CN103097514A

CN103097514A - 一种用于从蔗糖制备1,3-丙二醇的方法

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Publication number: CN103097514A
Application number: CN2011800427980A
Authority: CN
Inventors: P.索凯勒; C.波伊萨特
Original assignee: Metabolic Explorer SA
Current assignee: Metabolic Explorer SA
Priority date: 2010-07-05
Filing date: 2011-07-05
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2031-07-05
Also published as: EP2591091B1; KR20130041166A; KR101794384B1; CA2803070C; CA2803070A1; US8900838B2; BR112013000237A2; BR112013000237B1; US20130309737A1; JP5420798B2; ES2490968T3; JP2013529924A; WO2012004247A1; TWI500768B; PT2591091E; CN103097514B; AR082114A1; TW201213545A; EP2591091A1

Abstract

本发明涉及一种经遗传修饰的用于从蔗糖生物生产1,3-丙二醇的微生物，其中所述微生物包含：-用于产生1,3-丙二醇的两步代谢途径，包括第一步用具有2-酮酸脱羧酶活性的酶将4-羟基-酮丁酸脱羧基，和第二步用具有羟基醛还原酶活性的酶还原所得的3-羟基丙醛，和-能够使微生物利用蔗糖作为唯一碳源的基因。本发明还涉及一种通过发酵生物制备1,3-丙二醇的新方法，包括培养所述经遗传修饰的微生物，其中该培养在包含蔗糖源的合适培养基中进行，和回收所生产的1,3-丙二醇。在本发明的一个优选方面中，蔗糖源从植物生物量获得。

Description

一种用于从蔗糖制备1,3-丙二醇的方法

本发明涉及一种用于从蔗糖生物制备1,3-丙二醇的新方法，包括培养经遗传修饰用于生物生产1,3-丙二醇的微生物，其中所述微生物包含用于从4-羟基-2-酮丁酸产生1,3-丙二醇的两步代谢途径，其包括第一步脱羧基和第二步还原，并且其中所述微生物经修饰而能够使用蔗糖作为唯一碳源。

背景

通过培养产生1,3-丙二醇的微生物来发酵生产1,3-丙二醇是本领域中已知的。涉及维生素B12依赖性酶的1,3-丙二醇生产方法已经有叙述；这些方法使得生产工艺流程非常昂贵。

正需要可替代的解决方案以不依赖维生素B12的途径从可再生的碳源生产1,3-丙二醇。而且，正需要基于这种生产的必需能量改进被生产的产物的总得率(overall yield)。最后，正需要控制杂质和副产品的水平，用于产物分离、其销售和进一步的使用。

1,3-丙二醇主要从甘油(见专利申请PCT/EP2010/056078)和从葡萄糖经由中间物甘油产生。因为全世界的甘油储备(mondial glycerol stock)有限，因此需要发现其它的碳水化合物资源。

发酵培养基中使用的碳源一般由碳水化合物组成，所述碳水化合物大多来自于植物。淀粉是植物中最丰富的碳水化合物储备。

由于生物技术生产的大宗化学品(commodity chemicals)的成本主要与原材料的成本(即发酵底物的成本)有关，因此对于工业规模的生产而言，使用精制糖不是经济上可持续的选择。需要较廉价、保持高含量可发酵糖的底物。在这个方面，来自制糖工业的蔗糖代表了一种好的选择。

蔗糖从含糖植物，如糖用甜菜、甘蔗、甜高粱、糖枫、糖棕榈或蓝色龙舌兰(blue agaves)获得。含有制糖工艺的中间物、产物或副产物的不同蔗糖(原汁、稀汁或澄清汁、浓汁、蔗糖糖浆、纯蔗糖、糖蜜(molasses))均可用作发酵给料。

微生物中摄取和利用蔗糖的两种不同系统已经被表征。

第一种是基于磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)依赖的蔗糖磷酸转移酶的系统(蔗糖PTS)，其中蔗糖被摄取并以磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)作为供体被磷酸化，产生细胞内蔗糖-6-磷酸。蔗糖-6-磷酸随后被转化酶水解成D-葡萄糖-6-磷酸和D-果糖。D-果糖进一步被ATP依赖的果糖激酶磷酸化成为D-果糖-6-磷酸，然后可以进入中心代谢。这种系统已经在数种细菌菌种，革兰氏阳性以及革兰氏阴性中被描述。在肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中，超过90%的野生型克雷伯氏菌属(Klebsiella)，少于50%的埃希氏菌属(Escherichia)和少于10%的沙门氏菌属(Salmonella)菌株是蔗糖阳性的。

已经从沙门氏菌属中分离出了携带编码蔗糖PTS的scrKYABR基因的接合型质粒pUR400(Schmid等,1982,Schmid等,1988)。

最近在大肠杆菌(Escherichia coli)EC3132中发现了称作“非-PTS系统”的第二系统(Bockmann等,1992)。该系统包括编码蔗糖:质子同向转运转运系统(CscB)、果糖激酶(CscK)和蔗糖特异性阻抑物(CscR)的cscBKAR基因。

大肠杆菌K12及其衍生物不能利用蔗糖。然而，可以通过转移编码两种先前描述的系统的基因而赋予这种能力。这已经通过在大肠杆菌K12中转移质粒pUR400(Schmid等,1982)或在大肠杆菌的蔗糖阴性菌株中转移携带cscBKAR基因的不同质粒(包括pKJL101-1)(Jahreis等,2002)得到证明。关于工业应用，从蔗糖生产色氨酸已经在大肠杆菌K12中有文献报道(Tsunekawa等,1992)，生产氢已经在携带pUR400质粒的大肠杆菌中显示(Penfold和Macaskie,2004)，并且通过转移两种系统，即PTS和非PTS，生产不同氨基酸已在专利申请EP1149911中报道。

令人惊讶地，通过将导致在不能利用蔗糖的大肠杆菌菌株中利用蔗糖的遗传修饰和用于1,3-丙二醇的特异性生物合成途径组合，本发明的发明人能够获得从可再生的碳源(蔗糖)生产1,3-丙二醇的得率的改善。

发明内容

本发明涉及一种经遗传修饰、用于从蔗糖生物生产1,3-丙二醇的微生物，其中所述微生物包含：

-用于产生1,3-丙二醇的两步代谢途径，包括第一步用具有2-酮酸脱羧酶活性的酶将4-羟基-2-酮丁酸脱羧基，和第二步用具有羟基醛还原酶活性的酶还原所得的3-羟基丙醛，和

-能够使微生物利用蔗糖作为唯一碳源的基因。

根据本发明，所述微生物至少包含一个编码具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽的基因和一个编码具有羟基醛还原酶活性的多肽的基因。这些基因可是外源的或内源的，并且可以是染色体表达或者染色体外表达。

根据本发明的微生物被进一步遗传修饰而能够使用蔗糖作为唯一碳源。

发明详述

如本文所使用的，如下的术语可以用于解释权利要求和说明书。

术语“蔗糖”是指通过α(1,2)糖苷键连接的葡萄糖和果糖的二糖，具有分子式C₁₂H₂₂O₁₁。它的系统名为α-D-吡喃葡糖基-

-呋喃果糖苷。

术语“经遗传修饰的微生物”意思是本发明的微生物不是在自然中发现的，而是通过引入或者通过缺失新的遗传元件而被修饰的。它也可以通过如下而转化：在定点诱变和在特异选择压力下进化的组合中强迫新的代谢途径的产生和进化(参见例如WO2004/076659)。

如果将外源基因与允许它们在宿主微生物中表达的所有元件一起引入到微生物中，则微生物就能够表达外源基因。用外源DNA转化微生物是本领域技术人员的常规任务。

外源基因可以整合入宿主基因组，或者可以通过质粒或载体在染色体外表达。不同类型的质粒是本领域技术人员已知的，它们的不同在于其复制起点和在细胞中的拷贝数。

在具体的实施方案中，内源基因也可以被修饰以调节其表达和/或活性，这可以通过或者在编码序列中引入突变而修饰基因产物，或者通过引入异源序列叠加(in addition)或者替换(in replacement of)内源的调节元件。内源基因的调节可以有两种方式：一方面上调和/或增强基因产物的活性，或者另一方面下调和/或降低内源基因产物的活性。

调控基因表达的重要元件是启动子。在本发明的一个优选实施方案中，基因可以用具有不同强度的启动子表达，其可为诱导型的。这些启动子可为同源的或者异源的。本领域技术人员知道如何选择最方便的启动子，例如启动子Ptrc,Ptac,Plac或λ启动子cI是广泛使用的。

根据本发明，“具有2-酮酸脱羧酶活性的酶”是指具有脱羧酶活性的酶，其底物是2-酮酸。编码2-酮酸脱羧酶活性酶的基因是本领域中公知的，包括来自多个物种的Pdc基因，更具体为来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Pdc1,Pdc5,Pdc6,Aro10和Thi3基因；来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的kivD基因；丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的pdc基因；来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的Pdc2和Pdc3基因；来自树干毕赤酵母(Pichiastipitis)的Pdc1,Pdc2和Aro10；和来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的pdc基因。由来自大肠杆菌的基因sucA编码的2-酮戊二酸脱羧酶复合体的第一个亚基，以及由大肠杆菌的基因dxs编码的酶也具有2-酮酸脱羧酶活性。所述基因和蛋白的功能同源物、功能变体和功能片段也涵盖在本定义中。

根据本发明，“具有羟基醛还原酶活性的酶”是指具有还原酶活性的酶，其底物是羟基醛。编码羟基醛还原酶活性的基因是本领域中公知的，包括来自大肠杆菌的yqhD,fucO,dkgA,dkgB基因和来自酿酒酵母的ADH1和ADH2基因。所述基因和蛋白的功能同源物、功能变体和功能片段也涵盖在本定义中。

术语“利用蔗糖作为唯一碳源”是指微生物能够在含有蔗糖作为唯一碳源的培养基中生长。然而应当理解，在根据本发明的生产1,3-丙二醇的方法中，培养基中的蔗糖源除了蔗糖之外，可包含额外的碳源，如己糖(如葡萄糖、半乳糖或乳糖)、戊糖、单糖、双糖(例如蔗糖、纤维二糖或麦芽糖)、寡糖、淀粉或其衍生物、半纤维素、甘油，和其组合。

在本发明的一个具体实施方案中，微生物包括编码PTS蔗糖利用系统和/或非PTS蔗糖利用系统的功能基因。

PTS蔗糖利用系统是一种基于由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)依赖的蔗糖磷酸转移酶系统(蔗糖-PTS)转运蔗糖的蔗糖利用系统。磷酸转移酶系统将糖(例如蔗糖或葡萄糖)的转运与使用PEP作为磷酸供体的糖的磷酸化偶联。在转运入细胞后，蔗糖-磷酸被转化酶切割成葡萄糖-6-磷酸和果糖。果糖进一步被果糖激酶磷酸化为果糖-6-磷酸。编码此PTS蔗糖利用系统的基因可受到调节蛋白的调控。

非-PTS蔗糖利用系统是基于由不依赖磷酸烯醇式丙酮酸的系统转运蔗糖的蔗糖利用系统。在转运入细胞后，蔗糖被转化酶切割成葡萄糖和果糖。果糖进一步被果糖激酶磷酸化为果糖-6-磷酸，葡萄糖被葡萄糖激酶磷酸化为葡萄糖-6-磷酸。编码此非-PTS蔗糖利用系统的基因可受到调节蛋白的调控。

在本发明的一个具体方面中，微生物天然表达或者通过引入如下基因而被修饰：来自沙门氏菌属的scrKYABR(scrK编码果糖激酶，scrY编码膜孔蛋白(porin)，scrA编码蛋白IIBC，scrB编码蔗糖-6-P转化酶，scrR编码阻抑物)。携带所述scrKYABR基因的接合质粒pUR400可以用于转化微生物。这些基因可以全部组合在一起使用，或者以包含这些基因中至少一种的任意组合使用。特别地，scrR基因可以被省略。

在本发明的另一个具体方面中，微生物天然表达或者通过引入来自大肠杆菌EC3132的基因而被修饰：即编码蔗糖:质子同向转运转运系统(cscB)，果糖激酶(cscK)，转化酶(cscA)和蔗糖特异性阻抑物(cscR)的cscBKAR基因。这些基因可以全部组合在一起使用，或者以包含这些基因中至少一种的任意组合使用。特别地，cscR基因可以被省略。也可以使用来自其它生物体的同源基因。

根据本发明，这些基因的定名具有更一般的意义，并且涵盖其它微生物中的相应基因。使用来自沙门氏菌属和来自大肠杆菌的基因的GenBank参考，本领域的技术人员能够确定除沙门氏菌属或大肠杆菌之外的生物体中的等同基因。

同源序列及其百分比同源性的鉴定手段是本领域技术人员公知的，并且特别包含在BLAST程序中，其可以在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/网站上以该网站上所示的默认参数使用。所得序列可以用例如CLUSTALW程序(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)使用这些网站上所示的默认参数加以利用(比对)。

PFAM数据库(蛋白质家族比对和隐马尔可夫模型数据库http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)是一个大型的蛋白质序列比对集合。每个PFAM均使其能够显示多重比对，观察蛋白质结构域，评价在生物体中的分布，获取其它的数据库和显示已知的蛋白结构。

COGs(蛋白质直向同源组的簇http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)是通过比较来自66个完全测序的代表14个主要系统发育谱系(phylogenetic line)的单细胞基因组的蛋白质序列而获得的。每一个COG由至少3个谱系限定，使其有可能鉴定古老的保守结构域。

目前本领域的技术人员使用数种技术用于将DNA引入到细菌株内。一个优选的技术是电穿孔，其为本领域技术人员所熟知的。

根据本发明的一个具体实施方案，微生物包含编码2-酮酸脱羧酶活性的内源基因。所述微生物优选地选自：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(包括Pdc1,Pdc5,Pdc6,Aro10,Thi3基因)；乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(Kivd)；丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(Pdc)；树干毕赤酵母(Pichiastipitis)(Pdc1,Pdc2,Aro10)；运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)(Pdc)；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。

在本发明的一个优选实施方案中，编码2-酮酸脱羧酶的内源基因的表达在所述微生物中增强。

根据本发明的另一个实施方案，微生物不包含编码2-酮酸脱羧酶的内源基因。这种缺乏内源2-酮酸脱羧酶的微生物优选选自大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对于这些微生物，本发明的微生物包含一个编码2-酮酸脱羧酶的异源基因。编码2-酮酸脱羧酶活性的基因包括来自多个物种的Pdc基因，更特别地是来自酿酒酵母的Pdc1,Pdc5,Pdc6,Aro10,Thi3基因)；来自乳酸乳球菌的kivd基因；来自丙酮丁醇梭菌pdc基因；来自拟南芥的Pdc2和Pdc3基因；来自树干毕赤酵母的Pdc1,Pdc2和Aro10基因；和来自运动发酵单胞菌的Pdc基因。由来自大肠杆菌的sucA基因编码的2-酮戊二酸脱羧酶复合体的第一个亚基以及由大肠杆菌dxs基因编码的酶也具有2-酮酸脱羧酶活性。

根据本发明的另一个实施方案，所述微生物包括编码羟基醛还原酶活性的内源基因。其优选选自：大肠杆菌(yqhD,fucO,dkgA,dkgB)；酿酒酵母(ADH1,ADH2)；和具有至少一种具有醛还原酶活性或醇脱氢酶活性的酶的所有生物体。这种具有内源羟基醛还原酶活性的微生物可以进一步修饰，以增强编码羟基醛还原酶的内源基因的表达。

在一个具体的实施方案中，所述微生物包括编码羟基醛还原酶活性的异源基因。编码羟基醛还原酶活性的基因包括来自大肠杆菌的yqhD,fucO,dkgA,dkgB基因和来自酿酒酵母的ADH1和ADH2基因。

根据本发明的另一个实施方案，所述微生物经遗传修饰，以改进从蔗糖产生4-羟基-2-酮丁酸。这个结果可以通过增加高丝氨酸转氨酶或高丝氨酸氧化酶的表达来实现。这些酶使L-高丝氨酸(从L-天冬氨酸获得)转变为4-羟基-2-酮丁酸。增加高丝氨酸氧化酶的表达可以通过如下达成：引入和过表达来自不透明红球菌(R.opacus)的编码L-氨基酸氧化酶的基因，或者通过在基因中引入突变以增加相应蛋白质的活性。增加高丝氨酸转氨酶的表达水平可以通过如下达成：引入驱动大肠杆菌serC基因的表达的人工启动子，增加细胞中的拷贝数，或者在serC基因中引入突变以增加相应蛋白质的活性。

1,3-丙二醇的整体生物合成途径如图1所示。

在另一个实施方案中，所述微生物显示草酰乙酸生物合成途径中刺激的通量；此结果可通过增加由ppc基因编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表达水平而实现。增加磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表达水平可以通过如下达成：引入驱动ppc基因表达的人工启动子，增加细胞中的拷贝数，或者在ppc基因中引入突变以增加相应蛋白质的活性。草酰乙酸汇集物/池(pool)的增加也可以通过增加由埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)或谷氨酸棒杆菌的pyc基因编码的外源丙酮酸羧化酶的表达水平而实现。丙酮酸羧化酶表达水平的增加可以通过(于染色体上或者在染色体外)过表达这些基因而达成。特别地，在厌氧条件下，草酰乙酸汇集物的增加还可以通过增加由pckA基因编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的表达水平而实现。丙酮酸羧化酶表达水平的增加可以通过如下达成：引入驱动pckA基因表达的人工启动子，增加细胞中的拷贝数，或者在pckA基因中引入突变以增加相应蛋白质的活性。中间产物草酰乙酸的可用性也可以通过减弱分别由pckA和/或sfcA或maeB基因编码的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和/或苹果酸酶的基因的表达水平而增加。这可以通过用较低强度的启动子代替这些基因的野生型启动子，或者通过使用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定的元件来完成。如果需要，也可以通过缺失相应的DNA序列而实现这些基因的完全弱化或消除。

在另一个实施方案中，所述微生物向高丝氨酸生物合成途径提供刺激的通量。这可以通过增加分别由thrA/metL和asd基因编码的天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶和/或天冬氨酸半醛脱氢酶的表达而实现。增加天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶和/或天冬氨酸半醛脱氢酶的表达可以通过如下达成：引入驱动thrA/metL和/或asd基因表达的人工启动子，增加细胞中的拷贝数，或者在thrA和/或asd基因内引入突变以增加相应蛋白质的活性。

在本发明的一个特定实施方案中，可将突变引入thrA基因中，降低其对反馈抑制物苏氨酸的敏感性(反馈脱敏的等位基因)，从而允许在苏氨酸存在下活性的增加。

在本发明进一步的实施方案中，微生物经修饰以显示高丝氨酸转变为除1,3-丙二醇之外的化合物的水平减弱。这个结果可以通过减弱高丝氨酸消耗酶，如高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶(由thrB和thrC编码)、高丝氨酸O-转琥珀酰基酶(由metA编码)的水平而实现。这些基因可以通过如下弱化：用更弱的启动子代替天然启动子，或者使用使相应的信使RNA或蛋白不稳定的元件。如果需要，也可以通过缺失相应的DNA序列而实现这些基因的完全弱化或消除。

在本发明进一步的实施方案中，细菌经修饰以显示高丝氨酸前体转变为除3-羟基丙酸之外的化合物的水平减弱；这个结果可以通过减弱二氢吡啶二羧酸合酶(由dapA编码)的水平而实现。该基因的弱化可以通过如下完成：用较低强度的启动子代替天然启动子，或者使用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定的元件。如果需要，也可以通过缺失相应的DNA序列而实现基因的完全弱化或消除。本发明还涉及在本发明此具体实施方案中使用的细菌。

在本发明进一步的实施方案中，微生物经修饰以显示3-羟基丙醛转变为除1,3-丙二醇之外的化合物的水平减弱。这个结果可以通过减弱3-羟基丙醛消耗酶，如3-羟基丙醛脱氢酶(由aldA,aldB,aldH编码)的水平实现。这些基因可以通过如下弱化：用更弱的启动子代替天然启动子，或者使用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定的元件。如果需要，也可以通过缺失相应的DNA序列而实现基因的完全弱化或消除。

所有用于转化微生物的技术和用于增强本发明蛋白质的生产的调节元件均是本领域公知的，并且可在文献中获得，包括申请人自己的关于在多种微生物中修饰生物合成途径的专利申请，包括WO2008/052973,WO2008/052595,WO2008/040387,WO2007/144346,WO2007/141316,WO2007/077041,WO2007/017710,WO2006/082254,WO2006/082252,WO2005/111202,WO2005/073364,WO2005/047498,WO2004/076659，其内容通过提述并入本文。

如前所述，根据本发明，这些基因的定名具有更一般性的意义，并且涵盖在其它微生物中的相应基因。

根据本发明，术语“微生物”是指细菌、酵母或真菌。优选地，微生物选自：肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)和棒杆菌科(Corynebacteriaceae)。更优选地，微生物是埃希氏菌属(Escherichia)、梭菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、沙门氏菌属或棒杆菌属(Corynebacterium)。甚至更优选地，微生物是大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌或丙酮丁醇梭菌或枯草芽孢杆菌菌种。

本发明还涉及用于从蔗糖发酵生产1,3-丙二醇的方法，包括如下步骤：

-在含有蔗糖的合适培养基上培养根据本发明的微生物和

-从培养基回收1,3-丙二醇。

发酵在具有合适培养基的发酵罐中一般地进行，该合适培养基适合于(adapted to)所述微生物，含有蔗糖和，如果需要的话，共底物。

“合适培养基”是指如下的培养基(例如无菌的液体培养基)，其包含对于细胞的维持和/或生长必需的或有利的营养物，如碳源或碳底物、氮源例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和磷酸铵；磷源例如磷酸一钾或磷酸二钾；痕量元素(例如金属盐)如镁盐、钴盐、和/或锰盐；以及生长因子如氨基酸、维生素、生长促进剂等。

作为大肠杆菌已知培养基的一个实例，培养基可以和M9培养基(Anderson,1946,Proc.Natl.Acad.Sci.USA32:120-128),M63培养基(Miller,1992;A Short Course in Bacterial Genetics:A Laboratory Manual and Handbookfor Escherichia coli and Related Bacteria,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)或如Schaefer等(1999,Anal.Biochem.270:88-96)定义的培养基具有相同或相似的组成。

发酵过程的培养条件可以由本领域技术人员容易地定义。特别地，细菌在20℃-55℃，优选在25℃-40℃，且优选对于梭菌科在约35℃，而对于肠杆菌科在约37℃的温度发酵。

根据本发明，术语“培养”、“培育”、“生长”和“发酵”可互换使用，表示细菌在含有简单(simple)碳源的合适生长培养基中的生长。发酵是一个经典的过程，其可以在需氧、微氧或厌氧条件下进行。

“在需氧条件下”意指通过使气体溶解于液相中向培养物提供氧气。这可以通过如下获得：(1)将含氧气体(例如空气)喷射到液相或者(2)振荡含有培养基的容器以便将头部空间内含有的氧气转移到液相。在需氧条件代替厌氧条件下发酵的优势在于，氧气作为电子受体存在可改进菌株以ATP形式产生更多能量用于细胞过程的能力。因此，菌株的一般代谢得到改进。

微氧条件被定义为如下的培养条件，其中将低百分比的氧气(例如使用含有0.1-10%氧气、以氮气补足至100%的气体混合物)溶解到液相中。

厌氧条件被定义为如下的培养条件，其中不向培养基中提供氧气。严格的厌氧条件可以通过向培养基中喷射惰性气体如氮气以除去痕量的其它气体而获得。硝酸盐可以用作电子受体以改进菌株的ATP产生并改进其代谢。

在本发明的一个具体方面中，蔗糖从生物质，特别是从植物生物质获得。整个植物或者植物的任何具体部分均可用于制备用作含蔗糖培养基的原料。制备可基于本领域技术人员已知的任何处理，以从含蔗糖植物生物质提取蔗糖。

在本发明的一个优选方面中，含蔗糖培养基从选自下组的植物中获得：甘蔗、糖用甜菜、甜高粱、糖枫、糖棕榈和蓝色龙舌兰。

优选地，含蔗糖培养基从甘蔗或糖用甜菜获得。

可使用含蔗糖培养基的不同形式：汁(juice)、浓缩汁、糖浆、澄清汁、糖蜜或结晶蔗糖。优选的形式是来自甘蔗的原汁，从植物直接提取而不经任何处理。简言之，在用于提取汁液的磨制过程之前，洗涤收获的甘蔗。将甘蔗的结构打断，随后研磨，同时用水提取蔗糖以获得原汁。然后，添加石灰使原汁澄清，加热，并将澄清汁与沉淀物分离。通过蒸发获得浓缩的糖浆。

因为一些粗制含蔗糖培养基，特别是如上所述从生物质获得的那些，除了含蔗糖培养基之外，还含有其它可用于微生物生长的营养物，因此用于微生物生长的合适培养基可通过如下设计：使用仅含有蔗糖的培养基，即由含蔗糖培养基组成的合适培养基，或者用磷源和/或氮源补足含蔗糖培养基。

优选地，含蔗糖培养基包含至少7%的蔗糖。

在本发明的一个方面中，将回收的1,3-丙二醇进一步纯化。从培养基回收1,3-丙二醇是本领域技术人员的日常任务。回收和纯化方法在如下的专利申请中有公开：WO2009/068110和WO2010/037843。

在详细描述本发明之前，应当理解，本发明不仅限于特定的例示的方法，当然可以改变。特别地，实施例显示了经过修饰的大肠杆菌菌株，但是这些修饰可容易地在相同科的其它微生物上进行。

大肠杆菌属于肠杆菌科，其包括革兰氏阴性、棒状、不形成孢子，并且通常为1-5μm长的成员。大多数成员具有用于四处移动的鞭毛，但是少数菌属是不动的。该科的许多成员是人类和其它动物的肠中发现的肠道菌群中的正常部分，而其它的则见于水和土壤中，或者是不同动物和植物品种上的寄生物。大肠杆菌(E.coli)是最重要的模式生物之一，但是我们也可以引用克雷伯氏菌属(特别是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))和沙门氏菌属作为肠杆菌科的重要成员。

附图说明

图1从蔗糖生物合成1,3-丙二醇的途径。

实施例

实施例1

以葡萄糖和蔗糖生产1,3-丙二醇的最大得率(yield)的计算

1.1–用于模拟的参数

用METEX专有的软件METOPT^TM进行模拟。使用大肠杆菌的简化代谢网络，其包括中心代谢网络、用于所有生物质前体的代谢途径和如上所述的特定生产途径。使用用于大肠杆菌的经典生物质组成。使用葡萄糖或蔗糖碳源进行模拟。对于蔗糖使用，对PTS系统和非PTS系统均进行建模。因为在所计算的最大得率上没有差异，所以仅报告了一个使用蔗糖的得率。对实际最大得率进行了计算，考虑0.1h^-1的生长速度和5mmol_ATP.g_DW ^-1.h^-1的维持能量。所有的模拟均以3mmol.g_DW ^-1.h^-1的葡萄糖的比摄取速率(specific uptakerate)进行。模拟在需氧条件下进行。

1.2–模拟结果

	使用葡萄糖的1,3-丙二醇	使用蔗糖的1,3-丙二醇
			最大实际得率(g/g)	0.38	0.41

实施例2

由大肠杆菌serC基因编码的L-高丝氨酸转氨酶活性的证明

2.1–构建用于SerC表征的菌株：BL21(pPAL7-serC)

为了表征SerC蛋白，从表达载体pPAL7(Bio-rad)表达相应的基因。

为此，使用寡核苷酸pPAL7-serC F和pPAL7-serC R从大肠杆菌基因组扩增serC基因。PCR产物用HindIII和EcoRI酶限制性消化，并克隆到用相同限制酶限制性消化的载体pPAL7中。最终的载体命名为pPAL7-serC。

pPAL7-serC F(SEQ ID NO1):

cccAAGCTTtgATGGCTCAAATCTTCAATTTTAGTTCTGG

具有

-与serC基因的序列(956876-956904)(网站http://www.ecogene.org/上的参考序列)同源的区域(粗体)，

-带有HindIII限制位点的区域(加下划线)

pPAL7-serC R(SEQ ID NO2):

gGAATTCTTAACCGTGACGGCGTTCGAACTCAACC

具有

-与serC基因区的序列(957964-957937)(网站http://www.ecogene.org/上的参考序列)同源的区域(粗体)，

-带有EcoRI限制位点的区域(加下划线)

然后将该pPAL7-serC质粒引入感受态BL21(DE3)细胞(Invitrogen)中。

2.2–蛋白SerC的过表达

蛋白SerC的过表达使用补充有2.5g/l葡萄糖和100mg/l氨苄青霉素的LB培养液(Bertani,1951,J.Bacteriol.62:293-300)在2l锥形瓶中完成。预培养物在装有50ml补充以2.5g/l葡萄糖和100mg/l氨苄青霉素的LB培养液的500ml锥形瓶中过夜生长。该预培养物用于接种500ml培养物至OD_600nm为大约0.15。首先在37℃和200rpm培养直到OD_600nm为大约0.5，然后转移到25℃和200rpm并生长直到OD_600nm为大约0.6-0.8(大约1小时)，然后用500μM IPTG诱导。将培养保持在25℃和200rpm直到OD_600nm为大约4，然后停止。细胞在4℃在7000rpm离心5分钟，然后保存于-20℃。

2.3–蛋白SerC的纯化

2.3.1–步骤1：无细胞提取物的制备

将大约280mg的大肠杆菌生物质悬浮在45ml的100mM磷酸钾pH7.6和蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)中。细胞悬液于50ml圆锥管中(每个圆锥管15ml)在冰上声处理(Bandelin sonoplus,70W)，在30秒及30秒间隔的8个循环过程中进行。声处理后，将细胞用5mM MgCl₂和1UI/ml DNaseI在室温温育30分钟。通过在4℃在12000g离心30分钟除去细胞碎片。

2.3.2–步骤2：亲和纯化

在Profinity柱(BIORAD,Bio-Scale Mini Profinity Exact Cartridge5ml)上根据制造商推荐的操作流程通过亲和性从粗细胞提取物纯化蛋白质。将粗提物加载于用100mM磷酸钾pH7.6平衡的5ml Profinity Exact Cartridge上。用10倍柱体积的相同缓冲液洗涤柱子，用100mM磷酸钾pH7.6、100mM氟化物在室温温育30min。用2倍柱体积的100mM磷酸钾pH7.6将蛋白从柱上洗脱。标签保持与树脂紧密结合，并释放纯化的蛋白。汇集含有蛋白的级分，并相对100mM Tris HCl,150mM NaCl和10%甘油pH8透析。

用Bradford蛋白测定法测量蛋白质的浓度。

2.4–L-高丝氨酸转氨酶测定法

L-高丝氨酸转氨酶活性用偶联的酶测定法在30℃测量。L-高丝氨酸转氨酶活性测定使用1ml总体积中的420mM磷酸钾缓冲液pH8.2、2mM乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸、3mM L-高丝氨酸、20单位/ml来自牛肝脏的谷氨酸脱氢酶、1mM中和的α-酮戊酸和大约50μg粗提物进行。在分光光度计上在375nm监测乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸的消耗。从含有底物(L-高丝氨酸)的测定中检测到的活性减去缺乏底物的对照测定中检测到的活性。一个L-高丝氨酸转氨酶活性单位是在30℃每分钟催化1μmol L-高丝氨酸转氨基所需的酶量。(ε375nm=6100M^-1cm^-1)。

2.5–纯化的酶的活性

实施例3

由乳酸乳球菌基因kivD编码的4-羟基-2-酮丁酸脱羧酶活性的证明

3.1–构建用于KivD表征的菌株：BL21(pPAL7-kivDll)

为了表征KivD蛋白，从表达载体pPAL7(Bio-rad)表达相应基因。

为此，使用寡核苷酸pPAL7-kivDll F和pPAL7-kivDll R从乳酸乳球菌基因组扩增kivD基因。PCR产物用HindIII和EcoRI酶限制性消化，并克隆到用相同限制酶限制性消化的载体pPAL7中。最终的载体命名为pPAL7-kivDll。

pPAL7-kivDll F(SEQ ID NO3):

cccAAGCTTtgACTTCTATGTATACCGTGGGTGATTATC

具有

-与乳酸乳球菌kivD基因的合成基因的序列同源的区域(斜体)，

-带有用于产生如下无标签蛋白必需的核苷酸的区域(粗体)，该无标签蛋白含有有利于纯化的短的N-端氨基酸延伸

-带有HindIII限制位点的区域(加下划线)

pPAL7-kivDll R(SEQ ID NO4):

gGAATTCTTAGCTTTTATTCTGTTCGGCGAACAG

具有

-与乳酸乳球菌kivD基因的合成基因的序列同源的区域(斜体)，

-带有EcoRI限制位点的区域(加下划线)

然后将该pPAL7-kivDll质粒引入到菌株BL21(DE3)感受态细胞(Invitrogen)中。

3.2–蛋白KivD的过表达

kivD蛋白的过表达应用与实施例#2.2相同的操作流程完成。

3.3-蛋白KivD的纯化

3.3.1–步骤1：无细胞提取物的制备

将大约188mg大肠杆菌生物质悬浮在30ml100mM磷酸钾pH7.6和蛋白酶抑制剂混合物中。细胞悬液于50ml圆锥管中(每个圆锥管15ml)在冰上声处理(Bandelin sonoplus,70W)，在30秒及30秒间隔的8个循环过程中进行。声处理后，细胞用5mM MgCl₂和1UI/ml DNaseI在室温温育30分钟。通过在4℃在12000g离心30分钟除去细胞碎片。

3.3.2–步骤2：亲和纯化

在Profinity柱(BIORAD,Bio-Scale Mini Profinity Exact Cartridge5ml)上根据制造商推荐的操作流程通过亲和性从粗细胞提取物纯化蛋白质。将粗提物加载于用100mM磷酸钾pH7.6平衡的5ml Profinity Exact Cartridge上。用10倍柱体积的相同缓冲液洗涤柱子，用100mM磷酸钾pH7.6、100mM氟化物在4℃过夜温育。用2倍柱体积的100mM磷酸钾pH7.6将蛋白从柱上洗脱。标签保持与树脂紧密结合，并释放纯化的蛋白。汇集含有蛋白的级分，并相对100mM磷酸钾,150mM NaCl和10%甘油pH8透析。

用Bradford蛋白测定法测量蛋白质浓度。

3.4–4-羟基-2-酮丁酸脱羧酶测定法

3.4.1–4-羟基-2-酮丁酸的化学合成

4-羟基-2-酮丁酸的化学合成已经在如下出版物中有描述：

R S Lane;EE Dekker;(1969).2-keto-4-hydroxybutyrate.Synthesis,chemical properties,and as a substrate for lactate dehydrogenase of rabbit muscleBiochemistry.,8(7),2958-2966。

3.4.2-4-羟基-2-酮丁酸脱羧酶测定法

4-羟基-2-酮丁酸的脱羧基用偶联的酶测定法在30℃测量。4-羟基-2-酮丁酸脱羧酶活性测定法用1ml总体积中的50mM磷酸钾缓冲液pH6、0.2mMNADH、1mM MgSO₄、0.5mM硫胺二磷酸酯、72单位/ml来自酿酒酵母的醇脱氢酶、10mM中和的4-羟基-2-酮丁酸和大约40μg纯化的蛋白进行。用分光光度计在340nm监测NADH的消耗。从含有底物的测定中检测到的活性减去缺乏底物的对照测定中检测到的活性。一个4-羟基-2-酮丁酸脱羧酶活性单位是在30℃每分钟催化1μmol4-羟基-2-酮丁酸脱羧基所需的酶量。(ε340nm=6290M^-1cm^-1)。

3.5–纯化的酶的活性

实施例4

由大肠杆菌yqhD基因编码的3-羟基丙醛还原酶活性的证明

4.1-构建用于YqhD表征的菌株：MG1655ΔyqhD::Km(pTRC99A-yqhD)

4.1.1-MG1655ΔyqhD::Km菌株的构建

为了缺失yqhD基因，使用Datsenko和Wanner(2000)描述的同源重组策略。该策略允许插入氯霉素或卡那霉素抗性盒，同时缺失大多数关注的基因。为此，使用如下的寡核苷酸：

ΔyqhDF(SEQ ID NO5)

atgaacaactttaatctgcacaccccaacccgcattctgtttggtaaaggcgcaatcgctggtttacgcgaacaaattccgtgtaggctggagctgcttcg

具有

-与yqhD区的序列(3153377-3153456)(http://www.ecogene.org/网站的参考序列)同源的区域(小写)，

-用于扩增卡那霉素抗性盒的区域(大写)(Datsenko,K.A.和Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645中的参考序列)。

ΔyqhDR(SEQ ID NO6)

ttagcgggcggcttcgtatatacggcggctgacatccaacgtaatgtcatgattttcgcccagttgggtcatgccgtgctccatatgaatatcctccttag

具有

-与yqhD区的序列(3154540-3154460)(http://www.ecogene.org/网站的参考序列)同源的区域(大写)，

寡核苷酸ΔyqhDF和ΔyqhDR用于从质粒pKD4扩增卡那霉素抗性盒。然后通过电穿孔将所得的PCR产物引入到菌株MG1655(pKD46)中。然后选择卡那霉素抗性转化体，用如下限定的寡核苷酸yqhDF和yqhDR通过PCR分析验证抗性盒的插入。保留下来的菌株定名为MG1655ΔyqhD::Km。

yqhDF(SEQ ID NO7):ggcgtctcgccatacaacaaacgcacatcgggc(与序列3153068-3153100同源)。

yqhDR(SEQ ID NO8):gggctttgccgacaccttcttcgttcttg(与序列3154825-3154797同源)。

4.1.2–质粒pTRC99A-yqhD的构建

为了表征YqhD蛋白，从载体pTRC99A(Amersham)表达相应基因。

为此，使用寡核苷酸yqhD F pTRC99A F和yqhD R pTRC99A R从大肠杆菌基因组扩增yqhD基因。PCR产物用酶HindIII和BspHI限制性消化，并克隆入用NcoI-HindIII限制酶限制性消化的载体pTRC99A中。最终的载体命名为pTRC99A-yqhD。

yqhD F pTRC99A F(SEQ ID NO9):

cgatgcacgtcatgaacaactttaatctgcacaccccaacccg，

具有：

-与yqhD基因的序列(3153377-3153408)(http://www.ecogene.org/网站的参考序列)同源的区域(下划线)，

-BspHI限制位点(粗体)

yqhD R pTRC99A R(SEQ ID NO10):

ggcgtaaaaagcttagcgggcggcttcgtatatacggcggctgacatccaacgtaatgtcgtgattttcg

具有：

-与yqhD基因的序列(3154540-3154483)(http://www.ecogene.org/网站的参考序列)同源的区域(下划线)，

-HindIII限制位点(粗体)

然后将该pTRC99A-yqhD质粒引入到菌株MG1655ΔyqhD::Km中。

4.2–YqhD蛋白的过表达

YqhD蛋白在含有2.5g/l葡萄糖和50mg/l氨苄青霉素和50mg/l卡那霉素的500ml LB培养基的2l带挡板的锥形瓶中在37℃需氧条件下过表达。将瓶在200rpm在定轨摇床(orbital shaker)上摇动。当在550nm测量的光密度达到0.5单位时，将瓶在25℃温育。当光密度达到1.2单位时，通过添加IPTG至终浓度为500μM诱导YqhD蛋白的产生。当培养物达到超过3.5单位的光密度时，通过离心收获生物质。弃去上清，在使用前将沉淀储存在-20℃。

4.3–YqhD蛋白的纯化

4.3.1–步骤1：无细胞提取物的制备

将400mg大肠杆菌生物质悬浮在70ml的50mM Hepes pH7.5和蛋白酶抑制剂混合物中。将细胞于Rosett Cell RZ3中在冰上声处理(Bransonsonifier,70W)，在30秒及30秒间隔的8个循环过程中进行。声处理后，细胞用1mM MgCl₂和1UI/ml DNaseI在室温温育1小时。通过在4℃在12000g离心30min除去细胞碎片。保留上清作为粗提物。

4.3.2–步骤2：硫酸铵沉淀

粗提物用浓度为50%的硫酸铵沉淀：在冰上向粗提物添加硫酸铵固体(300g/l)。在4℃温育15min后，将混合物在4℃在12000g离心15min。弃去上清，将沉淀溶解于50ml的50mM Hepes pH7.5,1M硫酸铵中。

4.3.3–步骤3：疏水层析

使用Akta Purifier(GE Healthcare)，将来自上步的蛋白提取物加载于用相同缓冲液平衡的5ml HiTrap PhenylHP柱(GE Healthcare)上。用10倍柱体积的相同缓冲液洗涤柱子。蛋白质用两步梯度洗脱，10倍柱体积的1M至0.5M硫酸铵的梯度，和20倍柱体积的0.5M至0M硫酸铵的梯度。洗脱后，用10倍柱体积的50mM Hepes pH7.5洗涤柱子。柱流速为2.5ml/min，并收集2.5ml级分。汇集含有蛋白质的级分，在50mM Hepes pH7.5中透析，并浓缩至1.14μg/μl的浓度。

4.4–3-羟基丙醛还原酶活性测定法

通过用分光光度计在340nm波长和在37℃恒温测量NADPH氧化的初始速率来测定3-羟基丙醛还原酶活性。反应混合物以3-羟基丙醛为底物，在1ml的最终体积中的20mM Hepes pH7.5,0.1mM硫酸锌,0.2mM NADPH,6μg纯化的酶中进行。通过添加终浓度为10mM的底物3-羟基丙醛起始反应，然后将反应混合物在37℃温育5min。空白反应含有反应混合物的所有组分，但没有纯化的酶。一个酶活性单位定义为在37℃每分钟消耗1μmol底物的酶量。比酶活性表示为单位/mg蛋白。

4.5–纯化的酶的活性

实施例5

具有增加的1,3-丙二醇途径通量并表达4-羟基-2-酮丁酸脱羧酶编码基因、3-羟基丙醛还原酶编码基因和L-高丝氨酸转氨酶编码基因的菌株的构建：MG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABC(pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07)(pME101-thrA*1-serC)

5.1–菌株MG1655ΔpykF的构建

为了缺失pykF基因，使用Datsenko和Wanner(2000,PNAS,97:6640-6645)描述的同源重组策略。该策略允许插入氯霉素或卡那霉素抗性盒，同时缺失大多数关注的基因。为此，使用如下的寡核苷酸：

ΔpykFF(SEQ ID NO11)

cccatccttctcaacttaaagactaagactgtcatgaaaaagaccaaaattgtttgcaccatcggaccgaaaaccgaaTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

具有

-与pykF区的序列(1753689-1753766)(http://www.ecogene.org/网站的参考序列)同源的区域(小写)，

-用于扩增卡那霉素抗性盒的区域(大写)，

ΔpykFR(SEQ ID NO12)

ggacgtgaacagatgcggtgttagtagtgccgctcggtaccagtgcaccagaaaccataactacaacgtcacctttgtgCATATGAATATCCTCCTTAG

具有

-与pykF区的序列(1755129-1755051)(http://www.ecogene.org/网站的参考序列)同源的区域(大写)，

-用于扩增卡那霉素抗性盒的区域(大写)。

使用寡核苷酸ΔpykFF和ΔpykFR从质粒pKD4扩增卡那霉素抗性盒。然后通过电穿孔将所得的PCR产物引入到菌株MG1655(pKD46)中。然后选择卡那霉素抗性转化体，用如下限定的寡核苷酸pykFF和pykFR通过PCR分析验证抗性盒的插入。保留下来的菌株定名为MG1655ΔpykF::Km。

pykFF(SEQ ID NO13):gcgtaaccttttccctggaacg(与序列1753371-1753392同源)。

pykFR(SEQ ID NO14):gcgttgctggagcaacctgccagc(与序列1755518-1755495同源)。

消除卡那霉素抗性盒。通过电穿孔将携带作用于卡那抗性盒的FRT位点的FLP重组酶的质粒pCP20引入重组位点。在42℃系列培养之后，用与先前所用相同的寡核苷酸(pykFF/pykFR)通过PCR分析验证卡那霉素抗性盒的丢失。保留下来的菌株定名为MG1655ΔpykF。

5.2–菌株MG1655ΔpykFΔmetA的构建

为了缺失metA基因，使用Datsenko和Wanner(2000)描述的同源重组策略。该策略允许插入氯霉素或卡那霉素抗性盒，同时缺失大多数关注的基因。为此，使用如下的寡核苷酸。

ΔmetAF(SEQ ID NO15)：

ttcgtgtgccggacgagctacccgccgtcaatttcttgcgtgaagaaaacgtctttgtgatgacaacttctcgtgcgtctTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

具有

-与metA区的序列(4212310-4212389)(http://www.ecogene.org/网站的参考序列)同源的区域(小写)，

ΔmetAR(SEQ ID NO16):

atccagcgttggattcatgtgccgtagatcgtatggcgtgatctggtagacgtaatagttgagccagttggtaaacagtaCATATGAATATCCTCCTTAG

具有

-与metA区的序列(4213229-4213150)(http://www.ecogene.org/网站的参考序列)同源的区域(大写)，

使用寡核苷酸ΔmetAF和ΔmetAR从质粒pKD4扩增卡那霉素抗性盒。然后通过电穿孔将所得的PCR产物引入到菌株MG1655(pKD46)中。然后选择卡那霉素抗性转化体，用如下限定的寡核苷酸metAF和metAR通过PCR分析验证抗性盒的插入。保留下来的菌株定名为MG1655ΔmetA::Km。

metAF(SEQ ID NO17):tcaccttcaacatgcaggctcgacattggc(与序列4212203-4212232同源)，

metAR(SEQ ID NO18):ataaaaaaggcacccgaaggtgcctgaggt(与序列4213301-4213272同源)。

为了转移ΔmetA::Km，使用噬菌体P1转导的方法。将菌株MG1655ΔmetA::Km的噬菌体裂解物的制备物用于转导入菌株MG1655ΔpykF。

然后选择卡那霉素抗性转化体，并用先前定义的寡核苷酸metF/metAR通过PCR分析验证ΔmetA::Km。保留下来的菌株定名为MG1655ΔpykFΔmetA::Km。

消除卡那霉素抗性盒。通过电穿孔将携带作用于卡那抗性盒FRT位点的FLP重组酶的质粒pCP20引入到重组位点。在42℃系列培养之后，用与先前所用相同的寡核苷酸(pykFF/pykFR，和metF/metAR)通过PCR分析验证卡那霉素抗性盒的丢失。保留下来的菌株定名为MG1655ΔpykFΔmetA。

5.3–菌株MG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABC的构建

为了缺失thrLABC操纵子，使用Datsenko和Wanner(2000)描述的同源重组策略。该策略允许插入氯霉素或卡那霉素抗性盒，同时缺失大多数关注的基因。为此，使用如下的寡核苷酸。

DthrLABF(SEQ ID NO19):

cgggcaatatgtctctgtgtggattaaaaaaagagtgtctgatagcagcttctgaactggttaccttcctggctc accttcgggtgggcctttctggtatacTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

具有

-与thrLABC区的序列(22-86)(http://www.ecogene.org/网站的参考序列)同源的区域(小写)，

-来自T7噬菌体的T7Te转录终止子序列的区域(粗体下划线小写)(Harrington K.J.,Laughlin R.B.和Liang S.Proc Natl Acad Sci U S A.2001Apr24;98(9):5019-24.)，

-用于扩增氯霉素抗性盒的区域(大写)(Datsenko,K.A.和Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645中的参考序列)，

DthrLABCR(SEQ ID NO20):

CCCTGTCATTTTTCTCCATAATTTCTTCATAAAAAAGCCGGGCTGCATAAAAGCAAACCCGGCCTGATTGAGATAATGAATAGATTCCCGGGGGAGGCGCCCGCGGATCCCATATGAATATCCTCCTTAG

具有

-与thrLABC区的序列(5106-5021)(http://www.ecogene.org/网站的参考序列)同源的区域(大写)，

-用于添加BamHI-SfoI-SmaI限制位点的区域(斜体大写)，

-用于扩增氯霉素抗性盒的区域(粗体大写)。

使用寡核苷酸DthrBF和DthrCR从质粒pKD3扩增氯霉素抗性盒。然后通过电穿孔将所得的PCR产物引入到菌株MG1655(pKD46)中。然后选择氯霉素抗性转化体，用如下限定的寡核苷酸thrLF和thrCR通过PCR分析验证抗性盒的插入。保留下来的菌株定名为MG1655ΔthrLABC::Cm。

thrLF(SEQ ID NO21):GCCATGCCGCGCTGGTGTTTGGTCGCG(与序列4639281-4639307同源)，

thrCR(SEQ ID NO22):GCGACCAGAACCAGGGAAAGTGCG(与序列5283-5260同源)。

为了转移ΔthrLABC::Cm，使用噬菌体P1转导的方法。将菌株MG1655ΔthrLABC::Cm的噬菌体裂解物的制备物用于转导入菌株MG1655ΔpykFΔmetA。然后选择氯霉素抗性转化体，并用先前定义的寡核苷酸thrLF和thrCR通过PCR分析验证ΔthrLABC::Cm。保留下来的菌株定名为MG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABC::Cm。

消除氯霉素抗性盒。通过电穿孔将携带作用于卡那抗性盒FRT位点的FLP重组酶的质粒pCP20引入到重组位点。在42℃系列培养之后，用与先前所用相同的寡核苷酸(pykFF/pykFR，metAF/metAR，和thrLF/thrCR)通过PCR分析验证氯霉素抗性盒的丢失。保留下来的菌株定名为MG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABC。

5.4–构建用于过表达大肠杆菌的L-高丝氨酸转氨酶serC的质粒：pME101-thrA*1-serC质粒

为了增加serC基因的表达，使用合适的启动子从先前描述的pME101-thrA*1(PCT_WO2008707041)表达该基因。

为此，使用寡核苷酸serC F和serC R从大肠杆菌基因组扩增serC基因。PCR产物用酶XbaI和SmaI限制性消化，并克隆到用相同限制酶限制性消化的载体pME101-thrA*1中。最终的载体命名为pME101-thrA*1-serC。

serC F(SEQ ID NO23):

TGCTCTAGAGTCCGCGCTGTGCAAATCCAGAATGG

-与serC基因的序列(956619-956644)(http://www.ecogene.org/网站的参考序列)同源的区域(大写)，

-携带XbaI位点的区域(粗体大写)。

serC R(SEQ ID NO24):

具有

-与serC基因的序列(958028-958004)(http://www.ecogene.org/网站的参考序列)同源的区域(大写)，

-携带HindIII位点的区域(粗体大写)。

PCR扩增的片段用限制酶XbaI和HindIII限制性消化，并克隆到载体pME101-thrA*1的XbaI–HindIII位点，给出载体pME101-thrA*1-serC。

5.5–构建用于过表达大肠杆菌的3-羟基丙醛还原酶yqhD基因和乳酸乳球菌4-羟基-2-酮丁酸脱羧酶kivD基因的质粒：pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07质粒

首先构建pME101-yqhD-kivDll-TT07质粒。来自pME101-kivDll-TT07载体(PCT/2009/067994)的kivDll基因用BsrBI和BglII限制性消化，并克隆入用SnaBI和BglII限制性消化的pME101VB01-yqhD载体中(先前在PCT/2007/000509中描述)，最终的质粒命名为pME101-yqhD-kivDll-TT07。

然后用寡核苷酸Ptrc01-RBS01-yqhD pBBR F和kivD pBBR R从pME101-yqhD-kivDll-TT07质粒PCR扩增yqhD和kivDll基因。PCR产物用限制酶SpeI和SmaI消化，并克隆到同相同酶限制性消化的载体pBBR1MCS5(M.E.Kovach,(1995),Gene166:175-176)中，给出pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07载体。

Ptrc01-RBS01-yqhD pBBR F(SEQ ID NO25)

AgaACTAGTgagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaagtcgacGGATCCtaaggaggttataaatgaacaactttaatctgcacacccc

具有

-用于添加SpeI限制位点的区域(粗体大写)

-用于添加组成型Ptrc启动子序列的区域(粗体小写)

-用于添加BamHI限制位点的区域(斜体大写)

-用于添加核糖体结合位点序列的区域(下划线小写)

-与MG1655yqhD基因的序列(3153377-3153402)(http://www.ecogene.org/)同源的区域(斜体小写)

kivD pBBR R(SEQ ID NO26)

GAGCCCGGGGCAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGTGTGATACGTAGAATTCTTAATTAAGTTAGCTTTTATTCTGTTCGGCG

具有

-用于添加SmaI限制位点的区域(粗斜体大写)

-来自T7噬菌体T7Te转录终止子序列(Harrington K.J.,Laughlin R.B.和Liang S.Proc Natl Acad Sci U S A.2001Apr24;98(9):5019-24.)的区域(下划线大写)

-用于添加SnaBI-EcoRI–PacI限制位点的区域(粗体大写)

-与合成kivD基因末端同源的区域(斜体大写)

XX菌株MG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABC(pME101-thrA*1-serC)(pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07)的构建。

然后将pME101-thrA*1-serC和pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07质粒引入到菌株MG1655ΔmetAΔpykFΔthrLABC中。

实施例6

构建对于蔗糖具有增加的1,3-丙二醇途径通量、表达4-羟基-2-酮丁酸脱羧酶编码基因和3-羟基丙醛还原酶编码基因，和蔗糖非-PTS转运系统的菌株：MG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABC(pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07)(pME101-thrA*1-serC)(pKJL101-1)

pKJL101-1质粒在别处描述(Jahreis,K.等2002.Adaptation of sucrosemetabolism in the Escherichia coli wild-type strain EC3132.J.Bact.P5307-5316)。

将pME101-thrA*1-serC,pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07和pKJL101-1质粒引入到菌株MG1655ΔmetAΔpykFΔthrLABC中。

实施例7

用于1,3-丙二醇产生的培养

菌株的性能在500ml带挡板锥形瓶培养物中进行评估，使用经过修改的M9培养基(Anderson,1946,Proc.Natl.Acad.Sci.USA32:120-128)，其添加有4.5mM苏氨酸、5mM甲硫氨酸、10g/l MOPS和10g/l蔗糖或葡萄糖并调节到pH6.8。如果需要，添加浓度为50mg/l的大观霉素和/或庆大霉素，和/或如果需要，添加浓度为60mg/l的氯霉素。如果存在的话，还添加100μM IPTG用于诱导表达载体pME101。使用培养24h的预培养物接种50ml培养物至OD_600nm为大约0.1。培养物在37℃和200rpm生长，直至培养基中的蔗糖耗尽。此时，使用Biorad HPX97H柱用于分离并使用折射计用于检测，通过HPLC分析残余的糖和主要产物。1,3-丙二醇的产生通过LC/MS/MS确定。

不同菌株的性能在下表中给出。

用葡萄糖或蔗糖作为碳源培养的表达羟基酮酸脱羧酶和3-羟基丙醛还原酶的不同菌株的PDO生产；nd：未检测到；*野生型大肠杆菌MG1655在单独蔗糖碳源上不生长。

从上表中可以看出，如果通过缺失pykF和过表达thrA*1增加L-高丝氨酸生产的通量，通过缺失metA和thrABC减少L-高丝氨酸的转氨，并通过过表达serC催化L-高丝氨酸转化为4-羟基-酮丁酸，表达羟基酮酸脱羧酶和3-羟基丙醛还原酶的菌株可以从蔗糖生产PDO。据我们所知，野生型大肠杆菌在任何碳源上均未证明PDO的产生，这说明上述修饰将大肠杆菌野生型不生产PDO的菌株转变成了PDO生产菌株。

实施例8

构建菌株MG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABCΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR*ΔcscR::Km(pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07)(pME101-thrA*1-serC)

从实施例7可见，以蔗糖生产PDO的菌株(整合蔗糖转运系统及pKJL101.1)似乎比参考菌株产生较少的PDO。我们相信，这证明是由于该菌株中所含的三种不同的载体所致的稳定性问题。因此，我们决定将蔗糖转运系统引入到染色体上，以获得更稳定的菌株。

8.1–构建菌株MG1655ΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR*::Cm

为了构建能够在以蔗糖作为唯一碳源上生长的菌株，用来自菌株LJM115(Jahreis K.,Bentler L.,Bockmann J.,Hans S.,Meyer A.,Siepelmeyer J.,Lengeler J.W.J.Bact.2002.184(19):5307-5316)的P1噬菌体裂解物将csc基因转导入菌株MG1655中。

选择氯霉素抗性重组体，并用引物Opg0590_yfdC seq(SEQ ID N°27)和Opg1242_dsdX-dsdA seq(SEQ ID N°28)通过PCR验证csc基因的存在。经过验证和选择得到的菌株称作MG1655ΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR*::Cm。

Opg0590_yfdC seq(SEQ ID N°27):GTGCGGCAAAGATTGTGGTG(与序列2463948-2463967同源)

Opg1242_dsdX-dsdA seq(SEQ ID N°28):GCCAGTTTTTCTGCGTGTGCC(与序列2477624-2477604同源)

8.2–构建菌株MG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABCΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR*ΔcscR::Km

为了缺失cscR基因，使用Datsenko和Wanner(2000)描述的同源重组策略。该策略允许插入氯霉素或卡那霉素抗性盒，同时缺失大多数关注的基因。为此，使用如下的寡核苷酸。

Odi0195_cscR::Cm F(SEQ ID N°29)

GGTGGAACAACGGATCAACAGCGGGCAAGGGATCCGCGTCACTCTTCCCCCTTCACGACCTTCAATAATATGCAATGCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

-与cscR基因末端同源的区域(大写粗体)

-用于扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645中的参考序列)的区域(大写下划线)

Odi0196_cscR::Cm R(SEQ ID N°30)

ATGGCTTCATTAAAGGATGTCGCACGCCTGGCGGGAGTGTCGATGATGACAGTCTCCCGGGTGATGCATAATGCAGAATCCATATGAATATCCTCCTTAG

-与cscR基因起始区(befinning)同源的区域(大写粗体)

使用寡核苷酸Odi0195_cscR::Cm F和Odi0196_cscR::Cm R从质粒pKD4扩增卡那霉素抗性盒。然后通过电穿孔将所得的PCR产物引入到菌株MG1655ΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR*::Cm中。然后选择卡那霉素抗性转化体，用上面描述的寡核苷酸Opg1242_dsdX-dsdA seq(SEQ ID N°28)和如下定义的Opg0511_csc8(SEQ ID N°31)通过PCR分析验证抗性盒的插入。保留下来的菌株定名为MG1655ΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR*ΔcscR::Km。

Opg0511_csc8(SEQ ID N°31):CGATACATCATCCGTGGAAG(与cscA基因的序列同源)

为了转移ΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR*ΔcscR::Km染色体修饰，使用噬菌体P1转导的方法。将菌株MG1655ΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR*ΔcscR::Km的噬菌体裂解物的制备物用于转导入5.3中描述的菌株MG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABC中。

然后选择卡那霉素抗性转化体，并使用先前定义的寡核苷酸Opg1242_dsdX-dsdA seq/Opg0511_csc8通过PCR分析验证ΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR*ΔcscR::Km。保留下来的菌株定名为MG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABCΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR*ΔcscR::Km。

8.3–构建菌株MG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABCΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR*ΔcscR::Km(pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07)(pME101-thrA*1-serC)

最后，将pME101-thrA*1-serC和pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07质粒(在5.4和5.5中所述)引入菌株MG1655ΔmetAΔpykFΔthrLABCΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR*ΔcscR::Km。最终的菌株称作MG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABC　ΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR*ΔcscR::Km(pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07)(pME101-thrA*1-serC)。

实施例9

在蔗糖上培养新的生产菌株

菌株1：实施例5.5中所述的MG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABC(pME101-thrA*1-serC)(pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07)；

菌株2：实施例8.3中所述的MG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABCΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR*ΔcscR::Km(pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07)(pME101-thrA*1-serC)。

生产菌株在小锥形瓶中进行评估，使用经修饰的M9培养基(Anderson,1946,Proc.Natl.Acad.Sci.USA32:120-128)，其添加有4.5mM苏氨酸、5mM甲硫氨酸和10g.L^-1MOPS，并调节到pH6.8。对于菌株1，添加浓度为10g.L^-1的葡萄糖，对于菌株2，添加浓度为10g.L^-1的蔗糖。

5mL预培养物在混合培养基(10%含2.5g.L^-1葡萄糖或蔗糖的LB培养基(Sigma25%)，和90%上述基本培养基)中37℃生长6.5小时。使用它接种50ml培养物至基本培养基中OD₆₀₀为0.1。还添加IPTG(100μM)用于诱导表达载体pME101。如果需要，对于卡那霉素和大观霉素以50mg.L^-1，对于庆大霉素以10mg.L^-1的浓度添加抗生素。培养温度为37℃。当培养物达到OD₆₀₀为7-9时，用HPLC及折射法检测分析细胞外代谢物(有机酸和蔗糖)。1,3-丙二醇的产生通过LC/MS/MS确定。对菌株2进行4次重复。

表2：菌株1和2分批培养物中的PDO产生。SD表示浓度的标准偏差，其是基于重复实验的计算的。括号内指示了重复次数。

菌株	碳源	PDO(mM)	SD	生长速度(h^-1)
					菌株1(N=14)	葡萄糖	0.08	0.03	0.29±0.02
菌株2(N=4)	蔗糖	0.12	0.02	0.32±0.03

从上表可以看出，以蔗糖作为碳源的PDO产生与以葡萄糖作为碳源的PDO产生处于相同范围内。

参考文献(按照文中引用次序)

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