JP5420798B2 - スクロースから１，３−プロパンジオールを調製する方法 - Google Patents

Description

本発明は、スクロースから１，３−プロパンジオールを生物学的に調製する新規方法であって、１，３−プロパンジオールの生物学的生産のために遺伝的に改変された微生物を培養することを含んでなり、ここで、該微生物は、脱炭酸する第１段階および還元する第２段階を含んでなる、４−ヒドロキシ−２−ケトブチレートからの１，３−プロパンジオールの生産のための二段階代謝経路を含んでなり、かつ該微生物は、唯一の炭素源としてスクロースを使用できるように改変されている、方法に関する。

１，３−プロパンジオールを生産する微生物を培養することによる１，３−プロパンジオールの発酵生産は、当技術分野で公知である。ビタミンＢ１２依存性酵素が関与する１，３−プロパンジオール生産方法はすでに記載されているが、これらの方法では生産プロセスは非常に費用がかかるものとなる。

再生可能な炭素源から、ビタミンＢ１２非依存性経路により１，３−プロパンジオールを生産する代替解決策の必要性が継続している。さらに、そのような生産に必要なエネルギーに基づいて、生産されている産物の全収率向上の必要性が継続している。最後に、産物の単離ならびにそのマーケティングおよびさらなる使用のために、不純物および副産物のレベル制御の必要性が継続している。

１，３−プロパンジオールは主に、グリセロールから（特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５６０７８を参照）、またグルコースから中間体グリセロールを介して生産される。全世界のグリセロールストックは限られているため、他の炭水化物源を見つける必要がある。

発酵培地に用いられる炭素源は一般に炭水化物にあり、大部分は植物由来のものである。植物において最も豊富な貯蔵炭水化物はデンプンである。

バイオテクノロジーによって生産される汎用化学製品のコストは主に原料のコスト（すなわち、発酵基質のコスト）に関係しているため、精製糖の使用は、工業規模生産において経済的に維持可能な選択肢ではない。高含量の発酵性糖を保持するより安価な基質が必要である。この点において、製糖工業からのスクロースが良い選択肢である。

スクロースは、テンサイ、サトウキビ、サトウモロコシ、サトウカエデ、サトウヤシまたはテキラリュウゼツランなどの糖料植物から得られる。製糖プロセスからの中間体、産物または副産物を含有する種々のスクロース（粗汁、希薄汁または清浄汁、濃厚汁、ショ糖シロップ、純ショ糖、糖蜜）が発酵原料となり得る。

微生物におけるスクロースの取り込みおよび利用に用いる２つの異なる系が明らかにされている。

第１の系は、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）依存性スクロースホスホトランスフェラーゼ系（スクロースＰＴＳ）に基づいており、この系では、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）を供与体として用いてスクロースの取り込みおよびリン酸化が行われ、細胞内にスクロース−６−リン酸を生成する。スクロース−６−リン酸は、その後、インベルターゼによりＤ−グルコース−６−リン酸とＤ−フルクトースに加水分解される。Ｄ−フルクトースは、ＡＴＰ依存性フルクトキナーゼによりさらにリン酸化されてＤ−フルクトース−６−リン酸となり、その後、中央代謝に入ることができる。そのような系はグラム陽性ならびにグラム陰性のいくつかの細菌種において記載されている。腸内細菌科(Enterobacteriaceae)ファミリーでは、野生型クレブシェラ属(Klebsiella)の９０％を超える株、エシェリキア属(Escherichia)の５０％未満の株およびサルモネラ菌属(Salmonella)の１０％未満の株がスクロース陽性である。

スクロースＰＴＳをコードする遺伝子ｓｃｒＫＹＡＢＲを有する接合性プラスミドｐＵＲ４００はサルモネラ菌属から単離された(Schmid et al., 1982, Schmid et al., 1988)。

「非ＰＴＳ系」と呼ばれる第２の系は、最近になって大腸菌(E. coli)ＥＣ３１３２において発見された(Bockmann et al., 1992)。この系には、スクロース：プロトン共輸送系（ＣｓｃＢ）、フルクトキナーゼ（ＣｓｃＫ）、インベルターゼ（ＣｓｃＡ）およびスクロース特異的レプレッサー（ＣｓｃＲ）をコードする遺伝子ｃｓｃＢＫＡＲが関係している。

大腸菌（Escherichia coli）Ｋ１２およびその誘導体はスクロースを利用することができない。しかしながら、この能力は、前述の２つの系をコードする遺伝子の移入によって付与することができる。これは、プラスミドｐＵＲ４００を大腸菌Ｋ１２に(Schmid et al, 1982)またはｃｓｃＢＫＡＲ遺伝子を有する異なるプラスミド（ｐＫＪＬ１０１−１を含む）をスクロース陰性大腸菌株に(Jahreis et al., 2002)移入することによって示されている。産業上の利用に関しては、スクロースからのトリプトファン生産は大腸菌Ｋ１２において実証されており(Tsunekawa et al., 1992)、水素生産はｐＵＲ４００プラスミドを有する大腸菌において示され(Penfold and Macaskie, 2004)、ＰＴＳおよび非ＰＴＳの両系を導入することによる異なるアミノ酸の生産は特許出願ＥＰ１１４９９１１において報告された。

驚くべきことに、スクロースを利用することができない大腸菌株でのスクロース利用につながる遺伝子改変と、１，３−プロパンジオールの特異的生合成経路とを組み合わせることによって、本発明者らは再生可能な炭素源であるスクロースからの１，３−プロパンジオール生産の収率向上を得ることができた。

本発明は、スクロースからの１，３−プロパンジオールの生物学的生産のために遺伝的に改変された微生物であって、
・２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素により、４−ヒドロキシ−２−ケトブチレートを脱炭酸する第１段階、およびヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素により、得られた３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを還元する第２段階を含んでなる、１，３−プロパンジオールの生産のための二段階代謝経路と、
・該微生物が、唯一の炭素源としてスクロースを利用できるようにする遺伝子と
を含んでなる、微生物に関する。

本発明によれば、該微生物は、２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子およびヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つの遺伝子を含む。それらの遺伝子は、外来のものでも内在するものでもよく、染色体上でも染色体外でも発現され得る。

本発明による微生物は、さらに、唯一の炭素源としてスクロースを使用することができるように遺伝的に改変される。

発明の詳細な説明

本明細書において、以下の用語は特許請求の範囲および明細書の解釈のために用いられ得る。

「スクロース」とは、分子式Ｃ_１２Ｈ_２２Ｏ_１１を有する、α（１，２）グリコシド結合により連結されたグルコースとフルクトースからなる二糖類を表す。その組織名はα−Ｄ−グルコピラノシル−（１←→２）−β−Ｄ−フルクトフラノシドである。

「遺伝的に改変された微生物」とは、本発明の微生物は自然界では見られず、新たな遺伝エレメントの導入によりまたは欠失により改変されていることを意味する。また、その微生物は、指定突然変異誘発と特定の選択圧下での進化の組合せにより新規代謝経路の発生および進化を押し進めることによって形質転換することもできる（例えば、ＷＯ２００４／０７６６５９を参照）。

外来遺伝子が、宿主微生物におけるそれらの発現を可能にする総てのエレメントとともに微生物に導入されるならば、微生物はこれらの遺伝子を発現することができる。外来ＤＮＡでの微生物の形質転換は当業者にとって日常的な作業である。

外来遺伝子は、宿主ゲノムに組み込まれてよく、またはプラスミドまたはベクターによって染色体外で発現されてもよい。複製起点および細胞内コピー数に関して異なる様々な種類のプラスミドは当業者に知られている。

特定の実施形態では、内在性遺伝子はまた、遺伝子産物を改変するためにコード配列に突然変異を導入することによるかあるいは追加でまたは内在性調節エレメントの代わりに異種配列を導入することにより、それらの遺伝子の発現および／または活性を調整するために改変されていてもよい。内在性遺伝子の調整は、遺伝子産物の活性をアップレギュレートおよび／または増強するか、あるいは内在性遺伝子産物の活性をダウンレギュレートおよび／または低減するというように、いずれの方向にも向けることができる。

遺伝子の発現を制御するための重要なエレメントはプロモーターである。本発明の好ましい実施形態では、遺伝子は異なる強度のプロモーターを用いて発現させてよく、そのプロモーターは誘導性であってよい。これらのプロモーターは同種でも異種でもよい。当業者は、最も便宜なプロモーターを選択する方法を知っており、例えば、プロモーターＰｔｒｃ、Ｐｔａｃ、ＰｌａｃまたはλプロモーターｃＩが広く用いられている。

本発明によれば、「２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素」とは、デカルボキシラーゼ活性を有し、２−ケト酸を基質とする酵素を表す。２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性をコードする遺伝子は当技術分野でよく知られており、そのような遺伝子としては、様々な種由来のＰｄｃ遺伝子、より特には、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来のＰｄｃ１、Ｐｄｃ５、Ｐｄｃ６、Ａｒｏ１０およびＴｈｉ３遺伝子、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)由来のｋｉｖＤ遺伝子；クロストリジウム・アセトブチリクム(Clostridium acetobutylicum)由来のｐｄｃ遺伝子；シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来のＰｄｃ２およびＰｄｃ３遺伝子；ピキア・スティピティス(Pichia stipitis)由来のＰｄｃ１、Ｐｄｃ２およびＡｒｏ１０遺伝子；ならびにザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)由来のｐｄｃ遺伝子が挙げられる。大腸菌由来の遺伝子ｓｕｃＡによりコードされる、２−ケトグルタレートデカルボキシラーゼ複合体の第１のサブユニットは、２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有し、大腸菌の遺伝子ｄｘｓによりコードされる酵素も有する。該遺伝子およびタンパク質の機能的相同体、機能的変異体および機能的断片も定義に包含される。

本発明によれば、「ヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素」とは、レダクターゼ活性を有し、ヒドロキシアルデヒドを基質とする酵素を表す。ヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性をコードする遺伝子は当技術分野でよく知られており、そのような遺伝子としては、大腸菌由来のｙｑｈＤ、ｆｕｃＯ、ｄｋｇＡ、ｄｋｇＢ遺伝子ならびにサッカロミセス・セレビシエ由来のＡＤＨ１およびＡＤＨ２遺伝子が挙げられる。該遺伝子およびタンパク質の機能的相同体、機能的変異体および機能的断片も定義に包含される。

「唯一の炭素源としてスクロースを利用すること」とは、微生物が特有の炭素源としてスクロースを含有する培地中で増殖することができるということを示す。しかしながら、本発明による１，３−プロパンジオール生産方法では、培養培地中のスクロース源は、スクロースに加え、六炭糖（グルコース、ガラクトースまたはラクトースなど）、五炭糖、単糖類、二糖類（スクロース、セロビオースまたはマルトースなど）、オリゴ糖、デンプンまたはその誘導体、ヘミセルロース、グリセロールおよびそれらの組合せなどのさらなる炭素源を含んでなってよいと理解される。

本発明の特定の実施形態では、微生物は、ＰＴＳスクロース利用系および／または非ＰＴＳスクロース利用系をコードする機能的遺伝子を含んでなる。

ＰＴＳスクロース利用系は、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）依存性スクロースホスホトランスフェラーゼ系（スクロース−ＰＴＳ）によるスクロースの輸送に基づくスクロース利用のための系である。ホスホトランスフェラーゼ系は、糖（例えば、スクロースまたはグルコース）の輸送と、ＰＥＰをリン酸供与体として用いる糖のリン酸化とを結びつける。細胞内への輸送後、スクロース−リン酸はインベルターゼによりグルコース−６−リン酸とフルクトースに開裂される。フルクトースは、その後、フルクトキナーゼによりリン酸化されてフルクトース−６−リン酸となる。このＰＴＳスクロース利用系をコードする遺伝子は、調節タンパク質により制御され得る。

非ＰＴＳスクロース利用系は、ホスホエノールピルビン酸に依存しない系によるスクロースの輸送に基づくスクロース利用のための系である。細胞内への輸送後、スクロースはインベルターゼによりグルコースとフルクトースに開裂される。フルクトースは、その後、フルクトキナーゼによりリン酸化されてフルクトース−６−リン酸となり、グルコースはグルコキナーゼによりリン酸化されてグルコース−６−リン酸となる。この非ＰＴＳスクロース利用系をコードする遺伝子は、調節タンパク質により制御され得る。

本発明の特定の態様では、微生物は、サルモネラ菌属由来の遺伝子：ｓｃｒＫＹＡＢＲ（フルクトキナーゼをコードするｓｃｒＫ、ポーリンをコードするｓｃｒＹ、タンパク質ＩＩＢＣをコードするｓｃｒＡ、スクロース−６−Ｐ インベルターゼをコードするｓｃｒＢ、レプレッサーをコードするｓｃｒＲ）を自然発現するか、またはこれらの遺伝子の導入により改変されている。微生物を形質転換するために、該遺伝子ｓｃｒＫＹＡＢＲを有する接合性プラスミドｐＵＲ４００が用いられ得る。これらの遺伝子は、総てを一緒に組み合わせて用いることができるし、またはこれらの遺伝子の少なくとも１つを含んでなる任意の組合せで用いることもできる。特に、遺伝子ｓｃｒＲは省くことができる。

本発明の別の特定の態様では、微生物は、大腸菌ＥＣ３１３２由来の遺伝子、すなわち、スクロース：プロトン共輸送系（ｃｓｃＢ）、フルクトキナーゼ（ｃｓｃＫ）、インベルターゼ（ｃｓｃＡ）およびスクロース特異的レプレッサー（ｃｓｃＲ）をコードする遺伝子ｃｓｃＢＫＡＲを自然発現するか、またはこれらの遺伝子の導入により改変されている。これらの遺伝子は、総てを一緒に組み合わせて用いることができるし、またはこれらの遺伝子の少なくとも１つを含んでなる任意の組合せで用いることもできる。特に、遺伝子ｃｓｃＲは省くことができる。他の生物由来の相同遺伝子も用いることができる。

これらの遺伝子の名称は本発明に従うより一般的な意味を有し、他の微生物における対応する遺伝子を包含する。サルモネラ菌属由来または大腸菌由来の遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ参照番号を用いて、当業者ならば、サルモネラ菌属または大腸菌以外の生物における等価な遺伝子を決定することができる。

相同配列およびそれらの相同性％を同定する手段は当業者によく知られており、特にＢＬＡＳＴプログラムが挙げられ、このプログラムは、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上で、そのウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに利用することができる。得られた配列を、例えばプログラムＣＬＵＳＴＡＬＷ(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)を、これらのウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに用いて活用する（例えば、アラインする）ことができる。

ＰＦＡＭデータベース(アラインメントのタンパク質ファミリーデータベースおよび隠れマルコフモデル(protein families database of alignments and hidden Markov models) http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）は、タンパク質配列アラインメントを多数集めたものである。各ＰＦＡＭにより、多重アラインメントを視覚化し、タンパク質ドメインを調べ、生物間の分布を評価し、他のデータベースへのアクセスを確保し、既知のタンパク質構造を視覚化することができる。

１４の主要な系統学的株を示す、６６の完全に配列決定された単細胞ゲノムに由来するタンパク質配列を比較することにより、ＣＯＧ（タンパク質のオーソロガス群のクラスター(clusters of orthologous groups of proteins) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）が得られる。各ＣＯＧは、少なくとも３つの株から定義されるので、古くからの保存されたドメインを同定することができる。

細菌株にＤＮＡを導入するために、当業者によりいくつかの技術が現在用いられている。好ましい技術はエレクトロポレーションであり、エレクトロポレーションは当業者によく知られている。

本発明の特定の実施形態によれば、微生物は、２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性をコードする内在性遺伝子を含んでなる。該微生物は、好ましくは、サッカロミセス・セレビシエ（遺伝子Ｐｄｃ１、Ｐｄｃ５、Ｐｄｃ６、Ａｒｏ１０、Ｔｈｉ３を含んでなる）；ラクトコッカス・ラクチス（Ｋｉｖｄ）；クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｐｄｃ）；ピキア・スティピティス（Ｐｄｃ１、Ｐｄｃ２、Ａｒｏ１０）；ザイモモナス・モビリス（Ｐｄｃ）；結核菌(Mycobacterium tuberculosis)の中から選択される。

本発明の好ましい実施形態では、２−ケト酸デカルボキシラーゼをコードする内在性遺伝子の発現は前記微生物において増強される。

本発明の別の実施形態によれば、微生物は、２−ケト酸デカルボキシラーゼをコードする内在性遺伝子を含まない。内在性２−ケト酸デカルボキシラーゼを有していないそのような微生物は、好ましくは、大腸菌またはコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)または枯草菌(Bacillus subtilis)の中から選択される。そのような微生物に関し、本発明の微生物は、２−ケト酸デカルボキシラーゼをコードする異種遺伝子を含んでなる。２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性をコードする遺伝子としては、様々な種由来のＰｄｃ遺伝子、より特には、サッカロミセス・セレビシエ由来のＰｄｃ１、Ｐｄｃ５、Ｐｄｃ６、Ａｒｏ１０およびＴｈｉ３遺伝子、ラクトコッカス・ラクチス由来のｋｉｖＤ遺伝子；クロストリジウム・アセトブチリクム由来のｐｄｃ遺伝子；シロイヌナズナ由来のＰｄｃ２およびＰｄｃ３遺伝子；ピキア・スティピティス由来のＰｄｃ１、Ｐｄｃ２およびＡｒｏ１０遺伝子；ならびにザイモモナス・モビリス由来のｐｄｃ遺伝子が挙げられる。大腸菌由来の遺伝子ｓｕｃＡによりコードされる、２−ケトグルタレートデカルボキシラーゼ複合体の第１のサブユニットは、２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有し、大腸菌の遺伝子ｄｘｓによりコードされる酵素も有する。

本発明の別の実施形態によれば、微生物は、ヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性をコードする内在性遺伝子を含んでなる。該微生物は、好ましくは、大腸菌（ｙｑｈＤ、ｆｕｃＯ、ｄｋｇＡ、ｄｋｇＢ）；サッカロミセス・セレビシエ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２）；およびアルデヒドレダクターゼ活性またはアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素を有する総ての生物の中から選択される。内在性ヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性を有するこの微生物は、ヒドロキシアルデヒドレダクターゼをコードする内在性遺伝子の発現を増強するためにさらに改変され得る。

特定の実施形態では、微生物はヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性をコードする異種遺伝子を含んでなる。ヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性をコードする遺伝子としては、大腸菌由来のｙｑｈＤ、ｆｕｃＯ、ｄｋｇＡ、ｄｋｇＢ遺伝子ならびにサッカロミセス・セレビシエ由来のＡＤＨ１およびＡＤＨ２遺伝子が挙げられる。

本発明の別の実施形態によれば、微生物は、スクロースからの４−ヒドロキシ−２−ケトブチレートの生産向上のために遺伝的に改変されている。この結果は、ホモセリントランスアミナーゼまたはホモセリンオキシダーゼの発現を増加させることにより達成され得る。これらの酵素は、Ｌ−ホモセリン（Ｌ−アスパラギン酸から得られる）を４−ヒドロキシ−２−ケトブチレートへと変換させる酵素である。ホモセリンオキシダーゼの発現の増加は、R. opacus（ロドコッカス属細菌）由来のＬ−アミノ酸オキシダーゼをコードする遺伝子を導入し過剰発現させることにより、または対応するタンパク質の活性を高める突然変異を遺伝子に導入することにより達成することができる。ホモセリントランスアミナーゼの発現レベルの増大は、大腸菌のｓｅｒＣ遺伝子の発現を駆動する人工プロモーターを導入することにより、細胞内コピー数を増加させることにより、または対応するタンパク質の活性を高める突然変異をｓｅｒＣ遺伝子に導入することにより達成することができる。

１，３−プロパンジオールの全生合成経路を図１に示す。

別の実施形態では、微生物は、オキサロ酢酸生合成経路にフラックスの誘導をもたらすが、この結果は、ｐｐｃ遺伝子によりコードされる、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの発現のレベルを高めることにより達成され得る。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの発現レベルの増大は、ｐｐｃ遺伝子の発現を駆動する人工プロモーターを導入することにより、細胞内コピー数を増加させることにより、または対応するタンパク質の活性を高める突然変異をｐｐｃ遺伝子に導入することにより達成することができる。オキサロ酢酸プールの増加は、インゲン根粒菌(Rhizobium etli)またはコリネバクテリウム・グルタミクムのｐｙｃ遺伝子によりコードされる、外来ピルビン酸カルボキシラーゼの発現のレベルを高めることによっても達成され得る。ピルビン酸カルボキシラーゼの発現レベルの増大は、これらの遺伝子を染色体上でまたは染色体外で過剰発現させることにより達成することができる。具体的には、嫌気性条件では、オキサロ酢酸プールの増加は、ｐｃｋＡ遺伝子によりコードされる、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼの発現のレベルを高めることによっても達成され得る。ピルビン酸カルボキシラーゼの発現レベルの増大は、ｐｃｋＡ遺伝子の発現を駆動する人工プロモーターを導入することにより、細胞内コピー数を増加させることにより、または対応するタンパク質の活性を高める突然変異をｐｃｋＡ遺伝子に導入することにより達成することができる。中間生成物であるオキサロ酢酸のアベイラビリティも、ｐｃｋＡおよび／またはｓｆｃＡもしくはｍａｅＢ遺伝子それぞれによりコードされる、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼおよび／またはリンゴ酸酵素をコードする遺伝子の発現のレベルを減弱することにより高めることができる。これは、これらの遺伝子の野生型プロモーターを、より低い強度のプロモーターに、または対応するメッセンジャーＲＮＡもしくはタンパク質を不安定にするエレメントを用いて置き換えることにより行われ得る。必要な場合には、前記遺伝子の完全な減弱も、対応するＤＮＡ配列の欠失によって達成され得る。

別の実施形態では、微生物は、ホモセリン生合成経路にフラックスの誘導をもたらす。これは、ｔｈｒＡ／ｍｅｔＬおよびａｓｄ遺伝子それぞれによりコードされる、アスパルトキナーゼおよびホモセリンデヒドロゲナーゼおよび／またはアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現を増加させることにより達成され得る。アスパルトキナーゼおよびホモセリンデヒドロゲナーゼおよび／またはアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現の増加は、ｔｈｒＡ／ｍｅｔＬおよび／またはａｓｄ遺伝子の発現を駆動する人工プロモーターを導入することにより、細胞内コピー数を増加させることにより、または対応するタンパク質の活性を高める突然変異をｔｈｒＡおよび／またはａｓｄ遺伝子に導入することにより達成することができる。

本発明の特定の実施形態では、ｔｈｒＡ遺伝子に、フィードバック阻害剤であるトレオニンに対する感受性を低減する突然変異を導入することができ（フィードバック感受性抑制された対立遺伝子）、そうすることによって、トレオニンの存在下で活性を高めることが可能になる。

本発明のさらなる実施形態では、微生物は、１，３−プロパンジオール以外の化合物へのホモセリンの変換レベルの低減をもたらすために改変されている。この結果は、ホモセリンキナーゼおよびトレオニンシンターゼ（ｔｈｒＢおよびｔｈｒＣによりコードされる）、ホモセリン Ｏ−トランスサクシニラーゼ（ｍｅｔＡによりコードされる）のようなホモセリン消費酵素のレベルを低減することにより達成され得る。これらの遺伝子は、天然プロモーターを、より弱いプロモーターにまたは対応するメッセンジャーＲＮＡもしくはタンパク質を不安定にするエレメントに置き換えることにより減弱することができる。必要な場合には、前記遺伝子の完全な減弱も、対応するＤＮＡ配列の欠失によって達成され得る。

本発明のさらなる実施形態では、細菌は、３−ヒドロキシプロピオネート以外の化合物へのホモセリン前駆体の変換レベルの低減をもたらすために改変されているが、この結果は、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ｄａｐＡによりコードされる）のレベルを低減することにより達成され得る。この遺伝子の減弱は、天然プロモーターを、より低い強度のプロモーターにまたは対応するメッセンジャーＲＮＡもしくはタンパク質を不安定にするエレメントに置き換えることにより行われ得る。必要な場合には、前記遺伝子の完全な減弱も、対応するＤＮＡ配列の欠失によって達成され得る。本発明はまた、本発明のこの特定の実施形態において用いられる細菌に関する。

本発明のさらなる実施形態では、微生物は、１，３−プロパンジオール以外の化合物への３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの変換レベルの低減をもたらすために改変されている。これは、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄＡ、ａｌｄＢ、ａｌｄＨによりコードされる）のような３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド消費酵素のレベルを低減することにより達成され得る。これらの遺伝子は、天然プロモーターを、より弱いプロモーターにまたは対応するメッセンジャーＲＮＡもしくはタンパク質を不安定にするエレメントに置き換えることにより減弱することができる。必要な場合には、前記遺伝子の完全な減弱も、対応するＤＮＡ配列の欠失によって達成され得る。

微生物を形質転換するための総ての技術、および本発明のタンパク質の生産を増大させるために用いられる調節エレメントは、当技術分野でよく知られており、様々な微生物における生合成経路の改変に関する出願者所有の特許出願を含む文献で入手可能であり、それらにはＷＯ２００８／０５２９７３、ＷＯ２００８／０５２５９５、ＷＯ２００８／０４０３８７、ＷＯ２００７／１４４３４６、ＷＯ２００７／１４１３１６、ＷＯ２００７／０７７０４１、ＷＯ２００７／０１７７１０、ＷＯ２００６／０８２２５４、ＷＯ２００６／０８２２５２、ＷＯ２００５／１１１２０２、ＷＯ２００５／０７３３６４、ＷＯ２００５／０４７４９８、ＷＯ２００４／０７６６５９が含まれ、これらの内容は引用することにより本明細書の一部とされる。

前述のとおり、これらの遺伝子の名称は本発明に従うより一般的な意味を有し、他の微生物における対応する遺伝子を包含する。

本発明によれば、「微生物」とは、細菌、酵母または真菌を表す。好適には、微生物は、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、クロストリジウム科(Clostridiaceae)、バチルス科(Bacillaceae)、ストレプトミセス科(Streptomycetaceae)およびコリネバクテリウム科(Corynebacteriaceae)の中から選択される。より好適には、微生物は、エシェリキア属(Escherichia)、クロストリジウム属(Clostridium)、バチルス属(Bacillus)、クレブシェラ属、パンテア属(Pantoea)、サルモネラ菌属（Salmonella）またはコリネバクテリウム属(Corynebacterium)の種である。いっそうより好適には、微生物は、大腸菌(Escherichia coli)またはコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)またはクロストリジウム・アセトブチリクム(Clostridium acetobutylicum)または枯草菌(Bacillus subtilis)種のいずれかである。

本発明はまた、スクロースから１，３−プロパンジオールを発酵生産する方法であって、
・スクロースを含んでなる適当な培養培地において、本発明による微生物を培養する工程および
・該培養培地から１，３−プロパンジオールを回収する工程
を含んでなる、方法に関する。

発酵は一般に、スクロース、および必要であれば補助基質を含有する、微生物に適合された適当な培養培地の入った発酵槽で行われる。

「適当な培養培地」とは、細胞の維持および／または増殖に不可欠または有益な栄養、例えば、炭素源または炭素基質、窒素源、例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウム；リン源、例えば、リン酸一カリウムまたはリン酸二カリウム；微量元素（例えば、金属塩）、例えば、マグネシウム塩、コバルト塩および／またはマンガン塩；ならびに増殖因子（例えば、アミノ酸、ビタミン、増殖促進物質など）などを含んでなる培地（例えば、滅菌液体培地）を表す。

大腸菌に対する既知の培養培地の例として、その培養培地は、Ｍ９培地(Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128)、Ｍ６３培地(Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)またはSchaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96)により定義されているものなどの培地と同一または類似の組成であり得る。

当業者ならば、発酵プロセスに対する培養条件を容易に定義することができる。特に、細菌は２０℃〜５５℃の間、好ましくは２５℃〜４０℃の間の温度で、好ましくは、クロストリジウム科では約３５℃で、腸内細菌科では約３７℃で発酵される。

本発明によれば、「培養すること」、「培養」、「増殖」および「発酵」とは、単一炭素源を含有する適当な増殖培地中での細菌の増殖を表して互換的に用いられる。発酵は、好気性、微好気性または嫌気性条件下で行うことができる古典的プロセスである。

「好気性条件下で」とは、酸素ガスを液相中に溶解させることによって培養物に酸素を供給することを意味する。これは、（１）酸素含有ガス（例えば、空気）を液相中に注入するか、または（２）培養培地が入った容器を振盪して、ヘッドスペースに含まれる酸素を液相中に移行させることにより得られる。嫌気性条件の代わりに好気性条件下で発酵させることの利点は、電子受容体として酸素が存在することによって、細胞プロセスのためにＡＴＰの形態でより多くのエネルギーを生み出す株能力が高まることである。その結果、その株の全般的な代謝は高まる。

微好気性条件は、液相中に低率の酸素（例えば、０．１〜１０％の間の酸素を含有し、窒素で１００％となるガス混合物を使用）が溶解している培養条件として定義される。

嫌気性条件は、培養培地に酸素が供給されない培養条件として定義される。厳密には、嫌気性条件は、窒素のような不活性ガスを培養培地中に注入して、微量の他のガスを除去することによって得られる。株によるＡＴＰ生産を向上させ、その代謝を高めるために、硝酸塩を電子受容体として用いることもできる。

本発明の特定の態様では、スクロースは、バイオマス、特に、植物バイオマスから得られる。植物全体または植物の任意の特定部分を用いて、スクロース含有媒質として用いられる原料を調製することができる。この調製は、スクロース含有植物バイオマスからスクロースを抽出するための、当業者に知られている任意の処理に基づいてよい。

本発明の好ましい態様では、スクロース含有媒質は、サトウキビ、テンサイ、サトウモロコシ、サトウカエデ、サトウヤシおよびテキラリュウゼツランからなる群の中から選択される植物から得られる。

好適には、スクロース含有媒質はサトウキビまたはテンサイから得られる。

種々の形態のスクロース含有媒質：搾り汁、濃縮汁、シロップ、清浄汁、糖蜜または結晶化ショ糖を使用することができる。好ましい形態は、処理を行わずに植物から直接搾り取られたサトウキビ粗汁である。簡潔には、収穫したサトウキビを洗浄した後、搾汁のために粉砕処理を行う。サトウキビの構造を破壊した後、粉砕し、同時にスクロースを水で抽出し、粗汁を得る。粗汁は、次に、石灰を添加し加熱することによって清浄することができ、清浄汁を沈殿物から分離する。蒸発させることによって濃縮シロップを得る。

いくつかの粗製スクロース含有媒質、特に、上述のようなバイオマスから得られるものは、スクロース含有媒質に加えて微生物の増殖に用いられ得る他の栄養を含むため、微生物の増殖に適当な培地は、スクロース含有媒質だけを用いることによって（すなわち、適当な培地はスクロース含有媒質からなる）、またはスクロース含有媒質をリン源および／または窒素源で補うことによって設計することができる。

好適には、スクロース含有媒質は少なくとも７％のスクロースを含んでなる。

本発明の一態様では、回収された１，３−プロパンジオールは、さらに精製される。培養培地からの１，３−プロパンジオールの回収は当業者にとって慣例の作業である。回収および精製のための方法は以下の特許出願に開示されている：ＷＯ２００９／０６８１１０およびＷＯ２０１０／０３７８４３。

本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特に例示した方法に限定されず、当然、変化し得ることは理解されるべきである。特に、例では改変された大腸菌株(Escherichia coli)を示しているが、これらの改変は同じファミリーの他の微生物において容易に行うことができる。

大腸菌(Escherichia coli)は、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）ファミリーに属し、このファミリーは、芽胞形成しないグラム陰性の桿菌である、典型的には長さ１〜５μｍのメンバーを含んでなる。ほとんどのメンバーは鞭毛を有し、鞭毛を用いて動き回るが、いくつかの属は非運動性である。このファミリーの多くのメンバーが、ヒトおよび他の動物の腸内で見られる腸管内菌叢の正常な部分である一方で、水または土壌中で見られるものや、様々な異なる動植物に寄生するものもある。大腸菌(Escherichia coli)は最も重要なモデル生物の１つであるが、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）ファミリーの重要なメンバーとして、クレブシェラ属(Klebsiella)、特に肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、およびサルモネラ菌属（Salmonella）も挙げることができる。

スクロースからの１，３−プロパンジオールの生合成経路。

実施例１
グルコースおよびスクロースでの１，３−プロパンジオール生産の最大収率の計算
１．１ − シミュレーションに用いたパラメーター
シミュレーションは、METEX社製プロプライエタリソフトウェアＭＥＴＯＰＴ（商標）を用いて行った。大腸菌（E. coli）の簡易代謝ネットワークを、中央代謝ネットワーク、総てのバイオマス前駆体の代謝経路および上に記載した特定生産経路を含めて用いた。大腸菌用の古典的バイオマス組成を用いた。グルコースまたはスクロース炭素源のいずれかを用いてシミュレーションを行った。スクロース利用については、ＰＴＳ系および非ＰＴＳ系の両方をモデル化した。計算した最大収率には差がなかったため、スクロースでの収率は１つだけを報告する。増殖速度、０．１ｈ^−１および維持エネルギー、５ｍｍｏｌ_ＡＴＰ．ｇ_ＤＷ ^−１．ｈ^−１を考慮して、実際の最大収率の計算を行った。総てのシミュレーションを、グルコース取り込み速度、３ｍｍｏｌ．ｇ_ＤＷ ^−１．ｈ^−１により行った。シミュレーションは好気性条件下で行った。

１．２ − シミュレーション結果

実施例２
大腸菌(Escherichia coli)の遺伝子ｓｅｒＣによりコードされるＬ−ホモセリントランスアミナーゼ活性の実証
２．１ − ＳｅｒＣの特性評価のための株の構築：ＢＬ２１（ｐＰＡＬ７−ｓｅｒＣ）
ＳｅｒＣタンパク質を特性評価するために、発現ベクターｐＰＡＬ７(バイオラド社製)から対応する遺伝子を発現させた。

この目的で、ｓｅｒＣ遺伝子を、オリゴヌクレオチドｐＰＡＬ７−ｓｅｒＣ ＦおよびｐＰＡＬ７−ｓｅｒＣ Ｒを用いて、大腸菌（E. coli）ゲノムから増幅した。このＰＣＲ産物を、酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて制限酵素処理し、同じ制限酵素で制限酵素処理したベクターｐＰＡＬ７にクローニングした。得られたベクターをｐＰＡＬ７−ｓｅｒＣと呼称した。

以下の領域：
・遺伝子ｓｅｒＣの配列（９５６８７６〜９５６９０４）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（太字の文字）、
・ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有する領域（下線の文字）
を有する、

以下の領域：
・遺伝子ｓｅｒＣ領域の配列（９５７９６４〜９５７９３７）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（太字の文字）、
・ＥｃｏＲＩ制限部位を担持する領域（下線の文字）
を有する、

ｐＰＡＬ７−ｓｅｒＣプラスミドを、次に、コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）セル(インビトロジェン社製)に導入した。

２．２ − タンパク質ＳｅｒＣの過剰生産
タンパク質ＳｅｒＣの過剰生産を、２ｌエルレンマイヤーフラスコで、２．５ｇ／ｌのグルコースおよび１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを添加したＬＢ培養液(Bertani, 1951, J. Bacteriol. 62:293-300)を用いて行った。２．５ｇ／ｌのグルコースおよび１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを添加した５０ｍｌのＬＢ培養液を充填した５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコで前培養物を一晩増殖させた。この前培養物を用いて、ＯＤ_{６００ｎｍ}が約０．１５となるように５００ｍｌの培養物に植菌した。培養物をまず、３７℃および２００ｒｐｍで増殖させ、ＯＤ_{６００ｎｍ}が約０．５になったら、２５℃および２００ｒｐｍに変え、ＯＤ_{６００ｎｍ}が０．６〜０．８になるまで（約１時間）増殖させ、その後、５００μＭ ＩＰＴＧでの誘導を行った。培養は、２５℃および２００ｒｐｍで維持し、ＯＤ_{６００ｎｍ}がおよそ４になったら、停止させた。細胞を、４℃、７０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その後、−２０℃で保存した。

２．３ − タンパク質ＳｅｒＣの精製
２．３．１ − ステップ１：無細胞抽出物の調製
約２８０ｍｇの大腸菌（E. coli）バイオマスを４５ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム ｐＨ７．６およびプロテアーゼ阻害剤カクテルに懸濁させた。細胞懸濁液を５０ｍｌコニカルチューブに入れ（各コニカルチューブに１５ｍｌ）氷上で３０秒間８サイクル（３０秒間隔）の音波処理を施した（Bandelin社製ｓｏｎｏｐｌｕｓ、７０Ｗ）。音波処理の後、細胞を５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１ＵＩ／ｍｌのＤＮアーゼＩとともに室温で３０分間インキュベートした。細胞残渣を４℃、１２,０００ｇで３０分間の遠心分離により除去した。

２．３．２ − ステップ２：アフィニティー精製
Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙカラム（バイオラド社製、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅｘａｃｔカートリッジ ５ｍｌ）において、製造業者推奨のプロトコールに従い、親和性により粗細胞抽出物からタンパク質を精製した。１００ｍＭリン酸カリウム ｐＨ７．６で平衡化した５ｍｌ Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅｘａｃｔカートリッジに粗抽出物をロードした。カラムを同じバッファーの１０カラム容量で洗浄し、１００ｍＭリン酸カリウム ｐＨ７．６、１００ｍＭフッ化物とともに室温で３０分インキュベートした。１００ｍＭリン酸カリウム ｐＨ７．６の２カラム容量でカラムからタンパク質を溶出した。タグは樹脂としっかりと結合したまま保持され、精製タンパク質は放出された。精製タンパク質を含む画分をプールし、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１０％グリセロール ｐＨ８に対して透析した。

タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを用いて測定した。

２．４ − Ｌ−ホモセリントランスアミナーゼアッセイ
Ｌ−ホモセリントランスアミナーゼ活性を、共役酵素アッセイを用いて３０℃で測定した。Ｌ−ホモセリントランスアミナーゼ活性アッセイは、４２０ｍＭリン酸カリウムバッファー ｐＨ８．２、２ｍＭアセチルピリジンアデニンジヌクレオチド、３ｍＭ Ｌ−ホモセリン、２０単位／ｍｌのウシ肝臓由来グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、１ｍＭ α−ケトグルタル酸（中性化）および約５０μｇの粗抽出物を総量１ｍｌで用いて実施した。アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドの消費を、分光光度計により３７５ｎｍでモニタリングした。基質を含めたアッセイで検出された活性から、基質（Ｌ−ホモセリン）を含めていない対照アッセイで検出された活性を差し引いた。Ｌ−ホモセリントランスアミナーゼ活性の１単位は、３０℃で１分間当たりに１μｍｏｌのＬ−ホモセリンのアミノ基転移を触媒するのに必要な酵素の量である。（ε ３７５ｎｍ＝６１００Ｍ−１ ｃｍ−１）

２．５ − 精製酵素の活性

実施例３
ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）の遺伝子ｋｉｖＤによりコードされる４−ヒドロキシ−２−ケトブチレートデカルボキシラーゼ活性の実証
３．１ − ＫｉｖＤの特性評価のための株の構築：ＢＬ２１（ｐＰＡＬ７−ｋｉｖＤｌｌ）
ＫｉｖＤタンパク質を特性評価するために、発現ベクターｐＰＡＬ７(バイオラド社製)から対応する遺伝子を発現させた。

この目的で、ｋｉｖＤ遺伝子を、オリゴヌクレオチドｐＰＡＬ７−ｋｉｖＤｌｌ ＦおよびｐＰＡＬ７−ｋｉｖＤｌｌ Ｒを用いて、ラクトコッカス・ラクチスゲノムから増幅した。このＰＣＲ産物を、酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて制限酵素処理し、同じ制限酵素で制限酵素処理したベクターｐＰＡＬ７にクローニングした。得られたベクターをｐＰＡＬ７−ｋｉｖＤｌｌと呼称した。

以下の領域：
・ラクトコッカス・ラクチスｋｉｖＤ遺伝子の合成遺伝子の配列と相同な領域（斜体の文字）、
・精製に有利に働く短いＮ末端アミノ酸伸長を有するタグフリータンパク質を生成するのに必要なヌクレオチドを有する領域（太字の文字）
・ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有する領域（下線の文字）
を有する、

以下の領域：
・ラクトコッカス・ラクチスｋｉｖＤ遺伝子の合成遺伝子の配列と相同な領域（斜体の文字）、
・ＥｃｏＲＩ制限部位を有する領域（下線の文字）
を有する、

ｐＰＡＬ７−ｋｉｖＤｌｌプラスミドを、次に、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル(インビトロジェン社製)株に導入した。

３．２ − タンパク質ＫｉｖＤの過剰生産
タンパク質ｋｉｖＤの過剰生産を、実施例２．２と同じプロトコールを適用して行った。

３．３ − タンパク質ＫｉｖＤの精製
３．３．１ − ステップ１：無細胞抽出物の調製
約１８８ｍｇの大腸菌（E. coli）バイオマスを３０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム ｐＨ７．６およびプロテアーゼ阻害剤カクテルに懸濁させた。細胞懸濁液を５０ｍｌコニカルチューブに入れ（各コニカルチューブに１５ｍｌ）氷上で３０秒間８サイクル（３０秒間隔）の音波処理を施した（Bandelin社製ｓｏｎｏｐｌｕｓ、７０Ｗ）。音波処理の後、細胞を５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１ＵＩ／ｍｌのＤＮアーゼＩとともに室温で３０分間インキュベートした。細胞残渣を４℃、１２,０００ｇで３０分間の遠心分離により除去した。

３．３．２ − ステップ２：アフィニティー精製
Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙカラム（バイオラド社製、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅｘａｃｔカートリッジ ５ｍｌ）において、製造業者推奨のプロトコールに従い、親和性により粗細胞抽出物からタンパク質を精製した。１００ｍＭリン酸カリウム ｐＨ７．６で平衡化した５ｍｌ Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅｘａｃｔカートリッジに粗抽出物をロードした。カラムを同じバッファーの１０カラム容量で洗浄し、１００ｍＭリン酸カリウム ｐＨ７．６、１００ｍＭフッ化物とともに４℃で一晩インキュベートした。１００ｍＭリン酸カリウム ｐＨ７．６の２カラム容量でカラムからタンパク質を溶出した。タグは樹脂としっかりと結合したまま保持され、精製タンパク質は放出された。精製タンパク質を含む画分をプールし、１００ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１０％グリセロール ｐＨ８に対して透析した。

タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを用いて測定した。

３．４ − ４−ヒドロキシ−２−ケトブチレートデカルボキシラーゼアッセイ
３．４．１ − ４−ヒドロキシ−２−ケト酪酸の化学合成
４−ヒドロキシ−２−ケト酪酸の化学合成は、次の刊行物に記載されている：
R S Lane ;EE Dekker ; (1969).2-keto-4-hydroxybutyrate. Synthesis, chemical properties, and as a substrate for lactate dehydrogenase of rabbit muscle Biochemistry., 8 (7), 2958-2966。

３．４．２ − ４−ヒドロキシ−２−ケトブチレートデカルボキシラーゼアッセイ
４−ヒドロキシ−２−ケトブチレートの脱炭酸を、共役酵素アッセイを用いて３０℃で測定した。４−ヒドロキシ−２−ケトブチレートデカルボキシラーゼ活性アッセイは、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー ｐＨ６、０．２ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．５ｍＭチアミン二リン酸、７２単位／ｍｌのサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来アルコールデヒドロゲナーゼ、１０ｍＭ ４−ヒドロキシ−２−ケト酪酸（中性化）および約４０μｇの精製タンパク質を総量１ｍｌで用いて実施した。ＮＡＤＨの消費を、分光光度計により３４０ｎｍでモニタリングした。基質を含めたアッセイで検出された活性から、基質を含めていない対照アッセイで検出された活性を差し引いた。４−ヒドロキシ−２−ケトブチレートデカルボキシラーゼ活性の１単位は、３０℃で１分間当たりに１μｍｏｌの４−ヒドロキシ−２−ケト酪酸の脱炭酸を触媒するのに必要な酵素の量である。（ε ３４０ｎｍ＝６２９０Ｍ−１ ｃｍ^−１）。

３．５ − 精製酵素の活性

実施例４
大腸菌（Escherichia coli）の遺伝子ｙｑｈＤによりコードされる３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドレダクターゼ活性の実証
４．１ − ＹｑｈＤの特性評価のための株の構築：ＭＧ１６５５ ΔｙｑｈＤ：：Ｋｍ（ｐＴＲＣ９９Ａ−ｙｑｈＤ）
４．１．１ − ＭＧ１６５５ ΔｙｑｈＤ：：Ｋｍ株の構築
ｙｑｈＤ遺伝子を欠失させるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することを可能とする。この目的で、下記のオリゴヌクレオチドを用いた：
以下の領域：
・ｙｑｈＤ領域の配列（３１５３３７７〜３１５３４５６）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（小文字）、
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）、
を有する、

。
以下の領域：
・ｙｑｈＤ領域の配列（３１５４５４０〜３１５４４６０）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（大文字）、
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
を有する、

。

オリゴヌクレオチドΔｙｑｈＤＦおよびΔｙｑｈＤＲを用いて、プラスミドｐＫＤ４からカナマイシン耐性カセットを増幅する。得られたＰＣＲ産物を、次に、エレクトロポレーションによってＭＧ１６５５（ｐＫＤ４６）株に導入する。次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下記に定義されるオリゴヌクレオチドｙｑｈＤＦおよびｙｑｈＤＲを用いたＰＣＲ分析により確認する。保持した株をＭＧ１６５５ ΔｙｑｈＤ：：Ｋｍと呼称する。

（配列３１５３０６８〜３１５３１００と相同）。

（配列３１５４８２５〜３１５４７９７と相同）。

４．１．２ − プラスミドｐＴＲＣ９９Ａ−ｙｑｈＤの構築
ＹｑｈＤタンパク質を特性評価するために、ベクターｐＴＲＣ９９Ａ(アマシャム社製)から対応する遺伝子を発現させた。

この目的で、ｙｑｈＤ遺伝子を、オリゴヌクレオチドｙｑｈＤ Ｆ ｐＴＲＣ９９Ａ ＦおよびｙｑｈＤ Ｒ ｐＴＲＣ９９Ａ Ｒを用いて、大腸菌（E. coli）ゲノムから増幅した。このＰＣＲ産物を、酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｐＨＩを用いて制限酵素処理し、ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で制限酵素処理したベクターｐＴＲＣ９９Ａにクローニングした。得られたベクターをｐＴＲＣ９９Ａ−ｙｑｈＤと呼称した。

以下の領域：
・遺伝子ｙｑｈＤの配列（３１５３３７７〜３１５３４０８）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（下線の文字）、
・ＢｓｐＨＩ制限部位（太字の文字）
を有する、

。
以下の領域：
・遺伝子ｙｑｈＤの配列（３１５４５４０〜３１５４４８３）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（下線の文字）、
・ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（太字の文字）
を有する、

。

ｐＴＲＣ９９Ａ−ｙｑｈＤプラスミドを、次に、ＭＧ１６５５ ΔｙｑｈＤ：：Ｋｍ株に導入した。

４．２ − タンパク質ＹｑｈＤの過剰生産
タンパク質ＹｑｈＤを、２．５ｇ／ｌのグルコースおよび５０ｍｇ／ｌのアンピシリンおよび５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地５００ｍｌの入った２ｌバッフル付エルレンマイヤーフラスコで、好気性条件下、３７℃で過剰生産した。フラスコをオービタルシェーカー上で２００ｒｐｍにて撹拌した。５５０ｎｍで測定した光学濃度が０．５単位に達したら、フラスコを２５℃でインキュベートした。光学濃度が１．２単位に達したら、ＩＰＴＧを終濃度５００μＭまで添加することによりＹｑｈＤタンパク質の生産を誘導した。培養物が３．５単位を上回る光学濃度に達したら、バイオマスを遠心分離により回収した。上清を廃棄し、使用するまでペレットを−２０℃で保存した。

４．３ − タンパク質ＹｑｈＤの精製
４．３．１ − ステップ１：無細胞抽出物の調製
４００ｍｇの大腸菌（E. coli）バイオマスを７０ｍｌの５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５およびプロテアーゼ阻害剤カクテルに懸濁させた。細胞をロゼットセル（Ｒｏｓｅｔｔ ｃｅｌｌ）ＲＺ３に入れ、氷上で３０秒間８サイクル（３０秒間隔）の音波処理を施した（Branson社製ｓｏｎｉｆｉｅｒ、７０Ｗ）。音波処理の後、細胞を１ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１ＵＩ／ｍｌのＤＮアーゼＩとともに室温で１時間インキュベートした。細胞残渣を４℃、１２,０００ｇで３０分間の遠心分離により除去した。上清を粗抽出物として取っておいた。

４．３．２ − ステップ２：硫酸アンモニウム沈殿
粗抽出物を５０％硫酸アンモニウムの濃度で沈殿させた：粗抽出物に氷上で固体硫酸アンモニウム（３００ｇ／ｌ）を加えた。４℃での１５分のインキュベーション後に、混合物を４℃、１２,０００ｇで１５分間遠心分離した。上清を廃棄し、沈殿物を５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、１Ｍ硫酸アンモニウム５０ｍｌに溶解させた。

４．３．３ − ステップ３：疎水性クロマトグラフィー
Ａｋｔａ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ(GEヘルスケア社製)を使用し、前のステップのタンパク質抽出物を、同じバッファーで平衡化した５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＰｈｅｎｙｌＨＰカラム(GEヘルスケア社製)にロードした。カラムを同じバッファーの１０カラム容量で洗浄した。二段階勾配（１０カラム容量の１Ｍ〜０．５Ｍ硫酸アンモニウム勾配および２０カラム容量の０．５Ｍ〜０Ｍ硫酸アンモニウム勾配）を用いてタンパク質を溶出した。溶出後、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５の１０カラム容量でカラムを洗浄した。カラムの流速は２．５ｍｌ／分であり、２．５ｍｌの画分を集めた。タンパク質を含む画分をプールし、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５中で透析し、１．１４μｇ／μｌの濃度まで濃縮した。

４．４ − ３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドレダクターゼ活性アッセイ
３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドレダクターゼ活性を、分光光度計により波長３４０ｎｍおよび一定温度３７℃でＮＡＤＰＨ酸化の初速度を測定することによりアッセイした。２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、０．１ｍＭ硫酸亜鉛、０．２ｍＭ ＮＡＤＰＨ、６μｇの精製酵素で、最終量１ｍｌにて、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを基質として用いた反応混合を実施した。反応混合物を３７℃で５分間インキュベートした後、基質３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの終濃度１０ｍＭでの添加により反応を開始した。反応ブランクには、精製酵素を除いた、反応混合物の総ての成分を含めた。酵素活性の１単位は、３７℃で１分間当たりに１μｍｏｌの基質を消費する酵素の量と定義した。酵素比活性はタンパク質１ｍｇ当たりの単位として表した。

４．５ − 精製酵素の活性

実施例５
１，３−プロパンジオール経路フラックスが増大された、４−ヒドロキシ−２−ケトブチレートデカルボキシラーゼコード遺伝子、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドレダクターゼコード遺伝子およびＬ−ホモセリントランスアミナーゼコード遺伝子を発現する株の構築：ＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ ΔｍｅｔＡ ΔｔｈｒＬＡＢＣ（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１^＊２−ｙｑｈＤ−ｋｉｖＤｌｌ−ＴＴ０７）（ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ^＊１−ｓｅｒＣ）

５．１ − ＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ株の構築
ｐｙｋＦ遺伝子を欠失させるために、Datsenko and Wanner (2000, PNAS, 97: 6640-6645)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することを可能とする。この目的で、下記のオリゴヌクレオチドを用いた。
以下の領域：
・ｐｙｋＦ領域の配列（１７５３６８９〜１７５３７６６）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（小文字）、
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（大文字）、
を有する、

。
以下の領域：
・ｐｙｋＦ領域の配列（１７５５１２９〜１７５５０５１）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（大文字）、
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（大文字）
を有する

。

オリゴヌクレオチドΔｐｙｋＦＦおよびΔｐｙｋＦＲを用いて、プラスミドｐＫＤ４からカナマイシン耐性カセットを増幅した。得られたＰＣＲ産物を、次に、エレクトロポレーションによってＭＧ１６５５（ｐＫＤ４６）株に導入した。次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下記に定義されるオリゴヌクレオチドｐｙｋＦＦおよびｐｙｋＦＲを用いたＰＣＲ分析により確認した。保持した株をＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ：：Ｋｍと呼称した。

（配列１７５３３７１〜１７５３３９２と相同）。

（配列１７５５５１８〜１７５５４９５と相同）。

カナマイシン耐性カセットを除去した。カナマイシン耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するＦＬＰリコンビナーゼを有するプラスミドｐＣＰ２０を、次に、エレクトロポレーションによって組換え部位に導入した。４２℃での一連の培養の後、カナマイシン耐性カセットが存在しないことを、従前に用いたものと同じオリゴヌクレオチド（ｐｙｋＦＦ／ｐｙｋＦＲ）を用いたＰＣＲ分析により確認した。保持した株をＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦと呼称した。

５．２ − ＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ ΔｍｅｔＡ株の構築
ｍｅｔＡ遺伝子を欠失させるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することを可能とする。この目的で、下記のオリゴヌクレオチドを用いた。
以下の領域：
・ｍｅｔＡ領域の配列（４２１２３１０〜４２１２３８９）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（小文字）、
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
を有する、

。
以下の領域：
・ｍｅｔＡ領域の配列（４２１３２２９〜４２１３１５０）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（大文字）、
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
を有する、

。

オリゴヌクレオチドΔｍｅｔＡＦおよびΔｍｅｔＡＲを用いて、プラスミドｐＫＤ４からカナマイシン耐性カセットを増幅した。得られたＰＣＲ産物を、次に、エレクトロポレーションによってＭＧ １６５５（ｐＫＤ４６）株に導入した。次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下記に定義されるオリゴヌクレオチドｍｅｔＡＦおよびｍｅｔＡＲを用いたＰＣＲ分析により確認した。保持した株をＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＡ：：Ｋｍと呼称した。

（配列４２１２２０３〜４２１２２３２と相同）。

（配列４２１３３０１〜４２１３２７２と相同）。

ΔｍｅｔＡ：：Ｋｍを移入するために、ファージＰ１形質導入法を用いた。ＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ株への形質導入には、ＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＡ：：Ｋｍ株のファージ溶解液の調製物を用いた。

次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、ΔｍｅｔＡ：：Ｋｍを、従前に定義されているオリゴヌクレオチドｍｅｔＦ／ｍｅｔＡＲを用いたＰＣＲ分析により確認した。保持した株をＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ ΔｍｅｔＡ：：Ｋｍと呼称した。

カナマイシン耐性カセットを除去した。カナマイシン耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するＦＬＰリコンビナーゼを有するプラスミドｐＣＰ２０を、次に、エレクトロポレーションによって組換え部位に導入した。４２℃での一連の培養の後、カナマイシン耐性カセットが存在しないことを、従前に用いたものと同じオリゴヌクレオチド（ｐｙｋＦＦ／ｐｙｋＦＲおよびｍｅｔＦ／ｍｅｔＡＲ）を用いたＰＣＲ分析により確認した。保持した株をＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ ΔｍｅｔＡと呼称した。

５．３ − ＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ ΔｍｅｔＡ ΔｔｈｒＬＡＢＣ株の構築
ｔｈｒＬＡＢＣオペロンを欠失させるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することを可能とする。この目的で、下記のオリゴヌクレオチドを用いた。
以下の領域：
・ｔｈｒＬＡＢＣ領域の配列（２２〜８６）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（小文字）、
・Ｔ７ファージ由来のＴ７Ｔｅ転写ターミネーター配列に関する領域（太字下線の小文字）(Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.)、
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅に関する領域（大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
を有する、

。
以下の領域：
・ｔｈｒＬＡＢＣ領域の配列（５１０６〜５０２１）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（大文字）、
・ＢａｍＨＩ−ＳｆｏＩ−ＳｍａＩ制限部位の付加に関する領域（斜体の大文字）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅に関する領域（太字の大文字）
を有する、

。

オリゴヌクレオチドＤｔｈｒＢＦおよびＤｔｈｒＣＲを用いて、プラスミドｐＫＤ３からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅した。得られたＰＣＲ産物を、次に、エレクトロポレーションによってＭＧ１６５５（ｐＫＤ４６）株に導入した。次に、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下記に定義されるオリゴヌクレオチドｔｈｒＬＦおよびｔｈｒＣＲを用いたＰＣＲ分析により確認した。保持した株をＭＧ１６５５ ΔｔｈｒＬＡＢＣ：：Ｃｍと呼称した。

（配列４６３９２８１〜４６３９３０７と相同）。

（配列５２８３〜５２６０と相同）。

ΔｔｈｒＬＡＢＣ：：Ｃｍを移入するために、ファージＰ１形質導入法を用いた。ＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ ΔｍｅｔＡ株への形質導入には、ＭＧ１６５５ ΔｔｈｒＬＡＢＣ：：Ｃｍ株のファージ溶解液の調製物を用いた。次に、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、ΔｔｈｒＬＡＢＣ：：Ｃｍを、従前に定義されているオリゴヌクレオチドｔｈｒＬＦおよびｔｈｒＣＲを用いたＰＣＲ分析により確認した。保持した株をＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ ΔｍｅｔＡ ΔｔｈｒＬＡＢＣ：：Ｃｍと呼称した。

クロラムフェニコール耐性カセットを除去した。クロラムフェニコール耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するＦＬＰリコンビナーゼを有するプラスミドｐＣＰ２０を、次に、エレクトロポレーションによって組換え部位に導入した。４２℃での一連の培養の後、クロラムフェニコール耐性カセットが存在しないことを、従前に用いたものと同じオリゴヌクレオチド（（ｐｙｋＦＦ／ｐｙｋＦＲ、ｍｅｔＡＦ／ｍｅｔＡＲおよびｔｈｒＬＦ／ｔｈｒＣＲ）を用いたＰＣＲ分析により確認した。保持した株をＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ ΔｍｅｔＡ ΔｔｈｒＬＡＢＣと呼称した。

５．４ − 大腸菌(Escherichia coli)のＬ−ホモセリントランスアミナーゼｓｅｒＣの過剰発現のためのプラスミドの構築：ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ ^＊ １−ｓｅｒＣプラスミド
ｓｅｒＣ遺伝子の発現を増加させるために、すでに記載されているｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ^＊１（ＰＣＴ＿ＷＯ２００８７０７０４１）から、その適正なプロモーターを用いて、その遺伝子を発現させた。

この目的で、ｓｅｒＣ遺伝子を、オリゴヌクレオチドｓｅｒＣ ＦおよびｓｅｒＣ Ｒを用いて、大腸菌（E. coli）ゲノムから増幅した。このＰＣＲ産物を、酵素ＸｂａＩおよびＳｍａＩを用いて制限酵素処理し、同じ制限酵素で制限酵素処理したベクターｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ^＊１にクローニングした。得られたベクターをｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ^＊１−ｓｅｒＣと呼称した。
以下の領域:
・遺伝子ｓｅｒＣの配列（９５６６１９〜９５６６４４）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（大文字）、
・ＸｂａＩ部位を有する領域（太字の大文字）
を有する、

。
以下の領域：
・遺伝子ｓｅｒＣ領域の配列（９５８０２８〜９５８００４）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（大文字）、
・ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する領域（太字の大文字）
を有する、

。

ＰＣＲ増幅した断片を制限酵素ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ベクターｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ^＊１のＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、ベクターｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ^＊１−ｓｅｒＣを得た。

５．５ − 大腸菌(Escherichia coli)の３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドレダクターゼｙｑｈＤ遺伝子およびラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)の４−ヒドロキシ−２−ケトブチレートデカルボキシラーゼｋｉｖＤ遺伝子の過剰発現のためのプラスミドの構築：ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１ ^＊ ２−ｙｑｈＤ−ｋｉｖＤｌｌ−ＴＴ０７プラスミド
ｐＭＥ１０１−ｙｑｈＤ−ｋｉｖＤｌｌ−ＴＴ０７プラスミドをまず構築した。ＢｓｒＢＩおよびＢｇｌＩＩで制限酵素処理したｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ＴＴ０７ベクター（ＰＣＴ／２００９／０６７９９４）のｋｉｖＤｌｌ遺伝子を、ＳｎａＢＩおよびＢｇｌＩＩで制限酵素処理したｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤベクター（ＰＣＴ／２００７／０００５０９においてすでに記載されている）にクローニングし、得られたプラスミドをｐＭＥ１０１−ｙｑｈＤ−ｋｉｖＤｌｌ−ＴＴ０７と呼称した。

次に、ｙｑｈＤおよびｋｉｖＤｌｌ遺伝子を、オリゴヌクレオチドＰｔｒｃ０１−ＲＢＳ０１−ｙｑｈＤ ｐＢＢＲ ＦおよびｋｉｖＤ ｐＢＢＲ Ｒを用いて、ｐＭＥ１０１−ｙｑｈＤ−ｋｉｖＤｌｌ−ＴＴ０７プラスミドからＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ産物を制限酵素ＳｐｅＩおよびＳｍａＩで消化し、同じ酵素で制限酵素処理したベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ５(M. E. Kovach, (1995), Gene 166:175-176)にクローニングし、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１^＊２−ｙｑｈＤ−ｋｉｖＤｌｌ−ＴＴ０７ベクターを得た。

・ＳｐｅＩ制限部位の付加に関する領域（太字の大文字）
・構成型Ｐｔｒｃプロモーター配列の付加に関する領域（太字の小文字）
・ＢａｍＨＩ制限部位の付加に関する領域（斜体の大文字）
・リボソーム結合部位配列の付加に関する領域（下線の小文字）
・ＭＧ１６５５ ｙｑｈＤ遺伝子の配列（３１５３３７７〜３１５３４０２）(http://www.ecogene.org/)と相同な領域（斜体の小文字）

・ＳｍａＩ制限部位の付加に関する領域（太字斜体の大文字）
・Ｔ７ファージ由来のＴ７Ｔｅ転写ターミネーター配列に関する領域（下線の大文字）(Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.)、
・ＳｎａＢＩ−ＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩ制限部位の付加に関する領域（太字の大文字）
・合成ｋｉｖＤ遺伝子の末端と相同な領域（斜体の大文字）

ＸＸ ＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ ΔｍｅｔＡ ΔｔｈｒＬＡＢＣ（ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ^＊１−ｓｅｒＣ） （ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１^＊２−ｙｑｈＤ−ｋｉｖＤｌｌ−ＴＴ０７）株の構築。
ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ^＊１−ｓｅｒＣおよびｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１^＊２−ｙｑｈＤ−ｋｉｖＤｌｌ−ＴＴ０７プラスミドを、次に、ＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＡ ΔｐｙｋＦ ΔｔｈｒＬＡＢＣ株に導入した。

実施例６
スクロースでの１．３−プロパンジオール経路フラックスが増大された、４−ヒドロキシ−２−ケトブチレートデカルボキシラーゼコード遺伝子および３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドレダクターゼコード遺伝子、ならびにスクロース非ＰＴＳ輸送系を発現する株の構築：ＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ ΔｍｅｔＡ ΔｔｈｒＬＡＢＣ（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１^＊２−ｙｑｈＤ−ｋｉｖＤｌｌ−ＴＴ０７）（ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ^＊１−ｓｅｒＣ）（ｐＫＪＬ１０１−１）

ｐＫＪＬ１０１−１プラスミドは他の部分で記載した(Jahreis, K. et al. 2002. Adaptation of sucrose metabolism in the Escherichia coli wild-type strain EC3132. J. Bact. P5307-5316)。

ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ^＊１−ｓｅｒＣ、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１^＊２−ｙｑｈＤ−ｋｉｖＤｌｌ−ＴＴ０７およびｐＫＪＬ１０１−１プラスミドをＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＡ ΔｐｙｋＦ ΔｔｈｒＬＡＢＣ株に導入した。

実施例７
１，３−プロパンジオール生産のための培養
株の性能を、４．５ｍＭトレオニン、５ｍＭメチオニン、１０ｇ／ｌ ＭＯＰＳおよび１０ｇ／ｌスクロースまたはグルコースを添加し、ｐＨ６．８に調整した改変Ｍ９培地(Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128)を用いて、５００ｍｌバッフル付エルレンマイヤーフラスコでの培養により評価した。スペクチノマイシンおよび／またはゲンタマイシンは、必要であれば、５０ｍｇ／ｌの濃度で加え、および／または、クロラムフェニコールは、必要であれば、６０ｍｇ／ｌの濃度で加えた。発現ベクターｐＭＥ１０１が存在する場合には、その誘導のために１００μＭ ＩＰＴＧも加えた。２４時間培養した前培養物を用いて、ＯＤ_{６００ｎｍ}が約０．１となるように５０ｍｌの培養物に植菌した。培養物は、３７℃および２００ｒｐｍで増殖させ、培養培地中のスクロースが枯渇するまで行った。この時点において、残留する糖および主産物を、分離用のバイオラド社製ＨＰＸ ９７Ｈカラムおよび検出用の屈折計を用いてＨＰＬＣにより分析した。１，３−プロパンジオールの生産は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより確認した。

異なる株の性能を下表に示す。

上表から分かるように、ヒドロキシケト酸デカルボキシラーゼおよび３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドレダクターゼを発現する株は、Ｌ−ホモセリンの生産のためのフラックスがｐｙｋＦの欠失およびｔｈｒＡ^＊１の過剰発現を通じて増大し、Ｌ−ホモセリンの形質転換がｍｅｔＡおよびｔｈｒＡＢＣの欠失によって減少し、Ｌ−ホモセリンの４−ヒドロキシ−２−ケトブチレートへの形質転換がｓｅｒＣの過剰発現によって触媒作用を受ける場合に、スクロースからＰＤＯを生産する。本発明者らが知る限り、野生型大腸菌における任意の炭素源でのＰＤＯの生産は示されておらず、上記改変によって大腸菌野生型ＰＤＯ非生産株がＰＤＯ生産株へと変わることが示される。

実施例８
ＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ ΔｍｅｔＡ ΔｔｈｒＬＡＢＣ ΔＲＮ／ｙｆｄＣ−ｄｓｄＸ：：ｃｓｃＢ^＊（Ｑ３５３Ｈ）ＫＡＲ^＊ ΔｃｓｃＲ：：Ｋｍ（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１^＊２−ｙｑｈＤ−ｋｉｖＤｌｌ−ＴＴ０７）（ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ^＊１−ｓｅｒＣ）株の構築
実施例７から分かるように、スクロースでのＰＤＯ生産株（ｐＫＪＬ１０１．１によりスクロース輸送系を組み込んでいる）は参照株よりも生産するＰＤＯが少ないように思われる。これは、その株に含まれる３つの異なるベクターに起因する安定性問題を示していると考えられる。そのため、本発明者らは、より安定した株を得るために、スクロース輸送系を染色体上に導入することとした。

８．１ ＭＧ１６５５ ΔＲＮ／ｙｆｄＣ−ｄｓｄＸ：：ｃｓｃＢ ^＊ （Ｑ３５３Ｈ）ＫＡＲ ^＊ ：：Ｃｍ株の構築
スクロースを唯一の炭素源として増殖可能な株を構築するために、ｃｓｃ遺伝子を、ＬＪＭ１１５株からのＰ１ファージ溶解液を用いてＭＧ１６５５株に形質導入した(Jahreis K., Bentler L., Bockmann J., Hans S., Meyer A., Siepelmeyer J., Lengeler J.W. J. Bact. 2002. 184(19):5307-5316)。

クロラムフェニコール耐性組換え体を選択し、ｃｓｃ遺伝子の存在を、プライマーＯｐｇ ０５９０＿ｙｆｄＣ ｓｅｑ（配列番号２７）およびＯｐｇ １２４２＿ｄｓｄＸ−ｄｓｄＡ ｓｅｑ（配列番号２８）を用いたＰＣＲにより確認した。確認済みの選択株をＭＧ１６５５ ΔＲＮ／ｙｆｄＣ−ｄｓｄＸ：：ｃｓｃＢ^＊（Ｑ３５３Ｈ）ＫＡＲ^＊：：Ｃｍと呼称した。

（配列２４６３９４８〜２４６３９６７と相同）

（配列２４７７６２４〜２４７７６０４と相同）

８．２ ＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ ΔｍｅｔＡ ΔｔｈｒＬＡＢＣ ΔＲＮ／ｙｆｄＣ−ｄｓｄＸ：：ｃｓｃＢ ^＊ （Ｑ３５３Ｈ）ＫＡＲ ^＊ ΔｃｓｃＲ：：Ｋｍ株の構築
ｃｓｃＲ遺伝子を欠失させるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することを可能とする。この目的で、下記のオリゴヌクレオチドを用いた。

・ｃｓｃＲ遺伝子の末端と相同な領域（太字の大文字）、
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（下線の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)

・ｃｓｃＲ遺伝子の開始部位と相同な領域（太字の大文字）、
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（下線の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）

オリゴヌクレオチドＯｄｉ ０１９５＿ｃｓｃＲ：：Ｃｍ ＦおよびＯｄｉ ０１９６＿ｃｓｃＲ：：Ｃｍ Ｒを用いて、プラスミドｐＫＤ４からカナマイシン耐性カセットを増幅した。得られたＰＣＲ産物を、次に、エレクトロポレーションによってＭＧ１６５５ ΔＲＮ／ｙｆｄＣ−ｄｓｄＸ：：ｃｓｃＢ^＊（Ｑ３５３Ｈ）ＫＡＲ^＊：：Ｃｍ株に導入した。次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、上記のオリゴヌクレオチドＯｐｇ １２４２＿ｄｓｄＸ−ｄｓｄＡ ｓｅｑ（配列番号２８）および下記に定義されるＯｐｇ ０５１１＿ｃｓｃ８（配列番号３１）を用いたＰＣＲ分析により確認した。保持した株をＭＧ１６５５ ΔＲＮ／ｙｆｄＣ−ｄｓｄＸ：：ｃｓｃＢ^＊（Ｑ３５３Ｈ）ＫＡＲ^＊ ΔｃｓｃＲ：：Ｋｍと呼称した。

（ｃｓｃＡ遺伝子の配列と相同）

ΔＲＮ／ｙｆｄＣ−ｄｓｄＸ：：ｃｓｃＢ^＊（Ｑ３５３Ｈ）ＫＡＲ^＊ ΔｃｓｃＲ：：Ｋｍ染色体改変を移入するために、ファージＰ１形質導入法を用いた。５．３に記載したＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ ΔｍｅｔＡ ΔｔｈｒＬＡＢＣ株への形質導入には、ＭＧ１６５５ ΔＲＮ／ｙｆｄＣ−ｄｓｄＸ：：ｃｓｃＢ^＊（Ｑ３５３Ｈ）ＫＡＲ^＊ ΔｃｓｃＲ：：Ｋｍ株のファージ溶解液の調製物を用いた。

次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、ΔＲＮ／ｙｆｄＣ−ｄｓｄＸ：：ｃｓｃＢ^＊（Ｑ３５３Ｈ）ＫＡＲ^＊ ΔｃｓｃＲ：：Ｋｍを、従前に定義されているオリゴヌクレオチドＯｐｇ １２４２＿ｄｓｄＸ−ｄｓｄＡ ｓｅｑ／Ｏｐｇ ０５１１＿ｃｓｃ８を用いたＰＣＲ分析により確認した。保持した株をＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ ΔｍｅｔＡ ΔｔｈｒＬＡＢＣ ΔＲＮ／ｙｆｄＣ−ｄｓｄＸ：：ｃｓｃＢ^＊（Ｑ３５３Ｈ）ＫＡＲ^＊ ΔｃｓｃＲ：：Ｋｍと呼称した。

８．３ ＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ ΔｍｅｔＡ ΔｔｈｒＬＡＢＣ ΔＲＮ／ｙｆｄＣ−ｄｓｄＸ：：ｃｓｃＢ ^＊ （Ｑ３５３Ｈ）ＫＡＲ ^＊ ΔｃｓｃＲ：：Ｋｍ（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１ ^＊ ２−ｙｑｈＤ−ｋｉｖＤｌｌ−ＴＴ０７）（ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ ^＊ １−ｓｅｒＣ）株の構築
ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ^＊１−ｓｅｒＣおよびｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１^＊２−ｙｑｈＤ−ｋｉｖＤｌｌ−ＴＴ０７プラスミド（５．４および５．５に記載した）を、最後に、ＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＡ ΔｐｙｋＦ ΔｔｈｒＬＡＢＣ ΔＲＮ／ｙｆｄＣ−ｄｓｄＸ：：ｃｓｃＢ^＊（Ｑ３５３Ｈ）ＫＡＲ^＊ ΔｃｓｃＲ：：Ｋｍ株に導入した。得られた株をＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ ΔｍｅｔＡ ΔｔｈｒＬＡＢＣ ΔＲＮ／ｙｆｄＣ−ｄｓｄＸ：：ｃｓｃＢ^＊（Ｑ３５３Ｈ）ＫＡＲ^＊ ΔｃｓｃＲ：：Ｋｍ（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１^＊２−ｙｑｈＤ−ｋｉｖＤｌｌ−ＴＴ０７）（ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ^＊１−ｓｅｒＣ）と呼称した。

実施例９
スクロースでの新規生産株の培養
株１：実施例５．５に記載したＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ ΔｍｅｔＡ ΔｔｈｒＬＡＢＣ（ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ^＊１−ｓｅｒＣ）（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１^＊２−ｙｑｈＤ−ｋｉｖＤｌｌ−ＴＴ０７）；
株２：実施例８．３に記載したＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ ΔｍｅｔＡ ΔｔｈｒＬＡＢＣ ΔＲＮ／ｙｆｄＣ−ｄｓｄＸ：：ｃｓｃＢ^＊（Ｑ３５３Ｈ）ＫＡＲ^＊ ΔｃｓｃＲ：：Ｋｍ（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０１／ＲＢＳ０１^＊２−ｙｑｈＤ−ｋｉｖＤｌｌ−ＴＴ０７）（ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ^＊１−ｓｅｒＣ）。

生産株を、小エルレンマイヤーフラスコで、４．５ｍＭトレオニン、５ｍＭメチオニンおよび１０ｇ．Ｌ^−１ ＭＯＰＳを添加し、ｐＨ６．８に調整した改変Ｍ９培地(Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128)を用いて評価した。株１では、グルコースを１０ｇ．Ｌ^−１の濃度で加え、株２では、スクロースを１０ｇ．Ｌ^−１の濃度で加えた。

５ｍＬの前培養物を、混合培地（２．５ｇ．Ｌ^−１グルコースまたはスクロースを含む１０％ＬＢ培地（シグマ ２５％）および９０％上記最少培地）中で３７℃で６．５時間増殖させた。それを用いて、最少培地においてＯＤ_６００が０．１となるように５０ｍＬの培養物に植菌した。発現ベクターｐＭＥ１０１の誘導のために、ＩＰＴＧ（１００μＭ）も加えた。必要であれば、抗生物質を、カナマイシンおよびスペクチノマイシンは５０ｍｇ．Ｌ^−１、ゲンタマイシンは１０ｍｇ．Ｌ^−１の濃度で加えた。培養温度は３７℃であった。培養物のＯＤ_６００が７〜９に達したときに、細胞外代謝産物を、屈折率測定検出を用いたＨＰＬＣを用いて分析した（有機酸およびスクロース）。１，３−プロパンジオールの生産は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより確認した。株２については、４反復を行った。

上表から分かるように、炭素源としてのスクロースからのＰＤＯ生産は、グルコースを炭素源とした場合と同程度である。
（１）スクロースからの１，３−プロパンジオールの生物学的生産のために遺伝的に改変された微生物であって、
・２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素により、４−ヒドロキシ−２−ケトブチレートを脱炭酸する第１段階、および、ヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素により、得られた３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを還元する第２段階を含んでなる、１，３−プロパンジオールの生産のための二段階代謝経路と、
・該微生物が、唯一の炭素源としてスクロースを利用できるようにする遺伝子と
を含んでなる、微生物。
（２）ＰＴＳスクロース利用系および／または非ＰＴＳスクロース利用系をコードする機能的遺伝子を含んでなる、上記（１）に記載の微生物。
（３）遺伝子ｓｃｒＫＹＡＢＲまたはｓｃｒＫＹＡＢの導入により改変されている、上記（２）に記載の微生物。
（４）遺伝子ｃｓｃＢＫＡＲまたはｃｓｃＢＫＡの導入により改変されている、上記（２）に記載の微生物。
（５）２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素が内在性遺伝子によりコードされる、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物。
（６）２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする内在性遺伝子の発現が増強される、上記（５）に記載の微生物。
（７）２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素が異種遺伝子によりコードされる、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物。
（８）上記（１）〜（７）のいずれかに記載の微生物であって、該微生物において、スクロースからの４−ヒドロキシ−２−ケトブチレートの生産が改善されている、微生物。
（９）細菌、酵母および真菌からなる群の中から選択される、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の微生物。
（１０）腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、クロストリジウム科(Clostridiaceae)、バチルス科(Bacillaceae)、ストレプトミセス科(Streptomycetaceae)およびコリネバクテリウム科(Corynebacteriaceae)の中から選択される、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の微生物。
（１１）スクロースからの１，３−プロパンジオールの発酵生産方法であって、
・スクロースを含んでなる適当な培養培地において、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の微生物を培養する工程および
・該培養培地から１，３−プロパンジオールを回収する工程
を含んでなる、方法。
（１２）１，３−プロパンジオールがさらに精製される、上記（１１）に記載の方法。

参照文献（本文での引用順）

Claims (6)

1. スクロースからの１，３−プロパンジオールの生物学的生産のために遺伝的に改変された種Esherichia coli由来の微生物であって、
   ・遺伝子発現が増強される内在性遺伝子によりまたは異種遺伝子によりコードされる２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素により、４−ヒドロキシ−２−ケトブチレートを脱炭酸する第１段階、および、ヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素により、得られた３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを還元する第２段階を含んでなる、１，３−プロパンジオールの生産のための二段階代謝経路と、
   ・該微生物が、唯一の炭素源としてスクロースを利用できるようにする、ＰＴＳスクロース利用系および／または非ＰＴＳスクロース利用系をコードする機能的遺伝子と
   を含んでなる、微生物。
2. 遺伝子ｓｃｒＫＹＡＢＲまたはｓｃｒＫＹＡＢの導入により改変されている、請求項１に記載の微生物。
3. 遺伝子ｃｓｃＢＫＡＲまたはｃｓｃＢＫＡの導入により改変されている、請求項１に記載の微生物。
4. 請求項１〜３に記載の微生物であって、該微生物において、スクロースからの４−ヒドロキシ−２−ケトブチレートの生産が改善されている、微生物。
5. スクロースから１，３−プロパンジオールを発酵生産する方法であって、
   ・スクロースを含んでなる適当な培養培地において、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物を培養する工程および
   ・該培養培地から１，３−プロパンジオールを回収する工程
   を含んでなる、方法。
6. １，３−プロパンジオールがさらに精製される、請求項５に記載の方法。

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