JP5420798B2 - スクロースから1,3−プロパンジオールを調製する方法 - Google Patents
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Description
・2−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素により、4−ヒドロキシ−2−ケトブチレートを脱炭酸する第1段階、およびヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素により、得られた3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを還元する第2段階を含んでなる、1,3−プロパンジオールの生産のための二段階代謝経路と、
・該微生物が、唯一の炭素源としてスクロースを利用できるようにする遺伝子と
を含んでなる、微生物に関する。
・スクロースを含んでなる適当な培養培地において、本発明による微生物を培養する工程および
・該培養培地から1,3−プロパンジオールを回収する工程
を含んでなる、方法に関する。
グルコースおよびスクロースでの1,3−プロパンジオール生産の最大収率の計算
1.1 − シミュレーションに用いたパラメーター
シミュレーションは、METEX社製プロプライエタリソフトウェアMETOPT(商標)を用いて行った。大腸菌(E. coli)の簡易代謝ネットワークを、中央代謝ネットワーク、総てのバイオマス前駆体の代謝経路および上に記載した特定生産経路を含めて用いた。大腸菌用の古典的バイオマス組成を用いた。グルコースまたはスクロース炭素源のいずれかを用いてシミュレーションを行った。スクロース利用については、PTS系および非PTS系の両方をモデル化した。計算した最大収率には差がなかったため、スクロースでの収率は1つだけを報告する。増殖速度、0.1h−1および維持エネルギー、5mmolATP.gDW −1.h−1を考慮して、実際の最大収率の計算を行った。総てのシミュレーションを、グルコース取り込み速度、3mmol.gDW −1.h−1により行った。シミュレーションは好気性条件下で行った。
大腸菌(Escherichia coli)の遺伝子serCによりコードされるL−ホモセリントランスアミナーゼ活性の実証
2.1 − SerCの特性評価のための株の構築:BL21(pPAL7−serC)
SerCタンパク質を特性評価するために、発現ベクターpPAL7(バイオラド社製)から対応する遺伝子を発現させた。
・遺伝子serCの配列(956876〜956904)(ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列)と相同な領域(太字の文字)、
・HindIII制限部位を有する領域(下線の文字)
を有する、
・遺伝子serC領域の配列(957964〜957937)(ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列)と相同な領域(太字の文字)、
・EcoRI制限部位を担持する領域(下線の文字)
を有する、
タンパク質SerCの過剰生産を、2lエルレンマイヤーフラスコで、2.5g/lのグルコースおよび100mg/lのアンピシリンを添加したLB培養液(Bertani, 1951, J. Bacteriol. 62:293-300)を用いて行った。2.5g/lのグルコースおよび100mg/lのアンピシリンを添加した50mlのLB培養液を充填した500mlエルレンマイヤーフラスコで前培養物を一晩増殖させた。この前培養物を用いて、OD600nmが約0.15となるように500mlの培養物に植菌した。培養物をまず、37℃および200rpmで増殖させ、OD600nmが約0.5になったら、25℃および200rpmに変え、OD600nmが0.6〜0.8になるまで(約1時間)増殖させ、その後、500μM IPTGでの誘導を行った。培養は、25℃および200rpmで維持し、OD600nmがおよそ4になったら、停止させた。細胞を、4℃、7000rpmで5分間遠心分離し、その後、−20℃で保存した。
2.3.1 − ステップ1:無細胞抽出物の調製
約280mgの大腸菌(E. coli)バイオマスを45mlの100mMリン酸カリウム pH7.6およびプロテアーゼ阻害剤カクテルに懸濁させた。細胞懸濁液を50mlコニカルチューブに入れ(各コニカルチューブに15ml)氷上で30秒間8サイクル(30秒間隔)の音波処理を施した(Bandelin社製sonoplus、70W)。音波処理の後、細胞を5mM MgCl2および1UI/mlのDNアーゼIとともに室温で30分間インキュベートした。細胞残渣を4℃、12,000gで30分間の遠心分離により除去した。
Profinityカラム(バイオラド社製、Bio−Scale Mini Profinity exactカートリッジ 5ml)において、製造業者推奨のプロトコールに従い、親和性により粗細胞抽出物からタンパク質を精製した。100mMリン酸カリウム pH7.6で平衡化した5ml Profinity exactカートリッジに粗抽出物をロードした。カラムを同じバッファーの10カラム容量で洗浄し、100mMリン酸カリウム pH7.6、100mMフッ化物とともに室温で30分インキュベートした。100mMリン酸カリウム pH7.6の2カラム容量でカラムからタンパク質を溶出した。タグは樹脂としっかりと結合したまま保持され、精製タンパク質は放出された。精製タンパク質を含む画分をプールし、100mM Tris HCl、150mM NaClおよび10%グリセロール pH8に対して透析した。
L−ホモセリントランスアミナーゼ活性を、共役酵素アッセイを用いて30℃で測定した。L−ホモセリントランスアミナーゼ活性アッセイは、420mMリン酸カリウムバッファー pH8.2、2mMアセチルピリジンアデニンジヌクレオチド、3mM L−ホモセリン、20単位/mlのウシ肝臓由来グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、1mM α−ケトグルタル酸(中性化)および約50μgの粗抽出物を総量1mlで用いて実施した。アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドの消費を、分光光度計により375nmでモニタリングした。基質を含めたアッセイで検出された活性から、基質(L−ホモセリン)を含めていない対照アッセイで検出された活性を差し引いた。L−ホモセリントランスアミナーゼ活性の1単位は、30℃で1分間当たりに1μmolのL−ホモセリンのアミノ基転移を触媒するのに必要な酵素の量である。(ε 375nm=6100M−1 cm−1)
ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)の遺伝子kivDによりコードされる4−ヒドロキシ−2−ケトブチレートデカルボキシラーゼ活性の実証
3.1 − KivDの特性評価のための株の構築:BL21(pPAL7−kivDll)
KivDタンパク質を特性評価するために、発現ベクターpPAL7(バイオラド社製)から対応する遺伝子を発現させた。
・ラクトコッカス・ラクチスkivD遺伝子の合成遺伝子の配列と相同な領域(斜体の文字)、
・精製に有利に働く短いN末端アミノ酸伸長を有するタグフリータンパク質を生成するのに必要なヌクレオチドを有する領域(太字の文字)
・HindIII制限部位を有する領域(下線の文字)
を有する、
タンパク質kivDの過剰生産を、実施例2.2と同じプロトコールを適用して行った。
3.3.1 − ステップ1:無細胞抽出物の調製
約188mgの大腸菌(E. coli)バイオマスを30mlの100mMリン酸カリウム pH7.6およびプロテアーゼ阻害剤カクテルに懸濁させた。細胞懸濁液を50mlコニカルチューブに入れ(各コニカルチューブに15ml)氷上で30秒間8サイクル(30秒間隔)の音波処理を施した(Bandelin社製sonoplus、70W)。音波処理の後、細胞を5mM MgCl2および1UI/mlのDNアーゼIとともに室温で30分間インキュベートした。細胞残渣を4℃、12,000gで30分間の遠心分離により除去した。
Profinityカラム(バイオラド社製、Bio−Scale Mini Profinity exactカートリッジ 5ml)において、製造業者推奨のプロトコールに従い、親和性により粗細胞抽出物からタンパク質を精製した。100mMリン酸カリウム pH7.6で平衡化した5ml Profinity exactカートリッジに粗抽出物をロードした。カラムを同じバッファーの10カラム容量で洗浄し、100mMリン酸カリウム pH7.6、100mMフッ化物とともに4℃で一晩インキュベートした。100mMリン酸カリウム pH7.6の2カラム容量でカラムからタンパク質を溶出した。タグは樹脂としっかりと結合したまま保持され、精製タンパク質は放出された。精製タンパク質を含む画分をプールし、100mMリン酸カリウム、150mM NaClおよび10%グリセロール pH8に対して透析した。
3.4.1 − 4−ヒドロキシ−2−ケト酪酸の化学合成
4−ヒドロキシ−2−ケト酪酸の化学合成は、次の刊行物に記載されている:
R S Lane ;EE Dekker ; (1969).2-keto-4-hydroxybutyrate. Synthesis, chemical properties, and as a substrate for lactate dehydrogenase of rabbit muscle Biochemistry., 8 (7), 2958-2966。
4−ヒドロキシ−2−ケトブチレートの脱炭酸を、共役酵素アッセイを用いて30℃で測定した。4−ヒドロキシ−2−ケトブチレートデカルボキシラーゼ活性アッセイは、50mMリン酸カリウムバッファー pH6、0.2mM NADH、1mM MgSO4、0.5mMチアミン二リン酸、72単位/mlのサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来アルコールデヒドロゲナーゼ、10mM 4−ヒドロキシ−2−ケト酪酸(中性化)および約40μgの精製タンパク質を総量1mlで用いて実施した。NADHの消費を、分光光度計により340nmでモニタリングした。基質を含めたアッセイで検出された活性から、基質を含めていない対照アッセイで検出された活性を差し引いた。4−ヒドロキシ−2−ケトブチレートデカルボキシラーゼ活性の1単位は、30℃で1分間当たりに1μmolの4−ヒドロキシ−2−ケト酪酸の脱炭酸を触媒するのに必要な酵素の量である。(ε 340nm=6290M−1 cm−1)。
大腸菌(Escherichia coli)の遺伝子yqhDによりコードされる3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドレダクターゼ活性の実証
4.1 − YqhDの特性評価のための株の構築:MG1655 ΔyqhD::Km(pTRC99A−yqhD)
4.1.1 − MG1655 ΔyqhD::Km株の構築
yqhD遺伝子を欠失させるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することを可能とする。この目的で、下記のオリゴヌクレオチドを用いた:
以下の領域:
・yqhD領域の配列(3153377〜3153456)(ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列)と相同な領域(小文字)、
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域(大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)、
を有する、
以下の領域:
・yqhD領域の配列(3154540〜3154460)(ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列)と相同な領域(大文字)、
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域(大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
を有する、
YqhDタンパク質を特性評価するために、ベクターpTRC99A(アマシャム社製)から対応する遺伝子を発現させた。
・遺伝子yqhDの配列(3153377〜3153408)(ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列)と相同な領域(下線の文字)、
・BspHI制限部位(太字の文字)
を有する、
以下の領域:
・遺伝子yqhDの配列(3154540〜3154483)(ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列)と相同な領域(下線の文字)、
・HindIII制限部位(太字の文字)
を有する、
タンパク質YqhDを、2.5g/lのグルコースおよび50mg/lのアンピシリンおよび50mg/lのカナマイシンを含有するLB培地500mlの入った2lバッフル付エルレンマイヤーフラスコで、好気性条件下、37℃で過剰生産した。フラスコをオービタルシェーカー上で200rpmにて撹拌した。550nmで測定した光学濃度が0.5単位に達したら、フラスコを25℃でインキュベートした。光学濃度が1.2単位に達したら、IPTGを終濃度500μMまで添加することによりYqhDタンパク質の生産を誘導した。培養物が3.5単位を上回る光学濃度に達したら、バイオマスを遠心分離により回収した。上清を廃棄し、使用するまでペレットを−20℃で保存した。
4.3.1 − ステップ1:無細胞抽出物の調製
400mgの大腸菌(E. coli)バイオマスを70mlの50mM Hepes pH7.5およびプロテアーゼ阻害剤カクテルに懸濁させた。細胞をロゼットセル(Rosett cell)RZ3に入れ、氷上で30秒間8サイクル(30秒間隔)の音波処理を施した(Branson社製sonifier、70W)。音波処理の後、細胞を1mM MgCl2および1UI/mlのDNアーゼIとともに室温で1時間インキュベートした。細胞残渣を4℃、12,000gで30分間の遠心分離により除去した。上清を粗抽出物として取っておいた。
粗抽出物を50%硫酸アンモニウムの濃度で沈殿させた:粗抽出物に氷上で固体硫酸アンモニウム(300g/l)を加えた。4℃での15分のインキュベーション後に、混合物を4℃、12,000gで15分間遠心分離した。上清を廃棄し、沈殿物を50mM Hepes pH7.5、1M硫酸アンモニウム50mlに溶解させた。
Akta Purifier(GEヘルスケア社製)を使用し、前のステップのタンパク質抽出物を、同じバッファーで平衡化した5ml HiTrap PhenylHPカラム(GEヘルスケア社製)にロードした。カラムを同じバッファーの10カラム容量で洗浄した。二段階勾配(10カラム容量の1M〜0.5M硫酸アンモニウム勾配および20カラム容量の0.5M〜0M硫酸アンモニウム勾配)を用いてタンパク質を溶出した。溶出後、50mM Hepes pH7.5の10カラム容量でカラムを洗浄した。カラムの流速は2.5ml/分であり、2.5mlの画分を集めた。タンパク質を含む画分をプールし、50mM Hepes pH7.5中で透析し、1.14μg/μlの濃度まで濃縮した。
3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドレダクターゼ活性を、分光光度計により波長340nmおよび一定温度37℃でNADPH酸化の初速度を測定することによりアッセイした。20mM Hepes pH7.5、0.1mM硫酸亜鉛、0.2mM NADPH、6μgの精製酵素で、最終量1mlにて、3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを基質として用いた反応混合を実施した。反応混合物を37℃で5分間インキュベートした後、基質3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの終濃度10mMでの添加により反応を開始した。反応ブランクには、精製酵素を除いた、反応混合物の総ての成分を含めた。酵素活性の1単位は、37℃で1分間当たりに1μmolの基質を消費する酵素の量と定義した。酵素比活性はタンパク質1mg当たりの単位として表した。
1,3−プロパンジオール経路フラックスが増大された、4−ヒドロキシ−2−ケトブチレートデカルボキシラーゼコード遺伝子、3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドレダクターゼコード遺伝子およびL−ホモセリントランスアミナーゼコード遺伝子を発現する株の構築:MG1655 ΔpykF ΔmetA ΔthrLABC(pBBR1MCS5−Ptrc01/RBS01*2−yqhD−kivDll−TT07)(pME101−thrA*1−serC)
pykF遺伝子を欠失させるために、Datsenko and Wanner (2000, PNAS, 97: 6640-6645)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することを可能とする。この目的で、下記のオリゴヌクレオチドを用いた。
以下の領域:
・pykF領域の配列(1753689〜1753766)(ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列)と相同な領域(小文字)、
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域(大文字)、
を有する、
以下の領域:
・pykF領域の配列(1755129〜1755051)(ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列)と相同な領域(大文字)、
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域(大文字)
を有する
metA遺伝子を欠失させるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することを可能とする。この目的で、下記のオリゴヌクレオチドを用いた。
以下の領域:
・metA領域の配列(4212310〜4212389)(ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列)と相同な領域(小文字)、
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域(大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
を有する、
以下の領域:
・metA領域の配列(4213229〜4213150)(ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列)と相同な領域(大文字)、
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域(大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
を有する、
thrLABCオペロンを欠失させるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することを可能とする。この目的で、下記のオリゴヌクレオチドを用いた。
以下の領域:
・thrLABC領域の配列(22〜86)(ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列)と相同な領域(小文字)、
・T7ファージ由来のT7Te転写ターミネーター配列に関する領域(太字下線の小文字)(Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.)、
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅に関する領域(大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
を有する、
以下の領域:
・thrLABC領域の配列(5106〜5021)(ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列)と相同な領域(大文字)、
・BamHI−SfoI−SmaI制限部位の付加に関する領域(斜体の大文字)
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅に関する領域(太字の大文字)
を有する、
serC遺伝子の発現を増加させるために、すでに記載されているpME101−thrA*1(PCT_WO2008707041)から、その適正なプロモーターを用いて、その遺伝子を発現させた。
以下の領域:
・遺伝子serCの配列(956619〜956644)(ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列)と相同な領域(大文字)、
・XbaI部位を有する領域(太字の大文字)
を有する、
以下の領域:
・遺伝子serC領域の配列(958028〜958004)(ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列)と相同な領域(大文字)、
・HindIII部位を有する領域(太字の大文字)
を有する、
pME101−yqhD−kivDll−TT07プラスミドをまず構築した。BsrBIおよびBglIIで制限酵素処理したpME101−kivDll−TT07ベクター(PCT/2009/067994)のkivDll遺伝子を、SnaBIおよびBglIIで制限酵素処理したpME101VB01−yqhDベクター(PCT/2007/000509においてすでに記載されている)にクローニングし、得られたプラスミドをpME101−yqhD−kivDll−TT07と呼称した。
・構成型Ptrcプロモーター配列の付加に関する領域(太字の小文字)
・BamHI制限部位の付加に関する領域(斜体の大文字)
・リボソーム結合部位配列の付加に関する領域(下線の小文字)
・MG1655 yqhD遺伝子の配列(3153377〜3153402)(http://www.ecogene.org/)と相同な領域(斜体の小文字)
・T7ファージ由来のT7Te転写ターミネーター配列に関する領域(下線の大文字)(Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.)、
・SnaBI−EcoRI−PacI制限部位の付加に関する領域(太字の大文字)
・合成kivD遺伝子の末端と相同な領域(斜体の大文字)
pME101−thrA*1−serCおよびpBBR1MCS5−Ptrc01/RBS01*2−yqhD−kivDll−TT07プラスミドを、次に、MG1655 ΔmetA ΔpykF ΔthrLABC株に導入した。
スクロースでの1.3−プロパンジオール経路フラックスが増大された、4−ヒドロキシ−2−ケトブチレートデカルボキシラーゼコード遺伝子および3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドレダクターゼコード遺伝子、ならびにスクロース非PTS輸送系を発現する株の構築:MG1655 ΔpykF ΔmetA ΔthrLABC(pBBR1MCS5−Ptrc01/RBS01*2−yqhD−kivDll−TT07)(pME101−thrA*1−serC)(pKJL101−1)
1,3−プロパンジオール生産のための培養
株の性能を、4.5mMトレオニン、5mMメチオニン、10g/l MOPSおよび10g/lスクロースまたはグルコースを添加し、pH6.8に調整した改変M9培地(Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128)を用いて、500mlバッフル付エルレンマイヤーフラスコでの培養により評価した。スペクチノマイシンおよび/またはゲンタマイシンは、必要であれば、50mg/lの濃度で加え、および/または、クロラムフェニコールは、必要であれば、60mg/lの濃度で加えた。発現ベクターpME101が存在する場合には、その誘導のために100μM IPTGも加えた。24時間培養した前培養物を用いて、OD600nmが約0.1となるように50mlの培養物に植菌した。培養物は、37℃および200rpmで増殖させ、培養培地中のスクロースが枯渇するまで行った。この時点において、残留する糖および主産物を、分離用のバイオラド社製HPX 97Hカラムおよび検出用の屈折計を用いてHPLCにより分析した。1,3−プロパンジオールの生産は、LC/MS/MSにより確認した。
MG1655 ΔpykF ΔmetA ΔthrLABC ΔRN/yfdC−dsdX::cscB*(Q353H)KAR* ΔcscR::Km(pBBR1MCS5−Ptrc01/RBS01*2−yqhD−kivDll−TT07)(pME101−thrA*1−serC)株の構築
実施例7から分かるように、スクロースでのPDO生産株(pKJL101.1によりスクロース輸送系を組み込んでいる)は参照株よりも生産するPDOが少ないように思われる。これは、その株に含まれる3つの異なるベクターに起因する安定性問題を示していると考えられる。そのため、本発明者らは、より安定した株を得るために、スクロース輸送系を染色体上に導入することとした。
スクロースを唯一の炭素源として増殖可能な株を構築するために、csc遺伝子を、LJM115株からのP1ファージ溶解液を用いてMG1655株に形質導入した(Jahreis K., Bentler L., Bockmann J., Hans S., Meyer A., Siepelmeyer J., Lengeler J.W. J. Bact. 2002. 184(19):5307-5316)。
cscR遺伝子を欠失させるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することを可能とする。この目的で、下記のオリゴヌクレオチドを用いた。
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域(下線の大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域(下線の大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
pME101−thrA*1−serCおよびpBBR1MCS5−Ptrc01/RBS01*2−yqhD−kivDll−TT07プラスミド(5.4および5.5に記載した)を、最後に、MG1655 ΔmetA ΔpykF ΔthrLABC ΔRN/yfdC−dsdX::cscB*(Q353H)KAR* ΔcscR::Km株に導入した。得られた株をMG1655 ΔpykF ΔmetA ΔthrLABC ΔRN/yfdC−dsdX::cscB*(Q353H)KAR* ΔcscR::Km(pBBR1MCS5−Ptrc01/RBS01*2−yqhD−kivDll−TT07)(pME101−thrA*1−serC)と呼称した。
スクロースでの新規生産株の培養
株1:実施例5.5に記載したMG1655 ΔpykF ΔmetA ΔthrLABC(pME101−thrA*1−serC)(pBBR1MCS5−Ptrc01/RBS01*2−yqhD−kivDll−TT07);
株2:実施例8.3に記載したMG1655 ΔpykF ΔmetA ΔthrLABC ΔRN/yfdC−dsdX::cscB*(Q353H)KAR* ΔcscR::Km(pBBR1MCS5−Ptrc01/RBS01*2−yqhD−kivDll−TT07)(pME101−thrA*1−serC)。
(1)スクロースからの1,3−プロパンジオールの生物学的生産のために遺伝的に改変された微生物であって、
・2−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素により、4−ヒドロキシ−2−ケトブチレートを脱炭酸する第1段階、および、ヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素により、得られた3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを還元する第2段階を含んでなる、1,3−プロパンジオールの生産のための二段階代謝経路と、
・該微生物が、唯一の炭素源としてスクロースを利用できるようにする遺伝子と
を含んでなる、微生物。
(2)PTSスクロース利用系および/または非PTSスクロース利用系をコードする機能的遺伝子を含んでなる、上記(1)に記載の微生物。
(3)遺伝子scrKYABRまたはscrKYABの導入により改変されている、上記(2)に記載の微生物。
(4)遺伝子cscBKARまたはcscBKAの導入により改変されている、上記(2)に記載の微生物。
(5)2−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素が内在性遺伝子によりコードされる、上記(1)〜(4)のいずれかに記載の微生物。
(6)2−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする内在性遺伝子の発現が増強される、上記(5)に記載の微生物。
(7)2−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素が異種遺伝子によりコードされる、上記(1)〜(4)のいずれかに記載の微生物。
(8)上記(1)〜(7)のいずれかに記載の微生物であって、該微生物において、スクロースからの4−ヒドロキシ−2−ケトブチレートの生産が改善されている、微生物。
(9)細菌、酵母および真菌からなる群の中から選択される、上記(1)〜(8)のいずれかに記載の微生物。
(10)腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、クロストリジウム科(Clostridiaceae)、バチルス科(Bacillaceae)、ストレプトミセス科(Streptomycetaceae)およびコリネバクテリウム科(Corynebacteriaceae)の中から選択される、上記(1)〜(9)のいずれかに記載の微生物。
(11)スクロースからの1,3−プロパンジオールの発酵生産方法であって、
・スクロースを含んでなる適当な培養培地において、上記(1)〜(10)のいずれかに記載の微生物を培養する工程および
・該培養培地から1,3−プロパンジオールを回収する工程
を含んでなる、方法。
(12)1,3−プロパンジオールがさらに精製される、上記(11)に記載の方法。
Claims (6)
- スクロースからの1,3−プロパンジオールの生物学的生産のために遺伝的に改変された種Esherichia coli由来の微生物であって、
・遺伝子発現が増強される内在性遺伝子によりまたは異種遺伝子によりコードされる2−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素により、4−ヒドロキシ−2−ケトブチレートを脱炭酸する第1段階、および、ヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素により、得られた3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを還元する第2段階を含んでなる、1,3−プロパンジオールの生産のための二段階代謝経路と、
・該微生物が、唯一の炭素源としてスクロースを利用できるようにする、PTSスクロース利用系および/または非PTSスクロース利用系をコードする機能的遺伝子と
を含んでなる、微生物。 - 遺伝子scrKYABRまたはscrKYABの導入により改変されている、請求項1に記載の微生物。
- 遺伝子cscBKARまたはcscBKAの導入により改変されている、請求項1に記載の微生物。
- 請求項1〜3に記載の微生物であって、該微生物において、スクロースからの4−ヒドロキシ−2−ケトブチレートの生産が改善されている、微生物。
- スクロースから1,3−プロパンジオールを発酵生産する方法であって、
・スクロースを含んでなる適当な培養培地において、請求項1〜4のいずれか一項に記載の微生物を培養する工程および
・該培養培地から1,3−プロパンジオールを回収する工程
を含んでなる、方法。 - 1,3−プロパンジオールがさらに精製される、請求項5に記載の方法。
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