0.1M氢氧化钠。而亦因为考虑到内毒素对终成品的影响，所有涉及的罐和管道都需要浸泡0.5M氢氧化钠一小时才可以使用。清洗好超滤系统后，要先用将会用作透析的溶液循环膜包至少3分钟，进口压力保持在1bar，平衡系统(图5)。
(二)动物核酸疫苗的高密度生物发酵工艺中纯化方法的优化
一、菌体裂解工艺优化
从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可根据不同的需要采用不同的方法，化学裂解(碱变性法)因其抽提效果好、收得率高、适用面广及快速，因而被各实验室广泛采用。碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。抽提过程中在加入溶液二后，碱性条件使DNA的氢键断裂，宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两条链不会完全分离，当加入溶液三中和后，宿主DNA相对分子质量大，还没来得及复性，与SDS、蛋白质及高分子量RNA等缠绕在一起而沉淀下来，而质粒DNA由于能够迅速配对恢复原来的构型。为了能获得最大质粒回收量及最少裂解菌体规模，用不同菌体浓度作化学裂解，测定质粒回收量，以确定最佳裂解菌体浓度，结果表明菌体浓度30 OD600为化学裂解的最高裂解菌体浓度。具体步骤如下：
1、化学裂解
取菌体培养液倒入1.5ml离心管中，12000g离心2分钟。弃上清液，将离心管倒置让液体流尽，把菌体沉淀重悬浮于预冷的溶液一，把菌体调校至大约OD600值20、30、40、50及60。将250μL细胞悬浮液加入相同体积的溶液二，快速温和颠倒离心管数次，以混匀内容物，冰浴2分钟，使细胞膜裂解。加入125μL预冷的溶液三，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状物沉淀，再加入125μL溶液四，将管温和颠倒数次混匀，用12000g离心20分钟，上清液移入干净离心管中。
2、测定质粒浓度
将30μL上柱稀释液加入30μL上清裂解液。混合后转移至准备好的Wizard公司的离心柱中，于室温用离心机以最大速度离心上清液1分钟。然后，将收集管中的液体转移原来的离心柱中，于室温用离心机以最大速度离心上清液1分钟。再从收集管中取出离心管并弃去收集管中的液体，将离心柱重新插入收集管中。用750μL柱清洗液重复清洗步骤后，于室温用离心机以最大速度离心1分钟。然后再用250μL柱清洗液重复清洗步骤，于室温用离心机以最大速度离心2分钟。将离心柱转移至一个新的1.5ml消毒离心管中，将100μL无核酸酶的水加入离心柱以洗脱质粒DNA，于室温用离心机以最大速度离心1分钟。最后，将11μL的10X TE缓冲液加入100μL洗脱的DNA中，用OD260确定其浓度。
上柱稀释液由Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System提供。离心柱、柱清洗液、10X TE和无核酸酶的水均由Wizard Plus SV Miniprep DNA Purification System提供。
结果如表14和图6所示。由于生产溶液用量及生产车间设备，如化学裂解的溶液、所配合贮罐及生产车间的面积，对核酸疫苗的生产成本有很大的影响。本实验以固定比例(2:2:1:1)的溶液一、二、三及四进行化学裂解，观察利用不同浓度的菌体进行化学裂解的情况，计算增加菌体浓度对裂解后质粒的回收率的影响，找出最佳裂解条件，同时使用最少的缓冲液及最低生产车间的配套。结果表明：在20 OD600或30 OD600的菌体浓度，裂解后质粒的回收率都能达到百分百，如果菌体浓度提升到40 OD600菌体浓度或以上，裂解后质粒的回收率会低于85％，如果菌体浓度提升到60 OD600菌体浓度，回收率只有68％，损失的质粒就会很多。说明提高菌体浓度不能同步提升总质粒量，表示在40 OD600菌体浓度左右，化学裂解效率随着增加菌体浓度而降低，因此本实验证明20-35 OD600为最佳裂解菌体浓度。
表14、化学裂解菌体前浓度与质粒回收浓度及总量关系
Figure BDA0001359362480000201
二、化学沉淀法工艺优化
不同化学沉淀法对去除裂解液中RNA有所差别，为了能够获得最大限度去除RNA，减低RNA对下游纯化工艺的影响，本发明用不同的化学盐沉淀裂解液里RNA，以确定减低RNA的方法。结果表明硫酸胺(3.5M)及氯化钙(0.8M)有效去除RNA，而氯化锂不适用于从裂解液中沉淀RNA。具体步骤如下：
1、不同的化学盐沉淀
取发酵后的菌液倒入1.5ml离心管中，12000g离心2分钟。弃上清液，将离心管倒置让液体流尽，把菌体沉淀重悬浮于预冷的溶液一，把菌体调校至大约40 OD600，室温下放置5-10分钟，加入相同体积的溶液二，快速温和颠倒离心管数次，以混匀内容物，冰浴5分钟，使细胞膜裂解。加入1/2体积预冷的溶液三，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状物沉淀，放置冰上5分钟。12000g离心5分钟，上清液移入干净离心管中作不同化学沉淀法实验。根据沉淀的化学盐不同，沉淀方法分别如下：
(1)氯化钙沉淀法
把裂解液调节至不同浓度的氯化钙，摸索条件分别为:0.2M、0.4M、0.6M、0.8M及1.0M；12000g离心15分钟，把上清液移入干净离心管中，以PBS作稀释，沉淀物则用1.0M氯化钙洗涤，用PBS作稀释，各取0.1-0.2μg进行1％琼脂糖凝胶电泳检查。
(2)氯化锂沉淀法
把裂解液调节至不同浓度的氯化锂，浓度分别为:0.25M、0.5M、1.0M及2.0M；每个浓度分别孵育15分钟、30分钟、1小时、2小时；12000g离心15分钟，把上清液移入干净离心管中，以PBS作稀释，沉淀物则用2.0M氯化锂洗涤，用PBS作稀释，各取0.1-0.2μg进行1％琼脂糖凝胶电泳检查。
(3)硫酸胺沉淀法
把裂解液调节至不同浓度的硫酸胺，浓度分别为：1M、1.5M、2.0M、2.5M、3M及3.5M；12000g离心15分钟，把上清液移入干净离心管中，以PBS作稀释，沉淀物则用3.0M硫酸胺洗涤，用PBS作稀释，各取0.1-0.2μg进行1％琼脂糖凝胶电泳检查。
结果如图7-图10所示。结果表明：使用不同浓度的氯化钙来沉淀RNA：较高浓度的氯化钙将产生较多RNA沉淀。当氯化钙的浓度超过0.8M时，RNA沉淀再没有增加(图7)。使用不同浓度的氯化锂在不同时间沉淀裂解液中的RNA：在不同静置时间使用不同浓度的氯化锂都没有将RNA从裂解液中沉淀下来(图8)。加入不同剂量的硫酸胺，在离心后，观察去除RNA的效果。当硫酸胺的浓度增加时，上清的RNA明显减少(图9),而沉淀物内的RNA增加(图10)。
从结果可以看出：不同化学盐在不同浓度时对去除RNA有不同影响。硫酸胺及氯化钙沉淀法可有效减低裂解液中RNA。增加硫酸胺浓度，RNA沉淀明显增加，当硫酸胺浓度达到3M时已能去除大部份RNA。氯化钙浓度在0.8M时，巳达到最佳去除RNA的效果，再增加氯化钙浓度并没有增加RNA沉淀。用氯化钙沉淀RNA好处是浓度低，所用的化学盐以重量计比硫酸胺少，裂解液体积大，氯化钙沉淀是合适的选择，但不能把所有RNA沉淀出来。在0.25M到2M氯化锂浓度范围，用最长的实验孵育时间(2小时)，RNA没有被沉淀出来。说明氯化锂不适用于沉淀裂解液中的RNA。硫酸胺(3-3.8M)及氯化钙(0.8M)沉淀裂解液里RNA的效果最优。
实施例3、动物核酸疫苗的高密度生物发酵工艺的应用
本发明利用实施例1优化的最佳发酵方法和实施例2优化的最佳纯化方法对不同质粒进行发酵培养和纯化，得到疫苗成品，并对获得的疫苗成品效果进行检测。具体步骤如下：
一、动物核酸疫苗的制备
1、发酵
(1)分别将不同批次(生产批号如表15中所示)质粒产品pCAGGoptiHA(Re1)转化大肠杆菌DH5α，分别得到重组菌。
(2)一级培养
准备50毫升一级种子培养基(LB培养基)，装入250毫升的带挡板摇瓶内，高温121℃消毒30分钟后，将步骤(1)中的重组菌接种一级种子培养基(LB培养基)中，接种前加入150mg/L氨芐青霉素，放在30℃摇床，200rpm，过夜培养至OD600大约为2-3，得到一级种子液。
(3)二级培养
准备500毫升一级种子培养基，装入2升的带挡板摇瓶内，接种摇瓶数量根据发酵罐培养基容积决定，高温121℃消毒30分钟后，将步骤(2)中的一级种子液按照1.5％的接种量加入到2升摇瓶内，接种前加入150mg/L氨芐青霉素，放在30℃摇床，200rpm，培养8-9小时至OD600大约为2-3，得到二级种子液。
(4)批次发酵
准备发酵罐培养基，连发酵罐一起高温121℃消毒30分钟，待二级种子液OD600约为2-3时，离心，去上清，收集沉淀并使用约50–100毫升无菌的摇瓶培养基进行悬浮，得到离心菌液，然后加入已消毒的发酵罐培养基内，离心菌液的体积与发酵罐容积相同，接种前加入150mg/L氨芐青霉素和4.5mg/L硫胺素盐酸。批次发酵培养条件为：温度30℃，溶氧(DO)20％，pH6.8，培养11–13小时后，培养基碳源甘油会消耗完，加入补料溶液开始进行补料，补料的速度根据生长速率来计算，当菌液OD600到达50时，提升培养温度至37℃，培养4小时后，再次提升培养温度至40℃，再培养4–5小时后完成发酵，最后将菌液温度在1.5小时内降到10℃或以下，收获得到发酵后菌体。
2、纯化
按照实施例2步骤(一)中的纯化方法对发酵后菌体进行纯化，得到疫苗成品。纯化步骤如下：
1)先用Millipore超滤系统将发酵后菌体的大部分培养基清除，交换为溶液一；
2)然后用溶液一将发酵后菌体稀释至30 OD后，再用裂解液(溶液一、二、三及四)裂解发酵后菌体，将菌体内的质粒释放在裂解液中；
3)然后将裂解后菌体依次进行过滤澄清、浓缩及生理盐水透析，得到透析后的质粒液；
4)将所述透析后的质粒液进行硫酸铵沉淀，进一步清除大部分的杂质，得到沉淀后的质粒液；
5)将所述沉淀后的质粒液再经过深层过滤、PBS透析、浓缩和除菌过滤，得到疫苗成品。
二、动物核酸疫苗的效果检测
分别检测步骤一中不同质粒制备得到的疫苗成品的产量、回收率、浓度、超螺旋百分比及内毒素含量。产量是纯化完成后利用分光光度计260nm去估算，在OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg/ml，利用公式DNA浓度(mg/ml)＝(OD260×50×稀释倍数/1000，得出浓度结果。回收率是定量使用小规模质粒提取试剂盒提取质粒后，利用分光光度计定量每升菌液的质粒产量，再根据收获菌液的容积，计算出发酵后的总产量，然后纯化结束后，利用分光光度计定量纯化后总质粒产量，最后利用公式：回收率＝纯化后总产量/用试剂盒推算的总产量×100％，得到回收率。超螺旋是稀释样品到0.01μg/μl，加入10μl稀释后的样品到含10ng/ml溴化乙锭的0.7％琼脂糖凝胶，电泳后利用凝胶成像仪分析质粒样品超螺旋百分比。内毒素含量的具体检测步骤是参照中国药典内毒素检查方法。
结果如表15所示。本发明的动物核酸疫苗的高密度生物发酵工艺在生产不同发酵量和批次质粒时，能保持高回收率，高超螺旋百分比和低内毒素含量。
表15、生产不同发酵量和批次质粒产品的超螺旋百分比和低内毒素含量
Figure BDA0001359362480000231
注：表中的发酵体积是指该批次的发酵培养基容积。

Claims (3)

1.一种核酸疫苗的生产方法，包括如下步骤：
（1）将重组菌在发酵罐中进行分批发酵培养，培养至碳源全部消耗后，加入补料溶液进行补料，当发酵液OD600值为50-100时，分阶段提升培养温度至37-42 ℃，再培养8-9小时后，得到发酵后菌体；
（2）使用超滤系统将所述发酵后菌体进行裂解纯化，得到核酸疫苗；
所述步骤（1）中，所述重组菌为将含有编码某种抗原蛋白的外源基因的质粒导入宿主菌中得到的菌；所述重组菌的OD600值为2-3；所述宿主菌为大肠杆菌；
所述重组菌加入发酵罐前还包括离心的步骤，所述离心后的菌液与所述发酵罐内的发酵培养基的体积比为1:1；
所述发酵罐中的发酵培养基由甘油、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、酵母提取物、氯化钠、微量元素溶液、七水硫酸镁、氨芐青霉素、硫胺素盐酸和水组成；
所述甘油在所述发酵培养基中的浓度为（20-30）g/L；
所述磷酸二氢钾在所述发酵培养基中的浓度为13.3 g/L；
所述磷酸氢二铵在所述发酵培养基中的浓度为4 g/L；
所述酵母提取物在所述发酵培养基中的浓度为4 g/L；
所述氯化钠在所述发酵培养基中的浓度为2 g/L；
所述微量元素溶液在所述发酵培养基中的浓度为10 ml/L；
所述七水硫酸镁在所述发酵培养基中的浓度为1.2 g/L；
所述氨芐青霉素在所述发酵培养基中的浓度为150 mg/L；
所述硫胺素盐酸在所述发酵培养基中的浓度为4.5 mg/L；
所述补料溶液由甘油、酵母提取物、微量元素溶液、七水硫酸镁和水组成；
所述甘油在所述补料溶液中的浓度为995.2 g/L；
所述七水硫酸镁在所述补料溶液中的浓度为40 g/L；
所述酵母提取物在所述补料溶液中的浓度为10 g/L；
所述微量元素溶液在所述补料溶液中的浓度为14.9 ml/L；
所述步骤（2）包括如下步骤：
1）将发酵后菌体稀释至20-35OD600，用裂解液裂解发酵后菌体，将发酵后菌体内的质粒释放在裂解液中，得到裂解后菌体；
2）将所述裂解后菌体依次经过过滤澄清、浓缩和生理盐水透析后，再进行硫酸铵沉淀作用，得到沉淀后的质粒液；所述硫酸铵的浓度为3-3.8M；所述硫酸铵沉淀作用的时间为20-40 min；
3）将所述沉淀后的质粒液依次经过过滤和PBS透析，得到透析后的质粒液；
4）将所述透析后的质粒液依次经过浓缩和除菌过滤，得到疫苗成品。
2.权利要求1所述的方法在大规模生产动物核酸疫苗中的应用。
3.权利要求1所述的方法在提高核酸疫苗产量中的应用。
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