BRPI0923748B1 - Método para a preparação de dióis - Google Patents

Método para a preparação de dióis Download PDF

Info

Publication number
BRPI0923748B1
BRPI0923748B1 BRPI0923748-8A BRPI0923748A BRPI0923748B1 BR PI0923748 B1 BRPI0923748 B1 BR PI0923748B1 BR PI0923748 A BRPI0923748 A BR PI0923748A BR PI0923748 B1 BRPI0923748 B1 BR PI0923748B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
expression
genes
gene
microorganism
region
Prior art date
Application number
BRPI0923748-8A
Other languages
English (en)
Inventor
Philippe Soucaille
Cédric Boisart
Original Assignee
Metabolic Explorer
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Metabolic Explorer filed Critical Metabolic Explorer
Publication of BRPI0923748A2 publication Critical patent/BRPI0923748A2/pt
Publication of BRPI0923748B1 publication Critical patent/BRPI0923748B1/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/005—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor after treatment of microbial biomass not covered by C12N1/02 - C12N1/08
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

método para a preparação de dióis a presente invenção se refere a um novo método para a preparação biológica de um diol compreendendo cultivar um microorganismo geneticamente modificado para a bioprodução de um diol alifático, onde o microrganismo é composto por uma via metabólica para a descarboxilação de um metabólito de ácido hidróxi-2-ceto-alifático com uma enzima com uma atividade de 2-ceto ácido descarboxilase, o produto resultante da referida etapa de descarboxilação sendo posteriormente reduzido para o correspondente diol alifático, e no qual o microorganismo é geneticamente modificado para a produção melhorada do referido metabólito de ácido hidróxi-2-ceto-alifático. a invenção também diz respeito a um microorganismo modificado para a produção de um diol alifático.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE DIÓIS.
A presente invenção se refere a um novo método para a preparação biológica de um diol compreendendo o cultivo de um microorganismo geneticamente modificado para a bioprodução de um diol alifático, onde o microrganismo compreende uma via metabólica para a descarboxilação de um metabólito de ácido hidróxi-2-ceto-alifático com duas enzimas: uma enzima com atividade descarboxilase do 2-ceto ácido e uma enzima com atividade redutase para hidróxi aldeido. A invenção também diz respeito a um microorganismo modificado para a produção de um diol alifático. Antecedentes da Invenção
A produção fermentativa de dióis pelo cultivo de microrganismos produtores de dióis é conhecida no estado da técnica, incluindo a produção fermentativa com microrganismos geneticamente modificados para uma produção melhorada do dióis. A produção de dióis é descrita, entre outros, nos seguintes documentos: WO1996/035796,
W02001/012833, W02004/033646 e US7267972. Em particular, a produção de 1,3-propanodiol envolvendo enzimas dependentes de vitamina B12 já foi descrita, mas esta torna o processo de produção muito caro.
Há uma necessidade permanente de soluções alternativas com microorganismos modificados, tanto para a produção de dióis a partir de fontes renováveis de carbono quanto para ter-se potencial melhoria na produção dos dióis, particularmente com caminhos independentes da vitamina B12. Estas melhorias técnicas podem se dar sobre o rendimento global do produto que está sendo produzido, com base na energia necessária para essa produção, ou, eventualmente, no nivel de impurezas e subprodutos a serem especificamente controlados para o isolamento do produto e para a sua comercialização e utilização.
Descrição Geral Da Invenção
A presente invenção se refere um microorganismo geneticamente modificado para a bioprodução de um diol alifático, onde o microorganismo compreende uma via metabólica para a descarboxilação de um metabólito de ácido hidróxi-2-ceto-alifático com uma enzima tendo atividade descarboxilase do 2-ceto ácido, o produto obtido a partir da referida etapa de descarboxilação sendo posteriormente reduzido ao correspondente diol alifático com uma enzima tendo atividade de redutase de hidróxi aldeido e em que o microrganismo é geneticamente modificados para a produção melhorada do referido metabólito de ácido hidróxi-2-cetoalifático.
O microorganismo da presente invenção é geralmente selecionado do grupo consistindo de uma bactéria, levedura ou fungo. Preferencialmente, o microorganismo é selecionado entre: Enterobacteriaceae, Clostridiaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae e Corynebacteriaceae.
De acordo com uma primeira modalidade da presente invenção, o microorganismo compreende um gene endógeno de codificação para uma atividade ácido descarboxilase. É preferencialmente selecionado entre:
Saccharomyces cerevisiae (PDC1, Pdc5
Pdc6, ArolO, Thi3);
Lactococcus lactis (Kivd); Clostridium acetobutylicum (PDC), Arabidopsis thaliana (Pdc2, Pdc3); Pichia stipitis (PDC1, Pdc2, ArolO); Zymomonas mobilis (Pdc) e o Mycobacterium tuberculosis. Este microorganismo tendo atividade descarboxilase endógena de 2-ceto ácido pode ser modificado para aumentar a expressão do gene endógeno de codificação para a descarboxilase do 2-ceto ácido.
De acordo com outra modalidade da presente invenção, o microorganismo não compreende um gene endógeno que codifica para uma descarboxilase de 2-ceto ácido. Esse microrganismo destituído de descarboxilase do 2-ceto ácido endógena é preferencialmente selecionado entre: Escherichia coli ou Corynebacterium glutamicum ou Bacillus subtilis. Para esses microorganismos, o microorganismo da presente invenção compreende um gene heterólogo que codifica para uma 2 cetoácido descarboxilase.
De acordo com uma outra modalidade da presente invenção, o microorganismo compreende um gene endógeno de codificação para uma atividade hidróxi aldeido redutase. Ele é preferencialmente selecionado dentre: Escherichia coli (yqhD, Fuco, dkgA, dkgB); Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2, ...) e todos os organismos que tenham pelo menos uma enzima com atividade de aldeido redutase ou atividade de álcool desidrogenase. Este microorganismo tendo atividade de redutase endógena de hidróxi aldeido pode ser modificado para aumentar a expressão do gene endógeno de codificação para a hidróxi aldeido redutase.
O diol alifático produzido com os microorganismos da presente invenção é um diol alifático tendo uma cadeia linear ou ramificada compreendendo um grupo alquila de 2-6 átomos de carbono, preferivelmente 2, 3 ou 4 átomos de carbono.
Em uma modalidade preferida, etileno glicol e o metabólito do o diol alifático é ácido hidróxi-2-cetoalifático é hidroxipiruvato.
Em uma outra modalidade preferida, o diol alifático é o 1,3-propanodiol e o metabolito do ácido hidróxi-2-cetoalifático é o 4-hidróxi-2-cetobutirato.
Em uma outra modalidade preferida, o diol alifático é ο 1,4-butanodiol e o metabolito do ácido hidróxi-2-cetoalifático é 5-hidróxi-2-cetopentanoato.
A presente invenção também se refere a um método para a bioprodução de um diol alifático, compreendendo as etapas de:
- Cultivar um microorganismo da presente invenção, como descrito acima e ao longo desse relatório em um meio de cultura adequado compreendendo uma fonte de carbono, e
- Recuperar o diol alifático do meio de cultura.
De acordo com a modalidade preferida da invenção, o diol é posteriormente purificado.
Descrição detalhada da Invenção
Microorganismos
O microorganismo da presente invenção é um microrganismo geneticamente modificado ou geneticamente projetado. Isso significa, de acordo com o significado usual destes termos, que o microorganismo da presente invenção não é encontrado na natureza e é modificado, quer pela introdução ou pela exclusão de novos elementos genéticos. Ele também pode ser transformado, forçando o desenvolvimento e evolução de novas vias metabólicas pela combinação de mutagênese dirigida e evolução sob pressão de seleção especifica (ver, por exemplo, o documento WO
2004/076659).
De acordo com a presente invenção, o termo microorganismo designa uma bactéria, levedura ou fungo.
Preferencialmente, microorganismo é selecionado dentre:
Enterobacteriaceae,
Clostridiaceae,
Bacillaceae,
Streptomycetaceae
Corynebacteriaceae.
Mais preferencialmente, microrganismo é uma espécie de:
Escherichia coli,
Clostridium, Bacillus,
Klebsiella,
Pantoea, Salmonella e Corynebacterium.
Ainda mais preferencialmente, o microrganismo pode ser das espécies:
Escherichia coli e Corynebacterium glutamicum ou
Clostridium acetobutylicum e Bacillus subtilis.
Um microorganismo pode expressar genes exógenos se estes genes forem introduzidos no microorganismo com todos os elementos que permitam a sua expressão no microrganismo hospedeiro. Microorganismos transformados com DNA exógeno fazem parte de uma tarefa de rotina para um técnico no assunto.
Genes exógenos podem ser integrados ao genoma do hospedeiro, ou seja, expressos extracromossomalmente por plasmideos ou vetores. Diferentes tipos de plasmideos são conhecidos por um técnico no assunto, que diferem em relação à sua origem de replicação e de seu némero de cópias na célula.
Promotores são elementos importantes para controlar a expressão de genes. Em uma modalidade preferida da invenção, os genes podem ser expressos através de promotores com forças diferentes, que podem ser indutivel. Estes promotores podem ser homólogos ou heterólogos. Um técnico no assunto saberá como escolher os promotores que são os mais convenientes; por exemplo, os promotores Ptrc, PTAC, Plac ou o cl promotor lambda são amplamente utilizados.
Em modalidades especificas da presente invenção, genes endógenos também podem ser modificados para modular sua expressão e/ou atividade, quer através da introdução de mutações na sequência de codificação para modificar o produto do gene ou pela introdução de sequências heterólogas em adição ou em substituição aos elementos endógenos regulamentares. A modulação de um gene endógeno pode ir nos dois sentidos: hiper-regulação e/ou aumentando a atividade do produto do gene de um lado ou, por outro lado, hipo-regulação e/ou a diminuição da atividade do produto do gene endógeno.
O termo atenuação de um gene, de acordo com a presente invenção, indica a supressão parcial ou total da expressão de um gene, o qual é dito ser atenuado. Esta supressão da expressão pode ser tanto uma inibição da expressão do gene, uma exclusão de toda ou parte da região promotora necessária para a expressão do gene, uma deleção na região codificante do gene ou a substituição do tipo selvagem de promotor por um promotor natural menor ou sintético. Preferencialmente, a atenuação de um gene é, essencialmente, a eliminação completa desse gene, que pode ser substituído por um gene marcador de seleção que facilita a identificação, isolamento e purificação das linhagems de acordo com a invenção. Um gene é inativado, preferencialmente, por meio da técnica de recombinação homóloga (Datsenko, KA & Wanner, BL (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97: 66406645) .
Em outras modalidades da presente invenção, sequências endógenas também podem ser eliminadas ou excluídas, para favorecer a nova via metabólica.
Todas as técnicas para transformar os microorganismos e elementos regulatórios utilizados para aumentar a produção da proteína da presente invenção são bem conhecidas no estado da técnica e disponíveis na literatura, incluindo pedidos de patente dos próprios requerentes para modificação das vias de biossíntese de vários microorganismos, incluindo os documentos:
2008/052973, WO 2008/052595, WO 2008/040387,
WO
WO
2007/144346, WO 2007/141316, WO 2007/077041, WO
2007/017710, WO 2006/082254, WO 2006/082252, WO
2005/111202, WO 2005/073364, WO 2005/047498 e WO
2004/076659, cuj os conteúdos são aqui incorporados por
referência .
Genes e atividades enzimáticas
No relatório descritivo da presente invenção, atividades enzimáticas também são designadas com referência aos genes que codificam para as enzimas com tal atividade. Salvo indicação em contrário, os genes e as proteínas são geralmente identificadas com as denominações de genes de Escherichia coli. No entanto, o uso destas denominações tem um significado mais geral, de acordo com a invenção, abrangendo todos os genes e as proteínas correspondentes em outros organismos, mais particularmente microorganismos, homólogos funcionais, variantes funcionais e fragmentos funcionais dos referidos genes e proteínas.
Os genes a serem identificados no presente pedido são listados na Figura 4 com o seu número de acesso.
Usando as referências da nomenclatura enzimática IUBMB para as atividades enzimáticas conhecidas, um técnico no assunto é capaz de determinar as mesmas atividades enzimáticas em outros organismos, bactérias, leveduras, fungos, etc. Este trabalho de rotina é vantajosamente feito utilizando-se sequências consenso que podem ser determinadas através da realização de alinhamentos de sequência com proteínas provenientes de outros microorganismos.
Métodos de determinação da porcentagem de homologia entre duas sequências de proteínas são conhecidos dos técnicos no assunto. Por exemplo, ela pode ser feita após o alinhamento das sequências utilizando-se o software CLUSTALW disponível no endereço eletrônico http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ com os parâmetros padrão indicados no site. A partir do alinhamento, o cálculo da porcentagem de identidade pode ser feito facilmente pelo registro do número de resíduos idênticos na mesma posição em relação ao número total de resíduos. Alternativamente, o cálculo automático pode ser feito utilizando-se, por exemplo, os programas BLAST, disponível no endereço eletrônico http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/, com os parâmetros padrão indicados no site.
O banco de dados PFAM (banco de dados de famílias de proteínas por alinhamentos e modelos ocultos de Markov; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) representa uma grande coleção de alinhamentos de sequências de proteína. Cada PFAM torna possível a visualização de alinhamentos múltiplos, consulta de domínios da proteína, avaliação da distribuição entre os organismos, o acesso a outras bases de dados e a visualização de estruturas de proteínas conhecidas.
Os COGs (clusters de grupos de ortólogos de proteínas; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) são obtidos por comparação de sequências de proteínas de 66 genomas sequenciados, representando 30 principais linhas filogenéticas. Cada COG é definido a partir de pelo menos três linhas, que permitam a identificação dos domínios ancestrais conservados.
Proteínas compartilhando homologia com a proteína desejada podem ser obtidas a partir de outros microorganismos, ou podem ser uma variante ou um fragmento funcional de uma proteína natural.
termo variante funcional ou fragmento funcional significa que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo não pode limitar-se estritamente à sequência observada na natureza, mas que pode conter mais aminoácidos. Pelo termo fragmento funcional entende-se que a sequência do polipeptídeo pode incluir menos aminoácidos do que a sequência original, mas ainda aminoácidos suficientes para conferir a atividade enzimática da sequência original de referência. É bem conhecido no estado da técnica que um polipeptídeo pode ser modificado por substituição, inserção, exclusão e/ou adição de um ou mais aminoácidos, mantendo a sua atividade enzimática. Por exemplo, é comum a substituição de um aminoácido em uma determinada posição por um aminoácido quimicamente equivalente que não afeta as propriedades funcionais de uma proteína. Para efeitos da presente invenção, as substituições são definidas como intercâmbios dentro de um dos seguintes grupos:
• Resíduos alifáticos pequenos, não polares ou pouco polares: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly • Polares, resíduos carregados negativamente e suas amidas: Asp, Asn, Glu, Gin • Polares, resíduos positivamente carregados: His, Arg, Lys • Resíduos alifáticos grandes, resíduos não-polares: Met, Leu, Ile, Vai, Cys • Resíduos aromáticos grandes: Phe, Tyr, Trp.
Alterações que resultam na substituição de um resíduo carregado negativamente por outro (como o ácido glutâmico pelo ácido aspártico) ou de um resíduo de carga positiva por outro (como lisina para arginina) podem esperadamente produzir um produto funcionalmente equivalente.
As posições nas quais os aminoácidos são modificados e quais números de aminoácidos serão sujeitos a modificações na sequência de aminoácidos não são parâmetros particularmente limitados. Um técnico no assunto é capaz de reconhecer as modificações que podem ser introduzidas sem afetar a atividade da proteína. Por exemplo, alterações na porção N- ou C-terminal de uma proteína podem esperadamente não alterar a atividade de uma proteína em determinadas circunstâncias.
termo variante refere-se à polipeptídeos submetidos a modificações, como definido acima, mantendo a atividade enzimática original.
Os termos codificação ou código referem-se ao processo pelo qual um polinucleotídeo, através dos mecanismos de transcrição e tradução, produz uma sequência de aminoácidos. Este processo é permitido pelo código genético, que é a relação entre a sequência de bases no DNA e a sequência de aminoácidos nas proteínas. Uma das principais características do código genético é que ele é degenerado, significando que um aminoácido pode ser codificado por mais de uma trinca de bases (um códon). A consequência direta deste fato é que uma mesma sequência de aminoácidos pode ser codificada por diferentes polinucleotídeos. É bem conhecido de um técnico no assunto que o uso de códons pode variar de acordo com os organismos. Dentre os códons que codificam o mesmo aminoácido, alguns podem ser usados, preferencialmente, por um dado microorganismo. Assim, pode ser de interesse projetar-se um polinucleotideo adaptado à utilização de códons de um microorganismo em particular, a fim de otimizar a expressão da proteína correspondente neste organismo.
Em alguns exemplos, genes ou enzimas podem ser designados pelo nome da atividade. Em alguns outros casos, a designação de atividade pode significar uma combinação de duas ou mais enzimas em combinação com a atividade desejada. Nesse caso, cada enzima na combinação pode ser codificada por genes distintos sob controle de diferentes elementos regulatórios, ou uma combinação de genes sob o controle do mesmo operon.
Genes que codificam para uma atividade de 2-ceto ácido descarboxilase são bem conhecidos na técnica, incluindo Pdc genes de várias espécies, e mais particularmente os genes PDC1, Pdc5, Pdc6, ArolO e Thi3 de Saccharomyces cerevisiae, gene kivD de Lactococcus lactis; gene pdc de Clostridium acetobutylicum; genes Pdc2 e Pdc3 de Arabidopsis thaliana; genes Pdc2, PDC1 e ArolO de Pichia stipitis; gene pdc de Zymomonas mobilis. A primeira subunidade do complexo 2cetoglutarato descarboxilase, codificada pelo gene sucA da Escherichia coli, também possui atividade de 2-ceto ácido descarboxilase, bem como a enzima codificada pelo gene dxs de Escherichia coli. Homólogos funcionais, variantes funcionais e fragmentos funcionais dos referidos genes e proteínas são abrangidos por esta definição.
Genes que codificam para uma atividade hidroxi aldeído redutase também são bem conhecidos na teecnica, incluindo genes yqhD, fucO, dkgA, dkgB de Escherichia coli e os genes ADH1 e ADH2 de Saccharomyces cerevisiae. Homólogos funcionais, variantes funcionais e fragmentos funcionais dos referidos genes e proteínas são abrangidos por esta definição.
Produção fermentativa
A presente invenção também diz respeito a produção fermentativa de um diol alifático, compreendendo as etapas de:
- Cultivar de um microorganismo em um meio de cultura adequado compreendendo uma fonte de carbono; e
- Recuperar o diol alifático do meio de cultura.
A fermentação é geralmente conduzida em fermentadores com um meio de cultura adequado ao microorganismo a ser utilizado, contendo pelo menos uma fonte de carbono simples e, se necessário, co-substratos.
Um meio de cultura apropriado designa um meio (por exemplo, um meio estéril, líquido) compreendendo nutrientes essenciais ou benéficos para a manutenção e/ou o crescimento da célula, tais como: fontes de carbono ou substrato de carbono, fontes de nitrogênio, por exemplo, peptona, extratos de levedura, extratos de carne, extratos de malte, uréia, sulfato de amônia, cloreto de amônio, nitrato de amônio e fosfato; fontes de fósforo, por exemplo, fosfato monopotássico ou dipotássico;
oligoelementos (por exemplo, sais de metais) como, por exemplo, sais de magnésio, sais de cobalto e/ou sais de manganês, bem como fatores de crescimento, tais como aminoácidos, vitaminas, promotores de crescimento e semelhantes.
Como exemplo de meios de cultura conhecido para E. coli, o meio de cultura pode ser de composição idêntica ou semelhante a um meio M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sei. 32:120-128 EUA), um meio M63 (Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bactéria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ou um meio, tal como definido por Schaefer et al. (1999, Anal Biochem 270: 88-96).
Como outro exemplo de um meio de cultura para C. glutamicum, o meio de cultura pode ser de composição idêntica ou semelhante ao meio BMCG (Liebl et al, 1989, Appl Microbiol Biotechnol 32: 205-210) ou um meio tal como descrito por Riedel et al. (2001, J. Mol Microbiol Biotechnol 3: 573-583).
Os termos fonte de carbono ou substrato de carbono ou fonte carbônica, de acordo com a presente invenção, indicam qualquer fonte de carbono que pode ser utilizada por qualquer pessoa versada na técnica para propiciar o crescimento normal de um microrganismo, incluindo hexoses (tais como galactose, glicose ou lactose), pentoses, monossacarideos, dissacarideos, oligossacarideos (como a celobiose, sacarose ou maltose), melaço, fécula ou seus derivados, hemicelulose, glicerol e suas combinações. Uma fonte de carbono simples especialmente preferida é a glicose. Outra fonte de carbono simples preferida é a sacarose.
Em algumas modalidades da invenção, o meio de cultura compreende uma fonte de carbono para ser um subproduto de outro processo que utiliza biomassa como matéria-prima ou, eventualmente, o produto mecânico e/ou químico e/ou enzimático, e em tais casos tanto in vitro ou in vivo, da degradação da biomassa, como a degradação da celulose.
O microorganismo da presente invenção é vantajosamente escolhido e/ou modificado para utilizar a fonte de carbono como única fonte de carbono para crescer em meio de cultura.
Microrganismos selecionados para crescer em uma fonte especifica de carbono são bem conhecidos no estado da técnica, bem como modificações a serem introduzidas em um microorganismo que lhe permitam crescer na referida fonte especifica de carbono.
Os técnicos no assunto são capazes de definir as condições de cultura para os microrganismos de acordo com a presente invenção. Em especial, as bactérias fermentam a uma temperatura entre 20°C e 55°C, preferencialmente entre 25°C e 40°C e mais especificamente a cerca de 30°C para C. glutamicum e cerca de 37°C para E. coli.
Recuperar o diol alifático do meio de cultura é uma tarefa de rotina para um técnico no assunto.
Em um aspecto da invenção, o diol alifático recuperado é posteriormente purificado.
Métodos para recuperar um diol de um meio de cultura e sua purificação são conhecidos no estado da técnica e divulgados, entre outros, nos seguintes documentos: PCT/EP2008/063287, depositado em 03 de outubro de 2008 e PCT/EP2007/063068, depositado em 30 de novembro de 2007.
Modalidades especificas
Outras modalidades da presente invenção serão descritas a seguir. Os microrganismos são modificados tanto para favorecer a produção do metabólito de ácido hidróxi-2 ceto-alifático quanto para a transformação para o correspondente diol alifático do produto obtido a partir da etapa de descarboxilação do referido metabólito de ácido hidróxi-2-ceto-alifático.
A descrição abaixo é feita por referência a E. coli, cujo microorganismo carece de atividade descarboxilase endógena para 2-ceto ácido. Portanto, um gene heterólogo que codifica para tal atividade é introduzido no microorganismo.
Modificações do microrganismo para otimizar o caminho para a produção do metabólito de ácido hidróxi-2-cetoalifático e transformar o produto obtido a partir da etapa de descarboxilação do referido metabólito de ácido hidróxi2-ceto-diol alifático na também são feitas com base nas vias metabólicas e nos genes endógenos conhecidos de E. coli. No entanto, um técnico no assunto pode usar estratégias semelhantes para introduzir ou eliminar genes correspondentes em outros microrganismos com genes e caminhos metabólicos conhecidos.
I. Preparação de etileno glicol
A via de biossintese para a produção de etileno glycol, de acordo com a presente invenção, compreende três reações enzimáticas começando com a transformação do precursor 3-fosfohidroxipiruvato (precursor para serina).
Primeiro, uma atividade de fosfatase permite a conversão de fosfohidroxipiruvato em hidroxipiruvato. O hidroxipiruvato é transformado em glicoaldeido com uma atividade de 2-ceto ácido descarboxilase. Finalmente, uma atividade da hidróxi aldeido redutase permite a conversão do glicoaldeido em etileno glicol. Outro caminho para a produção de etileno glicol começa a partir de L-serina como precursor.
Primeiro, uma atividade de transaminase ou de oxidase de aminoácidos permite a conversão de serina em hidroxipiruvato. As próximas duas etapas são semelhantes ao primeiro esquema descrito acima.
A via de biossintese global representada na Figura
1.
A presente invenção fornece um método para a produção fermentativa de etileno glicol, seus derivados ou precursores, incluindo: cultura de um microorganismo, particularmente uma bactéria, em meio de cultura adequado compreendendo uma fonte de carbono e a recuperação do etileno glicol a partir do meio de cultura.
Em uma modalidade preferida, o método é realizado com um microorganismo, particularmente uma bactéria, que contém pelo menos um gene que codifica um polipeptideo com atividade de 2-ceto ácido descarboxilase e um gene que codifica um polipeptideo com atividade hidróxi aldeido redutase. Esses genes podem ser exógenos ou endógenos e podem ser expressos extracromossomalmente ou cromossomicamente.
Em uma modalidade adicional da invenção, o método é realizado com um microorganismo, particularmente uma bactéria, no qual a disponibilidade do intermediário 3fosfoglicerato é aumentada. Preferencialmente, o aumento é conseguido por meio da atenuação do nível de expressão de genes que codificam fosfoglicerato mutases, em particular, um ou ambos os genes GPMA e pgml. Isto pode ser feito através da substituição do promotor do tipo selvagem destes genes por um promotor mais fraco, ou pelo uso de um elemento desestabilizador do RNA mensageiro correspondente ou da proteína. Se necessário, a atenuação total dos genes também pode ser conseguida pela supressão das sequências de DNA correspondentes. A invenção também está relacionada com o microrganismo utilizado nesta modalidade particular da invenção, ou seja, um microorganismo, particularmente uma bactéria, que apresenta uma maior disponibilidade de 3fosfoglicerato, em particular um microorganismo, de preferência uma bactéria, em que a expressão dos genes que codificam para fosfoglicerato mutases é atenuada, de preferência a expressão de um 'ou ambos os genes GPMA e pgml.
Em outra modalidade, o método é realizado com um microorganismo, particularmente uma bactéria, no qual o fluxo na via de biossintese de serina é estimulado. Isto pode ser conseguido através do aumento do nível de expressão da 3-fosfoglicerato desidrogenase e/ou fosfoserina aminotransferase, codificada pelo gene serA e serC, respectivamente. 0 aumento do nível de expressão da
3-fosfoglicerato desidrogenase e/ou fosfoserina aminotransferase pode ser conseguido através da introdução de promotores artificiais que dirigem a expressão dos genes serA e/ou serC, pelo aumento do número de cópias na célula ou através da introdução de mutações nos genes serA e/ou serC que aumentam a atividade das proteínas correspondentes. A expressão do gene serA pode ser aumentada através da substituição do gene lrp tipo selvagem (que codifica a proteína reguladora de resposta à leucina) por um alelo mutado lrp (como o alelo lrp-1, correspondendo a uma substituição GLU114ASP na proteína lrp) levando ativação constitutiva da transcrição do gene serA.
presente invenção também é relacionada com microorganismo, particularmente uma bactéria, utilizado nesta modalidade específica da invenção.
Em uma modalidade especial da presente invenção, mutações podem ser introduzidas nos genes serA que reduzem a sensibilidade da proteína serA do inibidor feed-back de serina (alelos feed-back dessensibilizados) e, assim, permitindo uma maior atividade na presença de serina. Exemplos de alelos insensíveis, ou seja, alelos feed-back dessensibilizados, são descritos nos documentos EP 0 931 833 (Ajinomoto) ou EP 0 620 .853 (Wacker).
Em outra modalidade, o método é realizado com um microorganismo, particularmente uma bactéria, em que o fluxo na via de biossíntese hidroxipiruvato é estimulado. Este resultado pode ser conseguido através do aumento do nível de expressão de serino transaminase ou serino oxidase (para o percurso a partir de serina como precursor), ou aumentando a expressão da fosfatase-3-fosfohidroxipiruvato. O aumento no nível de expressão da serino oxidase pode ser conseguido através da introdução e superexpressão do gene que codifica para oxidase de L-aminoácidos a partir de R. opacus, ou através da introdução de mutações no gene que aumenta a atividade da proteína correspondente. Um aumento na expressão de serino transaminase pode ser conseguido através da introdução de promotores artificiais que expressam gene serC de
E.
coli aumentando o número de cópias na célula ou através da introdução de mutações no gene serC que aumentam atividade da proteína correspondente.
Um aumento da expressão da
324 fosfohidroxipiruvato fosfatase pode ser conseguido através da introdução de promotores artificiaia que expressam genes yeaB ou serB de E. coli, aumentando o número de cópias na célula ou através da introdução de mutações nos genes yeaB ou serB que aumentam a atividade das proteínas correspondentes. Um aumento da expressão da 3fosfohidroxipiruvato fosfatase também pode ser alcançado através da introdução e superexpressão do gene GPP2 de S. cerevisiae, ou através da introdução de mutações no gene GPP2 que aumentam a atividade da proteína correspondente. A invenção também é relacionada com os microorganismos, particularmente uma bactéria, utilizados nesta modalidade específica da invenção.
Em uma modalidade adicional da invenção, microorganismo, particularmente uma bactéria, é modificado para apresentar um nível de atenuação de conversão de serina para outros compostos de etileno glicol. Este resultado pode ser obtido pela atenuação do nível de enzimas consumidoras de serina como serino desaminases (codificada por sdaA e sdaB e tdcG) , serino transacetilase (codificada por cysE) , triptofano sintase (codificada por trpAB) ou serino hidroximetiltranferase (codificada por glyA). Esses genes podem ser atenuados através da substituição do promotor natural ou por um promotor de menor força por elementos desestabilizadores do RNA mensageiro correspondente ou da proteína. Se necessário, a atenuação total do gene também pode ser alcançada por uma supressão da sequência de DNA correspondente. A invenção também é relacionada com os microorganismos, particularmente uma bactéria, utilizados nesta modalidade específica da invenção.
Em uma modalidade adicional da invenção, o microorganismo, particularmente uma bactéria, é modificado para apresentar um nível de atenuação de conversão de hidroxipiruvato a outros compostos além de glicoaldeído. Este resultado pode ser obtido pela atenuação do nível de enzimas que consomem hidroxipiruvato, como hidroxipiruvato redutase (codificada por ghrA) ou hidroxipiruvato isomerase (codificada por hyi) . Estes genes podem ser atenuados através da substituição do promotor natural ou por um promotor de menor força por elementos desestabilizadores do RNA mensageiro correspondente ou da proteína. Se necessário, a atenuação total do gene também pode ser alcançada por uma supressão da sequência de
DNA correspondente.
A invenção também é relacionada aos microorganismos, particularmente uma bactéria, utilizados nesta modalidade específica da invenção.
Em uma modalidade adicional da invenção microorganismo, particularmente uma bactéria, é modificado para apresentar um nível de atenuação de conversão de glicoaldeido a outros compostos além de etileno glicol.
Isto pode ser alcançado por meio da atenuação do nível de enzimas que consomem hidroxitreonina, como glicoaldeido aldolase (codificada por ltaE) ou glicoaldeido desidrogenase (codificada por desses genes pode ser feita aldA, aldB) .
A atenuação através da substituição do promotor natural por um promotor elementos desestabilizadores correspondente ou da total do gene também da sequência de DNA de do proteína. Se menor força ou por
RNA mensageiro necessário, a atenuação pode ser alcançada por uma correspondente. A invenção supressão também é relacionada aos microorganismos, particularmente uma bactéria, invenção.
Em um de açúcar importação (PEP) como utilizados nesta modalidade específica da aspecto da invenção, a eficiência de importação é aumentada, utilizando-se um sistema de de açúcar doador de não dependente de fosfoenolpiruvato fósforo como a galP que é conhecida para o transporte de glicose, ou pelo fornecimento de mais fosfoenolpiruvato (PEP) para o fosfotransferase-açúcar do sistema. Existem vários meios que podem ser utilizados para aumentar a disponibilidade de
PEP em um microorganismo. Em particular, este pode ser realizado pela atenuação da reação piruvato -> PEP. Preferencialmente, pelo menos um gene selecionado entre pykA e pykF, codificando piruvato quinase, é atenuado na referida linhagem, a fim de obter este resultado. Outra forma de aumentar a disponibilidade de PEP é favorecer a reação piruvato -> PEP. Isto pode ser conseguido através do aumento da atividade da enzima fosfoenolpiruvato que catalisa a reação acima. Esta enzima é codificada pelo gene ppsA. Portanto, no microorganismo, a expressão do gene ppsA é preferencialmente aumentada. Ambas as alterações podem estar presentes no microorganismo simultaneamente.
II. Preparação de 1,3-propanodiol
A via de biossintese para a produção de 1,3propanodiol de acordo com a presente invenção compreende três reações enzimáticas, começando com a transformação do precursor de L-homoserina (obtido a partir de L-aspartato). Primeiro, uma atividade homosserino transaminase ou homosserino oxidase permite a conversão de L-homoserina em
4-hidróxi-2-cetobutirato. A segunda atividade descarboxilase do 2-ceto ácido permite a conversão de 4hidróxi-2-cetobutirato em 3-hidroxipropionaldeido. O 3hidroxipropionaldeído é então convertido em 1,3-propanodiol com uma atividade hidróxi aldeido redutase.
A via de biossintese global é representado na figura
2.
A presente invenção fornece um método para a produção fermentativa de 1,3-propanodiol, seus derivados ou precursores, incluindo: cultivar um microorganismo, particularmente uma bactéria, em meio de cultura adequado compreendendo uma fonte de carbono e a recuperação de 1,3propanodiol a partir de meio de cultura.
Em uma modalidade preferida, o método é realizado com um microorganismo, particularmente uma bactéria, que contém pelo menos um gene que codifica um polipeptideo com atividade de 2-ceto ácido descarboxilase e um gene que codifica um polipeptideo com atividade hidróxi aldeido redutase. Estes genes podem ser exógenos ou endógenos e podem ser expressos extracromolsomalmente ou cromossomicamente.
Em outra modalidade, o método é realizado com um microorganismo, particularmente uma bactéria, cujo fluxo na via de biossintese de oxalacetato é estimulado, sendo que este resultado pode ser conseguido através do aumento do nivel de expressão da fosfoenolpiruvato carboxilase, codificada pelo gene ppc. 0 aumento da expressão da fosfoenolpiruvato carboxilase pode ser alcançado através da introdução de promotores artificiais que expressam o gene ppc, pelo aumento do número de cópias na célula ou através da introdução de mutações no gene ppc que aumentam a atividade da proteína correspondente. A disponibilidade de produto intermediário oxaloacetato também pode ser aumentada por meio da atenuação do nível de expressão de genes que codificam para fosfoenolpiruvato carboxiquinase e/ou enzimas málicas, codificada pelos genes pckA e/ou maeA e/ou maeB, respectivamente. Isto pode ser feito através da substituição do promotor do tipo selvagem desses genes por um promotor mais fraco, ou pelo uso de um elemento desestabilizador do RNA mensageiro correspondente ou da proteína. Se necessário, a atenuação total dos genes também pode ser conseguida pela supressão das sequências de DNA correspondentes. A invenção também é relacionada aos microorganismos, particularmente uma bactéria, utilizados nesta modalidade particular da invenção, ou seja, um microorganismo, uma bactéria em particular, apresentando um aumento da disponibilidade dos oxaloacetato.
Em outra modalidade, o método é realizado com um microorganismo, particularmente uma bactéria, em que o fluxo na via de biossíntese homosserina é estimulado. Isto pode ser conseguido através do aumento da expressão de aspartoquinase e homosserino desidrogenase e/ou aspartato semialdeído desidrogenase, codificada pelos genes thrA e asd, respectivamente. O aumento da expressão de aspartoquinase e homosserino desidrogenase e/ou aspartato semialdeido desidrogenase pode ser realizado através da introdução de promotores artificiais que dirigem a expressão de genes thrA e/ou asd, aumentando o número de cópias na célula ou através da introdução de mutações nos genes thrA e/ou asd que aumentam a atividade das proteínas correspondentes. A invenção também é relacionada aos microorganismos, particularmente uma bactéria, utilizados nesta modalidade específica da invenção.
Em uma modalidade especial da presente invenção mutações podem ser introduzidas no gene thrA que reduzem a sua sensibilidade para o inibidor de feed-back de treonina (alelos feed-back dessensibilizados) e, assim, permitir uma maior atividade na presença de treonina.
Em outra modalidade, o método é realizado com um microorganismo, particularmente uma bactéria, em que o fluxo na via de biossíntese de 4-hidróxi-2-cetobutirato é estimulado. Este resultado pode ser conseguido através do aumento da expressão de homosserino transaminase ou homosserino oxidase. O aumento da expressão da homosserino oxidase pode ser realizado através da introdução e superexpressão do gene que codifica para a L-aminoácido oxidase de R. opacus, ou através da introdução de mutações no gene que aumentam a atividade da proteína correspondente. O aumento do nível de expressão de homosserino transaminase pode ser conseguido através da introdução de promotores artificiais que dirigem a expressão do gene serC de E. coli, aumentando o número de cópias na célula ou através da introdução de mutações no gene serC que aumentam a atividade da proteína correspondente. A invenção também é relacionada aos microorganismos, particularmente uma bactéria, utilizados nesta modalidade específica da invenção.
Em uma modalidade adicional da invenção, o microorganismo, particularmente uma bactéria, é modificado para apresentar um nível de atenuação de conversão homosserina a outros compostos além de 1,3-propanodiol. Este resultado pode ser obtido pela atenuação do nível de enzimas que consomem homosserina, como homosserino quinase e treonino sintase (codificada por thrB e thrC) , homosserino O-transsuccinilase (codificada por metA) ou dihidrodipicolinato sintase (codificada por dapA). Estes genes podem ser atenuados através da substituição do promotor natural por um promotor mais fraco ou por elementos desestabilizadores no RNA mensageiro ou proteínas correspondentes. Se necessário, a atenuação total do gene também pode ser alcançada pela supressão da sequência de
DNA correspondente. A invenção também é relacionada aos microorganismos, particularmente uma bactéria, utilizados nesta modalidade especifica da invenção.
Em uma modalidade adicional da invenção, o microorganismo, particularmente uma bactéria, é modificado para apresentar um nivel de atenuação de conversão 3hidroxipropionaldeido a outros compostos além de 1,3propanodiol. Isto pode ser alcançado por meio da atenuação do nivel de enzimas que consomem 3-hidroxipropionaldeido, como a 3-hidroxipropionaldeido-desidrogenase (codificada por aldA, aldB). Estes genes podem ser atenuados através da substituição do promotor natural por um promotor mais fraco ou por elementos desestabilizadores do RNA mensageiro correspondente ou da proteína. Se necessário, a atenuação total do gene também pode ser alcançada pela supressão da sequência de DNA correspondente. A invenção também é relacionada aos microorganismos, particularmente uma bactéria, utilizados nesta modalidade específica da invenção.
Em um aspecto da invenção, a eficiência da importação de açúcar é aumentada, utilizando-se um sistema de importação de açúcar não dependente de fosfoenolpiruvato (PEP) como doador de fósforo como o codificado pela galP, que é conhecido para o transporte de glicose, ou pelo fornecimento de mais fosfoenolpiruvato (PEP) para o sistema fosfotransferase-açúcar. Existem vários meios que podem ser usados para aumentar a disponibilidade de PEP em um microorganismo. Em particular, este pode ser obtido pela atenuação da reação piruvato -> PEP. Preferencialmente, pelo menos um gene selecionado entre pykA e piruvato quinase, é atenuado na referida pykF, codificando linhagem, a fim de obter este resultado.
Outra forma de aumentar a disponibilidade de PEP é favorecer a reação piruvato -> PEP.
Isto pode ser conseguido através do aumento da atividade da enzima fosfoenolpiruvato que catalisa a reação acima. Esta enzima é codificada pelo gene ppsA. Portanto, no microorganismo, a expressão do gene da ppsA é preferencialmente aumentada. Ambas as alterações podem estar presentes no microorganismo simultaneamente.
1,4-butanodiol
A via de biossintese para a produção de 1,4-butanodiol de acordo com a presente invenção compreende cinco reações enzimáticas começando com a transformação do precursor 2cetoglutarato (metabólito do ciclo de Krebs).
A primeira atividade, 4-oxoglutaril-CoA sintetase, permite a conversão de 2-cetoglutarato em 4 oxoglutarylCoA. Este composto é então convertido em 5-hidróxi-2cetopentanoato com as combinações de duas atividades, a aldeido desidrogenase primeiro e depois a álcool desidrogenase ambas codificadas pelo gene adhE2 de Clostridium acetobutylicum ou adhE de Escherichia coli. A atividade 2-ceto ácido descarboxilase permite, então, a conversão do 5-hidróxi-2-oxopentanoato em 4hidroxibutiraldeido, que é posteriormente convertido em 1,4-butanodiol com base na atividade hidróxi aldeido redutase.
A via de biossintese global é representada na figura 3.
A presente invenção fornece um método para a produção fermentativa de 1,4-butanodiol, seus derivados ou precursores, incluindo: cultivar um microorganismo, particularmente uma bactéria, em meio de cultura adequado compreendendo uma fonte de carbono e recuperar o 1,4butanodiol a partir do meio de cultura.
Em uma modalidade preferida, o método é realizado com um microorganismo, particularmente uma bactéria, que contém pelo menos um gene que codifica um polipeptideo com atividade de 2-ceto ácido descarboxilase e um gene que codifica um polipeptideo com atividade hidróxi aldeido redutase. Estes genes podem ser exógenos ou endógenos, e podem ser expressos extracromossomalmente ou cromossomicamente.
Em outra modalidade, o método é realizado com um microorganismo, particularmente uma bactéria, no qual o fluxo na via de biossintese de oxalacetato é estimulado (entrada do ciclo de Krebs).
Isto pode ser conseguido através do aumento da expressão da fosfoenolpiruvato carboxilase, codificada pelo gene ppc. O aumentando da expressão da fosfoenolpiruvato realizado através da introdução de carboxilase pode ser promotores artificiais que a expressam o gene ppc, aumentando o número de cópias na célula ou através da introdução de mutações no gene ppc gue aumentam a atividade da proteína correspondente. A disponibilidade do produto intermediário oxaloacetato também pode ser aumentada por meio da atenuação do nível de expressão de genes gue codificam para carboxicinase fosfoenolpiruvato e/ou enzimas málicas, codificadas pelos genes pckA e/ou maeA e/ou maeB, respectivamente. Isso pode ser feito através da substituição do promotor do tipo selvagem destes genes por um promotor mais fraco, ou pelo uso de um elemento desestabilizador do RNA mensageiro correspondente ou da proteína. Se necessário, a atenuação total dos genes também pode ser conseguida pela supressão das sequências de DNA correspondentes. A invenção também é relacionada aos microorganismos, particularmente uma bactéria, utilizados nesta modalidade particular da invenção, ou seja, um microorganismo, uma bactéria em particular, apresentando um aumento da disponibilidade de 2-cetoglutarato.
Em outra modalidade, o método é realizado com um microorganismo, particularmente uma bactéria, na qual o fluxo na via de biossintese de 2-cetoglutarato é estimulado. Isto pode ser conseguido através do aumento da expressão da enzima citrato sintase e/ou isocitrato desidrogenase, codificadas pelos genes gltA e icd, respectivamente. O aumento da expressão da citrato sintase e/ou isocitrato desidrogenase pode ser realizado através da introdução de promotores artificiais que dirigem a expressão dos genes gltA e/ou icd, aumentando o número de cópias na célula ou através da introdução de mutações nos genes gltA e/ou icd que aumentam a atividade das proteínas correspondentes. A atividade isocitrato desidrogenase é modulada por fosforilação ou desfosforilação, que são reações catalisadas por AceK. A fosforilação reduz a atividade de Icd e a desfosforilação reativa a enzima Icd. A atividade da enzima Icd pode, portanto, também ser controlada através da introdução de genes mutantes aceK que reduzam a atividade da quinase e aumentem a atividade da fosfatase em comparação com a enzima do tipo selvagem AceK. O nível de atividade AceK também pode ser diminuído pela atenuação da expressão do gene aceK. Isto pode ser feito através da substituição do promotor do tipo selvagem do gene por um promotor mais fraco, ou pelo uso de um elemento desestabilizador do RNA mensageiro correspondente ou da 5 proteína. Se necessário, a atenuação total do gene também pode ser alcançada pela supressão da sequência de DNA correspondente. A disponibilidade do intermediário 2cetoglutarato também pode ser aumentada pela atenuação da expressão de genes que codificam para 2-cetoglutarato 10 descarboxilase e succinil-CoA sintetase e/ou isocitrato liase e malato sintase, codificadas pelos genes sucAB ou sucCD e/ou aceA ou aceB, respectivamente. Isto pode ser feito através da substituição do promotor do tipo selvagem destes genes por um promotor mais fraco, ou pelo uso de um 15 elemento desestabilizador do RNA mensageiro correspondente ou da proteína. O fluxo no ciclo de Krebs também pode ser aumentado pelo alívio da repressão da ArcA (codificada pelo gene arcA) que reprime os genes que codificam o ciclo de Krebs. A invenção também é relacionada aos microorganismos, 20 particularmente uma bactéria, utilizados nesta modalidade particular da invenção, ou seja, um microorganismo, uma bactéria em particular, apresentando um aumento da disponibilidade de 2-cetoglutarato.
Em outra modalidade, o método é realizado com um microorganismo, particularmente uma bactéria, em que o fluxo na via de biossintese de 5-hidróxi-2-cetopentanoato é estimulado. Isto pode ser conseguido através do aumento da expressão da 4-oxoglutaril-CoA sintetase (formador de AMP, como codificada pelos genes prpE, ou formador de ADP, como codificada pelos genes sucC e sucD) e/ou o aldeido redutase / álcool desidrogenase. A invenção também é relacionada aos microorganismos, particularmente uma bactéria, utilizados nesta modalidade especifica da invenção.
Em uma modalidade adicional da invenção, o microorganismo, particularmente uma bactéria, é modificado para apresentar um nivel de atenuação de conversão de 2cetoglutarato a outros compostos que não 1,4-butanodiol. Isto pode ser alcançado por meio da atenuação do nivel de enzimas que consomem 2-cetoglutarato como a glutamato desidrogenase ou glutamato sintase (codificada por gdhA e gltB) . Estes genes podem ser atenuados através da substituição do promotor natural por um promotor mais fraco ou por elementos desestabilizadores do RNA mensageiro correspondente ou da proteína. Se necessário, a atenuação total do gene também pode ser alcançada pela supressão da sequência de DNA correspondente. A invenção também é relacionada aos microorganismos, particularmente uma bactéria, utilizados nesta modalidade específica da invenção.
Em uma modalidade adicional da invenção, o microorganismo, particularmente uma bactéria, é modificado para apresentar um nível de atenuação da conversão de 4hidroxibutiraldeido a outros compostos que não 1,4butanodiol. Isto pode ser alcançado por meio da atenuação do nível de enzimas que consomem 4- hidroxibutiraldeído, como a 4-hidroxibutiraldeído-desidrogenase (codificado por aldA, aldB). Estes genes podem ser atenuados através da substituição do promotor natural por um promotor mais fraco ou por elementos desestabilizadores do RNA mensageiro correspondente ou da proteína. Se necessário, a atenuação total do gene também pode ser alcançada pela supressão da sequência de DNA correspondente. A invenção também é relacionada aos microorganismos, particularmente uma bactéria, utilizados nesta modalidade específica da invenção.
Em uma modalidade adicional da invenção, o microorganismo, particularmente uma bactéria, é modificado para produzir 1,4-butanodiol em condições anaeróbicas. Para alcançar tal capacidade, o sistema de transporte PTS-açúcar é excluído no referido microorganismo, a fim de metabolizar o açúcar através de um sistema de transporte permease/quinase. A fim de produzir ATP suficiente para o crescimento do microrganismo em condições anaeróbias, oxaloacetato deve ser produzido a partir de fosfoenolpiruvato através da atividade fosfoenolpiruvato carboxiquinase codificada pelo gene pckA em E. coli. Isso gera um mol de ATP por mol de oxaloacetato produzido. De maneira semelhante, a conversão de 2-oxoglutarato em 4oxoglutaril-CoA deve ser alcançada através da 4oxoglutaril-CoA sintetase. A atividade formadora de ADP, tal como a codificada pelos genes sucC e sucD em E. coli, consome apenas um mol de ATP por mol de 4-oxoglutaril-CoA produzido. A via metabólica descrita para produzir 1,4butanodiol a partir de D-glicose é especialmente adaptada para as condições de crescimento anaeróbio. O equilíbrio da reação global da via é: D-glicose + ADP + Pi -> 1,4butanodiol + formato + CO2 + H2O + ATP. Em uma modalidade adicional da invenção, o microorganismo, particularmente uma bactéria, é modificado para apresentar um nível de atenuação de conversão de acetil-CoA para outros compostos que não 1,4-butanodiol; este resultado podendo ser obtido pela atenuação do nível de enzimas que consomem acetil-CoA como acetato quinase e fosfato acetiltransferase (codificada por ackA e pta). A atenuação destes genes pode ser feita através da substituição do promotor natural por um promotor de menor potência ou por um elemento desestabilizador do RNA mensageiro correspondente ou da proteína. Se necessário, a atenuação total do gene também pode ser alcançada por uma supressão da sequência de DNA correspondente. A invenção também é relacionada aos 5 microorganismos, particularmente uma bactéria, utilizados nesta modalidade específica da invenção.
EXEMPLOS
Exemplo 1
Construção de linhagens que expressam um gene 2-ceto ácido 10 que codifica a hidróxi aldeído descarboxilase e um gene que codifica redutase: MG1655 (pME101-kivDll-yqhD-TT07)
1.1 Construção do plasmídeo pM-Ptrc01-kivDll-TT07 para a superexpressão de kivD de Lactococcus lactis descarboxilase 15 que codifica a alfa-ceto-isovalerato descarboxilase:
Um gene sintético kivD de Lactococcus lactis codificando para a alfa-ceto-isovalerato descarboxilase foi preparado por Geneart (Alemanha). O uso de códons e o conteúdo GC do gene foi adaptado para Escherichia coli de 20 acordo com a matriz do fornecedor. A expressão do gene sintético foi conduzida por um promotor Ptrc constitutivo.
Um terminador de transcrição foi adicionado a jusante do gene. A construção foi clonada em vetores pM do fornecedor e verificada por sequenciamento. Quando necessário, o gene sintético foi clonado no vetor pMElOl (este plasmideo é derivado do plasmideo pCL1920 (Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631)) antes de transformar uma linhagem de E.
coli.
PtrcOl kivDll-TT07:
sitios de restrição (BamHI, HindIII, EcoRV) (SEQ ID NO 1): ggatccatgcaagcttatgcgatatc promotor PtrcOl (SEQ ID NO 2): gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaataaggaggtataac sequência do gene kivDll otimizado para E. coli (CAG34226.) (SEQ ID NO 3): atgtataccgtgggtgattatctgctggatcgtctgcatgaactgggcattgaagaaat tttcggcgttccgggtgattataatctgcagtttctggatcagattattagccataaag atatgaaatgggtgggtaatgccaatgaactgaatgcaagctatatggcagatggttat gcccgtaccaaaaaagcagcagcatttctgaccacctttggtgttggtgaactgagcgc agttaatggtctggctggtagctatgcagaaaatctgccggttgttgaaattgttggta gcccgaccagcaaagttcagaatgaaggcaaatttgtgcatcataccctggccgatggt gattttaaacatttcatgaaaatgcatgaaccggttaccgcagcacgtaccctgctgac cgcagaaaatgcaaccgttgaaattgatcgtgttctgagcgcactgctgaaagaacgta aaccggtgtatattaatctgccggtggatgttgcagcagcaaaagcagaaaaaccgagc ctgccgctgaaaaaagaaaatagcaccagcaataccagcgatcaggaaattctgaataa aattcaggaatccctgaaaaacgccaaaaaaccgattgtgattaccggtcatgaaatta ttagctttggcctggaaaaaaccgttacccagtttattagcaaaaccaaactgccgatt accaccctgaattttggtaaaagcagcgttgatgaagcactgccgagctttctgggtat ttataatggcaccctgagcgaaccgaatctgaaagaatttgtggaaagcgcagatttca ttctgatgctgggtgttaaactgaccgatagctctaccggtgcatttacccatcatctg aatgaaaacaaaatgattagcctgaatattgatgaaggcaaaatttttaatgaacgcat tcagaattttgattttgaaagcctgattagcagcctgctggatctgagcgaaatcgaat ataaaggcaaatatattgataaaaaacaggaagattttgttccgagcaatgcactgctg tctcaggatcgtctgtggcaggcagttgaaaatctgacccagagcaatgaaaccattgt tgcagaacagggcaccagcttttttggtgcaagcagcatttttctgaaaagcaaaagcc attttattggtcagccgctgtggggtagcattggttatacctttccggcagcactgggt agccagattgcagataaagaaagccgtcatctgctgtttattggtgatggtagcctgca gctgaccgttcaggaactgggtctggccattcgcgaaaaaattaatccgatttgcttta ttatcaataatgatggctataccgtggaacgtgaaattcatggtccgaatcagagctat aatgatattccgatgtggaattatagcaaactgccggaatcttttggtgcaaccgaaga tcgtgttgtgagcaaaattgtgcgcaccgaaaatgaatttgtgagcgtgatgaaagaag cacaggcagatccgaatcgtatgtattggattgaactgattctggccaaagaaggtgca ccgaaagttctgaaaaaaatgggcaaactgttcgccgaacagaataaaagctaa terminador de sequência T7Te (ref: Harrington KJ, Laughlin RB e Liang S. Proc Acad nacional Sei UAS A. 24 de abril de 2001, 98 (9) :5019-24.) (SEQ ID NO 4):
attacgtagaAGATCTtcctggctcaccttcgggtgggcctttctg sítios de restrição (Smal, BamHI, EcoRI) (SEQ ID NO 5): ccccgggatgcggatccatgcgaattc
Para a expressão de um vetor de cópia baixa do plasmídeo pMElOl foi construído como se segue. O plasmideo pCL1920 foi amplificado por PCR utilizando os oligonucleotideos PME101F e PME101R e o fragmento BstZ17I Xmnl do vetor pTRC99A carreando o gene lacl e o promotor Ptrc foi inserido no vetor amplificado. 0 vetor resultante foi restringido por Ncol e BamHI e o vetor contendo os genes kivDll foi restringido por AflIII e BamHI. 0 fragmento contendo kivDll foi então clonado no vetor pMElOl: 0 plasmideo resultante foi denominado pMElOl kivDll-TT07
PME101F (SEQ ID NO 6) : ccgacagtaa gacgggtaag cctg PME101R (SEQ ID NO 7): agcttagtaa agccctcgct ag
1.2 Construção de um plasmideo pME101-kivDll-yqhD-TT07 para a superexpressão de kivD de Lactococcus lactis descarboxilase que codifica a alfa-cetoisovalerato descarboxilase e yqhD de Escherichia coli codificando 15 metilglioxal redutase:
O vetor pMElOl e o vetor contendo os genes kivDll foram restringidos por SnaBI e BglII e o fragmento contendo yqhD foi clonado no vetor pMElOl, o plasmideo resultante sendo denominado pME101-kivDll-yqhD-TT07.
O gene yqhO foi amplificado por PCR do DNA genômico da linhagem de E. coli MG1655 com os oligonucleotideos yqhO F e yqhD R:
yqhD F (SEQ ID NO 8)
TTACGTAcccagcaaagggagcaagtaatgaacaac região para adição de um sitio de restrição SnaBI (caracteres maiúscillos em negrito e itálico)
- região (em caracteres minúsculos) homóloga à região de E. coli MG1655 yqhD de 3153357 a 3153385 yqhC R (SEQ ID NO 9) aagatcttcTTAGCGGGCGGCTTCGTATATAC
- região (em caracteres maiusculos) homóloga à região de E. coli MG1655 yqhO de 3154540 a 3154518 região de adição de um sitio de restrição BglII (caracteres minúsculos em negrito e itálico)
Fragmentos amplificados por PCR foram cortados com as enzimas de restrição SnaBI e BglII e clonados nos sitios SnaBI - BglII do vetor pME101-kivDll-TT07 resultando no vetor pME101-kivDIl-yqiiD-TT07 .
Exemplo 2
Construção de linhagens com maior fluxo da via de etileno glicol: MG1655 DsdaA DsdaB OpykF Ptrcl8-gpmA Ptrcl8-gpmB (pME101-kivDll-yqhD-TT07)
2.1 Construção da linhagem MG1655 OsdaA DsdaB
Para eliminar o gene sdaA, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000) foi utilizada. Esta estratégia permitiu a inserção de um cassete de cloranfenicol ou de um cassete de resistência à canamicina, ao excluir a maioria dos genes em questão. Para este efeito, os seguintes oligonucleotideos foram utilizados:
AsdaAF (SEQ ID NO 10) gtcaggagtattatcgtgattagtctattcgacatgtttaaggtggggattggtccctc atcttcccataccgtagggccTGTAG GCTGGAGCTGCTTCG com uma região (em caracteres minúsculos) homóloga à sequência (1894941-1895020) do gene sdaA (sequência de referência na página eletrônica http://genolist.pasteur.fr/Colibri/ ) ,
- uma região (caracteres maiúsculos em negrito) para a ampliação do cassete de resistência à canamicina (sequência de referência em Datsenko, KA & Wanner, BL, 2000, PNAS, 97: 6640-6645),
AsdaAR (SEQ ID NO 11) GGGCGAGTAAGAAGTATTAGTCACACTGGACTTTGATTGCCAGACCACCGCGT GAGGTTTCGCGGTATTTGGCGTTCATGTCCCATATGAATATCCTCCTAAG com
- uma região (caracteres maiúsculos) homóloga à sequência (1896336-1896254) do gene sdaA (sequência de referência na página eletrônica http://genolist.pasteur.fr/Colibri/ ),
- uma região (caracteres maiúsculos em negrito) para a ampliação do cassete de resistência à canamicina (sequência de referência em Datsenko, KA & Wanner, BL, 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Os oligonucleotideos AsdaAF e AsdaAR foram utilizados •t
Figure BRPI0923748B1_D0001
Figure BRPI0923748B1_D0002
para amplificar o cassete de resistência à canamicina a partir do plasmideo pKD4. O produto de PCR obtido foi, então, introduzido por eletroporação na linhagem MG 1655 (pKD46). Os transformantes resistentes à canamicina foram selecionadas e a inserção do cassete de resistência foi confirmada por análise de PCR com os oligonucleotideos sdaAF e sdaAR definidos abaixo. A linhagem retida foi
designada MG1655 AsdaA: Km. sdaAF (SEQ ID NO 12) :
cagcgttcgattcatctgcg (homóloga à sequência 1894341-
1894360). sdaAR (SEQ ID NO 13):
GACCAATCAGCGGAAGCAAG (homóloga à sequência 1896679-
1896660).
Os transformantes resistentes à canamicina foram então selecionados e o AsdaA: Km foi verificado pela análise de PCR com os oligonucleotideos previamente definidos sdaAF sdaAR. A linhagem retida foi designada MG1655 AsdaA: Km. Em seguida, o DsdaB: Cm foi introduzido na linhagem MG1655 AsdaA: Km por transdução. O AsdaB MG1655: Cm foi construído utilizando-se o mesmo método, como descrito anteriormente, com o seguinte oligonucleotídeo:
AsdaBF (SEQ ID NO 14) cggcattggcccttccagttctcataccgttggaccaatgaaagcgggtaaacaattta ccgacgatctgattgcccgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com uma região (em caracteres minúscuoas) homóloga à sequência (2927627-2927705) do gene sdaB (sequência de referência na página eletrônica http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),
- uma região ampliação do caracteres maiúsculos em negrito) para a cassete de resistência a cloranfenicol (sequência de referência em Datsenko
KA & Wanner, BL,
2000, PNAS, 97: 6640-6645),
AsdaBR (SEQ ID NO 15)
CGCAGGCAACGATCTTCATTGCCAGGCCGCCGCGAGAGGTTTCGCGGTACTTGGCGTTC
ATATCTTTACCTGTTTCGTACCATATGAATATCCTCCTTAG com
- uma região (caracteres maiúsculos) homóloga à sequência (2928960-2928881) do gene sdaB (sequência de referência na página eletrônica http://genolist.pasteur.fr/Colibri/), uma região (caracteres maiúsculos em negrito) para a ampliação do cassete de resistência a cloranfenicol (sequência de referência em Datsenko, KA & Wanner, BL,
2000, PNAS,
97:
6640-6645)
Os oligonucleotideos
AsdaBF e AsdaBR foram utilizados para amplificar o cassete de resistência a cloranfenicol do plasmideo pKD3. O produto de
PCR obtido foi, então, introduzido por eletroporação na linhagem MG1655 (pKD46).
Os transformantes resistentes a cloranfenicol foram selecionados e a inserção do cassete de resistência foi confirmada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos sdaBF e sdaBR definidos abaixo. A linhagem retida foi designada MG1655 AsdaB: Cm. sdaBF (SEQ ID NO 16): Gcgtaagtacagcggtcac (homóloga à sequência 2927450-2927468). sdaBR (SEQ ID NO 17) : CGATGCCGGAACAGGCTACGGC (homóloga à sequência 2929038-2929017). Para transferir a AsdaB::Cm, o método de transdução de PI fago foi usado. A preparação do lisato de fago da linhagem MG1655 AsdaB::Cm foi utilizada para a transdução na linhagem MG1655 AsdaA::Km.
Os transformantes resistentes a cloranfenicol, foram selecionados e a AsdaB::Cm foi verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos previamente definidos sdaBF e sdaBR. A linhagem retida foi designada MG1655 AsdaA::Km AsdaB::Cm. Os cassetes de resistência à canamicina e a cloranfenicol foram, então, eliminados. O plasmideo pCP20 carregando a FLP recombinase atuando nos locais FRT da canamicina e os cassetes de resistência a cloranfenicol foi então introduzido nos sitios recombinantes através de eletroporação. Após uma série de culturas a 42°C, a perda da resistência a canamicina e os cassetes cloranfenicol foram verificados por uma análise de PCR com os mesmos oligonucleotideos utilizados anteriormente (sdaAF / sdaAR e sdaBF / sdaBR). A linhagem retida foi designada MG1655 DsdaA AsdaB.
2.2 Construção da linhagem MG1655 AsdaA AsdaB ApykF6
Para eliminar o gene pykF, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000) foi utilizado. Esta estratégia permitiu a inserção de um cassete de resistência a cloranfenicol ou à canamicina, ao excluir a maioria dos genes em guestão. Para este efeito, os seguintes oligonucleotideos foram utilizados:
ApykFF (SEQ ID NO 18) cccatccttctcaacttaaagactaagactgtcatgaaaaagaccaaaattgtttgcac catcggaccgaaaaccgaaTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com uma região (em caracteres minúsculos) homóloga à sequência (1753689-1753766) da região pykF (seguência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/ ),
- uma região (caracteres maiusculos) para a ampliação do cassete de resistência à canamicina (sequência de referência em Datsenko, KA & Wanner, BL, 2000, PNAS, 97: 6640-6645),
ApykFR (SEQ ID NO 19) ggacgtgaacagatgcggtgttagtagtgccgctcggtaccagtgcaccagaaaccata actacaacgtcacctttgtgCATATGAATATCCTCCTTAG com
- uma região (caracteres maiúsculos) homóloga à sequência (1755129-1755051) da região pykF (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/ ),
- uma região (caracteres maiúsculos) para a ampliação do cassete de resistência à canamicina (sequência de referência em Datsenko, KA & Wanner, BL, 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Os oligonucleotideos ApykFF e ApykFR foram utilizados para amplificar o cassete de resistência à canamicina do plasmideo pKD4. O produto de PCR obtido foi, então, introduzido por eletroporação na linhagem MG 1655 (pKD46). Os transformantes resistentes a canamicina foram selecionados e, em seguida, a inserção do cassete de resistência foi confirmada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos pykFF e pykFR definidos abaixo. A linhagem retida foi designada MG1655 ApykF::Km. pykFF (SEQ ID NO 20) : gcgtaaccttttccctggaacg (homóloga à sequência 1753371-1753392). pykFR (SEQ ID NO 21): gcgttgctggagcaacctgccagc (homóloga à sequência 17555181755495).
Para transferir a ApykF::Km, o método de transdução de PI fago foi utilizado. A preparação do lisado de fago da linhagem MG1655 ApykF::Km foi utilizada para a transdução na linhagem MG1655 AsdaA AsdaB.
Os transformantes resistentes à canamicina foram selecionados e o ApykF::Km foi verificado por uma análise de PCR com os oligonucleotideos previamente definidos pykFF e pykFR. A linhagem retida foi designada MG1655 AsdaA AsdaB ApykF::Km.
O cassete de resistência à canamicina foi então eliminado. O plasmídeo pCP20 carregando a FLP recombinase atuando nos sítios FRT do cassete de resistência à canamicina foi então introduzido no sítio recombinante através de eletroporação. Após uma série de culturas a 42°C, a perda dos cassetes de resistência à canamicina foi verificada por uma análise de PCR com os mesmos oligonucleotídeos utilizados anteriormente (sdaAF / sdaAR, sdaBF / sdaBR e pykFF / pykFR) . A linhagem retida foi designada MG1655 AsdaA AsdaB ApykF.
2.3 Construção da linhagem MG1655AsdaA AsdaB ApykF PtrclõgpmA Ptrcl8-gpmB
Para aumentar o nível de 3-fosfoglicerato, os mutantes Ptrcl8-gpmA e Ptrcl8-gpmB foram construídos. Em primeiro lugar, para diminuir a expressão do gene fosfoglicerato mutase gpmA, o promotor é trocado por uma versão modificada do promotor constitutivo trc com atividade fraca. O Ptrcl8gpmA é transferido para a linhagem MG1655 AsdaA AsdaB ApykF por transdução.
A linhagem MG1655 Ptrcl8-gpmA::Km é primeiramente construída utilizando-se o mesmo método como descrito anteriormente com os seguintes oligonucleotídeos: Ptrcl8-gpmAF (SEQ ID NO 22) CCACTGACTTTCGCCATGACGAACCAGAACCAGCTTAGTTACAGCCATAATATACCTCC
TTATTCCACACAgTATACGAGCCGGATGATTAATcGcCAACAGCTCTGTAGGCTGGAGC TGCTTCG com
- uma região (caracteres maiusculos) homóloga à sequência (786.771-786.819) do gene da gpmA (sequência de referência na página eletrônica http://genolist.pasteur.fr/Colibri/ ),
- uma região (caracteres maiúsculos em negrito) para a ampliação do cassete de resistência à canamicina (sequência de referência em Datsenko, KA & Wanner, BL, 2000, PNAS, 97: 6640-6645) ,
- uma região (caracteres maiúsculos em itálico) para a sequência promotora trc onde as caixas -35 e -10 são sublinhadas.
Ptrcl8-gpmAR (SEQ ID NO 23) ggttatgcgtaagcattgctgttgcttcgtcgcggcaatataatgagaattattatcat taaaagatgatttgaggagtaagtatCATATGAATATCCTCCTTAG com uma região (em caracteres minúsculos) homóloga à sequência (786.903-786.819) da região a montante do gene gpmA (sequência de referência na página eletrônica http://genolist.pasteur.fr/Colibri/ ) ,
- uma região (em caracteres maiúsculos em negrito) para a ampliação do cassete de resistência à canamicina (sequência de referência em Datsenko, KA & Wanner, BL, 2000, PNAS, 97: 6640-6645) .
Os oligonucleotideos Ptrcl8-gpmAF e Ptrcl8-gpmAR foram utilizados para amplificar o cassete de resistência à canamicina do plasmideo pKD4. O produto de PCR obtido foi então introduzido por eletroporação na linhagem MG1655 (pKD46), na qual a enzima Red recombinase expressa permite a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes à canamicina são então selecionados, a inserção do cassete de resistência sendo verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos gpmAF e gpmAR definidos abaixo. A linhagem retida é designada MG1655 Ptrcl8-gpmA::Km. gpmAF (SEQ ID NO 24): CCTTCCTCTTTCAGCAGCTTACC (homóloga à sequência 786673-786695). gpmAR (SEQ ID NO 25): cgacgatcagcgcaaagtgaaagg (homóloga à sequência 787356787333).
Para transferir a modificação Ptrcl8-gpmA::Km, transdução de PI fago é utilizada. 0 protocolo seguido é implementado em duas etapas, com a preparação, primeiramente, do lisado de fago da linhagem MG1655 Ptrcl8gpmA::Km, e posterior transdução na linhagem MG1655 AsdaA AsdaB ApykF. A construção da linhagem é descrita anteriormente.
- Preparação do lisado de fago PI
- inoculação com 100 ml de uma cultura preparada na noite anterior de linhagem MG1655 Ptrcl8-gpmA::Km de 10 ml de LB + Km 50 mg/ml de glicose + 0,2% + CaCl2 5 mM. Incubação por min a 37°C com agitação.
- adição de 100 ml de lisado de fago PI preparado na linhagem MG1655 (cerca de l,109 fago/ml).
- agitação a 37 °C por 3 horas até que todas as células fossem lisadas. Adição de 200 μΐ de clorofórmio e submissão a vortex.
- centrifugação por 10 min a 4500 g para eliminar restos celulares.
- transferência do sobrenadante para um tubo estéril e adição de 200 μΐ de clorofórmio.
- armazenamento do lisado a 4°C.
- Transdução
- Centrifugação por 10 min a 1500 g de 5 ml de uma cultura preparada na noite anterior da linhagem MG1655 EsdaA AsdaB EpykF em meio LB.
- suspensão do pellet de células em 2,5 ml de MgSO4 10 mM, CaCl2 5 mM - Tubos de controle: células 100 μΐ
- 100 μΐ de fagos PI de linhagem MG1655 Ptrcl8-gpmA: : Km Tubo de ensaio: 100 μΐ de células + 100 μΐ de fagos PI de linhagem MG1655 Ptrcl8-gpmA::Km.
- incubação por 30 min a 30°C sem agitação. Adição de 100 μΐ de citrato de sódio 1 M em cada tubo e submissão a vortex.
- adição de 1 ml de LB. - Incubação por 1 hora a 37 °C com agitação.
- aplicação em pratos LB + Km 50 pg/ml após a centrifugação dos tubos por 3 min a 7000 rpm.
- incubação a 37°C durante a noite.
- Verificação da linhagem
Os transformantes resistentes à canamicina são selecionados e a modificação do promotor Ptrcl8-gpmA:: Km é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos gpmAF e gpmAR descritos anteriormente. A linhagem retida foi designada MG1655 AsdaA AsdaB ApykF Ptrcl8-gpmA: : Km. Em seguida, o Ptrcl8-gpmB é transferido para a linhagem MG1655 BsdaA AsdaB ApykF Ptrcl8-gpmA::Km por transdução. A MG1655 Ptrcl8-gpmB::Cm é primeiramente construída utilizando-se o mesmo método, como descrito anteriormente com os seguintes oligonucleotideos:
Ptrcl8-gpmBR (SEQ ID NO 26)
CGGCGTTCC ACTGCGTTTCACCGTGGCGGACTAGGTATACCTGTAACATAATATACCTCCTTATTCCA CACAgTATACGAGCCGGATGATTAATcGcCAACAGCTCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com
- uma região (caracteres maiúsculos) homóloga à sequência (4631414-4631366) do gene gpmB (sequência de referência na página eletrônica http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),
- uma região (caracteres maiúsculos em negrito) para a ampliação do cassete de resistência a cloranfenicol (sequência de referência em Datsenko, KA & Wanner, BL, 2000, PNAS, 97:6640-6645),
- uma região (caracteres maiúsculos em itálico) para a sequência promotora trc onde as caixas -35 e -10 são sublinhadas.
Ptrcl8-gpmBF (SEQ ID NO 27)
Gcgggattggtggtcgcacagacaacttggtgcataatcagcattactcagaaaattaa cgttacagcagtatacggaaaaaaagcCATATGAATATCCTCCTTAG com uma região (em caracteres minúsculos) homóloga à sequência (4631280-4631365) da região gpmB (sequência de referência na a montante do gene página eletrônica http://genolist.pasteur.fr/Colibri/), uma região (caracteres maiúsculos em negrito) para a ampliação do cassete de resistência a cloranfenicol (sequência de referência em Datsenko,
KA & Wanner, BL,
2000, PNAS,
97:
6640-6645).
Os oligonucleotideos Ptrcl8-gpmBF e Ptrcl8-gpmBR são utilizadas para amplificar o cassete de resistência a cloranfenicol do plasmideo pKD3. O produto de PCR obtido é então introduzido por eletroporação na linhagem MG1655 (pKD46), em que a enzima
Red recombinase expressa permite a recombinação homóloga.
Os transformantes resistentes a cloranfenicol são selecionados e, em seguida, a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos gpmBF e gpmBR definidos abaixo. A linhagem retida é designada MG1655 Ptrcl8-gpmB::Cm gpmBF (SEQ ID NO 28): ccttacgaccaatctcatcaataccgg (homóloga à sequência 4630906-4630932). gpmBR (SEQ ID NO 29): GCAATACCATGACTCACCAGC (homóloga à sequência 46318234631803).
Para transferir a modificação Ptrcl8-gpmB::Cm, transdução de PI fago é utilizada. Lisado de fago da linhagem MG1655 Ptrcl8-gpmB::Cm é utilizado para a transdução na linhagem MG1655 AsdaA AsdaB ApykF Ptrcl8gpmA::Km. Os transformantes resistentes a cloranfenicol são selecionados e o Ptrcl8-gpmB::Cm é verificado por uma análise de PCR com os oligonucleotideos previamente definidos gpmBF e gpmBR. A linhagem retida é designada MG1655 AsdaA hsdaB ApykF Ptrcl8-gpmA::Km Ptrcl8-gpmB:: Cm. Os cassetes de resistência à canamicina e a cloranfenicol podem ser eliminados. O plasmideo pCP20 carregando FLP recombinase atuando nos locais FRT da canamicina e os cassetes de resistência a cloranfenicol são então introduzidos no sitio recombinante através de eletroporação. Após uma série de culturas a 42°C, a perda dos cassetes de resistência à canamicina e acloranfenicol é verificada por uma análise de PCR com os mesmos oligonucleotideos utilizados anteriormente (gpmAF / gpmAR e gpmBF / gpmBR). A linhagem retida é designada MG1655 AsdaA AsdaB ApykF Ptrcl8-gpmA Ptrcl8-gpmB.
2,4 Construção da linhagem MG1655 AsdaB AsdaA ApykF Ptrcl8-gpmA Ptrcl8-gpmB (pME101-kivDll-yqhD-TT07)
O plasmideo pME101-kivDll-yqhD-TT07 é então introduzido na linhagem MG1655 AsdaA AsdaB ApykF Ptrcl8gpmA Ptrcl8-gpmB.
Exemplo 3
Construção de linhagems com fluxo de via 1,3propanodiol aumentado: MG1655 AmetA ApykF AthrLABC:: TT07Ptrc-thrA*l (pME101-kivDll-yqhD-TT07) (PMA aaoro)
3.1 Construção da linhagem MG1655 AmetA
Para eliminar o gene metA, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000) foi utilizada. Esta estratégia permite a inserção de um cassete de resistência a cloranfenicol ou à canamicina, ao excluir a maioria dos genes em questão. Para este efeito, os seguintes oligonucleotideos foram utilizados: AmetAF (SEQ ID NO 30): ttcgtgtgccggacgagctacccgccgtcaatttcttgcgtgaagaaaacgtctttgtg atgacaacttctcgtgcgtctTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com uma região (em caracteres minúsculos) homóloga à sequência (4212310-4212389) da região metA (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/),
- uma região (caracteres maiúsculos) para a ampliação do cassete de resistência à canamicina (sequência de referência em Datsenko, KA & Wanner, BL, 2000, PNAS, 97: 6640-6645),
AmetAR (SEQ ID NO 31): atccagcgttggattcatgtgccgtagatcgtatggcgtgatctggtagacgtaatagt tgagccagttggtaaacagtaCATATGAATATCCTCCTTAG com
- uma região (caracteres maiúsculos) homóloga à sequência (4213229-4213150) da região de metA (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/),
- uma região (caracteres maiúsculos) para a ampliação do cassete de resistência à canamicina (sequência de referência em Datsenko, KA & Wanner, BL, de 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Os oligonucleotideos AmetAF e AmetAR foram utilizados para amplificar o cassete de resistência à canamicina do plasmideo pKD4. O produto de PCR obtido foi, então, introduzido por eletroporação na linhagem MG 1655 (pKD46). Os transformantes resistentes à canamicina foram selecionados e, em seguida, a inserção do cassete de resistência foi confirmada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos metAF e metAR definidos a seguir. A linhagem retida foi designada MG1655 AmetA::Km. metAF (SEQ ID NO 32): tcaccttcaacatgcaggctcgacattggc (homóloga à sequência 4212203-4212232). metAR (SEQ ID NO 33): ataaaaaaggcacccgaaggtgcctgaggt (homóloga à sequência 4213301-4213272).
O cassete de resistência à canamicina foi então eliminado. O plasmideo pCP20 carregando a FLP recombinase atuando nos sitios FRT do cassete de resistência à canamicina foi então introduzido no sitio recombinante através de eletroporação. Após uma série de culturas a 42°C, a perda do cassete de resistência à canamicina foi verificada por uma análise de PCR com os mesmos oligonucleotideos utilizados anteriormente (metAF / metAR). A linhagem retida foi designada MG1655 AmetA.
3.2 Construção da linhagem MG1655 AmetA ApykF
Para transferir a ApykF: Km, transdução de P1 fago foi
utilizada. A preparação do lisado de fago da linhagem
MG1655 ApykF::Km (descrito acima) foi utilizado para a
transdução na linhagem MG1655 AmetA.
Transformantes resistentes à canamicina são
selecionados e o ApykF: :Km foi verificado por uma análise de PCR com os oligonucleotideos previamente definidos pykFF e pykFR. A linhagem retida foi designada MG1655 AmetA DpykF: : Km.
3.3 Construção da linhagem MG1655 DmetA DpykF DthrLABC: : TT07-Ptrc-thrA*l
Para aumentar a expressão do alelo resistente ao feedback de desidrogenase aspartoquinase/homosserino desidrogenase, thrA*l, os seguintes plasmideos foram construídos: pSBl para obter o thrA*l e pSB2 para substituir o operon thrLABC pelo alelo Ptrc-thrA*l.
O plasmídeo pSBl é derivado do plasmídeo pCL1920 (Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631) e abriga o alelo aspartoquinase/homosserina thrA* com resistência feed-back reduzida para treonina (Lee et al. 2003 J. Bacteriol. 185 , 18 pp 5442-5451) expressado do promotor Ptrc. Para a construção de pSBl, thrA foi amplificado por PCR do DNA genômico através dos seguintes oligonucleotideos: BspHIthrA (SEQ ID NO 34): TTATCATGAgagtgttgaagttcggcggtacatcagtggc com uma região (em caracteres minúsculos) homóloga à sequência (341-371) do gene thrA (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/), uma região (caracteres maiúsculos) para o sítio de restrição BspHI e extra-bases,
SmalthrA (SEQ ID NO 35): TTACCCGGGccgccgccccgagcacatcaaacccgacgc com uma região (em caracteres minúsculos) homóloga à sequência (2871-2841) do gene thrA (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/), uma região (caracteres maiusculos) para o sítio de restrição Smal e extra-bases.
fragmento amplificado por PCR foi cortado com as enzimas de restrição BspHI e Smal e clonados nos sítios Ncol/Smal do vetor pTRC99A (Stratagene). Para a expressão de um. vetor de cópia baixa do plasmídeo pMElOl foi construído como se segue. 0 plasmídeo pCL1920 foi amplificado por PCR utilizando os oligonucleotídeos PME101F e PME101R e o fragmento BstZ17I-XmnI do vetor pTRC99A carreadores do gene lacl e o promotor Ptrc foi inserido no vetor amplificado. 0 vetor resultante e o vetor contendo os genes thrA foram restringidos por Apal e Smal e o fragmento contendo thrA foi clonado no vetor pMElOl. Para liberar ThrA da inibição de feedback a mutação thrAS345F foi introduzida por mutagênese sítio-dirigida (Stratagene) utilizando os oligonucleotídeos ThrA SF for e Thra SF rev, resultando no vetor pSBl.
PME101F (SEQ ID NO 36) ccgacagtaagacgggtaagcctg
PME101R (SEQ ID NO 37) agcttagtaaagccctcgctag ThrA SF for (SEQ ID NO 38) CGTATTTCCGTGGTGCTGATTACGCAATTCTCTTCCGAGTACTCAATCAGTTTCTGC Thra SF rev (SEQ ID NO 39)
GCAGAAACTGATTGAGTACTCGGAAGAGAATTGCGTAATCAGCACCACGGAAATACG
Para excluir o operon thrLABC e substitui-lo pelo alelo Ptrc-thrA*l, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000) foi utilizada. Esta estratégia permite a inserção de um cassete de resistência a cloranf enicol ou à canamicina, mas também de DNA adicional, ao excluir a maioria dos genes em questão. Para este efeito, o seguinte plasmideo pSB2 foi construído.
O plasmideo pSB2 é derivado do plasmideo pUC18 (Norrander et al. Gene 26 (1983), 101-106) e abriga o cassete de resistência a cloranfenicol associado ao alelo Ptrc-thrA*l, ambos clonados entre a região a montante de thrL e a jusante de thrC.
Para a construção de pSB2, a região a montante de thrL e a região a jusante de thrC foram amplificadas a partir do DNA genômico através dos seguintes oligonucleotídeos: HpalupthrLF (SEQ ID NO 40) CGTAGTTAACGAATTCccaactagttgcatcatacaactaataaacgtgg com
- uma região (em caracteres minúsculos) homóloga à sequência (4638698-4638731) da região thrL (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/),
- uma região (caracteres maiúsculos) para os sítios de restrição Hpal e EcoRT e extra-bases.
BstZ17IupthrLR (SEQ ID NO 41) CCCGGGGGAGGCGCCCGCGGATCCCGGTATACCAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCA GGAaggtaaccagttcagaagctgctatcag com uma região (em caracteres minúsculos) homóloga à sequência (87-60) da região thrL (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/), uma região (caracteres maiúsculos em negrito) para sequência T7te de terminador de transcrição (Harrington KJ, Laughlin RB e Liang S. Proc Acad nacional Sei EUA A. 24 de abril de 2001; 98 (9):5019-24),
- uma região (caracteres maiúsculos) para o sítio múltiplo de clonagem composto por BstZlll, BamHI, SfoI e sítios de restrição Smal.
BamHIdownthrCF (SEQ ID N0 42)
TCCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGGTATACCGGGATCCGCGGGCGCCTCCCCC
GGGaatctattcattatctcaatcaggccggg com uma região (em caracteres minúsculos) homóloga à sequência (5021-5049) da região thrC (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/),
- uma região (caracteres maiúsculos em negrito) para a sequência T7te de terminador de transcrição (Harrington KJ, Laughlin RB e Liang S. Proc Acad nacional Sei EUA A. 24 de abril de 2001; 98 (9):5019-24),
- uma região (caracteres maiúsculos) para o sítio múltiplo de clonagem composto por BstZUI, Bam.H.1, SfoI e sítios de restrição Smal.
HpaldownthrCR (SEQ ID NO 43) CGTAGTTAACGAATTCgagaatgcccgagggaaagatctg com uma região (em caracteres minúsculos) homóloga à sequência de (6054-6031) da região thrC (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/),
- uma região (caracteres maiúsculos) para Hpal e sítio de restrição EcoRI e extra-bases.
Primeiramente, fragmentos acimathrL e abaixothrC foram amplificados de DNA genômico de MG1655 utilizando-se, respectivamente, os oligonucleotideos HpalupthrLF / BstZ17IupthrLR e BamHIdownthrCF / HpaldownthrCR. Em segundo lugar, o fragmento acimathrL-abaixothrC foi amplificado a partir de fragmentos PCR acimathrL e abaixothrC (que possuem uma região de sobreposição composta por um terminador de transcrição T7Te e o sitio de clonagem múltipla composto por BstZllI, BamHI, SfoI e sítios de restrição Smal) utilizando os oligonucleotídeos HpalupthrLF / HpaldownthrCR. O fragmento PCR acimathrL-abaixothrC foi cortado com a enzima de restrição Hpal e clonado nos sítios BcoRI / SfoI do vetor pUC18, dando o plasmideo pUC18DthrLABC::TT07-SMC.
Em seguida, o cassete de resistência a cloranfenicol foi amplificado por PCR a partir do vetor pKD3 utilizandose os seguintes oligonucleotídeos:
BstZ17ICmF (SEQ ID NO 44)
GGGGTATACtgtaggctggagctgcttcg com
- uma região (em caracteres minúsculos) para a ampliação do cassete de resistência a cloranfenicol (sequência de referência em Datsenko, KA & Wanner, BL, 2000, PNAS, 97:
í
6640-6645), uma região (caracteres maiúsculos) para o sítio de restrição BstZllI e extra-bases.
BamHICmR (SEQ ID NO 45)
CGCGGATCCcatatgaatatcctccttag com
- uma região (em caracteres minúsculos) para a ampliação do cassete de resistência a cloranfenicol (sequência de referência em Datsenko, KA & Wanner, BL, 2000, PNAS, 97: 6640-6645), uma região (caracteres maiusculos) para o sitio de restrição BamHI e extra-bases.
O fragmento de PCR foi cortado com as enzimas de restrição BstZlll e BamHI e clonado nos sitios BstZlll / BamHI do plasmideo pUC18-AthrLABC::TT07-SMC, dando o plasmideo pUC18-AthrLABC::TT07-SMC::Cm.
Por fim, o alelo Ptrc-thrA*l foi cortado a partir do plasmideo pSBl com as enzimas de restrição SfoI e Smal e clonados nos sitios Sfol / Smal do plasmideo pUC18AthrLABC::TT07-SMC::Cm, dando o plasmideo pUC18AthrLABC::TT07-Ftrc-thrA*l::Cm ou pSB2.
O fragmento AthrLABC::TT07-Ptrc-thrA*l::Cm foi obtido cortando-se o plasmideo pSB2 com a enzima de restrição BcoRI e foi introduzido por eletroporação na linhagem MG1655 (pKD46) , na qual a expressão da enzima Red recombinase permite a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes a cloranfenicol são selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos thrA*lF e thrA*lR definidos abaixo. A linhagem retida é designada MG1655 AthrLABC::TT07-Ptrc-thrA*l::Cm. thrA*lF (SEQ ID NO 46):
cgtgttgcgtgttaccaactcg (homóloga à sequência (46382764638297) da região thrL (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/)). thrA*lR (SEQ ID NO 47) cggaaactgacgcctccgcag (homóloga à sequência (6345-6325) da região thrC (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/)).
Plasmideos recombinantes foram verificados por sequenciamento de DNA.
Para transferir a AthrLABC::TT07-Ptrc-thrA*l::Cm, transdução de P1 fago é utilizada. A preparação do lisado de fago da linhagem MG1655 AthrLABC::TT07-Ptrc-thrA*l::Cm é utilizada para a transdução na linhagem MG1655 AmetA DpykF::Km.
Os transformantes resistentes a canamicina e cloranfenicol são selecionados e o AthrLABC::TT07-PtrcthrA*l::Cm é verificado por uma análise de PCR com os oligonucleotideos previamente definidos thrA*lF e thrA*lR.
linhagem retida designada
MG1655
AmetA
ApykF: :EiaAthrLABC: : TT07-Ptrc-thrA*l: :Cm.
Os cassetes de resistência canamicina cloranfenicol podem ser eliminado.
plasmideo pCP20 carregando FLP recombinase atuando nos sítios FRT da canamicina e os cassetes de resistência a cloranfenicol são então introduzida no sites recombinante através de eletroporação. Após uma série de culturas a 42 °C, a perda dos cassetes de resistência a canamicina e cloranfenicol é verificada por uma análise de PCR com os mesmos oligonucleotideos utilizados anteriormente (metAF / METAR, pykF / pykFR e thrA*lF / thrA*lR). A linhagem retida é designada MG1655 AmetA ApykE AthrLABC::TT07-Ptrc-thrA*l.
3,4 Construção do plasmideo pMA-aaoro
Um gene sintético do gene aao de Rhodococcus opacus codificando para aminoácido oxidase foi elaborado por Geneart (Alemanha). O uso de códons e conteúdo GC dos genes foi adaptado para Escherichia coli de acordo com o fornecedor das matrizes. A expressão do gene sintético foi conduzida por um promotor Ptrc constitutivo. A construção foi clonada em vetor pMA do fornecedor e verificada por sequenciamento.
PtrcOl aaoro:
sítios de restrição (Kpnl, EcoRI, Smal) (SEQ ID NO 48): ggtaccgaattccccggg promotor PtrcOl e RBS (SEQ ID NO 49): gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaaggatcccccgggtaag gaggttataa sequência do gene aaoro otimizado para E. coli (AY053450.) (SEQ ID NO 50):
atggcatttacccgtcgcagctttatgaaaggtctgggtgcaaccggtggtgcaggtct ggcatatggtgcaatgagcaccctgggtctggcaccgtctacagcagcaccggcacgta cctttcagccgctggcagccggtgatctgattggtaaagtgaaaggtagccatagcgtt gttgttctgggtggtggtccggcaggtctgtgtagcgcatttgaactgcagaaagccgg ttataaagttaccgttctggaagcacgtacccgtccgggtggtcgtgtttggaccgcac gtggtggtagcgaagaaaccgatctgagcggtgaaacccagaaatgtacctttagcgaa ggccatttttataatgttggtgccacccgtattccgcagagccatattaccctggatta ttgtcgcgaactgggtgttgaaattcagggtttcggcaatcaaaatgccaatacctttg tgaattatcagagcgataccagcctgagcggtcagagcgttacctatcgtgcagcaaaa gcagatacctttggctatatgagcgaactgctgaaaaaagcaaccgatcagggtgcact ggatcaggttctgagccgtgaagataaagatgcactgagcgaatttctgagcgattttg gtgatctgtctgatgatggtcgttatctgggtagcagccgtcgtggttatgatagcgaa ccgggtgccggtctgaattttggcaccgaaaaaaaaccgtttgccatgcaggaagttat tcgtagcggtattggtcgcaattttagctttgattttggctatgatcaggccatgatga tgtttacaccggttggtggtatggatcgtatttattatgcctttcaggatcgtattggc actgataacatcgtgttcggtgccgaagttaccagcatgaaaaatgttagcgaaggtgt gaccgttgaatataccgcaggcggtagcaaaaaaagcattaccgcagattatgccattt gtaccattcctccgcatctggttggtcgtctgcagaataatctgcctggtgatgttctg accgcactgaaagcagcaaaaccgagcagcagcggtaaactgggtattgaatatagccg tcgttggtgggaaaccgaagatcgcatttatggtggtgcaagcaataccgataaagata ttagccagattatgtttccgtatgatcattataatagcgatcgtggtgttgttgttgca tattatagctctggtaaacgccaggaagcatttgaaagcctgacccatcgtcagcgtct ggcaaaagcaattgcagaaggcagcgaaattcacggcgaaaaatatacccgtgatatta gcagcagctttagcggtagctggcgtcgtaccaaatatagcgaaagcgcatgggcaaat tgggcaggtagcggtggttctcatggtggtgcagccactccggaatatgaaaaactgct ggaaccggtggataaaatttattttgccggtgatcatctgagcaatgcaatcgcatggc agcatggtgcactgaccagcgcacgtgatgttgttacccatattcatgaacgtgttgca caggaagcctaa sítios de restrição (BglII, EcoRV, Paci, Saci, Xbal, HindIII) (SEQ ID NO 51): gatctgatatcttaattaagagctctctagaaagctt
3,5 Construção da linhagem MG1655 AmetA ApykF AthrLABC::TT07-Ptrc-thrA*1 (pME101-kivDll-yqhD-TT07) (pMAaaoro)
O pME101-kivDll-yqhD-TT07 e os plasmídeos pMA-aaoro são, então, introduzidos na linhagem MG1655 AmetA ApykF AthrLABC::TT07-Ptrc-thrA*l.
Exemplo 4
Construção de linhagems com fluxo de via 1,4butanodiol aumentado: MG1655 AsucCD AaceBAK AarcA AgdhA (pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-adhE2ca-prpE-TT02) (pMElOl-kivDllyqhD-TT07)
4.1 Construção da linhagem MG1655 AaceBAK AsucCD
Para apagar os genes aceBAK, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000) foi utilizada. Esta estratégia permite a inserção de cassete de resistência a cloranfenicol ou à canamicina, ao excluir a maioria dos genes em questão. Para este efeito, os seguintes oligonucleotideos foram utilizados:
AaceBAKF (SEQ ID NO 52): ctggctttcacaaggccgtatggcgagcaggagaagcaaattcttactgccgaagcggt agaatttctgactgagctggtTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com uma região (em caracteres minúsculos) homóloga à sequência (4213531-4213610) da região aceB (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/),
- uma região (caracteres maiúsculos em negrito) para a ampliação do cassete de resistência à canamicina (sequência de referência em Datsenko, KA & Wanner, BL, de 2000, PNAS, 97: 6640-6645),
AaceBAKR (SEQ ID NO 53): aacatcttccacatgcccttcacgtatgcggttttgtagtgcgcgccagtaatcagcgc ggaacaggtcggcgtgcatcCATATGAATATCCTCCTTAG com
- uma região (caracteres maiúsculos) homóloga à sequência (4218298-4218220) da região aceK (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/,
- uma região (caracteres maiúsculos em negrito) para a ampliação do cassete de resistência à canamicina (sequência de referência em Datsenko, KA & Wanner, BL, de 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Os oligonucleotideos AaceBAKF e áaceBAKR são utilizados para amplificar o cassete de resistência à canamicina do plasmideo pKD4. O produto de PCR obtido é então introduzido por eletroporação na linhagem MG 1655 (pKD46). Os transformantes resistentes à canamicina são selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos aceBAKF e aceBAKR definidos abaixo. A linhagem retida é designada MG1655 AmetA::Km. aceBAKF (SEQ ID NO 54): cgttaagcgattcagcaccttacc (homóloga à sequência 4213251 a 4213274). aceBAKR (SEQ ID NO 55):
aacgcattacccactctgtttaatacg (homóloga à sequência 4218728 a 4218702).
Para excluir os genes sucCD a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000) foi utilizada. Esta estratégia permite a inserção de um cassete de resistência a cloranfenicol ou à canamicina, ao excluir a maioria dos genes em questão. Para este efeito, os seguintes oligonucleotideos foram utilizados: AsucCDF (SEQ ID NO 56): tttttgcccgctatggcttaccagcaccggtgggttatgcctgtactactccgcgcgaa gcagaagaagccgcttcaaaaCATATGAATATCCTCCTTAG com uma região (em caracteres minúsculos) homóloga à sequência (762.268-762.347) da região sucC (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/),
- uma região (caracteres maiusculos em negrito) para a ampliação do cassete de resistência a cloranfenicol (sequência de referência em Datsenko, KA & Wanner, BL, de 2000, PNAS, 97: 6640-6645),
AsucCDR (SEQ ID NO 57): atatccgccaggctgcgaacggttttcacgcctgcggcttccagagcagcgaatttctc atccgcagtccctttaccggcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com
- uma região (caracteres maiusculos) homóloga à sequência (764.241-764.168) da região sucD (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/),
- uma região (caracteres maiúsculos em negrito) para a ampliação do cassete de resistência a cloranfenicol (sequência de referência em Datsenko, KA & Wanner, BL, de 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Os oligonucleotideos DsucCDF e DsucCDR são utilizados para amplificar o cassete de resistência a cloranfenicol do plasmideo pKD3. 0 produto de PCR obtido é então introduzido por eletroporação na linhagem MG 1655 (pKD46) . Os transformantes resistentes a cloranfenicol são selecionados e, em seguida, a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos sucCDF e sucCDR definidos abaixo. A linhagem retida é designada MG1655 AsucCD::Cm. sucCDF (SEQ ID NO 58): tcgcgaatccgtgggcttcctggtaacg (homóloga à sequência 761887-761914). sucCDR (SEQ ID NO 59: cctctgatgccaaccgaagagatgagccg (homóloga à sequência 764555764527).
Para transferir a kaceBAK: : Km, o método de transdução de PI fago é utilizado. Ά preparação do lisado de fago da linhagem MG1655 DaceBAK::Km é usado para a transdução na linhagem MG1655 AsucCD::Cm.
Os transformantes resistentes a canamicina e cloranfenicol são selecionados e os AaceBAK::Km são verificados por uma análise de PCR com os oligonucleotídeos previamente definidos e aceBAKF aceBAKR. A linhagem retida é designada MG1655 AsucCD'. : Cm HaceBAK: : Km.
Os cassetes de resistência à canamicina e a cloranfenicol podem ser eliminados. O plasmideo pCP20 carregando a FLP recombinase atuando nos sítios FRT dos cassetes de resistência a canamicina e cloranfenicol são então introduzidos no sítio recombinante através de eletroporação. Após uma série de culturas a 42 °C, a perda dos cassetes de resistência a canamicina e cloranfenicol é verificada por uma análise de PCR com os mesmos oligonucleotídeos utilizados anteriormente (aceBAKF / aceBAKR e sucCDF / sucCDR). A linhagem retida é designada
MG1655 LsucCD AaceBAK.
4.2 Construção da linhagem MG1655 AsucCD AaceBAK AarcA AgdhA
Para eliminar o gene arcA, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000) foi utilizada. Esta estratégia permite a inserção de um cassete de resistência a cloranfenicol ou à canamicina, ao excluir a maioria dos genes em questão. Para este efeito, os seguintes oligonucleotideos foram utilizados:
AarcAF (SEQ ID NO 60): cccgcacattcttatcgttgaagacgagttggtaacacgcaacacgttgaaaagtattt tcgaagcggaaggctatgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com uma região (em caracteres minúsculos) homóloga à sequência (4638322-4638245) da região arcA (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/),
- uma região (caracteres maiúsculos em negrito) para a ampliação do cassete de resistência à canamicina (sequência de referência em Datsenko, KA & Wanner, BL, de 2000, PNAS, 97: 6640-6645),
AarcAR (SEQ ID NO 61): ccagatcaccgcagaagcgataaccttcaccgtgaatggtggcgatgatttccggcgta tccggcgtagattcgaaatgCATATGAATATCCTCCTTAG com
- uma região (caracteres maiúsculos) homóloga à sequência (4637621-4637699) da região arcA (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/),
- uma região (caracteres maiúsculos em negrito) para a ampliação do cassete de resistência à canamicina (sequência de referência em Datsenko, KA & Wanner, BL, de 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Os oligonucleotideos DarcAF e DarcAR e são utilizados para amplificar o cassete de resistência à canamicina do plasmideo pKD4. 0 produto de PCR obtido é então introduzido por eletroporação na linhagem MG 1655 (pKD46) . Os transformantes resistentes à canamicina são selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos arcAF e arcar definidos abaixo. A linhagem retida é designada MG1655 AarcA::Km. arcAF (SEQ ID NO 62): cgacaattggattcaccacg (homóloga à sequência 4638746-4638727). arcAR (SEQ ID NO 63) : gcggtattgaaaggttggtgc (homóloga à sequência 46373084637328).
Para transferir o AarcA::Km, transdução de PI fago é utilizada. 0 lisado de fago da linhagem MG1655 DarcA::Km é usado para a transdução na linhagem MG1655 AsucCD AaceBAK.
Os transformantes resistentes à canamicina são selecionados e o AarcA::Km é verificado por uma análise de
PCR com os oligonucleotideos previamente definidos arcAF e arcAR. A linhagem retida é designada MG1655 AsucCD AaceBAK AarcA:: Km.
Para eliminar o gene gdhA, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000) foi utilizada. Os oligonucleotideos AgdhAF e AgdhAR são utilizados para amplificar o cassete de resistência a cloranfenicol do plasmideo pKD3.
AgdhAF (SEQ ID NO 64): taaacaacataagcacaatcgtattaatatataagggttttatatctatgTGTAGGCTG GAGCTGCTTCG com uma região (em caracteres minúsculos) homóloga à sequência (1840348-1840397) a montante do gene gdhA (http://ecogene.org/blast.php) ,
- uma região (caracteres maiúsculos em negrito) para a ampliação do cassete de resistência a cloranfenicol (sequência de referência em Datsenko, KA & Wanner, BL, de 2000, PNAS, 97: 6640-6645),
AgdhAR (SEQ ID NO 65): taagcgtagcgccatcaggcatttacaacttaaatcacaccctgcgccagCATATGAAT ATCCTCCTTAG com:
uma região (em caracteres minúsculos) homóloga à sequência (1841767-1841718) para o final e na região a jusante do gene gdhA (http://ecogene.org/blast.php),
- uma região (caracteres maiusculos em negrito) para a ampliação do cassete de resistência a cloranfenicol (sequência de referência em Datsenko, KA & Wanner, BL, de 2000, PNAS, 97: 6640-6645),
O produto de PCR obtido é então introduzido por eletroporação na linhagem MG1655 (pKD46). Os transformantes resistentes a cloranfenicol são selecionados e, em seguida, a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos Ptrc-gdhAverF e gdhA R.
Ptrc-gdhAverF (SEQ ID NO 66):
CCTTAACGTTATTGTCTCTGC uma região homóloga à sequência (1840168-1840188) da região montante do gene gdhA (http://ecogene.org/blast.php).
gdhA R (SEQ ID NO 67):
GGAGGAAGCCCCAGAGCAGG uma região homóloga à sequência (1842274-1842293) da região jusante do gene gdhA (http://ecogene.org/blast.php).
A linhagem obtida foi nomead
MG1655 AgdhA::Cm.
Para transferir a
AgdhA::Cm, transdução de PI fago é utilizada. 0 lisado de fago da linhagem MG1655 AgdhA::Cm é usado para a transdução na linhagem MG1655 AsucCD AaceBAK
AarcA::Km.
Os transformantes resistentes a canamicina e cloranfenicol são selecionados e a AgdhA::Cm é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos previamente definidos Ptrc-gdhAverF e gdhA R. A linhagem retida é designada MG1655 AsucCD EaceBAK AarcA::Km AgdhA::Cm.
Os cassetes de resistência canamicina e a cloranfenicol podem ser eliminados. O plasmideo pCP20 carregando a FLP recombinase atuando nos sitios FRT da canamicina e os cassetes de resistência a cloranfenicol são então introduzidos no sitio recombinante através de eletroporação. Após uma série de culturas a 42 °C, a perda dos cassetes de resistência à canamicina e a cloranfenicol sendo verificada por uma análise de PCR com os mesmos oligonucleotideos utilizados anteriormente (aceBAKF / aceBAKR, sucCDF / sucCDR, arcAF / arcAR e gdhAverF / gdhA R ). A linhagem retida é designada MG1655 AsucCD AaceBAK AarcA AgdhA.
4,3 Construção de um plasmideo para superexpressão da acetaldeído-CoA/álcool desidrogenase bifuncional adhE2 de Clostridium acetobutylicum e propionil-CoA sintetase de gene prpE de Escherichia coli: pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01adhE2ca-prpE-TT02
O gene adhE2 de Clostridium acetobutylicum codificando para a acetaldeído-CoA/álcool desidrogenase bifuncional foi clonado no plasmideo pUC19. O gene que codifica para a prpE propionil-CoA sintetase foi clonado a montante de adhE2.
O gene adhE2 foi amplificado por PCR a partir do megaplasmideo pSoll da linhagem de ATCC824 de Clostridium acetobutylicum (posição 33722-36298), com os oligonucleotideos adhE2Ca F e adhE2Ca R.
adhE2Ca F(SEQ ID NO 68): ggtaccggatccgggcccgagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtgg aattgtga gcgga taacaatt TACG TAt aaqqaqgtatat t ATGAAAGTTACAAA.TCAA· AAAGAAC com
- uma região (em caracteres minúsculos em negrito) para a adição do sítio de restrição Kpnl, BamHI, Apal
- uma região (caracteres sublinhados minúsculos) para a adição do promotor PtrcOl
- uma região (em caracteres minúsculos em itálico) para a adição de uma sequência operadora ΟΡΟΙ
- uma região (caracteres maiúsculos em negrito) para a adição de sítio de restrição SnaBI
- uma região (em caracteres minúsculos) para a sequência de adição RBS01
- uma região (caracteres sublinhados maiúsculos) homólogos da região adhE2 33722-33752 de C. acetobutylicum adhE2Ca R (SEQ ID NO 69) :
Figure BRPI0923748B1_D0003
atttgatg cctagggctagctctagatta a TTAáAATGATTTTATATAGATATCCTTAA
GTTCAC, com
- uma região (caracteres maiúsculos) para a adição do sítio de restrição Hindlll, Saci.
- uma região (caracteres sublinhados em negrito minúsculos) para a adição do terminador TT02
- uma região (caracteres em itálico) para a adição do sítio de restrição Pacl, Xbal, Nhel, Avrll
- uma região (caracteres sublinhados maiúsculos) homólogos da região adhE2 36264-36298 de C.acetobutylicum.
Este fragmento de PCR foi digerido com BamHI e Hindlll e clonado no vetor pUC19 digerido com as mesmas enzimas de restrição. O plasmídeo obtido foi nomeado pUC19Ptrc01/OP01/RBS01-adhE2ca-TT02
Para amplificar o gene prpE, PCR é realizado através de DNA cromossômico de E. coli como modelo e os primers prpE F e prpE R.
prep F(SEQ ID NO 70) : tctagaggatccaaqttcaacaggagagcattatg, com
- uma região (caracteres em negrito sublinhados) para a adição de sítios de restrição Xbal e BamHI
- uma região homóloga (em caracteres minúsculos) à região
351910-351932 (http://ecogene.org/blast.php).
prep R (SEQ ID NO 71):
ggatccgctagccctaggtacgtactactcttccatcgcctggc, com
- uma região (caracteres em negrito sublinhados) para a adição de sítios de restrição BamHI, Nhel, Avrll, SnaBII
- uma região (em caracteres minúsculos) homóloga à região 353816-353797 (http://ecogene.org/blast.php).
Este fragmento de PCR foi digerido com Xbal e Nhel e clonados no vetor pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-adhE2ca-TT02 digerido com as mesmas enzimas de restrição. 0 plasmídeo obtido foi nomeado pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-adhE2ca-prpETT02 .
4,4 Construção da linhagem AsucCD MG1655 AaceBAK AarcA AgdhA (pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-adhE2ca-prpE-TT02) (pMElOlkivDll-yqhD-TT0 7)
Os plasmídeos pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-adhE2ca-prpETT02 e pME101-kivDll-yqhD-TT07 são então introduzidos no linhagem MG1655 AsucCD AaceBAK AarcA AgdhA.
Exemplo 5
Fermentação de linhagems produtoras de etileno glicol em frascos de Erlenmeyer desempenho das linhagens foi avaliado em culturas mantidas em frascos Erlenmeyer de 500 ml com meio modificado M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sei.
32:120-128 EUA), que foi suplementado com 10 g MOPS/1 e 10 g/1 de glicose e pH ajustado para 6,8. Espectinomicina foi adicionada, se necessário, em uma concentração de 50 mg/L e/ou antibiótico cloranfenicol foi adicionado, se necessário, a uma concentração de 30mg/l. Uma precultura de 24h foi utilizada para inocular uma cultura de 50 ml a um OD600 nm de cerca de 0,3. As culturas foram mantidas em um agitador a 37°C e 200 rpm até a glicose no meio de cultura ser esgotada. No final da cultura, glicose e os principais produtos foram analisados por HPLC usando uma coluna Biorad HPX 97H para a separação e um refratômetro para a detecção. A produção de etileno glicol foi confirmada por cromatografia gasosa / espectrometria de massas (GC / MS) com um cromatógrafo a gás Hewlett Packard 6890 Series acoplado a um detector de massas série 5973 Hewlett Packard seletivo (EI) e uma coluna HP-Innowax (25 m de comprimento, 0,20 mm de diâmetro, 0,20 mícrons de espessura de filme). O tempo de retenção e espectro de massas de Etileno Glicol gerados foram comparados com a de Etileno Glicol autêntico.
A comparação dos desempenhos entre a linhagem de produção e uma linhagem de referência é dada na tabela abaixo. (Ver abaixo para a construção da linhagem produtora)
Ref Cultura Linhagem genótipo [etilenoglicol] (mM)
FbDI_0180 MG1655 DpykF nd
FbDI_0184 MG1655 DpykF (pMElOlkivDll-yqhD-yeaB-TT07) (pCCIBAC-serA) 0, 63
nd: não detectado
Exemplo 6
Construção de linhagem com o aumento do fluxo da via de etileno glicol: MG1655 ApykE (pME101-kivDll-yqhD-yeaB5 TT07) (pCCIBAC-serA)
6,1 Construção de um plasmideo para a superexpressão da ácido ceto-hidroxi descarboxilase kivD de Lactococcus lactis, da aldeído hidroxi redutase yqhD e os genes yeaB fosfohidróxi piruvato fosfatase de Escherichia coli:
plasmideo pME101-kivDll-yqhD-yeaB-TT07
O fragmento contendo yeaB foi restringido por Xbal e BglII e clonado no vetor pMElOl-kivDll-yqhD limitado pela mesmas enzimas de restrição, o plasmideo resultante sendo denominado pME101-kivDll-ygrhD-yeaB-TT07.
O gene yeaB foi amplificado por PCR do DNA genômico da linhagem MG1655 de E. coli com os oligonucleotideos yeaB F e yeaB R:
yeaB F (SEQ ID NO 72)
AGCTGTATACTAGaATTCATAGATCTtaaggaggtatattATGGAATACCGTAGCCTGA CGC com
- uma região (caracteres em negrito e itálico maiúsculos) para a adição de sítios de restrição BstZllT, EcoRI e BamHI uma região (caracteres sublinhados minúsculos) para adição de um Ribosome Binding Site
- uma região (caracteres maiúsculos) homóloga à região yeaB de E. coli MG1655 de 1894195-1894215 (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/), yeaB R (SEQ ID NO 73)
GC T TA TAAGCCAGC TGGC TC TAGATAGCAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGGAGT ATACATGAAGCATTTCCGTTAATTAACGGAGCTCATCCTÃGGTCAGGGTTTCA.CA.CCRA TTTGCAGCGCC
- uma região (caracteres maiúsculos em negrito) homóloga à região yeaB de E. coli MG1655 de 1894772-1894745 (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/) ,
- uma região (caracteres sublinhados maiúsculos) homóloga à sequência de terminação T7Te(ref Harrington KJ, Laughlin RB e Liang S. Proc Acad National Sei EUA A. 24 abr de2001, 98 (9) :5019-24.) uma região (caracteres maiúsculos em itálico), para adição de sítios de restrição PsíII, PvuII, Xbal, BstZ17I, Xmnl, PacI, SacT e Avrll
O fragmento amplificado por PCR foi cortado com as enzimas de restrição Xbal e BglII e clonado nos sitios Xbal - BglII do vetor pME101-kivDll-yqhD-TT07 dando vetor pME101-kivDll-yqhD-yeaB-TT07 .
6,2 Construção de um plasmideo para superexpressão Fosfoglicerato desidrogenase de serA de plasmideo de Escherichia coli: pCClBAC-serA
Para aumentar a expressão do gene serA, o gene foi expresso a partir do vetor de controle de cópia pCCIBAC (epicentro), utilizando o seu próprio promotor.
Para este efeito, o gene serA foi amplificado a partir do genoma de E. coli utilizando os oligonucleotideos serA F e serA R. O produto de PCR foi restringido utilizando-se as enzimas Xbal e Smal e clonado no vetor pUC18 (Stratagene) limitado pela mesmas enzimas de restrição. O vetor resultante foi denominado pUC18-serA.
serA F (SEQ ID NO 74): ctagTCTAGATTAGTACAGCAGACGGGCGCG com
- uma região (caracteres maiúsculos) homóloga à sequência (3055199-3055220) do gene serA (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/),
- uma região (caracteres em negrito) que abriga o sitio
Xbal serA R (SEQ ID NO 75) : tccCCCGGGAAGCTTCCGTCAGGGCGTGGTGACCG com
- uma região (caracteres maiúsculos) homóloga à sequência (3056880-3056861) da região de gene serA (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/ ),
- uma região (caracteres em negrito) abrigando os sitios Smal e Hindlll.
Para transferir o gene serA para a cópia de controle de vetor pCCIBAC, o vetor pUC18-serA foi limitado com a enzima Hindlll e clonado em sitio Hindlll clonagem pronto pCCIBAC (epicentro).
resultado de construto foi verificado e chamado de pCClBAC-serA.
6,3 Construção de linhagem ApykF MG1655 (pMElOlkivDll-yqhD-yeaB-TT07) (pCCIBAC-serA)
A linhagem de construção MG1655 ApykF foi previamente detalhada (parte 2.2).
Os plasmideos pCCIBAC-serA e pMElOl-kivDll-yqhD-yeaBTT07 foram introduzidos na linhagem MG1655 ApykF.
Exemplo 7
Demonstração da atividade de hidróxi-cetoácido descarboxilase codificada pelo gene kivD de Lactococcus lactis
1,1 Construção de linhagem para a caracterização KivD: BL21 (pPALl kivDll)
Para caracterizar a proteína KivD, o gene correspondente foi expresso a partir do vetor de expressão pPAL7 (Bio-Rad).
Para este efeito, o gene kivD foi amplificado a partir do genoma de Lactococcus lactis utilizando os oligonucleotideos pPAL7-kivDll F e pPAL7-kivDll R. O produto de PCR foi restringido com o uso de enzimas HindIII e BcoRI e clonados no vetor pPAL7 limitado pelas mesmas enzimas de restrição. O vetor resultante foi denominado pPAL7-kivDll.
pPAL7-kivDll F(SEQ ID NO 76):
c c cAAGCTTtgACTTCTATGTATACCGTGGGTGATTATC com
- uma região (caracteres em itálico) homóloga à sequência do gene sintético do gene kivD de Lactococcus lactis, uma região (caracteres em negrito), contendo os nucleotídeos necessários para gerar a proteína livre de tag, contendo uma pequena extensão de aminoácidos Nterminal para favorecer a purificação
- uma região (caracteres sublinhados) abrigando o sítio de restrição HindIII pPAL7-kivDll R (SEQ ID NO 77):
gGAALLCTTAGCTTTTATTCTGTTCGGCGAACAG com
- uma região (caracteres em itálico) homóloga à sequência do gene sintético do gene kivD de Lactococcus lactis,
- uma região (caracteres sublinhados) abrigando o sítio de restrição EcoRI.
plasmideo pPAL7-kivDll foi, então, introduzido na linhagem BL21 (DE3) competente (Invitrogen).
7,2 superprodução da proteína KivD
A superprodução da proteína KivD foi feita em um balão Erlenmeyer de 2 1, utilizando caldo LB (Bertani, 1951, J. Bacteriol. 62:293-300), que foi suplementado com 2,5 g/1 de glicose e 100 mg/1 de ampicilina. Uma precultura da noite anterior foi usada para inocular uma cultura de 500 ml para um OD600 nm de cerca de 0,15. Esta precultura foi realizada em um Erlenmeyer de 500 ml preenchido com 50 ml de caldo LB que foi suplementado com 2,5 g/1 de glicose e 100 mg/litro de ampicilina. A cultura foi mantida em um agitador a 37°C e 200 rpm até OD600 nm ser de cerca de 0,5 e, em seguida, a cultura foi movida em um segundo agitador a 25°C e 200rpm até OD600 nm ser de 0,6 - 0,8 (cerca de uma hora), antes da indução com IPTG 500μΜ. A cultura foi mantida a 25°C e 200 rpm até OD600 nm ser de cerca de 4 e depois foi parada. As células foram centrifugadas a 7000 rpm, por 5 minutos a 4°C e, em seguida, armazenadas a -20°C.
7,3 purificação da proteína KivD
7.3.1 Etapa 1: Preparação dos extratos livres de célula
Cerca de 188 mg de biomassa de E. coli foi suspensa em 30 ml de fosfato de potássio 100 mM, pH 7,6, e num coquetel de inibidores de protease. A suspensão de células (15 ml por tubo cônico) foi sonicada em gelo (sonoplus Bandelin, 70 W) em um tubo de 50 ml, durante 8 ciclos de 30 segundos com intervalos de 30 seg. Após a secagem, as células foram incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente com 5 mM MgC12 e lUI/mL de DNasel. Detritos de células foram removido por centrifugação a 12000g por 30 min a 4°C.
7.3.2 Etapa 2: Purificação por afinidade
A proteína foi purificada a partir de extrato bruto de células por afinidade em coluna Profinity (BioRad, BioEscala Mini cartucho Profinity de exatos 5 ml) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O extrato bruto foi carregado em um cartucho Profinity exato de 5 ml equilibrado com fosfato de potássio 100 mM, pH 7,6. A coluna foi lavada com 10 volumes de coluna do mesmo tampão e incubada durante a noite com fosfato de potássio 100 mM, pH 7,6, 100 mM de fluoreto a 4°C. A proteína foi eluída da coluna com 2 volumes de coluna de fosfato de potássio 100 mM, pH 7,6. O marcador ficou fortemente ligado à resina e a proteína purificada foi liberada. As frações contendo as proteínas foram misturadas e dialisadas contra o fosfato de potássio 100 mM, 150 mM NaCl e glicerol 10% pH 8.
A concentração de proteínas foi medida usando o ensaio da proteína de Bradford.
7,4 Ensaio de hidróxi ceto-ácido descarboxilase
7.4.1 Síntese química do ácido 5-hidróxi-2cetopentanóico
A síntese química do ácido 5-hidróxi-2-cetopentanóico foi descrita na publicação: Friedhelm Korte, Karl Heinz Büchel, a-Hydroxyalkyliden-lacton-Umlagerung, X. aHydroxyalkyliden-lacton-Umlagerung em wãEriger Salzsãure Chemische Berichte, Volume 92 No.4, páginas 877-883 (1959).
7.4.2 A síntese química do ácido 4-hidróxi-2cetobutírico
A síntese química do ácido 4-hidróxi-2-cetobutírico foi descrita na publicação: RS Lane; EE Dekker; (1969) 2keto-4-hydroxybutyrate. Synthesis, chemical properties, and as a substrate for lactate dehydrogenase of rabbit muscle Biochemistry., 8 (7), 2958-2966.
7.4.3 Ensaio de hidóxi ceto-ácido descarboxilase
A descarboxilação do hidóxi ceto-ácido foi medida a 30°C utilizando-se um ensaio enzimático acoplado. 0 ensaio da atividade hidóxi ceto-ácido descarboxilase foi realizada com tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6, 0,2 mM NADH 1 mM MgSO4, difosfato de tiamina 0,5 mM, 72 unidades/ml de álcool desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae, 10 mM 5 hidróxi ceto-ácido neutralizados (ácido hidroxipirúvico ou ácido 4-hidróxi-2-cetobutírico ou ácido 5-hidróxi-2cetopentanóico) e cerca de 40 mg de proteína purificada em um volume total de 1 ml. O consumo de NADH foi monitorado a 340 nm em espectrofotômetro. A atividade detectada no 10 ensaio de controlo, sem o substrato, foi subtraída da atividade detectada no ensaio com substrato. Uma unidade de atividade hidroxi ceto-ácido descarboxilase é a quantidade de enzima necessária para catalisar a descarboxilação de 1 mol de hidroxil-ceto-ácido por minuto a 30°C. (Nm Epsilon 15 340 = 6290 M-l cm-1).
7,5 atividade da enzima purificada
Atividade da enzima purificada (mUI / mg)
Ensaio hidroxipiruvato descarboxilase 79
Ensaio 4-hidróxi-2- cetobutirato descarboxilase 70
Ensaio 5-hidróxi-2- cetopentanoato descarboxilase 63
Exemplo 8
Demonstração da atividade hidróxi aldeido redutase codificada pelo gene yqhD de Escherichia coli
8.1 construção de uma linhagem para YqhD caracterização: MG1655 ApykF: :Km (pTRC99A-yqhD)
8.1.1 Construção da linhagem MG1655 AyqhD::Km
Para eliminar o gene yqhD, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000) foi utilizada. Esta estratégia permite a inserção de um cassete de resistência a cloranfenicol ou à canamicina, ao excluir a maioria dos genes em questão. Para este efeito, os seguintes oligonucleotídeos foram utilizados:
AyqhDF (SEQ ID NO 78) atgaacaactttaatctgcacaccccaacccgcattctgtttggtaaaggcgcaatcgc tggtttacgcgaacaaattccgtgtaggctggagctgcttcg com uma região (em caracteres minúsculos) homóloga à sequência (3153377-3153456) da região yqhD (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/ ), - uma região (caracteres maiusculos) para a ampliação do cassete de resistência à canamicina (sequência de referência em Datsenko, KA & Wanner, BL,
2000, PNAS, 97:
6640-6645),
AyqhDR (SEQ ID NO 79) ttagcgggcggcttcgtatatacggcggctgacatccaacgtaatgtcatgattttcgc ccagttgggtcatgccgtgct ccatatgaatatcctccttag com
- uma região (caracteres maiúsculos) homóloga à sequência (3154540-3154460) da região yqhD (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/ ),
- uma região (caracteres maiúsculos) para a ampliação do
cassete de resistência à canamicina (sequência de
referência em Datsenko, KA & Wanner, BL, 2000, PNAS, 97:
6640-6645).
Os oligonucleotideos AyqhDF e AyqhDR são utilizados para amplificar o cassete de resistência à canamicina do plasmideo pKD4. 0 produto de PCR obtido por eletroporação na linhagem MG transformantes resistentes à canamicina a inserção do cassete de resistência é é então introduzido
1655 (pKD46). Os são selecionados e verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos yqhDF e definidos abaixo. A linhagem retida é designada
AyqhD::Km.
yqhDF (SEQ
ID
NO yqhDR
MG1655
80) :
ggcgtctcgccatacaacaaacgcacatcgggc (homóloga à sequência
3153068-3153100) .
yqhDR (SEQ
ID
NO
81) :
gggctttgccgacaccttcttcgttcttg (homóloga à sequência
3154825-3154797).
8.1.2 Construção de plasmideo pTRC99A-yqhD
Para caracterizar a proteína YqhD, o gene correspondente foi expresso a partir do vetor pTRC99A (Amersham).
Para este efeito, o gene yqhD foi amplificado a partir do genoma de E. coli usando os oligonucleotideos yqhD F pTRC99A F e yqhD R pTRC99A R. O produto de PCR foi restringido peloo uso de enzimas HindIII e BspHI e clonados no vetor pTRC99A restringido pelas enzimas de restrição NcoI-HindIII. O vetor resultante foi denominado pTRC99AyghD.
yqhD F pTRC99A F (SEQ ID NO 82):
cgatgcacg tcatgaacaactttaatctgcacaccccaacccg, com:
uma região (caracteres sublinhados), homóloga à sequência (3153377-3153408) do gene yqhD (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/),
- um sítio de restrição BspHI (caracteres em negrito) yqhD R pTRC99A R (SEQ ID NO 83):
g g cgt a a aaagcttagcgggcggcttcgtatatacggcggctgacatccaacgtaatgt cgtgattttcg com:
- uma região (caracteres sublinhados), homóloga à sequência (3154540-3154483) do gene yqhD (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/),
- um sítio de restrição HindIII (caracteres em negrito).
pTRC99A-yqhD plasmideo foi então introduzida no
MG1655 linhagem AyqhD: km.
8,2 superprodução da proteína YqhD
A proteína YqhD foi superproduzida a 37°C em condições aeróbias em frasco Erlenmeyer desconectado de 21 com 500 mL de meio LB com 2,5 ampicilina e 50mg/l agitados a 200 rpm g/1 de glicose de canamicina.
em um agitador e 50 mg/litro de
Os frascos foram orbital. Quando a densidade óptica medida em 550 nm chegou a 0,5 unidades, os frascos foram incubados a 25°C. Quando a densidade ótica atingiu 1,2 unidades, a produção de proteínas YqhD foi induzida pela adição de IPTG para uma concentração final de
500 mM. A biomassa foi coletada por centrifugação quando as culturas atingiram uma densidade óptica acima de 3,5 unidades. 0 sobrenadante foi descartado e o precipitado foi armazenado a -20°C antes do uso.
8,3 purificação da proteína YqhD
8.3.1 Etapa 1: Preparação dos extratos livres de célula.
400 mg de biomassa de E. coli foram suspensas em 70 ml de Hepes 50 mM pH 7,5, e num coquetel de inibidores de protease. As células foram sonicadas em gelo (Branson sonifier, 70W) em uma célula RZ3 Rosett durante oito ciclos de 30 segundos com intervalos de 30 segundos. Após a secagem, as células foram incubadas por 1 hora em temperatura ambiente com MgC12 lmM e ΙϋΙ/mL de DNasel. Os detritos de células foram removidos por centrifugação a 12000g por 30 min a 4°C. O sobrenadante foi mantido como o extrato bruto.
8.3.2 Etapa 2: Precipitação com sulfato de amônio
O extrato bruto foi precipitado em uma concentração de sulfato de amónio 50% e sulfato de amónio sólido (300 g/1) foi adicionado ao extrato bruto em gelo. Após 15 min de incubação a 4°C, a mistura foi centrifugada a 12000g por 15 min a 4°C. O sobrenadante foi descartado e o precipitado dissolvido em 50 ml de Hepes 50 mM pH 7,5, 1 M de sulfato de amônio.
8.3.3 Etapa 3: cromatografia de interação hidrofóbica
Utilizando-se um Akta Purifier (GE Healthcare), o extrato protéico da etapa anterior foi carregado em uma coluna de 5ml PhenylHP HiTrap (GE Healthcare) equilibrada com o mesmo tampão. A coluna foi lavada com 10 volumes de coluna do mesmo tampão. As proteínas foram eluídas com gradientes de duas etapas, um gradiente de 10 volumes de coluna a partir de 1 M a 0,5 M de sulfato de amônio e um
100 gradiente de 20 volumes de coluna de 0,5 m a 0 M de sulfato de amônio. Após eluição, a coluna foi lavada com 10 volumes de coluna de 50 mM Hepes pH 7,5. A taxa de fluxo da coluna foi de 2,5 ml/min e foram coletadas frações de 2,5 ml. As frações contendo a proteína foram reunidas, dialisadas em 50 mM Hepes pH 7,5 e concentradas a uma concentração de 1,14 mg/microlitro.
8,4 Ensaios de hidróxi aldeído redutase
8.4.1 Síntese química de 4-hidroxibutiraldeído
A síntese química do 4-hidroxibutiraldeído foi descrita na publicação: N° 158 Transposition des dihydro-
2.5 furannes en dihydro-2.3 furannes. - Application à la préparation de l'hydroxy-4 butanal ; par R. PAUL, M. FLUCHAIRE et G. GOLLARDEAU.
Bulletin de la Société Chimique de France, 668-671, 1950.
8.4.2 Ensaio de atividade de glicoaldeído e 4hidroxibutiraldeído redutase
A atividade glicoaldeído e 4-hidroxibutiraldeídoredutase foi avaliada através da medição da velocidade inicial de oxidação do NADPH com espectrofotômetro em um comprimento de onda de 340 nm e em uma temperatura constante de 30°C. A mistura de reação utilizando glicoaldeído ou 4-hidroxibutiraldeído como substrato foi realizada em 20 mM HEPES pH 7,5, 0,1 mM de sulfato de
101 zinco, 0,2 mM de NADPH, 2 mg de proteína purificada em um volume final de lml. A mistura de reação foi incubada por 5 min a 30°C e, em seguida, a reação foi iniciada pela adição do substrato (glicoladeído ou 4-hidroxibutiraldeído) a uma concentração final de 10 mM. Um ensaio controle (branco), sem o substrato, foi executado em paralelo, o valor medido para o controle foi subtraído do valor medido para o ensaio levando em conta a oxidação não específica de NADPH. (Epsilon 340 nm = 6290 M-l cm-1).
Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima que consumiu 1 mol de substrato por minuto nas condições do ensaio. A atividade enzimática específica foi expressa em unidades por mg de proteína.
8.4.3 .Ensaio de atividade 3-hidroxipropionaldeídoredutase
A atividade de YqhD para o substrato 3hidroxipropionaldeído (3-HPA) foi descrita na publicação: Hongmei Li ;Jia Chen ;Hao Li ;Yinghua Li ;Ying Li ; (2008).Enhanced activity of yqhD oxidoreductase in synthesis of 1,3-propanediol by error-prone PCR Prog Nat Sei., 18 (12), 1519-1524.
Estes autores utilizaram cloreto de zinco 5mM, lmM EDTA e lmM Beta-mercaptoetanol para seus ensaios de 3hidroxipropionaldeido redutase.
102
8,5 atividade da enzima purificada
Atividade da enzima purificada (mUI / mg)
Ensaio de atividade glicoladeído redutase 9840
Ensaio de atividade 3- hidroxipropionaldeído- redutase 7918
Ensaio de atividade 4 hidroxibutiraldeídoredutase 1443
Exemplo 9
Demonstração da atividade da L-serino transaminase codificada pelo gene serC de Escherichia coli
9,1 Construção de linhagem para a caracterização serC:
BL21 (pPAL7-SERC)
Para caracterizar a proteína serC, o gene correspondente foi expresso a partir do vetor de expressão pPAL7 (Bio-Rad).
Para este efeito, o gene serC foi amplificado a partir do genoma de E. coli usando os oligonucleotideos pPAL7serC-F e pPAL7-serC R. O produto de PCR foi restrito com o uso de enzimas Hindlll e EcoRI e clonado no vetor pPAL7 limitado pelas mesmas enzimas de restrição. O vetor
103 resultante foi denominado pPAL7-serC.
pPAL7 SERC-F (SEQ ID NO 84):
c c cAAGCTTtgATGGCTCAAATCTTCAATTTTAGTTCTGG com
- uma região (caracteres em negrito) homóloga à sequência (956.876-956.904) do gene serC (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/),
- uma região (caracteres sublinhados) abrigando o sitio de restrição HindIII pPAL7 SERC-R (SEQ ID NO 85) :
gGAATTCTTAACCGTGACGGCGTTCGAACTCAACC com
- uma região (caracteres em negrito) homóloga à sequência (957.964-957.937) da região do gene serC (sequência de referência na página eletrônica http://www.ecogene.org/ ),
- uma região (caracteres sublinhados) abrigando o sitio de restrição EcoRI plasmideo pPAL7-serC foi então introduzido nas células BL21 pertinentes (DE3) (Invitrogen).
9.2 Superprodução da proteína serC
A superprodução da proteína serC foi realizada aplicando o mesmo protocolo do exemplo 7.2.
9.3 Purificação da proteína serC
9.3.1 Etapa 1: Preparação dos extratos livres de
104 células.
Cerca de 280 mg de biomassa de E. coli foi suspensa em 45 ml de fosfato de potássio 100 mM pH 7,6, e num coquetel de inibidores de protease. A suspensão de células (15 ml por tubo cônico) foi sonicada em gelo (sonoplus Bandelin, 70 W) em um tubo de 50 ml, durante 8 ciclos de 30 segundos com intervalos de 30 seg. Após a secagem, as células foram incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente com 5 mM MgCl2 e lUI/mL de DNasel. Detritos de células foram removidos por centrifugação a 12000g por 30 min a 4°C.
9.3.2 Etapa 2: Purificação por afinidade
A proteína foi purificada a partir de extrato bruto de células por afinidade em coluna Profinity (BioRad, BioEscala, Mini cartuchos Profinity exatos de 5 ml) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O extrato bruto foi carregado em um cartucho Profinity de 5 ml exato equilibrado com fosfato de potássio 100 mM pH 7,6. A coluna foi lavada com 10 volumes de coluna do mesmo tampão e incubada por 30min com fosfato de potássio 100 mM pH 7,6, 100 mM de flúor à temperatura ambiente. A proteína foi eluída da coluna com 2 volumes de coluna de fosfato de potássio 100 mM pH 7,6. O marcador ficou fortemente ligado à resina e a proteína purificada foi liberada. As frações contendo as proteínas foram misturadas e dialisadas contra
105
100 mM Tris HC1 150 mM NaCl e glicerol 10% pH 8.
A concentração de proteína foi medida usando o ensaio da proteína de Bradford.
9,4 Ensaio de atividade de L-serino transaminase
Para o ensaio de atividade de L-serino transaminase cerca de 30 mg de enzima purificada foi adicionada a uma solução tampão contendo tampão 50 mM Tris-HCl pH 8,2, 3 mM L-Serina, 1 mM de ácido α-cetoglutárico em um volume total de 300 ml. A reação foi incubada durante 60 minutos a 30°C. O produto de reação (ácido hidroxipirúvico) foi medido diretamente por LC-MS/MS.
9,5 Atividade da enzima purificada
Atividade da enzima purificada (mUI / mg)
Ensaio L-Serino transaminase 186
Exemplo 10
Demonstração da atividade da 3-fosfohidroxipiruvato fosfatase codificada pelo gene GPP2 de Saccharomyces cerevisiae
10,1 Construção de uma linhagem para a caracterização de GPP2sc: BL21 (pPAL7-gpp2sc)
Para caracterizar a proteína GPP, o gene correspondente é expresso a partir do vetor de expressão pPAL7 (Bio-Rad).
106
Para este efeito, o gene gpp é amplificado do genoma de Saccharomyces cerevisiae utilizando-se os oligonucleotideos pPAL7-gpp2sc F e pPAL7-gpp2sc R. O produto de PCR é restrito com o uso de enzimas HindIII e BamHI e clonado no vetor pPAL7 limitado pela mesmas enzimas de restrição. O vetor resultante é chamado pPAL7-gpp2sc. pPAL7-gpp2sc F (SEQ ID NO 86):
c c cAAGCTTTgATGGGATTGACTACTAAACCTCTATC com
- uma região (caracteres em negrito) homóloga à sequência (280680-280655) da região do gene gpp2 (sequência de referência na página eletrônica http://www.yeastgenome.org/ ) ,
- uma região (caracteres sublinhados) abrigando o sítio de restrição HindIII pPAL7 kivDll-R (SEQ ID NO 87):
gGGATCCTTACCATTTCAACAGATCGTCCTTAGC com
- uma região (caracteres em negrito) homóloga à sequência (279928-279954) da região do gene gpp2 (sequência de referência na página eletrônica http://www.yeastgenome.org/ ) ,
- uma região (caracteres sublinhados) abrigando o sítio de restrição BamHI
107
O plasmídeo pPAL7-gpp2sc é então introduzido em células BL21 pertinentes(DE3) (Invitrogen).
10.2 Superprodução da proteína GPP2sc
A superprodução da proteína GPP2sc foi realizada aplicando-se o mesmo protocolo do exemplo 7.2.
10.3 purificação da proteína GPP2sc
10.3.1 Etapa 1: Preparação dos extratos livres de células
Cerca de 294 mg de biomassa de E. coli foi suspensa em 45 ml de fosfato de potássio 100 mM pH 7,6, e num coquetel de inibidores de protease. A suspensão de células (15 ml por tubo cônico) foi sonicada em gelo (sonoplus Bandelin, 70 W) em um tubo de 50 ml, durante 8 ciclos de 30 segundos com intervalos de 30 seg. Após a secagem, as células foram incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente com 5 mM MgC12 e lUI/mL de DNasel. Detritos de células foram removidos por centrifugação a 12000g por 30 min a 4°C.
10.3.2 Etapa 2: Purificação por afinidade
A proteína foi purificada a partir de extrato bruto de células por afinidade em coluna Profinity (BioRad, BioEscala Mini cartucho Profinity exato de 5 ml) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. 0 extrato bruto foi carregado em um cartucho Profinity de 5 ml exato, equilibrado com fosfato de potássio 100 mM pH 7,6. A coluna
108 foi lavada com 10 volumes de coluna do mesmo tampão e incubada durante a noite com fosfato de potássio 100 mM pH 7,6, 100 mM de flúor à temperatura ambiente. A proteína foi eluída da coluna com 2 volumes de coluna de fosfato de potássio 100 mM pH 7,6. O marcador ficou fortemente ligado à resina e a proteína purificada foi liberada. As frações contendo as proteínas foram misturadas e dialisadas contra fosfato de potássio 100 mM, 150 mM NaCl, glicerol 10% pH 8 e concentradas em uma concentração de 0,22 mg/microlitro.
A concentração de proteínas foi medida usando-se o ensaio de proteína de Bradford.
10,4 Ensaio de atividade 3-fosfohidroxipiruvato fosfatase
10.4.1 Síntese química de 3-fosfohidroxipiruvato
A síntese química, de 3-fosfohidroxipiruvato foi descrita na publicação: CE Bailou ;H Hesse ;R Hesse ; (1956).The Synthesis and Properties of Hydroxypyruvic Acid Phosphate J Am Chem Soc., 78 (15), 3718-3720.
10.4.2 Ensaio de atividade 3-fosfohidroxipiruvato fosfatase
O ensaio de atividade 3-fosfohidroxipiruvato fosfatase foi realizado com 50 tampão Tris-HCl pH 8,2 mM, 5 mM MgC12,
3,6 mM de 3-fosfohidroxipiruvato e cerca de 6 mg de proteína purificada (GPP), num volume total de 300 ml. A
109 reação foi incubada durante 120 minutos a 30°C. O produto de reação (ácido hidroxipirúvico) foi determinado diretamente por LC-MS/MS.
10.5 Atividade da enzima purificada
Atividade da enzima purificada (mUI / mg)
Ensaio 3-fosfohidroxi piruvato fosfatase 9
Exemplo 11
Simulação do rendimento máximo de etilenoglicol, produção de 1,3-propanodiol e de 1,4-butanodiol
11,1 Parâmetros utilizados para as simulações
As simulações foram realizadas com o software METOPT™ de propriedade de Metex. Uma rede metabólica simplificada de E. coli foi utilizada, incluindo uma rede central metabólica, vias metabólicas de todos os precursores de biomassa e processos de produção específicos, como descritos acima. Uma composição clássica de biomassa para
E. coli foi utilizada. Para cada diol específico, duas simulações foram realizadas. A primeira para calcular um rendimento máximo teórico (tendo em conta a estequiometria apenas do modelo, sem crescimento e sem energia de manutenção). A segunda para o cálculo do rendimento máximo prático, tendo em conta uma taxa de crescimento de 0,lh_1 e
110 uma energia de manutenção de 5 mmolATP. gDW _1. h_1. Todas as simulações foram realizadas com uma taxa de absorção específica de glicose de 3 mmol. gDW _1. h_1. Para etileno glicol e 1,3 propanodiol, simulações foram realizadas em condições aeróbias. Especificamente para o 1,4-butanodiol, as simulações foram realizadas tanto em condições aeróbias quanto anaeróbias. Nas condições anaeróbicas, a taxa de crescimento não é definida em 0,lh_1. Ά taxa de crescimento é a taxa de crescimento máxima possível de acordo com o ATP 10 disponível.
11,2 Resultados das simulações
etilenoglico 1 1,3- propanodiol 1,4- butanodiol aeróbico) 1,4- butanodiol (anaeróbico)
Rendimento máximo teórico (g / g) 0, 69 0,60 0,50 0,50
Rendimento máximo prático (g / g) 0,50 0,39 0,35 0,45 (I^máx — 0,03h_1)
1/4

Claims (8)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Microrganismo geneticamente modificado de
    Escheríchía coli para a bioprodução de um diol alifático escolhido entre etileno-glicol, 1,3-propanodiol e 1,4butanodiol, caracterizado pelo fato de que o microorganismo compreende uma via metabólica para a descarboxilação de um metabólito ácido hidroxi-2-cetoalifático com uma enzima tendo uma atividade 2-cetoácido descarboxilase codificada pelo gene kivD de Lactococcus lactis, sendo o produto obtido da dita etapa de descarboxilação ainda reduzido no diol alifático correspondente com uma enzima que possui atividade de hidroxil aldeido redutase codificada pelo gene yqhD de Escheríchía coli, em que o metabólito do ácido hidroxi-2-cetoalifático é:
    - hidroxipiruvato quando o diol alifático é etilenoglicol, ou
    - 4-hidroxi-2-cetobutirato, quando o diol alifático é o 1,3-propanodiol, ou
    - 5-hidroxi-2-cetopentanoato quando o diol alifático é
    1,4-butanodiol, respectivamente, e
    em que o microorganismo é geneticamente modificado para a produção melhorada do referido metabólito ácido hidroxi-2-cetoaiifático.
  2. 2. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a produção melhorada de
    Petição 870180045477, de 28/05/2018, pág. 45/128
    2/4 hidroxipiruvato é obtida por, pelo menos, uma das seguintes modificações:
    - Atenuar a expressão dos genes gpmA e/ou pgml;
    - Aumentar a expressão dos genes serA e / ou serC; - Mutar o gene serA para obter um alelo resistente a feedback ; - Aumentar a expressão dos genes yeaB ou serB;
    - Introduzir e aumentar a expressão do gene GPP2 de S.
    Cerevisíae;
    - Atenuar a expressão dos genes sdaA e / ou sdaB e ou tdcG e/ou cysE e/ou trpAB e / ou glyA; - atenuar a expressão dos genes ghrA ou hyi; - atenuar a expressão dos genes ItaE ou aldA / aldB; - atenuar a expressão dos genes pykA e pykF; - Aumentar a expressão do gene ppsA. 3. Microorganismo, de acordo com a reivindicação
    caracterizado pelo fato de que a produção melhorada de 4hidroxi-2-cetobutirato é obtida por, pelo menos, uma das seguintes modificações:
    - aumentar a expressão do gene ppc;
    - atenuar a expressão dos genes pckA e/ou maeA e / ou maeB;
    - aumentar a expressão dos genes thrA e asd;
    - mutar o gene thrA para obter um alelo resistente a feedback ;
    - aumentar a expressão do gene serC;
    - atenuar a expressão dos genes thrB e thrC, e/ou metA e/ou dapA;
    - atenuar a expressão dos genes aldA e aldB;
    Petição 870180045477, de 28/05/2018, pág. 46/128
  3. 3/4
    - atenuar a expressão dos genes pykA e pykF;
    - aumentar a expressão do gene ppsA.
  4. 4. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a produção melhorada de 5hidroxi-2-cetopentanoato é obtida por, pelo menos, uma das seguintes modificações:
    - aumentar a - atenuar a expressão expressão do gene ppc; dos genes pckA e / ou maeA e / ou maeB; - aumentar a expressão dos genes gl tA e / ou icd;
    - atenuar a expressão dos genes sucAB ou sucCD e/ou aceA: ou aceB;
    - atenuar a expressão do gene arcA;
    - aumentar a expressão do gene prpE;
    - atenuar a expressão dos genes gdhA e gltB;
    - atenuar a expressão dos genes aldA e aldB;
    - atenuar a expressão dos genes ack e pta.
  5. 5. Método para a produção fermentativa de um diol alifático escolhido entre etileno-glicol, 1,3-propanodiol e 1,4-butanodiol caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
    - cultivar um microrganismo conforme definido pelas reivindicações 1 a 4 em um meio de cultura adequado compreendendo uma fonte de carbono, e
    - recuperar o diol alifático do meio de cultura.
  6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o diol é ainda purificado.
  7. 7. Método, de acordo com uma das reivindicações 5 ou
    6, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono é
    Petição 870180045477, de 28/05/2018, pág. 47/128
    4/4 selecionada entre hexoses, pentoses, monossacarideos, dissacarideos, oligossacarideos, melaços, amido e combinações dos mesmos.
  8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono é selecionada entre glicose e sacarose.
BRPI0923748-8A 2008-12-31 2009-12-29 Método para a preparação de dióis BRPI0923748B1 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14169908P 2008-12-31 2008-12-31
EP08173129.1 2008-12-31
US61/141,699 2008-12-31
EP08173129 2008-12-31
PCT/EP2009/067994 WO2010076324A1 (en) 2008-12-31 2009-12-29 Method for the preparation of diols

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BRPI0923748A2 BRPI0923748A2 (pt) 2015-08-18
BRPI0923748B1 true BRPI0923748B1 (pt) 2019-04-09

Family

ID=40637987

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0923748-8A BRPI0923748B1 (pt) 2008-12-31 2009-12-29 Método para a preparação de dióis

Country Status (10)

Country Link
US (1) US9121041B2 (pt)
EP (1) EP2379730B1 (pt)
JP (1) JP5774493B2 (pt)
KR (2) KR101827230B1 (pt)
CN (1) CN102341502B (pt)
BR (1) BRPI0923748B1 (pt)
ES (1) ES2549003T3 (pt)
MX (1) MX2011007039A (pt)
PT (1) PT2379730E (pt)
WO (1) WO2010076324A1 (pt)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL1862189T3 (pl) 2006-06-02 2012-01-31 Fresenius Medical Care Deutschland Gmbh Pojemnik napełniony ciekłym koncentratem do przygotowywania dializatu
MY195387A (en) 2009-06-04 2023-01-18 Genomatica Inc Microorganisms for the Production of 1,4-Butanediol and Related Methods
CA2796118A1 (en) * 2010-04-13 2011-10-20 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the production of ethylene glycol
TWI500768B (zh) * 2010-07-05 2015-09-21 Metabolic Explorer Sa 由蔗糖製備１，３－丙二醇之方法
CN103314101B (zh) 2010-11-03 2016-05-18 加利福尼亚大学董事会 通过蛋白质生物质发酵的重组微生物的生物燃料和化学生产
EP2503003A1 (en) * 2011-03-24 2012-09-26 Volker Sieber Synthetic pathway for the production of alcohols or amines
WO2012177983A2 (en) * 2011-06-22 2012-12-27 Genomatica, Inc. Microorganisms for producing ethylene glycol and methods related thereto
EP2540834A1 (en) 2011-06-29 2013-01-02 Metabolic Explorer Method for the preparation of 1,3-propanediol
US9914947B2 (en) * 2011-07-27 2018-03-13 Alliance For Sustainable Energy, Llc Biological production of organic compounds
WO2013052717A2 (en) * 2011-10-05 2013-04-11 The Procter & Gamble Company Microorganisms and methods for producing acrylate and other products from homoserine
EP2783007B9 (en) 2011-11-21 2018-03-28 Metabolic Explorer Microorganism strains for the production of 2,3-butanediol
WO2013126721A1 (en) * 2012-02-23 2013-08-29 Massachusetts Institute Of Technology Engineering microbes and metabolic pathways for the production of ethylene glycol
US11932845B2 (en) * 2012-06-04 2024-03-19 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for production of 4-hydroxybutyrate, 1,4-butanediol and related compounds
WO2014004625A1 (en) * 2012-06-26 2014-01-03 Genomatica, Inc. Microorganisms for producing ethylene glycol using synthesis gas
ES2800341T3 (es) * 2012-07-11 2020-12-29 Adisseo France Sas Método para la preparación de 2,4-dihidroxibutirato
WO2014037912A2 (en) * 2012-09-07 2014-03-13 Cellworks Research India Pvt. Ltd Methods for production of isobutanol through nutrient stress and genetically modified microorganisms thereof
WO2014049382A2 (en) 2012-09-26 2014-04-03 Metabolic Explorer Ethylenediamine fermentative production by a recombinant microorganism
KR102113254B1 (ko) 2013-08-23 2020-05-21 삼성전자주식회사 1,4―ｂｄｏ 생산을 위한 유전자 스크리닝 방법
EP2930244A1 (en) * 2014-04-07 2015-10-14 The Procter and Gamble Company Microorganisms and methods for producing acrylate and other products from homoserine
WO2015167043A1 (ko) * 2014-04-30 2015-11-05 삼성전자 주식회사 증가된 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제 활성을 갖는 미생물 및 이를 이용한 1,4-부탄디올 생산방법
EP3201326B1 (en) * 2014-10-03 2020-03-04 Metabolic Explorer Mutant glutamate dehydrogenase for the conversion of homoserine into 4-hydroxy-2-ketobutyrate
WO2016094526A1 (en) * 2014-12-11 2016-06-16 Ciris Energy Inc. Genetically modified microbes for the biological conversion of carbonaceous materials to diols
CN107580603A (zh) 2015-02-24 2018-01-12 生物蛋白有限公司 条件活性生物蛋白
JP2018526969A (ja) 2015-06-04 2018-09-20 バイオアンバー インコーポレイテッドＢｉｏａｍｂｅｒ Ｉｎｃ． 官能基化アルファ置換アクリレートおよびｃ４ジカルボキシレートのバイオベース産生
US10801050B2 (en) 2015-10-23 2020-10-13 Metabolic Explorer Microorganism modified for the assimilation of levulinic acid
CN105441372A (zh) * 2015-10-30 2016-03-30 清华大学 一种重组谷氨酸棒杆菌与应用
RU2760290C1 (ru) 2016-07-08 2021-11-23 Метаболик Эксплорер Способ ферментативной продукции целевых молекул микроорганизмами, включающими гены, кодирующие фосфотрансферазную систему (фтс) сахаров
CN106957878B (zh) * 2017-04-19 2020-10-30 波顿（上海）生物技术有限公司 一种生物催化生产2-苯乙醇的方法
EP3470512A1 (en) 2017-10-10 2019-04-17 Metabolic Explorer Mutant phosphoserine aminotransferase for the conversion of homoserine into 4-hydroxy-2-ketobutyrate
EP3906313A1 (en) 2019-02-15 2021-11-10 Braskem S.A. Microorganisms and methods for the production of glycolic acid and glycine via reverse glyoxylate shunt
EP3908663A1 (en) 2019-02-20 2021-11-17 Braskem S.A. Microorganisms and methods for the production of oxygenated compounds from hexoses
JP7463388B2 (ja) 2019-02-20 2024-04-08 ブラスケム エス．エー． ペントース糖およびヘキソース糖のための分解経路
US20230212616A1 (en) * 2019-07-08 2023-07-06 Symrise Ag Biotechnological production of diols
CN111349643B (zh) * 2020-03-17 2022-06-24 花安堂生物科技集团有限公司 生物合成异戊二醇的菌株及方法
EP4419657A1 (en) * 2021-10-20 2024-08-28 Genomatica, Inc. Aldehyde dehydrogenase variants and methods of use
CN116355821B (zh) * 2023-03-10 2023-09-29 湖北大学 一种生产乙二醇的运动发酵单胞菌重组菌株、构建方法及其应用

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW313589B (pt) 1991-12-12 1997-08-21 Wacker Chemie Gmbh
US5686276A (en) 1995-05-12 1997-11-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Bioconversion of a fermentable carbon source to 1,3-propanediol by a single microorganism
JP4066543B2 (ja) 1998-01-12 2008-03-26 味の素株式会社 発酵法によるｌ−セリンの製造法
FR2796081B1 (fr) 1999-07-09 2003-09-26 Agronomique Inst Nat Rech Procede de preparation du 1,3-propanediol par un micro-organisme recombinant en l'absence de coenzyme b12 ou de l'un de ses precurseurs
CA2733616C (en) 1999-08-18 2016-09-27 E.I. Du Pont De Nemours And Company Process for the biological production of 1,3-propanediol with high titer
KR101148255B1 (ko) 2002-10-04 2012-08-08 다니스코 유에스 인크. 고수율을 갖는 1,3-프로판디올의 생물학적 제조 방법
MXPA05008857A (es) 2003-02-18 2006-03-09 Metabolic Explorer Sa Procedimiento de preparacion de microorganismos evolucionados que permite la creacion o la modificacion de vias metabolicas.
DE10331291A1 (de) * 2003-07-10 2005-02-17 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Varianten der 3-Phosphoglyceratdehydrogenase mit reduzierter Hemmung durch L-Serin und dafür codierende Gene
FR2862068B1 (fr) 2003-11-06 2007-10-12 Metabolic Explorer Sa Souches de microorganismes optimisees pour des voies de biosyntheses consommatrices de nadph
FR2864967B1 (fr) 2004-01-12 2006-05-19 Metabolic Explorer Sa Microorganisme evolue pour la production de 1,2-propanediol
WO2005111202A1 (en) 2004-05-12 2005-11-24 Metabolic Explorer Recombinant enzyme with altered feedback sensitivity
EP1846564A2 (en) 2005-02-07 2007-10-24 Metabolic Explorer Method for the enzymatic production of alpha-ketobutyrate
WO2006082254A2 (en) 2005-02-07 2006-08-10 Metabolic Explorer Microorganisms comprising enzymes expressed with low gamma-elimination activity
WO2007017710A1 (en) 2005-08-11 2007-02-15 Metabolic Explorer Process for the preparation of aspartate and derived amino acids like lysine, threonine, isoleucine, methionine, homoserine, or valine employing a microorganism with enhanced isocitrate lyase and/or malate synthase expression
WO2007077041A1 (en) 2006-01-04 2007-07-12 Metabolic Explorer Process for the preparation of methionine and its precursors homoserine or succinylhomoserine employing a microorganism with enhanced sulfate permease expression
US7659104B2 (en) * 2006-05-05 2010-02-09 E.I. Du Pont De Nemours And Company Solvent tolerant microorganisms and methods of isolation
WO2007140816A1 (en) 2006-06-09 2007-12-13 Metabolic Explorer Glycolic acid production by fermentation from renewable resources
WO2007144018A1 (en) 2006-06-12 2007-12-21 Metabolic Explorer Ethanolamine production by fermentation
CA2665120A1 (en) 2006-10-03 2008-04-10 Metabolic Explorer Process for chromosomal integration and dna sequence replacement in clostridia
MX2009004659A (es) 2006-10-31 2009-05-22 Metabolic Explorer Sa Procedimiento para la produccion biologica de 1,3-propanodiol a partir de glicerina con un alto rendimiento.
WO2008052596A1 (en) 2006-10-31 2008-05-08 Metabolic Explorer Process for the biological production of n-butanol with high yield
KR20090117739A (ko) 2007-02-09 2009-11-12 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 재조합 미생물을 이용한 생물연료의 생산
EP2137315B1 (en) * 2007-03-16 2014-09-03 Genomatica, Inc. Compositions and methods for the biosynthesis of 1,4-butanediol and its precursors

Also Published As

Publication number Publication date
PT2379730E (pt) 2015-10-16
US20110294178A1 (en) 2011-12-01
BRPI0923748A2 (pt) 2015-08-18
EP2379730B1 (en) 2015-07-22
WO2010076324A1 (en) 2010-07-08
US9121041B2 (en) 2015-09-01
KR20170049612A (ko) 2017-05-10
JP2012513760A (ja) 2012-06-21
EP2379730A1 (en) 2011-10-26
ES2549003T3 (es) 2015-10-22
KR20110117131A (ko) 2011-10-26
KR101827230B1 (ko) 2018-02-07
CN102341502B (zh) 2015-07-01
MX2011007039A (es) 2011-07-20
JP5774493B2 (ja) 2015-09-09
CN102341502A (zh) 2012-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BRPI0923748B1 (pt) Método para a preparação de dióis
Chen et al. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for the production of 3-hydroxypropionic acid from glucose and xylose
US8900838B2 (en) Method for the preparation of 1,3-propanediol from sucrose
US8911978B2 (en) Method for the preparation of hydroxy acids
US20110151530A1 (en) Enzymatic production of 2-hydroxy-isobutyrate (2-hiba)
KR20120041115A (ko) Ｏ-포스포세린 생산 균주 및 이로부터 생산된 ｏ-포스포세린으로부터 ｌ-시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법
US10385322B2 (en) Mutant glutamate dehydrogenase for the conversion of homoserine into 4-hydroxy-2-ketobutyrate
EP3280794A1 (en) A modified microorganism for the optimized production of 2,4-dihydroxyburyrate with enhanced 2,4-dihydroxybutyrate efflux
JP2017534268A (ja) 有用産物の生産のための改変微生物および方法
BR112019013349A2 (pt) conversão de metilglioxal em hidroxiacetona utilizando novas enzimas e aplicações das mesmasconversão de metilglioxal em hidroxiacetona utilizando novas enzimas e aplicações das mesmas
US11162082B2 (en) Mutant phosphoserine aminotransferase for the conversion of homoserine into 4-hydroxy-2-ketobutyrate
EP2540834A1 (en) Method for the preparation of 1,3-propanediol

Legal Events

Date Code Title Description
B07A Technical examination (opinion): publication of technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 29/12/2009, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. (CO) 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 29/12/2009, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS