CN104099284A - 一株以葡萄糖为底物合成粘康酸的大肠杆菌工程菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株以葡萄糖为底物合成粘康酸的大肠杆菌工程菌，属于生物技术领域。本发明向大肠杆菌中引入了2，3-二羟基苯甲酸(2，3-DHB)至粘康酸(MA)的代谢途径，并强化了大肠杆菌自身从葡萄糖到2，3-DHB的代谢途径。本发明提供的新途径所需要的外源基因少，减少了宿主菌表达外源基因的负担和外源基因的不兼容问题。此外，宿主菌不是营养缺陷型，无需外源添加昂贵莽草酸或其他芳香族氨基酸，摇瓶发酵粘康酸产量为1.15g/L。
Description
技术领域
本发明涉及一株以葡萄糖为底物合成粘康酸的大肠杆菌工程菌，属于生物技术领域。
背景技术
粘康酸，又称己二烯二酸，由于可以被用作生产生物塑料的前体和平台化合物而被广泛研究。这些产品主要有商业化的大宗化学品如己二酸，对苯二甲酸和偏苯三酸，用于制造尼龙66，聚酯合成纤维，对酞酸二甲酯，工业塑料，药品，增塑剂和化妆品等等。全世界范围内己二酸的消耗已经达到了300万吨，我国的己二酸需求量每年都在增长，聚氨酯生产企业的需求量每年增长都在10％以上。传统的粘康酸化学生产方法主要依赖于不可再生的石油原料和高纯度的重金属催化剂，这导致严重的环境污染，石油消耗和昂贵的分离加工过程。因此，通过一种可持续的，环境友好的，依赖于廉价糖类的低成本的生物合成方法变得尤为迫切。
一些微生物可以依靠某些芳香族化合物如苯甲酸等代谢产生粘康酸，例如Acinetobactersp.，Pseudomonas sp.，Sphingobacterium sp.和Cinctura sp.等。但是还没有发现一种微生物可以利用简单碳源如葡萄糖直接生产粘康酸。Draths和Frost最早通过敲除了大肠杆菌中的莽草酸脱氢酶基因来阻断莽草酸途径，并且利用三个外源基因，分别是3-脱氢莽草酸脱水酶(DHSdehydratase，AroZ)，原儿茶酸脱羧酶(PCA decarboxylase，AroY)和邻苯二酚1，2-双加氧酶(catechol1,2-dioxygenase，CatA)来组成异源合成途径，该途径从葡萄糖经3-脱氢莽草酸、原儿茶酸，邻苯二酚合成粘康酸。通过发酵条件的优化，粘康酸的含量达到了36.8g/L(Biotechnology progress,2002,18(2):201-211)。然而，由于重组菌是芳香族氨基酸和芳香族维生素的营养缺型，在培养基中要添加苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，对氨基苯甲酸，对羟基苯甲酸和2，3-二羟基苯甲酸等菌体才能正常生长，这些芳香族化合物价格昂贵，限制了利用此菌株工业化生产粘康酸。Curran和Weber研究团队在酿酒酵母中，构建相同的代谢途径，粘康酸的产量分别达到了1.5mg/L和140mg/L(Metabolic engineering,2013,15:55-66；Appliedand environmental microbiology,2012,78(23):8421-8430)。但是产量都低，还不适合用来工业化生产。中国专利CN103667166A公布了采用同样的代谢合成途径，通过对途径中关键酶3-脱氢莽草酸脱水酶(DHS dehydratase，AroZ)，原儿茶酸脱羧酶(PCA decarboxylase，AroY)和邻苯二酚1，2-双加氧酶(catechol1,2-dioxygenase，CatA)进行密码子的优化，及设计组成型启动子和终止子，以及重组菌的发酵条件优化，摇瓶发酵24小时，发酵液中粘康酸含量1.5g/L。7.5L发酵罐发酵84小时，粘康酸最高含量达到52g/L，有应用前景，但是在培养基中加入了一定量的莽草酸，以弥补大肠杆菌芳香族氨基酸的营养缺陷型，莽草酸价格非常昂贵，增加了粘康酸的生产成本。
Yan小组最近报道了两条粘康酸的生物合成新途径，其中一条是从葡萄糖经莽草酸、分支酸合成邻氨基苯甲酸，并阻断色氨酸分支合成途径，由邻氨基苯甲酸合成粘康酸，另一条是在异分支酸处引进水杨酸合成途径，通过水杨酸合成粘康酸。两条途径的摇瓶含量分别达到了389.96mg/L和1.5g/L(Applied and environmental microbiology,2013,79(13):4024-4030；Metabolic engineering,2014,23:62-69)。但是从分支酸合成邻氨基苯甲酸是一个限速反应，需要谷氨酸的再生过程；而水杨酸到邻苯二酚需要NADH的参与，这都增加了构建粘康酸生物合成重组菌的难度，限制产量的进一步提高。
发明内容
本发明的目的是提供一株以葡萄糖为底物合成粘康酸的大肠杆菌工程菌。
所述大肠杆菌工程菌中引入了2，3-二羟基苯甲酸(2，3-DHB)至粘康酸(MA)的代谢途径，并强化了大肠杆菌自身从葡萄糖到2，3-DHB的代谢途径。
所述2，3-DHB至MA的代谢途径通过表达异源邻苯二酚1，2-双加氧酶和2，3-二羟基苯甲酸脱羧酶来实现。
所述强化大肠杆菌自身从葡萄糖到2，3-DHB的代谢途径，通过表达分支酸异构酶、异分支酸裂解酶，2,3-二氢-2,3-二羟基苯甲酸脱氢酶实现。
所述强化大肠杆菌自身从葡萄糖到2，3-DHB的代谢途径，还包括表达DAHP合酶基因aroGfbr与莽草酸激酶基因，以解除苯丙氨酸对AroG的反馈抑制，并强化莽草酸途径。
编码所述邻苯二酚1，2-双加氧酶的基因entX的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
编码所述2，3-二羟基苯甲酸脱羧酶的基因catA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
编码所述分支酸异构酶的基因entC的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
编码所述异分支酸裂解酶的基因entB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
编码所述，2,3-二氢-2,3-二羟基苯甲酸脱氢酶的基因entA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
所述DAHP合酶基因aroGfbr的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，是将大肠杆菌JM109aroG基因(Gene ID:945605)编码的第146位的天冬氨酸(GAT)突变为天冬酰胺(AAT)。
编码所述莽草酸激酶的基因aroL的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
所述entX和catA的表达优选以pACYCDuet-1或pETDuet-1为载体进行共表达。
所述entC、entB、entA优选以载体pRSFDuet-1进行共表达，得到pRSF-CBA。
所述aroGfbr和aroL优选以pCDFDuet-1为载体进行共表达。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种构建所述大肠杆菌工程菌的方法，是利用代谢工程策略在大肠杆菌(Escherichia coli)中引入2，3-二羟基苯甲酸(2，3-DHB)至粘康酸(MA)的代谢途径，并强化大肠杆菌自身从葡萄糖到2，3-DHB的代谢途径。
所述方法优选引入2，3-二羟基苯甲酸脱羧酶和邻苯二酚1，2-双加氧酶催化的异源代谢途径，催化2，3-二羟基苯甲酸转化成邻苯二酚，最终得到粘康酸；同时强化表达大肠杆菌自生的分支酸异构酶、异分支酸裂解酶，2,3-二氢-2,3-二羟基苯甲酸脱氢酶，并表达DAHP合酶基因aroGfbr与莽草酸激酶基因aroL，解除苯丙氨酸对aroG的反馈抑制，构建了一条利用葡萄糖合成粘康酸的新途径。
所述方法进一步优选以下步骤：
(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的2，3-二羟基苯甲酸脱羧酶的entX基因与核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的邻苯二酚1,2-双加氧酶基因catA分别在质粒pACYCDuet-1和pETDuet-1上共表达，分别得到pACYC-XA和pET-XA。
(2)将大肠杆菌自身的分支酸异构酶的entC基因与异分支酸裂解酶的基因entB、2,3-二氢-2,3-二羟基苯甲酸脱氢酶的entA基因在质粒pRSFDuet-1上共表达，得到pRSF-CBA。
(3)将解除苯丙氨酸反馈抑制的DAHP合酶的基因aroGfbr与莽草酸激酶基因aroL在质粒pCDFDuet-1上共表达，得到pCDF-GL。
(4)将pACYC-XA、pRSF-CBA、pCDF-GL同时导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌Mu1(E.coli Mu1)。
(5)将pET-XA、pRSF-CBA、pCDF-GL同时导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌Mu2(E.coli Mu2)。
本发明要解决的第三个技术问题是应用上述大肠杆菌工程菌发酵生产粘康酸。
大肠杆菌工程菌发酵生产粘康酸培养基为无机盐培养基，组成为g/L：MgSO4·7H2O0.1-0.4，CaCl2·2H2O0.015-0.045，KH2PO43.5-4.5,K2HPO412.5-20.0，NaCl0.5-3.0，(NH4)2SO43.0-6.0，盐酸硫胺素0.0125-0.0325，2，3-DHB0.001-0.05，微量元素母液，葡萄糖终浓度1.0-5.0，甘油终浓度1.0-10.0；所述微量元素母液的组成为g/L：Al2(SO4)3·18H2O2.0-4.0，CoCl2·6H2O0.05-0.20，CuSO4·5H2O0.10-0.45，H3BO31.25-2.00，MnCl2·4H2O0.16-0.70，Na2MoO4·2H2O0.15-0.45，ZnSO4·7H2O0.30-0.80，添加量为培养基总体积的1/1000。
将大肠杆菌工程菌活化后转接到上述发酵培养基中，并添加相应的抗生素，以180rpm-300rpm的转速在37℃培养到OD600为0.4-1.5，然后加入终浓度为0.1-1.0mM的IPTG，于30℃继续培养96h。
本发明相比现有技术的改进之处在于本发明粘康酸生物合成新途径所需要的外源基因少，减少了宿主菌表达外源基因的负担和外源基因的不兼容问题。此外，宿主菌不是营养缺陷型，无需外源添加昂贵莽草酸或其他芳香族氨基酸，摇瓶发酵粘康酸产量为1.15g/L。
附图说明
图1粘康酸生物合成新途径示意
具体实施方式
所用引物：
A1：5’-GAAGATCTCATGCGCGGAAAAATTGCTT-3’
(下划线为BglII酶切位点)
A2：5’-GGGGTACCTTATTTAATGTTAAATACGCGG-3’
(下划线为KpnI酶切位点)
B1：5’-GGAATTCGATGACCGTGAAAATTTCCCAC-3’
(下划线为EcoRI酶切位点)
B2：5’-CCCAAGCTTTTAGCCCTCCTGCAACGCCCGC-3’
(下划线为HindIII酶切位点)
C1：5’-GAAGATCTCATGGCTATTCCAAAATTAC-3’
(下划线为BglII酶切位点)
C2：5’-GGGGTACCTTATGCCCCCAGCGTTGAG-3’
(下划线为KpnI酶切位点)
D1：5’-GGAATTCGATGGCTATTCCAAAATTAC-3’
(下划线为EcoRI酶切位点)
D2：5’-CCCAAGCTTTTATGCCCCCAGCGTTGAG-3’
(下划线为HindIII酶切位点)
E1：5’-GAAGATCTCATGAATTATCAGAACGACG-3’
(下划线为SacI酶切位点)
E2：5’-ATTCAGGAATTCACCCGCCGCTG-3’
E3：5’-GGCGGGTGAATTCCTGAATATGATCACCCCAC-3’
E4：5’-GGGGTACCTTACCCGCGACGCGCTTT-3’
(下划线为HindIII酶切位点)
F1：5’-CGAGCTCGATGACACAACCTCTTTTTC-3’
(下划线为BglII酶切位点)
F2：5’-CCCAAGCTTTTAACAATTGATCGTCTG-3’[SEQ ID:No.14]
(下划线为KpnI酶切位点)
实施例1 质粒pACYC-XA和pET-XA的构建。
分别以pACYCDuet-1和pETDuet-1作为合成粘康酸外源基因的共表达载体。
通过PCR用引物A1和A2从Klebsiella pneumoniae CICIM B7001基因组克隆得到entX(SEQ ID NO.1编码2，3-二羟基苯甲酸脱羧酶)；通过PCR用引物B1和B2从恶臭假单胞菌F1基因组克隆得到catA(SEQ ID NO.2编码邻苯二酚1，2-双加氧酶)。两基因的PCR产物和表达载体分别用相应的限制性内切酶酶切以后，把DNA片段同时插到pACYCDuet-1和pETDuet-1相应的酶切位点，得到重组质粒pACYC-XA和pET-XA。
实施例2 质粒pRSF-CBA的构建。
选择pRSFDuet-1作为entC和entBA基因的表达载体。通过PCR用引物C1和C2从大肠杆菌JM109基因组克隆得到entC(编码分支酸异构酶)；通过PCR用引物D1和D2从大肠杆菌JM109基因组克隆得到entBA(编码异分支酸裂解酶和2,3-二氢-2,3-二羟基苯甲酸脱氢酶)。PCR产物和表达载体分别用相应的限制性内切酶酶切以后，把DNA片段插到pRSFDuet-1相应的酶切位点，得到重组质粒pRSF-CBA。
实施例3 质粒pCDF-GL的构建。
选择pCDFDuet-1作为aroGfbr和aroL基因的表达载体。这个载体具有双T7启动子，通过IPTG添加与否实现外源基因有或无的表达。3-脱氧-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶简称为DAHP合成酶，由AroG、AroF、AroH组成，aroG编码AroG，其中AroG受苯丙氨酸反馈抑制，用定点突变方法(引物E1、E2、E3和E4)，将AroG146位的天冬氨酸(GAT)突变为天冬酰胺(AAT)，得到突变后的基因aroGfbr，解除了苯丙氨酸的反馈抑制。aroL，通过PCR用引物F1和F2从大肠杆菌JM109基因组克隆得到。PCR产物和表达载体分别用相应的限制性内切酶酶切以后，把DNA片段插到pCDFDuet-1相应的酶切位点，得到重组质粒pCDF-GL。
实施例4 粘康酸生产菌Mu1和Mu2的构建
将pACYC-XA，pRSF-CBA和pCDF-GL用热击法同时导入大肠杆菌BL21(DE3)中，所得阳性菌株命名为E.coli Mu1。培养基中抗生素分别为氯霉素(20mg/mL)、卡那霉素(40mg/mL)，以及链霉素(40mg/mL)。
将pET-XA，pRSF-CBA和pCDF-GL用热击法同时导入大肠杆菌BL21(DE3)中，所得阳性菌株命名为E.coli Mu2。培养基中抗生素分别为氨苄霉素(20mg/mL)、卡那霉素(40mg/mL)，以及链霉素(40mg/mL)。
实施例5 大肠杆菌Mu1和Mu2摇瓶发酵生产粘康酸
大肠杆菌Mu1和Mu2摇瓶发酵生产粘康酸的发酵培养基为无机盐培养基，配方如下：MgSO4·7H2O(0.1-0.4g/L)，CaCl2·2H2O(0.015-0.045g/L)，KH2PO4(3.5-4.5g/L),K2HPO4(12.5-20.0g/L)，NaCl(0.5-3.0g/L)，(NH4)2SO4(3.0-6.0g/L)，盐酸硫胺素(0.0125-0.0325g/L)，2，3-DHB(0.001-0.05g/L)，微量元素母液，葡萄糖和甘油终浓度分别为1.0-5.0g/L和1.0-10.0g/L。其中，微量元素母液包括Al2(SO4)3·18H2O(2.0-4.0g/L)，CoCl2·6H2O(0.05-0.20g/L)，CuSO4·5H2O(0.10-0.45g/L)，H3BO3(1.25-2.00g/L)，MnCl2·4H2O(0.16-0.70g/L)，Na2MoO4·2H2O(0.15-0.45g/L)，ZnSO4·7H2O(0.30-0.80g/L)，添加量为培养基总体积的1/1000。
将于LB液体培养基中过夜生长的Mu1和Mu2以1％-5％的接种量接种到上述发酵培养基中，并添加相应的抗生素，以180rpm-300rpm的转速在37℃培养到OD600为0.4-1.5，然后加入终浓度为0.1-1.0mM的IPTG，于30℃继续培养96h，离心分离菌体，用高效液相色谱测定上清液中的MA(Waters，Agilent C18柱，流动相为3.3mM的硫酸溶液，流速0.5mL/min，检测波长为260nm)，测得粘康酸产量分别为837mg/L和1.15g/L。空载质粒对照不产粘康酸。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一株以葡萄糖为底物合成粘康酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于，引入了2，3-二羟基苯甲酸至粘康酸的代谢途径，并强化了大肠杆菌自身从葡萄糖到2，3-DHB的代谢途径；所述2，3-DHB至MA的代谢途径通过表达异源2，3-二羟基苯甲酸脱羧酶和邻苯二酚1，2-双加氧酶来实现；所述强化大肠杆菌自身从葡萄糖到2，3-DHB的代谢途径，通过表达分支酸异构酶、异分支酸裂解酶、2,3-二氢-2,3-二羟基苯甲酸脱氢酶实现。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，还表达了DAHP合酶基因aroGfbr与莽草酸激酶基因，以解除苯丙氨酸对同工酶AroG的反馈抑制，并强化莽草酸途径。
3.根据权利要求1或2所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，编码所述2，3-二羟基苯甲酸脱羧酶的基因entX的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述邻苯二酚1，2-双加氧酶的基因catA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码所述分支酸异构酶的基因entC的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码所述异分支酸裂解酶的基因entB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；编码所述2,3-二氢-2,3-二羟基苯甲酸脱氢酶的基因entA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.根据权利要求2所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述DAHP合酶基因aroGfbr的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；编码所述莽草酸激酶的基因aroL的核苷酸序列如SEQID NO.7所示。
5.根据权利要求2所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述entX和catA以pACYCDuet-1或pETDuet-1为载体进行共表达；所述aroGfbr和aroL以pCDFDuet-1为载体进行共表达，所述entC、entB、entA以质粒pRSFDuet-1进行共表达。
6.一种构建权利要求2所述大肠杆菌工程菌的方法，其特征在于，是向大肠杆菌中引入2，3-二羟基苯甲酸脱羧酶和邻苯二酚1，2-双加氧酶的异源代谢途径，催化2，3-二羟基苯甲酸转化成邻苯二酚，最终得到粘康酸；同时强化表达大肠杆菌自身的分支酸异构酶、异分支酸裂解酶、2,3-二氢-2,3-二羟基苯甲酸脱氢酶，并表达DAHP合酶基因aroGfbr与莽草酸激酶基因aroL，解除苯丙氨酸对aroG的反馈抑制。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的2，3-二羟基苯甲酸脱羧酶的entX基因与核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的邻苯二酚1,2-双加氧酶基因catA在质粒pACYCDuet-1和pETDuet-1上共表达，分别得到pACYC-XA或pET-XA；
(2)将大肠杆菌自身的分支酸异构酶的entC基因与异分支酸裂解酶、2,3-二氢-2,3-二羟基苯甲酸脱氢酶的entBA基因在质粒pRSFDuet-1上共表达，得到pRSF-CBA；
(3)将解除苯丙氨酸反馈抑制的DAHP合酶基因aroGfbr与莽草酸激酶基因aroL在质粒pCDFDuet-1上共表达，得到pCDF-GL；
(4)将pACYC-XA、pRSF-CBA、pCDF-GL同时导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌Mu1；
(5)将pET-XA、pRSF-CBA、pCDF-GL同时导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌Mu2。
8.一种应用权利要求1所述大肠杆菌工程菌发酵生产粘康酸的方法。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将大肠杆菌工程菌活化后转接到发酵培养基中，并添加相应的抗生素，以180rpm-300rpm的转速在37℃培养到OD600为0.4-1.5，然后加入终浓度为0.1-1.0mM的IPTG，于25-37℃继续培养96h。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为无机盐培养基，组成为g/L：MgSO4·7H2O0.1-0.4，CaCl2·2H2O0.015-0.045，KH2PO43.5-4.5,K2HPO412.5-20.0，NaCl0.5-3.0，(NH4)2SO43.0-6.0，盐酸硫胺素0.0125-0.0325，2，3-DHB0.001-0.05，微量元素母液，葡萄糖终浓度1.0-5.0，甘油终浓度1.0-10.0；所述微量元素母液的组成为g/L：Al2(SO4)3·18H2O2.0-4.0，CoCl2·6H2O0.05-0.20，CuSO4·5H2O0.10-0.45，H3BO31.25-2.00，MnCl2·4H2O0.16-0.70，Na2MoO4·2H2O0.15-0.45，ZnSO4·7H2O0.30-0.80，添加量为培养基总体积的1/1000。
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2014
- 2014-07-01 CN CN201410310643.6A patent/CN104099284B/zh not_active Expired - Fee Related
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| CN117004547B (zh) * | 2023-09-27 | 2023-12-22 | 北京化工大学 | 一种以葡萄糖为底物从头合成顺，顺-粘康酸的基因工程菌及其应用 |
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