BR112019013349A2 - conversão de metilglioxal em hidroxiacetona utilizando novas enzimas e aplicações das mesmasconversão de metilglioxal em hidroxiacetona utilizando novas enzimas e aplicações das mesmas - Google Patents

Abstract

a presente invenção se refere a novas enzimas metilglioxal redutase (mgr) que são úteis para converter eficientemente metilglioxal em hidroxiacetona. a invenção se refere mais particularmente a um método para converter eficientemente metilglioxal em hidroxiacetona utilizando as referidas enzimas, a um método para produzir 1,2-propanodiol utilizando um microrganismo superexpressando as referidas enzimas e ao referido microrganismo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: CONVERSÃO DE METILGLIOXAL EM HIDROXIACETONA UTILIZANDO NOVAS ENZIMAS E APLICAÇÕES DAS MESMAS

INTRODUÇÃO [001] A presente invenção se refere a novas enzimas metilglioxal redutase (MGR) que são úteis para converter eficientemente metilglioxal em hidroxiacetona. A invenção mais particularmente se refere a um método para converter eficientemente metilglioxal em hidroxiacetona utilizando as referidas enzimas, a um método para produzir 1,2-propanodiol utilizando um microrganismo superexpressando as referidas enzimas, e ao referido microrganismo.

[002] 1,2-propanodiol ou propilenoglicol, um di-álcool C3 com fórmula C3H8O2 ou HO-CH2-CHOH-CH3, é um produto químico amplamente utilizado, bem conhecido sob o número CAS 57-556, que encontrou numerosas aplicações industriais, como em produtos farmacêuticos, cosméticos, aeronáutica, indústria de alimentos, tabaco e têxtil, para citar algumas. É um líquido incolor, quase inodoro, transparente e viscoso, com um sabor levemente adocicado, higroscópico e miscível com água, acetona e clorofórmio, que é usado principalmente como componente de resinas de poliéster insaturado, mas também de detergentes líquidos, fluidos de congelamento e descongelamento para aeronaves. Pode ainda ser utilizado como umectante (E1520), solvente e conservante em alimentos

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2/64 e produtos de tabaco. 0 propilenoglicol tem sido usado cada vez mais desde 1993-1994 como um substituto para os derivados de etileno, que são reconhecidos como sendo mais tóxicos do que os derivados de propileno.

[003] O 1,2-propanodiol é atualmente produzido principalmente por meios químicos usando um processo de hidratação de óxido de propileno que consome grandes quantidades de água, emprega substâncias altamente tóxicas e gera subprodutos tais como tert-butanol e 1-fenil etanol. Tais processos químicos ainda conduzem tipicamente à produção de uma mistura de (R)-1,2-propanodiol e (S)—1,2— propanediol.

[004] Via(s) metabólica(s) natural(is) ou sintética(s) para a produção de 1,2-propanodiol em microrganismos representa uma alternativa atraente, pois alivia muitos dos problemas acima mencionados.

[005] Até o momento, duas vias biológicas naturais foram caracterizadas para a produção fermentativa de 1,2propanodiol a partir de açúcares em microrganismos.

[006] Na primeira via, que é funcional em E. coli sob condições anaeróbicas, os açúcares 6-desoxi (por exemplo, Lramnose ou L-fucose) são clivados em fosfato de dihidroxiacetona e (S)-lactaldeído, que pode ser ainda reduzido em (S)-1,2-propanodiol por uma oxidorredutase de 1,2-propanodiol, também chamada lactaldeído redutase (LAR)

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3/64 e codificada pelo gene fucO (Badia et al., 1985) . No entanto, os processos de fermentação que dependem desta via não são economicamente viáveis devido aos elevados custos dos substratos de desoxihexoses.

[007] A segunda via natural envolve o metabolismo de açúcares comuns (por exemplo, glicose ou xilose), incluindo mais especificamente a via da glicólise seguida pela via do metilglioxal. Ela converte o fosfato de di-hidroxiacetona em metilglioxal, o qual pode então ser reduzido em (R)lactaldeido ou hidroxiacetona (isto é, acetol), dependendo da natureza da redutase. Estes dois compostos são então transformados em (R)-1,2-propanodiol. Esta via é tipicamente observada em microrganismos que produzem naturalmente (R) 1,2-propanodiol, tais como Clostridium sphenoides e Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum. No entanto, os desempenhos de produção exibidos por esses organismos são altamente limitados.

[008] Dado que a via de metilglioxal é funcional em Enterobacteriaceae, várias investigações foram conduzidas para manipular uma via de síntese para melhorar a produção de 1,2-propanodiol utilizando fontes de carbono simples nos referidos microrganismos, mais particularmente em E. coli (documento WO 98/37204; Cameron et al. , 1998; Altaras and Cameron, 1999; Huang et al. , 1999; Altaras and Cameron, 2000; Berrios-Rivera et al., 2003) .

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4/64 [009] Em cepas de E. coli recombinante manipuladas que produzem 1,2-propanodiol, 1,2-propanodiol pode ser derivada do metabolismo central em três etapa. A metilglioxal sintase que converte o fosfato de di-hidroxiacetona em metilglioxal é o primeira etapa obrigatório, que é seguido pelo segunda etapa de conversão de metilglioxal em (R)-lactaldeido ou hidroxiacetona por metilglioxal redutases (Cameron et al., 1998; Bennet et al., 2001; Ko et al., 2005). Mostrou-se que o aldeido redutase YdhD dependente de NADPH converte mais particularmente o metilglioxal em hidroxiacetona (documento WO 2008/116853), enquanto a glicerol desidrogenase GldA demonstrou converter o metilglioxal em (R)-lactaldeido (Subedi et al., 2008). Na última etapa, a hidroxiacetona ou o lactaldeido são convertidos em 1,2-propanodiol por atividades enzimáticas distintas, em particular a glicerol desidrogenase (codificada pelo gene gldA) ou a 1,2propanodiol oxidoredutase (codificada pelo gene fucO) (Altaras and Cameron, 2000) .

[0010] De modo a melhorar ainda mais a produção de 1,2propanodiol nas referidas cepas de E. coli, a enzima YqhD nativa foi substituída por novas enzimas YqhD mutantes exibindo uma maior eficiência catalítica (ie aumento de kcat/Km) e afinidade para metilglioxal e NADPH. , notavelmente com a enzima mutante YqhD* (G149E) (YqhD: kcat/Km =0,4 mM-l.s-1 e Km = 2,09 mM, versus YqhD* (G149E):

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5/64 kcat/Km = 0,8 mM-ls-1 e Km = 2,92 mM) (documento WO 2011/012697).

[0011] No entanto, os inventores observaram que o YqhD* (G149E) deve ser altamente expresso no microrganismo de modo a permitir a produção de 1,2-propanodiol, o que resulta em uma carga metabólica e, portanto, gera um estresse ao microrganismo devido à privação de carbono e energia.

[0012] Existe assim uma necessidade na técnica de fornecer redutases metilglioxal alternativas (MGR), que podem reduzir o metabolismo metilglioxal com uma maior eficiência catalítica a um nível de expressão mais baixo, de modo a produzir eficientemente (R)-1,2-propanodiol.

[0013] A presente invenção aborda as necessidades discutidas acima na técnica.

[0014] Os inventores descobriram de fato surpreendentemente que as enzimas conhecidas até agora como redutases utilizando vários substratos tais como hexanaldeído, gliceraldeído ou butiraldeído são também capazes de usar metilglioxal como substrato, e desse modo convertendo o dito substrato em hidroxiacetona. Inesperadamente, as referidas enzimas exibem uma eficiência catalítica em relação à metilglioxal e NADPH que é pelo menos sete vezes superior à de YqhD* (G149E) . Com base nesta descoberta, os inventores modificaram as cepas de E. coli existentes produzindo 1,2-propanodiol, e observaram que as

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6/64 referidas cepas podiam produzir mais 1,2-propanodiol em gramas por biomassa, mantendo ao mesmo tempo um menor nível

de expressão destas	novas	metilglioxal redutases.	do	que
para YqhD* (G149E).
[0015] A presente	invenção proporciona, portanto,	um
método aperfeiçoado	para	converter eficientemente	em	um

microrganismo metilglioxal em hidroxiacetona usando as ditas enzimas, um método para produzir 1,2-propanodiol em um microrganismo e um microrganismo produzindo 1,2-propanodiol superexpressando as referidas enzimas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0016] Deve ser entendido que a seguinte descrição detalhada não é limitativa e que várias modificações, substituições, omissões e mudanças podem ser feitas sem se afastar do escopo da invenção. Deve também ser entendido que a terminologia usada aqui é para o propósito de descrever modalidades particulares da invenção, e não pretende ser limitativa.

[0017] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados, sejam supra ou infra, são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

[0018] Além disso, salvo indicação em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm os mesmos significados que os normalmente entendidos pelos especialistas na matéria. As técnicas convencionais de

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7/64 microbiologia e biologia molecular são também aquelas bem conhecidas e vulgarmente utilizadas na técnica. Tais técnicas são bem conhecidas do especialista na técnica e são totalmente explicadas na literatura.

[0019] As formas singulares um, a e o incluem a referência plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[0020] Os termos compreendem, contêm, envolvem ou incluem ou variações como compreende, compreendendo, contendo, envolvido, inclui, incluindo, são usados aqui em um sentido inclusivo, isto é, para especificar a presença das características indicadas, mas não para impedir a presença ou adição de características adicionais em várias modalidades da invenção.

[0021] O termo atividade, atividade catalítica ou função de uma enzima designa, no contexto da invenção, a reação que é catalisada pela referida enzima para converter seu (s) substrato (s) correspondente (s) em outra (s) molécula (s) (produtos)). Como bem conhecido na técnica, a atividade de uma enzima pode ser avaliada medindo a sua eficiência catalítica e/ou constante de Michaelis.

[0022] A eficiência catalítica ou constante de especificidade de uma enzima fornece uma medida direta do seu desempenho, ou em outras palavras, da eficiência com que uma enzima converte seu (s) substrato (s) em um (s) produto

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8/64 (s). De fato, quanto maior a eficiência catalítica, menor a enzima necessária para converter uma determinada quantidade de substrato (s) em um produto (s) . Uma comparação de constantes de especificidade pode também ser usada como uma medida da preferência de uma enzima por diferentes substratos (isto é, especificidade do substrato). A seguinte equação, conhecida como modelo de Michaelis-Menten, pode ser usada para descrever a cinética das enzimas:

[0023] em que E, S, ES e P representam enzima, substrato, complexo enzima-substrato e produto respectivamente. Os símbolos kf, k_r, e k_cat denotam as constantes de velocidade para a ligação para a frente e desligamento reverso de substrato, e para a conversão catalítica de substrato (s) para produto (s) , respectivamente. A eficiência catalítica é igual à razão k_cat/Km.

[0024] A constante catalítica (k_cat) é a taxa de formação do produto quando a enzima é saturada com substrato e é expressa em M^_1s^_1. Em outras palavras, designa o número de moléculas de substrato que a enzima converte em produto por unidade de tempo.

[0025] A constante de Michaelis (Km), por sua vez, é uma medida da afinidade de uma enzima por seu substrato (quanto mais baixo o Km, maior a afinidade), e é expressa em

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M. É mais especificamente definida como segue:

&Γ + fecai [0026] e é igual à concentração de substrato na qual a enzima converte o (s) substrato (s) em produto (s) a metade da sua taxa máxima. Quanto mais baixo o Km, maior a afinidade.

[0027] Está dentro da habilidade da pessoa na técnica medir os parâmetros acima mencionados de uma enzima (Segei, 1993).

[0028] Os termos metilglioxal redutase ou MGR se referem a uma enzima cuja atividade é reduzir uma função carbonila, tal como um aldeido ou uma função cetona, em uma função hidroxila, que é de converter metilglioxal em hidroxiacetona ou lactaldeido. A referida atividade pode ser dependente de NADPH ou dependente de NADH (isto é, dependente de cofator), e pode ocorrer em condições aeróbicas e/ou anaeróbicas. No contexto da presente invenção, as metilglioxal redutases preferidas são as metilglioxal redutases que convertem o metilglioxal em hidroxiacetona.

[0029] O termo microrganismo, como usado aqui, se refere a um organismo microscópico vivo, que pode ser uma célula única ou um organismo multicelular e que geralmente pode ser encontrado na natureza. No contexto da presente invenção, o microrganismo é preferivelmente uma bactéria,

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10/64 levedura ou fungo. Mais preferencialmente, o microrganismo da invenção pertence à família das bactérias Enterobacteríaceae, Clostrídíaceae, Bacíllaceae, Streptomycetaceae e Corynebacteriaceae ou à família das leveduras Saccharomycetaceae. Ainda mais preferencialmente, o microrganismo de acordo com a invenção é a bactéria Enterobacteríaceae Escherichia coll ou Klebsiella pneumoniae, a bactéria Clostrídíaceae Clostridium sphenoides ou Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, a bactéria Corynebacteria ceae Corynebacterium glutamicum, ou a levedura Saccharomycetaceae Saccharomyces cerevisiae. Mais preferencialmente, o microrganismo da invenção é Escherichia coli .

[0030] Os termos microrganismo geneticamente modificado e microrganismo recombinante são intercambiáveis e se referem a um microrganismo como definido acima, que não é encontrado na natureza e, portanto, difere geneticamente de sua contraparte natural. Em outras palavras, se refere a um microrganismo que é modificado pela introdução e/ou deleção e/ou pela modificação de seus elementos genéticos. Tal modificação pode ser realizada, por exemplo, por engenharia genética, ou forçando o desenvolvimento e evolução de novas vias metabólicas combinando mutagênese dirigida e evolução sob pressão de seleção específica (ver, por exemplo, o documento W02005/073364 ou WO2008/116852, incorporado aqui

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11/64 por referência).

[0031] Um microrganismo pode ser geneticamente modificado através da modulação do nivel de expressão de um ou mais genes endógenos. Por modulação entende-se aqui que o nivel de expressão do referido gene pode ser regulado positivamente (isto é, superexpresso), regulado negativamente (isto é, subexpresso ou atenuado), ou mesmo completamente abolido por comparação com o seu nivel de expressão natural (isto é, suprimido). Por regulação positiva ou superexpressão de um gene de interesse, entende-se aqui o aumento do nivel de expressão do referido gene em um microrganismo, em comparação com o microrganismo não modificado. Em contraste, regulação negativa, subexpressão, ou atenuação de um gene de interesse significa diminuir o nivel de expressão do referido gene em um microrganismo, em comparação com o microrganismo não modificado. A expressão de um gene de interesse também pode ser completamente abolida, significando que o nivel de expressão do referido gene é nulo. A modulação acima descrita pode, portanto, resultar em um aumento da atividade do produto gênico, ou alternativamente, em uma atividade inferior ou nula do produto gênico.

[0032] Por gene entende-se aqui uma sequência nucleotidica que compreende pelo menos uma região que codifica para uma proteína de interesse. A referida região pode ainda ser flanqueada em cada extremidade 5' e/ou 3' por

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12/64 regiões não traduzidas (UTRs, denominadas 5'UTR e/ou 3'UTR), que podem conter elementos reguladores que controlam a síntese de proteína. De modo a facilitar a compreensão da invenção, os genes descritos no presente pedido são denominados de acordo com a sua nomenclatura padrão (Demerec et al., 1966); estas denominações não devem, no entanto, ser consideradas limitativas, nomeadamente no que diz respeito às espécies de origem do referido gene, considerando que a sequência de aminoácidos da proteína codificada por cada gene é aqui fornecida.

[0033] O termo gene endógeno se refere aqui a um gene como definido acima que está naturalmente presente em um microrganismo.

[0034] Um gene endógeno pode notavelmente ser superexpresso pela introdução de sequências heterólogas que favorecem a regulação positiva em adição aos elementos reguladores endógenos, ou pela substituição daqueles elementos regulatórios endógenos com tais sequências heterólogas, ou pela introdução de uma ou mais cópias suplementares do gene endógeno cromossomicamente (isto é, dentro do cromossomo) ou extra cromossomicamente (por exemplo, dentro de um plasmídeo ou vetor) dentro do microrganismo. A este respeito, várias cópias de um gene podem ser introduzidas em um cromossomo por métodos bem conhecidos na técnica, tal como por recombinação genética.

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Em contraste, quando um gene é expresso extra cromossomicamente, ele pode ser transportado por diferentes tipos de plasmideo que podem diferir em relação à sua origem de replicação dependendo do microrganismo em que eles podem replicar, e pelo seu número de cópias na célula. Por exemplo, um microrganismo transformado por um plasmideo pode conter 1 a 5 cópias do plasmideo, ou cerca de 20 cópias dele, ou até 500 cópias dele, dependendo da natureza do plasmideo selecionado. Uma variedade de plasmideos, que diferem em relação à sua origem de replicação e do seu número de cópias em uma célula, são bem conhecidos na técnica e podem ser facilmente selecionados pelo perito para tais fins. Exemplos de plasmideos de baixo número de cópias que podem replicar em E. coli incluem, sem limitação, o plasmideo pSClOl (replicação apertada), o plasmideo RK2 (replicação apertada), bem como os plasmideos pACYC e pRSFlOlO, enquanto um exemplo de plasmideo de elevado número de cópias que pode replicar em E. coli é pSK bluescript II.

[0035] Outra maneira de modular a expressão de um gene endógeno é trocar o seu promotor (isto é, promotor do tipo selvagem) com um promotor mais forte ou mais fraco para regular para cima ou para baixo o seu nivel de expressão. Os promotores adequados para esse fim podem ser homólogos (originários da mesma espécie) ou heterólogos (originários de uma espécie diferente) ou artificiais (projetados e

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14/64 sintetizados de novo) e são bem conhecidos na técnica. Está dentro da habilidade da pessoa na técnica selecionar promotores apropriados para modular a expressão de um gene endógeno. Os promotores que são os mais convenientes para aumentar o nível de expressão gênica são bem conhecidos do especialista na técnica: estes incluem, entre outros, os promotores Ptrc, Ptac, Plac e o promotor lambda Pr e Pl. Estes promotores podem ser indutíveis por um composto particular ou por condições externas específicas, tais como temperatura ou luz, e/ou podem ser homólogos ou heterólogos.

[0036] O nível de expressão gênica endógena também pode ser aumentado ou diminuído por meio da introdução de mutações em sua sequência de codificação. As mutações podem ser introduzidas por mutagênese dirigida usando, por exemplo, Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), por técnicas de mutagênese aleatória, por exemplo, através de agentes mutagênicos (raios ultravioletas ou agentes químicos como nitrosoguanidina (NTG) ou etilmetanosulfonato (EMS)) ou embaralhamento de DNA ou PCR sujeito a erros. Uma eliminação de todo ou parte de um gene endógeno pode alternativamente ser realizada para inibir totalmente a sua expressão dentro do microrganismo.

[0037] Adicionalmente, ou alternativamente, um microrganismo pode ser geneticamente modificado para superexpressar um ou mais genes exógenos, desde que os

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15/64 referidos genes sejam introduzidos no microrganismo com todos os elementos reguladores necessários para a sua expressão no microrganismo hospedeiro. A modificação genética ou transformação de microrganismos com DNA exógeno é uma tarefa de rotina para aqueles habilitados na técnica.

[0038] Por gene exógeno, entende-se aqui um gene que não ocorre naturalmente em um microrganismo. De modo a expressar (isto é, superexpressar) um gene exógeno em um microrganismo, esse gene pode ser diretamente integrado no cromossoma do microrganismo, ou ser expresso extra cromossomicamente dentro do microrganismo, como explicado acima. Os genes exógenos de acordo com a invenção são vantajosamente genes homólogos.

[0039] No contexto da invenção, o termo gene homólogo ou homólogo não se refere apenas a um gene herdado por duas espécies (isto é, espécies de microrganismos) por um ancestral genético comum teórico, mas também inclui genes que podem ser geneticamente não relacionados que têm, no entanto, evoluído para codificar proteínas que desempenham funções semelhantes e/ou têm estrutura semelhante (ou seja, homólogo funcional). Portanto, o termo homólogo funcional se refere aqui a um gene que codifica uma proteína funcionalmente homóloga.

[0040] Usando a informação disponível em bases de dados tais como UniProt (para proteínas), GenBank (para genes), ou

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NCBI (para proteínas ou genes), o praticante habilitado pode facilmente determinar a sequência de uma proteína específica e/ou gene de um microrganismo, e identificar com base nesta sequência a uma de proteínas ou genes equivalentes, ou homólogos dos mesmos, em outro microrganismo. Este trabalho de rotina pode ser realizado, por exemplo, por alinhamento de uma sequência específica de gene (ou proteína) de um microrganismo com sequências de genes (ou proteínas) ou do genoma (ou proteoma) de outros microrganismos, que podem ser encontrados nas bases de dados mencionadas acima. Tal alinhamento de sequências pode vantajosamente ser realizado utilizando o algoritmo BLAST desenvolvido por Altschul et al. (1990) . Uma vez que uma homologia de sequência tenha sido estabelecida entre as sequências, uma sequência de consenso pode ser derivada e utilizada para projetar sondas degeneradas de modo a clonar o gene homólogo correspondente (e, portanto, proteína homóloga) do microrganismo relacionado. Estes métodos de rotina da biologia molecular são bem conhecidos de indivíduos versados na técnica.

[0041] Deverá ser ainda entendido que, no contexto da presente invenção, um gene exógeno que codifica uma proteína de interesse pode ser expresso em um microrganismo específico, uma versão sintética deste gene é preferivelmente construída substituindo códons não preferidos ou códons menos preferidos por códons preferidos

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17/64 do referido microrganismo que codifica o mesmo aminoácido. É de fato bem conhecido na técnica que a utilização de códons varia entre espécies de microrganismos, o que pode ter impacto no nível de expressão recombinante da proteína de interesse. Para superar esse problema, os métodos de otimização de códons foram desenvolvidos e são amplamente descritos por Graf et al. (2000), Deml et al. (2001) e Davis & Olsen (2011) . Diversos programas de software foram especialmente desenvolvidos para a determinação da otimização de códons, como o software GeneOptimizer® (Lifetechnologies) ou o software OptimumGene™ da (GenScript) . Em outras palavras, o gene exógeno que codifica uma proteína de interesse de um modo preferido, é preferencialmente otimizado por códons para expressão em um microrganismo específico.

[0042] Um microrganismo pode também ser geneticamente modificado para aumentar ou diminuir a atividade de uma ou mais proteínas que são naturalmente ou não naturalmente expressas no microrganismo.

[0043] O aumento dessa atividade pode ser alcançado melhorando a eficiência catalítica da proteína (se a proteína for uma enzima) e/ou diminuindo a rotatividade proteica.

[0044] Melhorar a eficiência catalítica da proteína significa aumentar o k_cat e/ou diminuir o Km para um dado substrato e/ou um dado cofator, e/ou aumentar o Ki para um

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18/64 dado inibidor. Ki é também uma constante de Michaelis-Menten que a pessoa habilitada na técnica é capaz de determinar (Segei, 1993). Diminuir a rotatividade de proteína significa estabilizar a proteína. Métodos para aumentar a eficiência catalítica da proteína e/ou diminuir a rotatividade de proteínas são bem conhecidos da pessoa habilitada na técnica. Esses incluem engenharia racional com análise de sequência e/ou estrutural e mutagênese dirigida, bem como mutagênese e triagem aleatória. A estabilização da proteína também pode ser alcançada adicionando uma sequência peptídica de marcação ou no terminal N ou no terminal C da proteína. Tais marcações são bem conhecidas na técnica e incluem, entre outras, a Glutationa-S-Transferase (GST).

[0045] Como aqui utilizado, o termo mutante se refere a uma proteína funcional ou um gene funcional, cuja sequência é modificada em pelo menos uma posição (isto é, pelo menos um aminoácido da referida proteína ou pelo menos um nucleotídeo do referido gene é modificado, respectivamente). É para ser entendido que está pelo menos uma modificação de sequência resulta em um mutante de proteína funcional ou em um mutante de gene funcional, possuindo, de um modo vantajoso, uma atividade biológica melhorada em comparação com a proteína do tipo selvagem ou progenitora ou o gene de tipo selvagem ou progenitor.

[0046] O aumento de uma atividade proteica também pode

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19/64 ser conseguido melhorando a expressão da proteína, através de, por exemplo, uma diminuição na rotatividade de proteína, uma diminuição na rotatividade do RNA mensageiro (RNAm), um aumento na transcrição do gene que codifica a referida proteína ou um aumento na tradução de mRNA.

[0047] O decréscimo da rotatividade de mRNA pode ser alcançado modificando a sequência do gene da região não traduzida de 5' (5'-UTR) e/ou da região de codificação e/ou da 3'-UTR (Carrier e Keasling, 1999).

[0048] O aumento da transcrição de um gene, seja endógeno ou exógeno, pode ser conseguido aumentando o número de suas cópias dentro do microrganismo e/ou colocando o referido gene sob o controle de um promotor mais forte, de acordo com os métodos descritos acima.

[0049] O aumento da tradução do mRNA pode ser alcançado pela modificação do Sítio de Ligação ao Ribossomo (RBS). Um RBS é uma sequência no mRNA que é ligada pelo ribossomo ao iniciar a tradução da proteína. Pode ser ou a extremidade 5' de um RNAm em eucariotos, uma região de 6-7 nucleotídeos a montante dos códons de iniciação AUG em procariotos (denominada sequência de Shine-Dalgarno) ou um local de entrada de ribossomo interno (IRES) em vírus. Ao modificar esta sequência, é possível alterar a taxa de iniciação da tradução da proteína, alterar proporcionalmente sua taxa de produção e controlar sua atividade dentro da célula. Também

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20/64 é possível otimizar a força de uma sequência de RBS para obter uma taxa de iniciação de translação direcionada usando o software RBS CALCULATOR (Sails, 2011) . Está dentro da habilidade da pessoa na técnica selecionar a sequência RBS com base na natureza do mRNA.

[0050] Por outro lado, a diminuição da atividade de uma proteína pode significar ou diminuir a sua atividade catalítica específica por mutação do gene que codifica a referida proteína, ou diminuindo a sua expressão, suprimindo a região codificante do referido gene.

[0051] Os termos processo fermentativo, fermentação ou cultura são usados aqui de forma intercambiável para denotar o crescimento de um microrganismo.

[0052] O termo condições de fermentação se refere às condições experimentais que permitem o crescimento de um determinado microrganismo. O crescimento de um microrganismo é geralmente realizado em fermentadores com um meio de crescimento apropriado adaptado ao microrganismo a ser utilizado, e que pode ser facilmente determinado pela pessoa habilitada na técnica.

[0053] No contexto da presente invenção, por conversão fermentativa, entende-se que a conversão de metilglioxal em hidroxiacetona ocorre quando o microrganismo é cultivado sob condições de fermentação apropriadas.

[0054] Um meio de cultura significa aqui um meio (por

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21/64 exemplo, um meio líquido estéril) compreendendo nutrientes essenciais ou benéficos para a manutenção e/ou crescimento do microrganismo, tais como fontes de carbono ou substratos de carbono; fontes de nitrogênio, por exemplo peptona, extratos de levedura, extratos de carne, extratos de malte, ureia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, nitrato de amônio e fosfato de amônio; fontes de fósforo, por exemplo, fosfato monopotássico ou fosfato dipotássico; elementos de traço (por exemplo, sais metálicos) por exemplo sais de magnésio, sais de cobalto e/ou sais de manganês; bem como fatores de crescimento, como aminoácidos e vitaminas.

[0055] O termo fonte de carbono, fonte de carbono ou substrato de carbono de acordo com a presente invenção se refere a qualquer molécula que um microrganismo é capaz de metabolizar e que contenha pelo menos um átomo de carbono. Exemplos de fontes de carbono preferidas de acordo com a invenção incluem, sem limitação, carboidratos.

[0056] O termo carboidrato é uma fonte de carbono como definido acima e que compreende ainda dois átomos de hidrogênio e um átomo de oxigênio. O CO2 não é um carboidrato porque não contém hidrogênio. Exemplos de carboidratos incluem, sem limitação, monossacarídeos tais como glicose, frutose, manose, xilose, arabinose, galactose e semelhantes, dissacarídeos como sacarose, celobiose, maltose, lactose e semelhantes, oligossacarídeos tais como rafinose,

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22/64 estaquiose, maltodextrinas e semelhantes, polissacarideos tais como celulose, hemicelulose, amido e semelhantes, metanol, formaldeido e glicerol. Carboidratos particularmente preferidos de acordo com a invenção são arabinose, frutose, galactose, glicose, lactose, maltose, sacarose, xilose e qualquer mistura dos mesmos. Mais preferivelmente, o carboidrato é escolhido entre glicose, xilose, sacarose ou misturas dos mesmos. Ainda mais preferencialmente, o carboidrato preferido é uma mistura de glicose e xilose.

[0057] Em uma modalidade preferida da invenção, a fonte de carbono é derivada de matéria-prima renovável. Matériaprima renovável é definida como matéria-prima necessária para certos processos industriais que podem ser regenerados dentro de um breve atraso e em quantidade suficiente para permitir sua transformação no produto desejado. A biomassa vegetal pré-tratada ou não, é uma fonte de carbono renovável particularmente preferida.

[0058] Definições adicionais são fornecidas ao longo da especificação.

[0059] A presente invenção pode ser entendida mais prontamente por referência à seguinte descrição detalhada, incluindo modalidades preferidas da invenção, e exemplos aqui incluídos.

[0060] Em um primeiro aspecto, a presente invenção se

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23/64 refere a um método para a conversão fermentativa de metilglioxal em hidroxiacetona, compreendendo a etapa de expressar, em um microrganismo, pelo menos uma metilglioxal redutase tendo uma eficiência catalítica k_cat/Km igual ou superior a 5 mM^s¹ e uma constante de Michaelis Km superior a 0 mM e igual ou inferior a 11 mM. Em particular, a presente invenção é dirigida a um método para a conversão fermentativa eficiente de metilglioxal em hidroxiacetona, compreendendo a etapa de expressar, em um microrganismo, pelo menos uma metilglioxal redutase tendo uma eficiência catalítica kcat/Km igual ou superior a 5 mitV¹ e uma constante de Michaelis Km superior a 0 mM e igual ou inferior a 11 mM. Por conseguinte, a invenção se refere à utilização de pelo menos uma enzima possuindo as propriedades listadas acima, para converter eficientemente, por fermentação microbiana, metilglioxal em hidroxiacetona. Uma conversão fermentativa eficiente como entendida no contexto da presente invenção é assim conseguida quando o metilglioxal é convertido em hidroxiacetona por pelo menos uma metilglioxal redutase tendo uma eficiência catalítica kcat/Km igual ou superior a 5 mM^s¹ e uma constante de Michaelis Km superior a 0 mM e igual ou inferior a 11 mM. Os inventores descobriram de fato que as enzimas que apresentam as atividades acima melhoram grandemente a taxa de conversão de metilglioxal em hidroxiacetona, em comparação com as metilglioxal redutases convencionais, em

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24/64 particular as codificadas pelos genes YqhD ou YqhD*, dos quais Km e k_cat/kM são 2,09 mM, 0,40 mM^_1s^_1 e 2,92 mM, 0,80 rnJUs¹, respectivamente. Assim, as enzimas de acordo com a invenção reduzem grandemente a carga metabólica para realizar a referida conversão e, portanto, podem facilitar o crescimento do microrganismo.

[0061] Os inventores identificaram mais particularmente enzimas específicas que têm a capacidade de realizar a conversão acima.

[0062] De acordo com alguma modalidade preferida, a referida metilglioxal redutase é selecionada do grupo consistindo da enzima YjgB da sequência SEQ ID NO: 1 e seus

mutantes,	a	enzima	YahK	da	sequência	SEQ	ID	NO:	3	e	seus
mutantes,	a	enzima	YhdN	da	sequência	SEQ.	ID	NO:	5	e	seus
mutantes,	a	enzima	Gld	da	sequência	SEQ	ID	nO:	7	e	seus

mutantes, e as suas combinações. Exemplos de mutantes de

YjgB preferidos são YjgB* (N240Y) da sequência SEQ ID NO: 9, YjgB* (I165V) da SEQ ID NO: 125 e YjgB * (Q39R/I165V/A296V) da sequência SEQ ID NO: 127.

[0063] De um modo muito preferido, a referida metilglioxal redutase é a enzima YjgB da sequência SEQ ID NO: 1.

[0064] Ainda mais preferencialmente, a enzima YjgB da sequência SEQ ID NO: 1 é expressa em combinação com a enzima YahK da sequência SEQ ID NO: 3, a enzima YhdN da sequência

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SEQ ID NO: 5, a enzima Gid da sequência SEQ ID NO: 7 , a enzima YafB de sequência SEQ ID NO: 11 ou a enzima YqhD de sequência SEQ ID NO: 13 ou o seu mutante YqhD* (G149E) da sequência SEQ ID NO: 15.

[0065] A informação sobre as sequências de aminoácidos e nucleotideos correspondentes e as propriedades catalíticas das referidas enzimas são apresentadas na Tabela 1 abaixo. Ela indica notavelmente que as referidas enzimas não são conhecidas por exibirem uma atividade metilglioxal redutase.

[0066] Em uma modalidade preferida da invenção, o microrganismo superexpressa a metilglioxal redutase, isoladamente ou em combinação com outra metilglioxal redutase como descrito acima. Mais precisamente, em uma modalidade preferida, o método acima envolve a etapa de cultivar, sob condições de fermentação, um microrganismo superexpressando pelo menos um gene codificador da referida enzima, em um meio de cultura compreendendo um carboidrato como fonte de carbono, e convertendo eficientemente o metilglioxal em hidroxiacetona. Para o fazer, a fonte de carbono é de preferência reduzida para o metabolito intermediário di-hidroxiacetona fosfato (DHAP) pelo referido microrganismo através do metabolismo central do carbono, utilizando vias adequadas e enzimas descritas por exemplo em Neidhardt et al. (1996), aqui incorporado por referência. DHAP é então transformado em metilglioxal (MG) pela ação da

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26/64 metilglioxal sintase (EC 4.2.3.3).

[0067] Como descrito acima, está dentro da habilidade da pessoa na técnica superexpressar um gene que codifica para a referida enzima em um microrganismo. De preferência, esta superexpressão pode ser conseguida através da superexpressão de uma sequência nucleotidica, tal como um gene conhecido ou uma sua variante, codificando cada enzima. A referida sequência nucleotidica pode ser já presente no microrganismo de interesse, no caso em que é dito ser um gene endógeno e pode ser superexpresso de acordo com qualquer um dos métodos descritos acima. Em contraste, quando um microrganismo não compreende naturalmente genes que codificam para tais enzimas, o referido microrganismo pode ser vantajosamente transformado com uma ou mais sequências nucleotidicas exógenas, tais como genes de outros microrganismos ou suas variantes, que codificam a (s) referida (s) enzima (s) de acordo com qualquer do método descrito acima: as referidas sequências de nucleotideos exógenos também se dizem estar superexpressadas. Um gene que codifica uma proteína específica pode ser facilmente recuperado pelo indivíduo versado na técnica através do carregamento de, por exemplo, a sequência de aminoácido da referida proteína na base de dados UniProt ou NCBI, e através de pesquisa para a sequência de nucleotideos de codificação correspondente, que pode ser expresso em um microrganismo particular. Além disso, é

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27/64 possivel e bem conhecido do indivíduo versado na técnica como deduzir uma sequência de nucleotídeos artificial a partir de uma dada sequência de aminoácidos de modo a sintetizar um gene artificial que codifica uma proteína específica de interesse.

[0068] A pessoa habilitada na técnica pode determinar facilmente as condições de cultura necessárias para o crescimento dos microrganismos de acordo com a invenção. Em particular, é bem conhecido que as bactérias podem ser fermentadas a uma temperatura compreendida entre 20 °C e 55 °C, preferencialmente entre 25 °C e 40 °C. E. coll pode ser mais particularmente cultivada a uma temperatura compreendida entre cerca de 30 °C e cerca de 37 °C.

[0069] Este processo de cultura pode ser realizado em um processo em batelada, em um processo alimentado em batelada ou em um processo contínuo, e sob condições aeróbicas, microaeróbias ou anaeróbicas.

[0070] Uma fermentação sob condições aeróbicas significa que o oxigênio é fornecido à cultura pela dissolução do gás na fase líquida da cultura. Isto pode ser conseguido (1) pulverizando oxigênio contendo gás (por exemplo ar) na fase líquida, ou (2) agitando o recipiente contendo o meio de cultura de modo a transferir o oxigênio contido no espaço da cabeça para a fase líquida. A principal vantagem da fermentação em condições aeróbicas é que a

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28/64 presença de oxigênio como um aceptor de elétrons melhora a capacidade da cepa de produzir mais energia sob a forma de ATP para processos celulares, melhorando assim o metabolismo geral da cepa.

[0071] Condições micro-aeróbicas podem ser aqui utilizadas e são definidas como as condições de cultura, em que percentagens baixas de oxigênio (por exemplo, utilizando uma mistura de gás que contém entre 0,1 e 10% de oxigênio, completada a 100% de nitrogênio) são dissolvidos na fase liquida.

[0072] Em contraste, condições anaeróbicas são definidas como condições de cultura em que não é fornecido oxigênio no meio de cultura. Condições anaeróbicas estritas podem ser conseguidas por borbulhamento de um gás inerte tal como nitrogênio para o meio de cultura para remover vestígios de outro gás. O nitrato pode ser usado como um aceitador de elétrons para melhorar a produção de ATP pela cepa e melhorar seu metabolismo.

[0073] O método acima é mais particularmente útil quando aplicado a um processo de fermentação microbiana, que é dirigido à produção de 1,2-propanodiol, em particular à produção de (R)-1,2-propanodiol. Os inventores descobriram de fato que a substituição da enzima YqhD (nativa ou mutada) em cepas de E. coli capazes de produzir 1,2-propanodiol, com metilglioxal redutases de acordo com a invenção, aumenta

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29/64 grandemente a produção de 1,2-propanodiol, em um nível de expressão muito baixo.

[0074] Assim, em outro aspecto, a invenção se refere a um microrganismo geneticamente modificado para a produção de 1,2-propanodiol, em que o referido microrganismo superexpressa pelo menos um gene que codifica para uma metilglioxal redutase de acordo com a invenção. Modalidades preferidas em relação à referida metilglioxal redutase são como descritas acima.

[0075] Consequentemente, uma vez que a metilglioxal redutase de acordo com a invenção é diretamente utilizada para converter metilglioxal em hidroxiacetona, o microrganismo compreende ainda de preferência a deleção do gene yqhD ou YqhD* que codifica a metilglioxal redutase da sequência SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15.

[0076] A substituição ou deleção do yqhD ou YqhD* do gene que codifica a enzima yqhD nativa ou mutada, respectivamente, com uma ou mais das metilglioxal redutases de acordo com a invenção é particularmente vantajosa, pois isso alivia a carga metabólica associada com a expressão de yqhD ou YqhD* pelo microrganismo. De fato, como as enzimas de enzimas YqhD nativas ou mutantes têm uma eficiência catalítica menor do que as metilglioxal redutases de acordo com a invenção, elas devem ser superexpressas e podem representar até 40% da proteína total em um microrganismo, impondo um nível

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30/64 significativo de estresse na maquinaria celular.

[0077] O termo microrganismo geneticamente modificado para a produção de 1,2-propanodiol se refere aqui a microrganismos modificados através da introdução ou supressão de elementos genéticos, ou através de uma etapa de evolução como descrito no pedido de patente WO 2005/073364. Em particular, designa um microrganismo geneticamente modificado apresentando uma produção melhorada de 1,2propanodiol em comparação com microrganismos não modificados (isto é, sem modificações genéticas). Tais microrganismos são bem conhecidos na técnica e foram notavelmente descritos extensivamente, por exemplo, nos pedidos de patente WO 2008/116848, WO 2008/116853, WO 2011/012693, WO 2011/012697, WO 2011/012702 ou EP2532751, que são todos aqui incorporados como referência.

[0078] Modificações genéticas preferidas para a produção de 1,2-propanodiol, mais particularmente para a produção de (R) 1,2-propanodiol, são as seguintes:

- sobre-expressão de pelo menos um gene selecionado entre o gene mgsA que codifica a metilglioxal sintase da sequência SEQ ID NO: 17 ou um mutante do mesmo tal como MgsA* (H21Q) da SEQ ID NO: 19, o gene gldA que codifica uma glicerol desidrogenase de sequência SEQ ID NO: 21 ou mutante do mesmo tal como GldA * (A160T) (este mutante também é dependente de NADH) da sequência SEQ ID NO: 23 e do gene fucO que codifica

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31/64 a lactaldeído redutase da sequência SEQ ID NO: 25;

deleção do gene edd que codifica para a fosfogluconato desidratase da sequência SEQ ID NO: 27 e/ou do gene eda que codifica a 2-ceto-3-desoxigluconato 6fosfato aldolase da sequência SEQ ID NO: 29;

- atenuação da síntese de subprodutos indesejados pela deleção de pelo menos um dos genes que codificam enzimas envolvidas na síntese de metilglioxal lactato (como o gene gloA que codifica a glioxalase I de sequência SEQ ID NO: 31, gene aldA codificador de aldeído desidrogenase A da sequência SEQ ID NO: 33, gene aldB codificador da acetaldeído desidrogenase B da sequência SEQ ID NO: 35), lactato do piruvato (gene IdhA codificador da lactato desidrogenase da sequência SEQ ID NO: 37), formato (gene pflA que codifica piruvato formato liase da sequência SEQ ID NO: 39, pflB gene que codifica a piruvato formato liase de sequência SEQ ID NO: 41), etanol (adhE gene que codifica a aldeído- álcool desidrogenase da sequência SEQ ID NO: 43) e acetato (ACKA gene que codifica acetato quinase de sequência SEQ ID NO: 45, o gene pta de fosfato acetiltransferase de codificação da sequência de SEQ ID NO: 47, poxB gene que codifica piruvato oxidase de sequência SEQ ID NO: 49);

eliminação das vias consumindo fosfoenolpiruvato (PEP) tais como piruvato quinases de sequência SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 53 (codificado pelos genes pykA e pykF) e/ou

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32/64 através da promoção da síntese de PEP, por exemplo, através da superexpressão do gene ppsA que codifica a PEP sintase da sequência SEQ ID NO: 55;

mutação específica no gene Ipd que codifica a lipoamida desidrogenase da sequência SEQ ID NO: 57;

- o gene arcA que codifica para a sequência ArcA transcricional dupla reguladora da SEQ ID NO: 59 e o gene ndh que codifica NADH: ubiquinona oxidoredutase II da sequência de SEQ ID NO: 61 pode ser suprimido;

- o gene gapA que codifica gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase de sequência SEQ ID NO: 63 pode estar sob o controle de temperatura do promotor induzível;

- a superexpressão de genes envolvidos na importação e metabolismo de sacarose (gene cscB que codifica a sacarose permease de sequência SEQ ID NO: 65, gene cscA que codifica a sacarose-hidrolase de sequência SEQ ID NO: 67, gene cscK que codifica frutoquinase de sequência SEQ ID NO: 69, gene scrA que codifica a Enzima II do sistema de fosfotransferase dependente de fosfoenolpiruvato da sequência SEQ ID NO: 71, gene scrK que codifica a fructoquinase dependente de ATP da sequência SEQ ID NO: 73, gene scrB codificador da sacarose 6-fosfato hidrolase (invertase) da sequência SEQ ID NO: 75, gene scrY que codifica a sacarose porine de sequência SEQ ID NO: 77); e

- combinações dos mesmos.

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33/64 [0079] Uma modificação genética mais preferida para a produção de 1,2-propanodiol, mais particularmente para a produção de (R) 1,2-propanodiol, é a superexpressão do gene mgsA.

[0080] Deverá ser entendido que estas modificações genéticas preferidas, em particular a superexpressão do gene mgsA, podem preferencialmente ser combinadas com as modalidades descritas abaixo.

[0081] Mais precisamente, de modo a converter hidroxiacetona em 1,2-propanodiol, o microrganismo de acordo com a invenção preferencialmente superexpressa o gene gldA que codifica a glicerol desidrogenase dependente de NADH da sequência SEQ ID NO: 21, ou um mutante da mesma que codifica para a glicerol desidrogenase dependente de NADH da sequência SEQ ID NO: 23. Esta última é particularmente vantajosa em relação ao gene gldA de tipo selvagem, uma vez que codifica um glicerol desidrogenase que é menos inibida pelo substrato (hidroxiacetona) e produtos (NAD+ e 1,2-propanodiol) da reação.

[0082] No entanto, a redução de hidroxiacetona em 1,2propanodiol não é total com as enzimas de sequência SEQ ID NO: 21 e 23, notadamente devido ao estado redox interno da célula sob condições anaeróbicas. Neste contexto, pode, portanto, ser particularmente preferido aumentar a atividade da acetol redutase dependente de NADPH bem como o

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34/64 fornecimento de NAPDH.

[0083] Por conseguinte, em uma modalidade preferida da presente invenção, a fim de aumentar a conversão da hidroxiacetona em 1,2-propanodiol, o microrganismo de acordo com a invenção preferencialmente superexpressa pelo menos um gene que codifica uma acetol redutase dependente de NADPH, a referida acetol redutase dependente de NADPH tendo pelo menos 60% de identidade de aminoácidos com qualquer uma das sequências SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, e SEQ ID NO: 5.

[0084] De um modo preferido, a referida acetol redutase dependente de NADPH tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de identidade de sequência com as sequências acima, e mais preferencialmente tem pelo menos 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,999% de identidade de sequência com as referidas sequências, desde que a atividade da enzima seja retida, embora possivelmente com uma eficácia diferente. Em alguns casos, a referida acetol redutase dependente de NADPH pode corresponder a qualquer uma das sequências acima (isto é, tem 100% de identidade de sequência).

[0085] A identidade de sequência entre sequências de aminoácidos pode ser determinada por métodos bem conhecidos na técnica, tal como por alinhamento ótimo com o algoritmo de alinhamento de homologia global de Needleman e Wunsch (1970), por implementações computorizadas deste algoritmo

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35/64 (tal como CLUSTAL W) ou por inspeção visual.

[0086] Ainda mais preferencialmente, a acetol redutase dependente de NADPH de acordo com a invenção é da sequência SEQ ID NO: 79.

[0087] A atividade de acetol redutase dependente de NADPH pode ainda ser aumentada diminuindo a atividade de HAR dependente de NADH.

[0088] Por conseguinte, em uma outra modalidade preferida, de modo a aumentar a conversão de hidroxiacetona em 1,2-propanodiol, o microrganismo de acordo com a invenção pode ainda compreender a deleção do gene gldA ou gldA ★ que codifica a glicerol desidrogenase dependente de NADH da sequência SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23 e/ou superexpressam um mutante da mesma que codifica uma glicerol desidrogenase dependente de NADPH. Deverá ser entendido que a referida modalidade pode ser preferencialmente combinada com a descrita acima, em que a atividade de acetol redutase dependente de NADPH é aumentada.

[0089] Como indicado acima, o referido mutante funcional possui uma especificidade de cofator diferente da enzima GldA de tipo selvagem, uma vez que é dependente de NADPH. Isso pode ser facilmente alcançado pelo praticante habilitado por engenharia de cofator (Katzberg et al., 2010) .

[0090] Mais precisamente, a mudança na especificidade do cofator GldA pode ser mediada por pelo menos uma mutação na

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36/64 posição D37. Assim, em uma modalidade preferida, o resíduo de aminoácido na posição D37 pode ser substituído por uma glicina (D37G), uma alanina (D37A) ou uma valina (D37V). Em uma modalidade mais preferida, o resíduo de aminoácido na posição D37 é substituído por uma glicina (D37G).

[0091] Em uma modalidade preferida, a mudança na especificidade do cofator GldA pode ser melhorada combinando uma mutação na posição D37 com pelo menos uma mutação na posição P161. De um modo preferido, o resíduo de aminoácido na posição P161 pode ser substituído por uma serina (P161S) ou uma treonina (P161T). Mais preferencialmente, o resíduo de aminoácido na posição P161 é substituído por uma serina (P161S) .

[0092] Em uma modalidade preferida, a alteração na especificidade do cofator GldA pode ser melhorada combinando mutações nas posições D37 e P161 com pelo menos uma mutação na posição L164. De um modo preferido, o resíduo de aminoácido na posição L164 pode ser substituído por uma alanina (L164A), uma glicina (L164G) ou uma valina (L164V). Mais preferivelmente, o resíduo de aminoácido na posição L164 é substituído por uma alanina (L164A).

[0093] Em uma modalidade particularmente preferida, o microrganismo da invenção superexpressa um gene mutante gldA ★ que codifica um glicerol desidrogenase dependente de NADPH compreendendo pelo menos as seguintes mutações: D37G, P161S

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37/64 e L164A, tal como a enzima de sequência SEQ ID NO: 87.

[0094] A produção de 1,2-propanodiol pode ser ainda melhorada combinando um aumento na atividade de acetol redutase dependente de NADPH como descrito acima com um aumento na disponibilidade de NADPH na célula. Estratégias para aumentar a disponibilidade de NADPH na célula são bem conhecidas do praticante experiente (Lee et al., 2013) .

[0095] Consequentemente, em uma outra modalidade preferida, a fim de aumentar a disponibilidade de NADPH, o microrganismo da invenção pode ainda compreender pelo menos uma das seguintes modificações genéticas:

- a superexpressão do gene operon pntAB que codifica a nucleotideo transidrogenase de nicotinamida das sequências SEQ ID NO: 89 e SEQ ID NO: 91, como descrito pelo documento WO 2012/055798A1 (aqui incorporado por referência);

a atenuação	do	gene	pgi	que	codifica	para a
fosfoglicose isomerase	de	sequência I	SEQ ID NO: 93;
a atenuação	do	gene	pfkA	que	codifica	para a
fosfofrutoquinase de	sequência	SEQ	ID	NO: 95,	conforme

descrito pelo documento WO 2005/047498 (aqui incorporada por referência);

- a superexpressão do gene zwf que codifica para a glicose-6-fosfato desidrogenase de sequência SEQ ID NO: 97, como descrito por Lim et al. , 2002 (aqui incorporado por referência);

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- a superexpressão	do	gene	yjeF	que	codifica	para a
desidratase dependente de	ADP de	sequência	SEQ ID	NO: 99,
como descrito por Marbaix	et	al.,	2011 i	(aqui	incorporada por
referência);
- a superexpressão	do	gene	gapN	que	codifica	para a

gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase NADP-dependentes de sequência SEQ ID NO: 101;

a superexpressão de um gene ipd * mutante que codifica para a lipoamida desidrogenase NADP-dependentes de sequência SEQ ID NO: 103, tal como descrito por Bocanegra et al., 1993 (aqui incorporada por referência); e

- combinações dos mesmos.

[0096] O microrganismo da invenção pode ainda ser geneticamente modificado de modo a converter exclusivamente a fonte de carbono em hidroxiacetona, atenuando ou abolindo assim a síntese de subprodutos indesejados, em particular lactato. Assim, é uma modalidade preferida da invenção fornecer um microrganismo como descrito acima, o qual compreende ainda a deleção do gene gloA que codifica a glioxalase I da sequência SEQ ID NO: 31.

[0097] De acordo com uma modalidade particularmente preferida, o microrganismo da invenção compreende pelo menos:

- a superexpressão do gene mgsA ou mgsA ★ que codifica a metilglioxal sintase da SEQ ID NO: 17 ou 19, e um gene que

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39/64 codifica uma enzima selecionada a partir da glicerol desidrogenase dependente de NADH da SEQ ID NO: 21 ou 23 e enzimas da SEQ ID NO: 79, 81, 83, 85, 87 e 5, e

a deleção dos genes gloA que codificam para a glioxalase I da SEQ ID NO: 31, pflAB que codifica para as piruvato formato liases de SEQ ID NO: 39 e 41, adhE codificando para a aldeido álcool desidrogenase de SEQ ID NO: 43, IdhA codificando a lactato desidrogenase da SEQ ID NO: 37, aldA e aldB codificando as desidrogenases de lactaldeido da SEQ ID NO: 33 e 35, edd codificando para a fosfogluconato desidratase da SEQ ID NO: 27, arcA codificando para o regulador duplo transcricional de SEQ ID NO: 59 e ndh que codificam a NADH desidrogenase da SEQ ID NO: 61.

[0098] De acordo com uma modalidade ainda mais preferida, o microrganismo da invenção compreende pelo menos:

- a sobre-expressão do gene mgsA ou mgsA ★ da SEQ ID NO: 18 ou 20 e um gene escolhido entre os genes da SEQ ID NO: 22 ou 24, e SEQ ID NO: 80, 82, 84, 86, 88 e 6, e

- a deleção dos genes gloA de SEQ ID NO: 32, pflAB de SEQ ID NO: 40 e 42, adhE de SEQ ID NO: 44, IdhA de SEQ ID NO: 37, aldA e aldB de SEQ ID NO: 34 e 36, edd da SEQ ID NO: 28, arcA da SEQ ID NO: 60 e ndh da SEQ ID NO: 62.

[0099] Modalidades preferidas em relação à família,

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40/64 gênero e/ou espécies do referido microrganismo são as descritas acima.

Tabela 1: Enzimas e genes de acordo com a invenção (n/a: não disponível)

Nome	Microorgani smo da origem	Enzima Nome uniprot	Enzima Referê ncia unipro t	Enz ima SEQ ID NO:	Gene Referênc ia RefSeq ou GenBank	Gene SEQ ID NO:	Cofator enzima tico
YjgB	Escherichia coli	aldeido redutase	P27250	1	NP_41869 0.4	2	NADPH
YahK	Escherichia coli	aldeido redutase	P75691	3	NP_41485 9.1	4	NADPH
YhdN	Bacillus subtilis	proteína geral de estresse 69	P80874	5	NP_38883 4.1	6	NADPH
Gld	Gluconose oxydans bacter	putativo oxidoredutase	Q5FQJ0	7	WP_01125 3139.1	8	NADPH
YjgB* (N240Y)	n/a	n/a	n/a	9	n/a	10	NADPH
YafB	Escherichia coli	Ácido 2,5- diceto-Dglucônico redutase B	P30863	11	NP_41474 3.1	12	NADPH
YqhD	Escherichia coli	álcool desidrogenase	Q46856	13	NP_41748 4.1	14	NADPH
YqhD* (G149E)	n/a	n/a	n/a	15	n/a	16	NADPH
MgsA	Escherichia coli	sintase de metilglioxal	P0A731	17	NP_41548 3.2	18	n/a
MgsA* (H21Q)	n/a	n/a	n/a	19	n/a	20	n/a
GldA	Escherichia coli	glicerol desidrogenase	P0A9S5	21	NP_41838 0.4	22	NADH
GldA* (A160T)	n/a	n/a	n/a	23	n/a	24	NADH
FucO	Escherichia coli	lactaldeído redutase	P0A9S1	25	NP_41727 9.2	26	NADH
Edd	Escherichia coli	fos f o desidratase de gluconato	P0ADF6	27	NP_41636 5.1	28	n/a
Eda	Escherichia coli	2-ceto-3desoxiglicona to 6-fosfato aldolase	P0A955	29	NP_41636 4.1	30	n/a
GloA	Escherichia coli	lactoil glutationa liase	P0AC81	31	NP_41616 8.1	32	n/a
AldA	Escherichia coli	lactaldeído desidrogenase	P25553	33	NP_41593 3.1	34	n/a

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		A
AldB	Escherichia coli	aldeido desidrogenase B	P37685	35	NP_41804 5.4	36	n/a
LdhA	Escherichia coli	Desidrogenase D-lactato	P52643	37	NP_41589 8.1	38	NADH
PflA	Escherichia coli	Enzima ativadora de piruvato formiatoliase	P0A9N4	39	NP_41542 2.1	40	n/a
PflB	Escherichia coli	piruvato formiato liase	P09373	41	NP_41542 3.1	42	n/a
AdhE	Escherichia coli	aldeidoálcool desidrogenase	P0A9Q7	43	NP_41575 7.1	44	NADH
Ac kA	Escherichia coli	acetato quinase	P0A6A3	45	NP_41679 9.1	46	n/a
Pta	Escherichia coli	fosfato acetiltransfe rase	P0A9M8	47	NP_41680 0.1	48	n/a
PoxB	Escherichia coli	piruvato oxidase	P07003	49	NP_41539 2.1	50	n/a
PykA	Escherichia coli	piruvato quinase II	P21599	51	NP_41636 8.1	52	n/a
PykF	Escherichia coli	piruvato quinase I	P0AD61	53	NP_41619 1.1	54	n/a
PpsA	Escherichia coli	fos foenol piruvato sintase	P23538	55	NP_41621 7.1	56	n/a
Lpd	Escherichia coli	lipoamida desidrogenase	P0A9P0	57	NP_41465 8.1	58	n/a
ArcA	Escherichia coli	regulador duplo transcriciona 1	P0A9Q1	59	NP_41881 8.1	60	n/a
Ndh	Escherichia coli	NADH desidrogenase	P00393	61	NP_41562 7.1	62	n/a
GapA	Escherichia coli	gliceraldeido 3-fos fato desidrogenase	P0A9B2	63	NP_41629 3.1	64	n/a
CscB	Escherichia coli	permease de sacarose	E0IXR1	65	WP_00119 7025.1	66	n/a
CscA	Escherichia coli	hidrolase de sacarose	E0IXQ9	67	WP_00019 4515.1	68	n/a
CscK	Escherichia coli	Frutoquinase	EOIXRO	69	WP_00127 4885.1	70	n/a
ScrA	Escherichia coli	Enzima II do fos foenol sistema de fosfotransfer ase dependente de piruvato	P08470	71	NG_03457 4.1	72	n/a
ScrK	Escherichia	Frutoquinase	P26984	73	NG_03446	74	n/a

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	coli	dependente de ATP			0.1
ScrB	Escherichia coli	6-fosfato de sacarose hidrolase	P37075	75	NG_03457 4.1	76	n/a
ScrY	Escherichia coli	porina de sacarose	P22340	77	NG_03447 2.1	78	n/a
Adh	Clostridium beijerincki i	Isopropanol desidrogenase dependente de NADP	P25984	79	GenBank: AF157307 .2	80	NAD PH
Adh	Thermoanaer obacter brockii	Isopropanol desidrogenase dependente de NADP	P14941	81	GenBank: X64841.1	82	NAD PH
Adhl	Entamoeba histolytica	Isopropanol desidrogenase dependente de NADP	P35630	83	GenBank: M8 8600.1	84	NAD PH
Gld2	Hypocrea j ecorina	Glicerol 2desidrogenase (NADP (+))	Q0GYU4	85	GenBank: DQ422038 .1	86	NAD PH
GldA* (D37G, P161S, L164A)	n/a	n/a	n/a	87	n/a	88	NAD PH
PntA	Escherichia coli	subunidade alfa da nucleotida transhidrogenase da nicotinamida	P07001	89	NP_41612 0.1	90	n/a
PntB	Escherichia coli	subunidade beta de transhidrogenase de nucleotideo de nicotinamida	P0AB67	91	NP_41611 9.1	92	n/a
Pgi	Escherichia coli	fosfoglicose isomerase	P0A6T1	93	NP_41844 9.1	94	n/a
PfkA	Escherichia coli	Fós forofrutoquinase	P0A796	95	NP_41835 1.1	96	n/a
Zwf	Escherichia coli	desidrogenase de glicose-6fos fato	P0AC53	97	NP_41636 6.1	98	n/a
YjeF	Escherichia coli	Desidratase dependente de ADP	P31806	99	NP_41858 8.1	100	n/a
GapN	Streptococc us mutans	Desidrogenase de gliceraldeido -3-fos fato dependente de NADP	Q59931	101	NP_72110 4.1	102	n/a

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Lpd*	n/a	Dependência de lipoamida desidrogenase dependente de NADP	n/a	103	n/a	104	n/a
YdjG* (D232E)	n/a	n/a	n/a	105	n/a	106	NAD PH
Adh3.2	Di ck eya zeae	Desidrogenase alcoólica do grupo III	R4Z7U3	107	GenBank: HF546062 .1	108	NAD PH
YdhF	Escherichia coli	Oxidorredutas e YdhF	P76187	109	WP_00025 0656.1	110	NAD PH
YeaE	Escherichia coli	Proteína não caracterizada YeaR	P76234	111	NP_41629 5.1	112	NAD PH
Gld2	Hypocrea j ecorina	Glicerol 2desidrogenase (NADP (+))	Q0GYU4	113	GenBank: DQ422038 .1	114	NAD PH
YiaY	Escherichia coli	Provável álcool desidrogenase	P37686	115	WP_00074 1518.1	116	NADH
BudC	Klebsiella pneumoniae	Redutase diacetil [ ( S) -acetoina formando]	Q48436	117	WP_00415 1179.1	118	NADH
YjgB* (I165V)	n/a	n/a	n/a	125	n/a	126	NAD PH
YjgB* (Q39R/ I165V/ A296V)	n/a	n/a	n/a	127	n/a	128	NAD PH

[00100] Como indicado acima, o microrganismo da invenção é útil para produzir 1,2-propanodiol, em particular (R)-l,2 propanodiol.

[00101] Por conseguinte, em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a um método para a produção fermentativa de 1,2-propanodiol, compreendendo as etapas de:

a) cultivar, sob condições fermentativas, um microrganismo geneticamente modificado para a produção de 1,2-propanodiol, em um meio de cultura compreendendo um carboidrato como fonte de carbono; e

b) recuperar 1,2-propanodiol do referido meio de cultura,

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44/64 [00102] em que o referido microrganismo superexpressa pelo menos um gene que codifica para uma metilglioxal redutase como descrito acima e converte eficientemente metilglioxal em hidroxiacetona.

[00103] A fonte de carbono pode ser preferencialmente reduzida pelo microrganismo de modo a proporcionar o metabolite intermediário metilglioxal.

[00104] Modalidades preferidas para o microrganismo e fonte de carbono descritas acima aplicam-se aqui mutatís mutandis.

[00105] De acordo com uma modalidade preferida, o método acima compreende ainda a etapa c) de purificação do 1,2propanodiol recuperado da etapa b) . Está dentro da habilidade do praticante purificar o produto desejado do meio de cultura, utilizando métodos convencionais na técnica, tais como os descritos nos pedidos de patentes WO 2011/076690 e WO 2012/130316, ambos aqui incorporados por referência.

DESENHOS [00106] Figura 1. Atividade especifica da Metilglioxal redutase (MGR) de cepas abrigando diferentes enzimas MGR e percentagens de expressão das enzimas MGR relacionadas nas cepas relacionadas.

EXEMPLOS [00107] Nas cepas de E. coli de produção de 1,2-propanodiol correntemente disponíveis, o metilglioxal é transformado em

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45/64 hidroxiacetona pela enzima metilglioxil redutase (MGR) YqhD* (G149E) . No entanto, o YqhD* (G149E) exibe uma baixa eficiência catalítica e deve ser altamente expresso de modo a permitir a produção de 1,2-propanodiol (representa até 40% do total de proteínas expressas na cepa). Este alto nível de expressão resulta em uma carga metabólica para o microrganismo e, portanto, gera um estresse na célula devido à privação de carbono e energia.

[00108] Além disso, mesmo se o nível de expressão de YqhD* (G149E) fosse empurrado para um nível de expressão mais elevado, a sua eficiência catalítica não seria suficiente para atingir um desempenho de produção de 1,2-propanodiol máximo. Assim, para aumentar a produção de 1,2-propanodiol, é necessário utilizar uma enzima metilglioxal redutase com maior eficiência catalítica que YqhD* (G149E). Para isso, várias enzimas candidatas, não conhecidas por reduzir o metilglioxal, foram avaliadas medindo suas eficiências catalíticas in vitro. As enzimas com melhor desempenho foram então testadas quanto à sua capacidade de desintoxicar o metilglioxal (MG) in vivo. As enzimas que exibem a maior resistência ao metilglioxal foram então introduzidas em uma cepa de E. coli de produção de 1,2-propanodiol.

MATERIAL E MÉTODOS:

[00109] Nos exemplos dados abaixo, foram utilizados métodos bem conhecidos na técnica para construir cepas de E.

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46/64 coli contendo vetores replicantes e/ou várias deleções cromossômicas e substituições utilizando recombinação homóloga bem descrita por Datsenko & Wanner, (2000) para Escherichia coli. Da mesma maneira, o uso de plasmideos ou vetores para expressar ou superexpressar um ou vários genes em um microrganismo recombinante são bem conhecidos pelo especialista na técnica. Exemplos de vetores de expressão de E. coli adequados incluem pTrc, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pREP4, PHS1, pHS2, pPLc236, etc. (Studier et al. , 1990. e Pouwels et al., 1985) .

[00110] Vários protocolos foram usados nos exemplos a seguir. Protocolo 1 (modificações cromossômicas por recombinação homóloga, seleção de recombinantes), protocolo 2 (a transdução do fago Pl) e protocolo 3 (excisão cassete de antibiótico, os genes de resistência foram removidos quando necessário) utilizado na presente invenção foram completamente descritos no pedido de patente EP 2532751, aqui incorporado por referência. As modificações cromossômicas foram verificadas por uma análise de PCR com oligonucleotideos apropriados que o indivíduo versado na técnica é capaz de projetar.

Protocolo 4: Construção de plasmideos recombinantes [00111] A tecnologia de DNA recombinante é descrita em Molecular Cloning: Sambrook and Russell (2001). Resumidamente, os fragmentos de DNA foram amplificados por

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PCR utilizando oligonucleotideos e DNA genômico apropriado como matriz (que o especialista na técnica será capaz de definir). Os fragmentos de DNA e o plasmideo escolhido foram digeridos com enzimas de restrição compatíveis, depois ligados e transformados em células competentes. Os transformantes foram analisados e os plasmídeos recombinantes de interesse foram verificados por sequenciação de DNA.

EXEMPLO 1: IDENTIFICAÇÃO DE ENZIMAS DE METILGLIOXAL REDUTASE NOVAS (MGR)

1.1 Determinação da atividade da metilglioxal redutase de várias enzimas candidatas

1.1.1. Construção das cepas 1 a 16 [00112] Para determinar os parâmetros cinéticos de várias enzimas aldeído redutase, as seguintes cepas foram construídas:

Tabela 2: cepas construídas e usadas para a determinação dos parâmetros cinéticos de 16 candidatos à enzima aldeído redutase.

Cepa	Enzima Metilglioxal redutase
Número	Nome	Uniprot Ref	Microrganismo de origem	sequência genética
1	YqhD	Q46856	E. coli	SEQ ID N° 14
2	YqhD*(G149E)	—	E. coli	SEQ ID N°

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				16
3	YafB	P30863	E. coli	SEQ ID N° 12
4	YhdN	P80874	Bacillus subtilis	SEQ ID N° 6
5	YahK	P75691	E. coli	SEQ ID N° 4
6	Gld	Q5FQJ0	Gluconobacter oxydans	SEQ ID N° 8
7	YdjG*(D232E)		E. coli	SEQ ID N° 106
8	Adh3.2	R4Z7U3	Dickeya zeae	SEQ ID N° 108
9	YdhF	P76187	E. coli	SEQ ID N° 110
10	YeaE	P76234	E. coli	SEQ ID N° 112
11	Gld2	Q0GYU74	Hypocrea jecorina	SEQ ID N° 114
12	YiaY	P37686	E. coli	SEQ ID N° 116
13	BudC	Q48436	Klebsiella pneumoniae	SEQ ID N° 118
14	GldA*(A160T)	-	E. coli	SEQ ID N° 24
15	YjgB	P27250	E. coli	SEQ ID N° 2
16	YjgB*(N240Y)		E. coli	SEQ ID N° 10
17	YjgB*(I165V)		E. coli	SEQ ID N° 126

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18

YjgB* (Q39R/I165V/A296V)

E. coli

SEQ ID N° 128

[00113] Os genes que codificam as diferentes enzimas putativas da metilglioxal redutase foram clonados no plasmideo de expressão pPAL7 (Biorad®) e os plasmideos obtidos foram transformados na cepa BL21(DE3)star, exceto para as cepas 2 e 7.

[00114] Para a cepa 2, o plasmideo foi clonado em uma cepa em BL21(DE3)star, deletado para yqhD obtido como se segue. O gene yqhD foi inativado na cepa MG1655 usando a estratégia de recombinação homóloga (de acordo com o Protocolo 1) . Oligonucleotideos para DyqhD: SEQ ID NO: 119 e 120, foram utilizados para amplificar por PCR o cassete de resistência. A cepa retida foi designada MG1655 DyqhD::Cm. Finalmente, a deleção DyqhD::Cm foi transferida por transdução de fago PI (de acordo com o Protocolo 2) na cepa BL21 (DE3) star e o plasmideo pPAL7-YqhD* (G149E) foi introduzido resultando na cepa 2.

[00115] Para a cepa 7, o plasmideo foi clonado em uma cepa BL21(DE3)star deletada para ydjG obtido como se segue. O gene ydjG foi inativado na cepa MG1655 usando a estratégia de recombinação homóloga (de acordo com o Protocolo 1) . Oligonucleotideos para DydjG: SEQ ID N° 121 e 122, foram utilizados para amplificar por PCR o cassete de resistência. A cepa retida foi designada MG1655 DydjG::Km. Finalmente, a

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50/64 deleção de DydjG::Km foi transferida por transdução de fago PI (de acordo com o Protocolo 2) na cepa BL21 (DE3) star e o plasmídeo pPAL7-ydjG * (D232E) foi introduzido resultando na cepa 7 .

[00116] A cepa 14, contendo a enzima GldA * (A160T) , foi a mesma que a cepa número 20 descrita no pedido de patente EP14305691, aqui incorporado por referência.

1.1.2. Superprodução de proteínas [00117] Culturas para a superprodução de proteínas foram realizadas em um frasco Erlenmeyer de 2 L, utilizando caldo LB (Bertani, 1951) que foi suplementado com 2,5 g/1 de glicose e 100 mg/L de ampicilina. Utilizou-se uma pré-cultura durante a noite para inocular uma cultura de 500 mL a uma ODgoonm de cerca de 0,15. Esta pré-cultura foi realizada em um frasco de Erlenmeyer de 500 mL preenchido com 50 mL de caldo LB que foi suplementado com 2,5 g/L de glicose e 100 mg/L de ampicilina. A cultura foi primeiro mantida em um agitador a 37 °C e 200 rpm até que a ODgoonm fosse cerca de 0,5 e depois a cultura foi movida em um segundo agitador a 25 °C e 200 rpm até que a OD6oonm fosse 0,6 - 0,8 (cerca de uma hora), antes da indução com 500 μΜ de IPTG. A cultura foi mantida a 25 °C e 200 rpm até que a OD6oonm estivesse por volta de 4 e depois foi parada. As células foram centrifugadas a 7000 rpm, 5 minutos a 4 °C e, depois, armazenadas a -20 °C.

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1.1.3. Purificação de proteínas

Etapa 1: Preparação de extratos sem células.

[00118] Cerca de 400 mg de biomassa de E. coli foram suspensos em 60 ml de fosfato de potássio 100 mM pH 7,6, e em um cocktail inibidor de protease. A suspensão celular (15 mL por tubo cônico) foi sonicada em gelo (Bandelin sonoplus, 7 0 W) em um tubo cônico de 50 mL durante 8 ciclos de 30 segundos com intervalos de 30 segundos. Após sonicação, as células foram incubadas durante 30 min à temperatura ambiente com 5 mM de MgCU e lUI/mL de DNasel. Os detritos de células foram removidos por centrifugação a 12000 g durante 30 min a 4 °C.

Etapa 2: purificação por afinidade [00119] Com exceção da cepa 14, as proteínas foram purificadas a partir do extrato celular bruto por afinidade em coluna Profinity (BIORAD, cartucho exato de Mini Profinity Bio-Scale 5 ml) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O extrato bruto foi carregado em um cartucho Profinity exact de 5 ml, equilibrado com fosfato de potássio 100 mM, pH 7,6. A coluna foi lavada com 10 volumes de coluna do mesmo tampão e incubada 30 min com fosfato de potássio 100 mM pH 7,6, fluoreto 100 mM à temperatura ambiente. A proteína foi eluída da coluna com 2 volumes de coluna de 100 mM de fosfato de potássio pH 7,6. A marcação permaneceu firmemente ligada à resina e a proteína purificada foi

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52/64 liberada. As frações contendo a proteína foram reunidas, concentradas e carregadas em uma coluna de filtração em gel (coluna Superdex 200 10/300 GL, GE Healthcare) equilibrada com diferentes tampões de armazenamento (Tabela 3) . A concentração de proteína foi medida usando o ensaio de proteína de Bradford.

[00120] Para a cepa 14, o protocolo de purificação foi previamente descrito no pedido de patente WO 2015/173247, aqui incorporado por referência.

Tabela 3: Tampão de armazenamento de proteína

Enzima	Tampão de armazenamento
YqhD	50mM Hepes pH7.5
YqhD*(G149E)	50mM Hepes pH7.5
YafB	1M Tris-HCl pH7 150mM NaCl
YeaE	50mM Hepes pH7.5
YdhF	50mM Hepes pH 7.5
YhdN	Fosfato de potássio 100 mM pH7,6
Gld2	lOOmM MES pH6.5
YahK	Fosfato de potássio 100 mM pH 7,6 NaCl 150 mM
Gld	50mM Hepes pH 7.5
YdjG*(D232E)	Fosfato de potássio 100 mM pH7,6
Adh3.2	Fosfato de potássio 100 mM pH 7,6 NaCl 150 mM
YiaY	Fosfato de potássio 100 mM pH 7,6 NaCl 150 mM
BudC	Fosfato de potássio 100 mM pH 7,6 NaCl 150 mM
GldA*(A160T)	100 mM MES pH6.5
YjgB	Fosfato de potássio 100 mM pH 7,6 NaCl 150 mM
YjgB*(N240Y)	Fosfato de potássio 100 mM pH 7,6 NaCl 150 mM

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53/64

YjgB*(I165V)	Fosfato de potássio 100 mM pH 7,6 NaCl 150 mM
YjgB* (Q39R/I165V/A296V)	Fosfato de potássio 100 mM pH 7,6 NaCl 150 mM

1.1.4. Determinação de parâmetros cinéticos de enzimas putativas de metilglioxal redutase purificadas [00121] A atividade da metilglioxal redutase (MGR) foi determinada medindo o consumo de NAD(P)H a 340 nm em um espectrofotômetro a 30 °C (À340 = 6290 cnr¹) . A mistura reacional (1 mL) contendo tampão de ensaio e enzima purificada foi incubada durante 5 min a 30 °C. Em seguida, foi adicionado metilglioxal 0,1-40 mM para iniciar a reação. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima que catalisa a diminuição de 1 pmol de NAD(P)H por min. Parâmetros cinéticos foram determinados com Sigmaplot. Os parâmetros cinéticos das enzimas purificadas são fornecidos na Tabela 4.

1.1.5. Determinação do produto de reação [00122] O produto de reação pelas diferentes enzimas putativas de metilglioxal (MG) foi medido por GC-MS (Agilent Technologies) para a Hidroxiacetona (HA) e por UHPLC-MS/MS para o Lactaldeido (LA) após reação com metilbenzotiazolinona-2-hidrazona (MBTH) e FeCls. A mistura reacional (1 mL) contendo tampão de ensaio, metilglioxal 10 mM, NADPH 5 mM e 5-10 pg de enzima purificada foi incubada durante 30 min a 30 °C. 1 μΐ do produto de reação foi

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54/64 injetado. Uma mistura de reação sem MG foi preparada como um controle. 0 produto de reação das enzimas purificadas é fornecido na Tabela 4.

Tabela 4: Parâmetros cinéticos e produto de reação de enzimas purificadas

Enzima	Tampão de ensaio	Cofator	Km mM	kcat/ΚΠΙ	Produtos de Reação
YqhD	20mM Hepes (pH7,5) 0,ImM ZnSO4	NADPH	2,09	0,40	HA
YqhD* (G149E)	20mM Hepes (pH7,5) 0,ImM ZnSO4	NADPH	2,92	0,80	HA
YafB	20mM Hepes (pH7,5)	NADPH	8,20	2,06	HA
YeaE	20mM Hepes (pH7,5)	NADPH	1,59	0,91	ND
YdhF	20mM Hepes (pH7,5)	NADPH	21,8	0,35	HA
YhdN	20mM Hepes (pH7,5) 0,ImM ZnSO4	NADPH	0,64	5,92	HA
Gld2	Fosfato de sódio 10 mM (pH 7)	NADPH	7,7	11,1	LA
YahK	20mM Hepes (pH7,5)	NADPH	1,41	8,3	HA
Gld	20mM Hepes (pH7,5)	NADPH	1,10	8,74	HA
YdjG* (D232E)	20mM Hepes (pH7,5)	NADPH	3,25	0,01	HA
Adh3,2	20mM Hepes (pH7,5)	NADPH	6, 7	0,17	HA
YiaY	20mM Hepes (pH7,5) 0,ImM FeSO4	NADH	2,84	0,34	HA
BudC	50 mM Imidazole (pH7)	NADH	74,8	4,2	ND
GldA* (A160T)	100 mM de MES-KOH (pH 6,5) FeSO4 0,1 mM Sulfato de amônio 30 mM	NADH	3,17	7,8	LA
YjgB	40mM Hepes (pH7,5)	NADPH	10,6	51,6	HA
YjgB* (N240Y)	40mM Hepes (pH7,5)	NADPH	1,6	40,4	ND
YjgB*(11 65V)	40mM Hepes (pH7,5)	NADPH	5,5	57,02	ND
YjgB* (Q39R/I1	40mM Hepes (pH7,5)	NADPH	0,88	39,9	ND

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65V/A2 9 6 V)

HA: Hidroxiacetona , LA: Lactaldeldo, ND: Não determinado [00123] Cinco enzimas produtoras de hidroxiacetona e tendo uma eficiência catalítica pelo menos duas vezes maior que a de YqhD* (G149E) (enzima mutante que por si só tem uma eficiência catalítica duas vezes maior que a enzima YqhD nativa) foram selecionadas para posterior caracterização e triagem: Gld, YhdN, YafB, Yahk e YjgB.

1.2. Seleção das melhores enzimas metilglioxal redutase

1.2.1. Construção das cepas 17 a 23 [00124] As enzimas MGR selecionadas foram subsequentemente rastreadas por clonagem dos genes correspondentes na cepa de E. coli modificada 15: MG1655 DgloA Dedd DpflAB DldhA DadhE DgldA DyqhD construída como se segue. Para inativar a glioxalase I codificada por gloA, o fosfogluconato desidratase codificado por edd, a enzima ativadora de piruvato formiato liase e o piruvato formiato liase codificado por pflA e pflB respectivamente, a lactato desidrogenase codificada por IdhA e a álcool desidrogenase codificada por adhE, as deleções DgloA, Dedd, DpflAB, DldhA e DadhE descritas no pedido de patente WO 2008/116852 (aqui incorporado por referência) foram transferidas por fago PI (de acordo com o Protocolo 2) para a cepa MG1655 e os genes

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56/64 de resistência foram removidos de acordo com o protocolo 3. Para inativar a glicerol desidrogenase codificada por gldA, a deleção de DgldA descrita no pedido de patente WO 2015/173247 (aqui incorporado por referência) foi transferida por fago PI (de acordo com o Protocolo 2) para a cepa anterior. Finalmente, para inativar a aldeido redutase codificada por yqhD, a deleção DyqhD::Cm descrita acima foi transferida por transdução de fago PI (de acordo com o Protocolo 2) para a cepa anterior, resultando na cepa 17.

[00125] Em seguida, os genes descritos na Tabela 5 abaixo foram expressos sob RBS definido no plasmideo pME101VB06 descrito no pedido de patente EP 2532751 (aqui incorporado por referência), e cada plasmideo foi introduzido na cepa 17 resultando nas cepas 18 a 23.

Tabela 5: descrição das cepas de metilglioxal redutase de 18 a 23

Cepa	Enzima
18	Gld
19	YhdN
20	YafB
21	YqhD*(G149E)
22	YahK
23	YjgB

1.2.2. Ensaio da metilglioxal redutase no extrato bruto [00126] A atividade da metilglioxal redutase (MGR) foi determinada medindo o consumo de NAD(P)H a 340 nm em um

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57/64 espectrofotômetro a 30 °C (À340 = 6290 M^cnr¹) . A mistura reacional (1 mL) contendo tampão de ensaio e extrato em bruto foi incubada durante 5 min a 30 °C. Em seguida, adicionouse metilglioxal 10 mM para iniciar a reação. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima que catalisa a diminuição de 1 pmol de NAD(P)H por min. A atividade enzimática específica foi expressa como unidades de atividade enzimática por mg de proteína. O valor de atividade determinado sem substrato no ensaio foi subtraído.

1.2.3. Determinação do nível de expressão das enzimas metilglioxal redutase [00127] Em paralelo a atividade específica em todas as cepas, o nível de expressão dos diferentes MGR foi quantificado por análise SDS-PAGE. Uma mesma quantidade de extrato bruto foi carregada em SDS-PAGE e o nível de expressão foi determinado como a razão do volume da banda do MGR em relação ao volume total da pista, utilizando o Software BioRad Image Lab ™.

[00128] As atividades específicas dessas diferentes enzimas foram muito diferentes e não direcionadas em relação ao nível de expressão. Por exemplo, a cepa 21 apresenta uma expressão elevada com uma atividade específica baixa enquanto a cepa 22 mostra um nível de expressão 5 vezes inferior, mas uma atividade específica 4 vezes maior (Figura D .

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1.2.4. Triagem em metilglioxal (MG) [00129] Uma vez que a atividade in vitro pode não refletir a atividade real in vivo, as cepas 17 a 23 foram testadas quanto à sua resistência a MG em placas de ágar LB. As cepas foram cultivadas a 37 °C em meio LB rico suplementado com 50 pg/mL de espectinomicina, até um OD600 nm de cerca de 1. Então 100 pL de diluições 0, IO^-1 ou 10~² foram plaqueadas em placas LB agar suplementadas com 50 pg/mL de espectinomicina e 0, 2, 3 ou 4 mM de MG. As placas foram incubadas a 37 °C durante 48 horas.

[00130] A Tabela 6 abaixo indica a menor diluição e a maior concentração de MG na qual alguns clones cresceram, o que deu uma indicação do nível de resistência da cepa (quanto maior a concentração de MG e a menor diluição para uma dada concentração, maior a resistência).

Tabela 6: triagem no metilglioxal das cepas 17 a 23

Cepa	17	18	19	20	21	22	23
MGR	X	Gld	YhdN	YafB	YqhD*	YahK	YjgB
mM MG	0	2	2	3	2	3	3
Diluição	10-2	IO-2	IO-2	ίο-1	IO-2	IO-2	IO-2
Nível de resistência	—	+	+	++	+	+++	+++

sem resistência; +: resistência média; ++: alta resistência; +++: resistência muito alta [00131] As enzimas YahK e YjgB, permitindo a melhor resistência a MG, essas enzimas candidatas MGR foram retidas para substituir YqhD* (G149E) nas cepas produtoras de MPG.

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59/64 perito praticante compreendería, contudo, prontamente que as enzimas Gld, YafB e YhdN, também seriam adequadas para substituir YqhD* (G149E) nas referidas cepas produtoras de MPG.

EXEMPLO 2: Produção de 1,2-propanodiol com o novo metilglioxal redutase (MGR) enzimas de acordo com a invenção

2.1. Construção das cepas 24 a 26 [00132] Para inativar o gene ptsG, utilizou-se a estratégia de recombinação homóloga (conforme protocolo 1). Os oligonucleotídeos para DptsG: SEQ ID NO: 123 e 124, foram utilizados para amplificar por PCR o cassete de resistência. A cepa retida foi designada MG1655 DptsG::Km. A deleção de DptsG: :Km foi transferida por transdução de fago PI (de acordo com o Protocolo 2) para a cepa 5 de produção de E. coli MPG descrita no pedido de patente WO 2015/173247 (aqui incorporado por referência), originando a cepa 24. Depois disso, yahK e yjgB foram superexpressos cromossomicamente sob o promotor Ptrc e sob RBS definido e ou a construção foi transferida por fago PI (de acordo com o Protocolo 2) para a cepa 24 modificada adicionalmente por deleção de yqhD como descrito no Exemplo 1, dando origem à cepa 25 para YahK e cepa 26 para YjgB.

2.2. Avaliação de cepas de produção de MPG [00133] As cepas de produção de 1,2-propanodiol foram cultivadas em frascos de agitação (como descrito no pedido

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60/64 de patente EP 2532751, aqui incorporado por referência, exceto que glicose e xilose foram utilizadas como carboidrato e 40 gL-1 de MOPS no meio de modo a manter um pH acima de 6,0 ao longo do curso de fermentação) e em fermentadores de 2 L como segue:

[00134] Os inóculos foram obtidos após 24 horas de préculturas realizadas em frascos com defletores contendo 50 mL de meio mínimo (Ml) completado com 10% de meio LB (p/p) a 37 °C.

[00135] Posteriormente, fermentadores de 2,5 L (Pierre Guerin) foram preenchidos com 700 mL de meio mínimo (M2) e inoculados a uma concentração de biomassa de 0,2 g.L^-1 com um volume de pré-cultura variando entre 55 a 80 mL. Para a cepa 26, adicionou-se zinco ao meio de lote a uma concentração final de 4 mg.L^-1.

[00136] A temperatura da cultura foi mantida constante a °C e o pH foi mantido ao valor de trabalho (6,8) pela adição automática de solução de NH4OH (10%) . A taxa de agitação inicial foi fixada em 200 RPM e a taxa de fluxo de ar inicial foi fixada em 40 NL.tr¹. A concentração de oxigênio dissolvido foi mantida em valores entre 20 e 40%, preferencialmente 30% de saturação, aumentando a agitação e, se necessário, aumentando a aeração. Quando necessário, os antibióticos foram adicionados a uma concentração de 50 mg.L~ ¹ para a espectinomicina.

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61/64 [00137] O meio de alimentação do lote foi composto de açúcares (glicose/xilose; proporção 2: 1) e a taxa de alimentação foi ajustada automaticamente para manter uma concentração de açúcar de 30 g.lc¹ no caldo de fermentação, medindo a produção de CO2.

[00138] As culturas foram interrompidas após 54 horas.

Tabela 7: Composição dos meios Ml e M2

Componente	Ml Concentração (g/1)	M2 Concentração (g/1)
Glicose	20,00	21,0
Xilose	0, 00	9, 0
(NH4)2SO4	4, 88	4, 88
Ácido cítrico, H2O	1,70	0, 00
KH2PO4	l, 65	6,76
MgSO4, 7H2O	l, 00	l, 80
K2HPO4, 3H2O	0, 92	0, 00
(NH4) 2hpo4	0, 40	0, 00
Citrato de Fe (III), H2O	0,1064	0,0000
FeSO4, 7H2O	0,0000	0,1000
CaCl2, 2H2O	0, 08	0, 08
MnCl2, 4H2O	0,0150	0,0000
Zn(CH3COO)2, 2H2O	0,0130	0,0000
Tiamina, HC1	0,0100	0,0140
EDTA, 2Na, 2H2O	0,0084	0,0000
H3BO3	0,0030	0,0000
CoCl2, 6H2O	0,0025	0,0036
Na2Mo04, 2H2O	0,0025	0,0000
CuC12, 2H2O	0,0015	0,0000

[00139] O 1,2-propanodiol (PG) e a sua precursora hidroxiacetona (HA) foram quantificados por HPLC-RID com coluna Biorad HPX-87H.

[00140] Nos frascos de agitação, as cepas de produção com superexpressão de yahK ou yjgB produziram mais PG + HA em

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62/64 grama por grama de biomassa do que a cepa com superexpressão de yqhD* (G149E). Em fermentadores de 2 L, apenas a cepa com superexpressão de yjgB foi melhor.

Tabela 8: Rendimento de PG + HA para cepas produtoras de PG em grama PG + HA por grama de biomassa.

	Cepa 24	Cepa 25	Cepa 26
Frascos de agitação	1, 88	2,15	2,14
Fermentadores de 2 L	3,25	3,63	5,42

[00141] O comportamento da cepa 25 em fermentadores de 2L foi atribuído à inibição de YahK por HA.

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Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para a conversão fermentativa de metilglioxal em hidroxiacetona caracterizado pelo fato de compreender a etapa de expressar, em um microrganismo, pelo menos uma metilglioxal redutase tendo uma eficiência catalítica k_cat/Km igual ou superior a 5 mM^s¹ em que a referida metilglioxal redutase é selecionada do grupo que consiste na enzima YjgB da sequência SEQ ID NO: 1 e seus mutantes, em que o mutante de YjgB é preferencialmente selecionado de YjgB* (N240Y) da sequência SEQ ID NO: 9, YjgB*(I165V) da SEQ ID NO: 125 e YjgB*(Q39R/I165V/A296V) da sequência SEQ ID NO: 127.
2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida metilglioxal redutase é a enzima YjgB da sequência SEQ ID NO: 1.
3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a enzima YjgB é expressa em combinação com a enzima YahK da sequência SEQ ID NO: 3, a enzima YhdN da sequência SEQ ID NO: 5, a enzima Gld da sequência SEQ ID NO: 7, a enzima YafB de sequência SEQ ID NO: 11 ou as enzimas yqhD de sequência SEQ ID NO: 13.
4. 4. Método para a produção fermentativa de 1,2propanodiol caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:

   a) cultivar, em condições de fermentação, um microrganismo geneticamente modificado para a produção de

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   2/5

   1,2-propanodiol, em um meio de cultura compreendendo um carboidrato como fonte de carbono; e

   b) recuperar 1,2-propanodiol do referido meio de cultura, em que o referido microrganismo superexpressa pelo menos um gene que codifica para uma metilglioxal redutase, tal como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, e converte metilglioxal em hidroxiacetona.
5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a etapa c) de purificação do 1,2-propanodiol recuperado da etapa b).
6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o referido microrganismo compreende ainda a deleção do gene yqhD ou yqhD* que codifica a metilglioxal redutase da sequência SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15.
7. 7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 6, caracterizado pelo fato de que o referido microrganismo superexpressa o gene gldA que codifica a glicerol desidrogenase dependente de NADH da sequência SEQ ID NO: 21, ou um mutante da mesma codificando uma glicerol desidrogenase dependente de NADH de sequência SEQ ID NO: 23.
8. 8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 6, caracterizado pelo fato de que o referido microrganismo superexpressa pelo menos um gene que codifica uma acetol redutase dependente de NADPH, a referida acetol

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   3/5 redutase dependente de NADPH tendo pelo menos 60% de identidade de aminoácido com qualquer uma das sequências ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, e SEQ ID NO: 5.
9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o referido microrganismo compreende ainda a deleção do gene gldA ou gldA* que codifica a glicerol desidrogenase dependente de NADH da sequência SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23, e/ou superexpressa um mutante dos mesmos codificando uma glicerol desidrogenase dependente de NADPH.
10. 10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 9, caracterizado pelo fato de que o referido microrganismo compreende ainda pelo menos uma das seguintes modificações genéticas:

    - a superexpressão do gene operon pntAB codificando para a transhidrogenase nucleotideo nicotinamida das

    sequências SEQ ID NO: 89 e SEQ ID NO : 91, a atenuação do gene pgi que codifica para a fosfoglicose isomeras e de sequência SEQ ID NO: 93, a atenuação do gene pfkA que codifica para a

    fosfofrutoquinase de sequência SEQ ID NO: 95, a superexpressão do gene zwf que codifica a desidrogenase glicose-6-fosfato da sequência SEQ ID NO: 97,

    - a superexpressão do gene yjeF que codifica para a

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    4/5 desidratase dependente de ADP de sequência SEQ ID NO: 99,

    - a superexpressão do gene gapN que codifica para a gliceraldeido-3-fosfato desidrogenasse dependente de NADP da sequência SEQ ID NO: 101,

    - a superexpressão de urn gene Ipd* mutante que codifica a lipoamida desidrogenasse dependente de NADP da sequência SEQ ID NO: 103 e

    - combinações dos mesmos.
11. 11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 10, caracterizado pelo fato de que ο referido microrganismo compreende ainda a deleção do gene gloA que codifica a glioxalase I da sequência SEQ ID NO: 31.
12. 12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 11, caracterizado pelo fato de que o referido microrganismo é selecionado entre Enterobacteriaceae , Clostridiaceae , Bacillaceae, Streptomycetaceae, Corynebacteriaceae e Saccharomycetaceae.
13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido microrganismo é selecionado dentre o grupo que consiste em Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Clostridium sphenoides, Corynebacterium glutamicum e Saccharomyces cerevisiae.
14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é Escherichia

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    5/5 coli .
15. 15. Microrganismo geneticamente modificado para a produção de 1,2-propanodiol caracterizado pelo fato de que o referido microrganismo é como definido na reivindicação 4 ou qualquer uma das reivindicações de 6 a 14.