MX2011004842A - Uso de sacarosa como sustrato para la produccion fermentativa de 1,2-propanodiol. - Google Patents

Abstract

La presente invención está relacionada con un procedimiento para producir 1,2-propanodiol por fermentación, que comprende: el cultivo de un microorganismo que produce 1,2-propanodiol en un medio apropiado que comprende una fuente de sacarosa y la recuperación del 1,2-propanodiol que se está produciendo, en el que el microorganismo es capaz de utilizar sacarosa como única fuente de carbono para la producción de 1 ,2-propanodiol; en un aspecto preferente de la invención, la fuente de sacarosa se obtiene a partir de biomasa, en particular, a partir de biomasa vegetal, particularmente de jugo de caña de azúcar.

Description

USO DE SACAROSA COMO SUSTRATO PARA LA PRODUCCIÓN FERMENTATIVA PE 1 ,2-PROPANODIOL CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a procedimientos de fermentación, a microorganismos y a sustratos útiles para la fermentación. En particular, la presente invención se refiere a la producción de 1 ,2-propanodiol mediante fermentación, a partir de un medio que contiene sacarosa, en particular procedente de biomasa vegetal.

El 1 ,2-propanodiol o propilenglicol, un dialcohol C3, es un producto químico muy utilizado. Es un componente de resinas de poliéster no saturado, detergentes líquidos, refrigerantes y líquidos anticongelantes y de deshielo para aviones. El propilenglicol se ha ido utilizando cada vez más desde 1993-1994 como un producto de sustitución para los derivados del etileno, considerados más tóxicos que los derivados del propileno.

En la actualidad, el 1 ,2-propanodiol se produce químicamente mediante un procedimiento de hidratación del óxido de propileno que requiere grandes cantidades de agua. El óxido de propileno puede producirse mediante dos procedimientos: utilizando epiclorhidrina o hidroperóxido. Ambos utilizan sustancias de elevada toxicidad. Asimismo, la vía con hidroperóxido genera subproductos como el terc-butanol y el 1-feniletanol. Para que la producción de propileno sea óptima, se debe encontrar un uso para estos subproductos.

La vía química generalmente produce 1 ,2-propanodiol racémico, mientras que los dos estereoisómeros, (R) 1 ,2-propanodiol y (S) 1 ,2-propanodiol, son de interés para determinadas aplicaciones (por ej. materiales de inicio quirales para productos químicos y productos farmacéuticos especializados).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las desventajas del procedimiento químico para la producción de 1 ,2-propanodiol hacen que la síntesis biológica sea una alternativa interesante. Los microorganismos caracterizan dos vías para la producción natural de 1 ,2-propanodiol a partir de azúcares. En la primera vía, 6-desoxíazúcares (por ej. L-ramnosa o L-fucosa) se separan en fosfato de dihidroxiacetona y (S)-lactaldehído, que se pueden reducir a su vez en (S)-1 ,2-propanodiol (Badia y col, 1985). Esta vía es funcional en E. coli, pero no es económicamente viable debido al elevado coste de las desoxihexosas. La segunda vía es el metabolismo de azúcares comunes (por ej. glucosa o xilosa) a través de la ruta de la glucólisis seguida de la ruta del metilglioxal. El fosfato de dihidroxiacetona se convierte en metilglioxal, que se puede reducir a lactaldehído o acetol. Estos dos compuestos pueden someterse entonces a una segunda reacción de reducción que da lugar a 1 ,2-propanodiol. Esta vía es utilizada por los productores naturales de (R)-1 ,2-propanodiol, como Clostridium sphenoides y Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum. Estos dos organismos han sido usados para producir 1 ,2-propanodiol a partir de diferentes azúcares, a saber, monosacáridos (D-glucosa, D-manosa, D-galactosa para las hexosas y D-xilosa o L-arabinosa para las pentosas) o disacáridos (lactosa o celobiosa) o mezclas (Tran Din y Gottschalk, 1985, Cameron y Cooney, 1986, Sánchez-Rivera y cois., 1987, Altaras y cois., 2001). El mejor rendimiento obtenido fue de un valor de 9 g/l y una producción a partir de glucosa de 0.2 g/g (Sánchez-Rivera y cois., 1987). Sin embargo, es probable que la mejora del rendimiento obtenido con estos organismos sea limitada debido a la escasez de herramientas genéticas disponibles. La misma ruta de síntesis es funcional en E. coli u otras enterobacterias, y el grupo de Cameron ha realizado varias investigaciones (Cameron y cois., 1998, Altaras y Cameron, 1999, Altaras y Cameron, 2000) así como el grupo de Bennett (Huang y cois., 1999, Berrios-Rivera y cois., 2003) para la producción de 1 ,2-propanodiol en este organismo con fuentes de carbono limitadas a D-glucosa o D-fructosa. El mejor resultado obtenido en un fermentador de cultivo por lotes (fed-batch) fue una producción de 4,5 g/l de 1 ,2-propanodiol con una producción de 0.19 g/g de glucosa (Altaras y Cameron, 2000). En la patente WO 98/37204, también se describen resultados obtenidos con el mismo enfoque pero con valores y producciones menores, aunque usando diferentes fuentes de carbono, a saber galactosa, lactosa, sacarosa y xilosa, pero también glucosa. Los valores obtenidos con los disacáridos (lactosa y sacarosa) fueron muy bajos (6 mg/l y 7 mg/l, respectivamente). Los mejores resultados de producción se describieron con una cepa racionalmente diseñada y evolucionada de E. coli en la solicitud de patente WO 2005/073364. Se obtuvo un valor de 1 ,2-propanodiol de 1 ,8 g/l, con una producción de 0.35 g/g de glucosa consumida. La producción de 1 ,2-propanodiol e hidroxiacetona también se describió usando una levadura recombinante en la patente WO 99/28481.

Las fuentes de carbono usadas en los medios de fermentación generalmente están compuestas por hidratos de carbono, principalmente derivados de vegetales. La sacarosa se obtiene a partir de plantas de azúcar, como remolacha azucarera, caña de azúcar, sorgo dulce, arce de azúcar, palmas de azúcar o agaves azules. El almidón es el hidrato de carbono de almacenamiento más abundante en las plantas. Las fuentes de almidón más importantes son los cereales (trigo, maíz, arroz), la mandioca, las batatas y las patatas. El almidón no es metabolizado por la mayoría de los microorganismos, pero puede ser procesado hasta materias primas fermentables por la industria del almidón. La inulina o los polímeros tipo inulina (formados principalmente por unidades de fructosa) son los segundos hidratos de carbono de almacenamiento más abundantes en los vegetales y se encuentran en la achicoria, la pataca, o la dalia. La biomasa lignocelulósica compuesta por celulosa, hemicelulosa y lignina es también una fuente de hidratos de carbono prometedora pero aún está en desarrollo (Peters, 2006). Como el coste de los productos químicos de partida producidos mediante biotecnología están principalmente asociados al coste de la materia prima (es decir, el coste del sustrato de la fermentación), el uso de azúcares refinados como la glucosa o la sacarosa no es una opción económicamente sostenible para la producción a escala industrial. Se requieren sustratos menos caros que conserven un alto contenido de azúcar fermentable. En este aspecto, las fuentes de carbono que contienen sacarosa, procedentes de la industria azucarera son una buena opción.

La sacarosa se produce a partir de remolacha azucarera que contiene de 16 a 24% de sacarosa procesando la remolacha azucarera en varios pasos. Las remolachas limpias y lavadas se cortan en tiras largas llamadas virutas o cossettes que se extraen con agua caliente por difusión para obtener un jugo de sacarosa llamado jugo sin refinar y que contiene de 10 a 15% de sacarosa. El segundo paso es la purificación del jugo sin refinar por alcalinización y carbonatación usando cal seca y después dióxido de carbono para eliminar las impurezas y obtener un jugo fino. El proceso de evaporación aumenta la concentración de sacarosa en el jugo fino eliminando el agua para obtener un jugo grueso con un contenido en sacarosa del 50 al 65%. Este jugo de sacarosa concentrado después se cristaliza y los cristales se separan por centrifugación y después se lavan y secan para obtener azúcar puro. Se pueden aplicar uno o más pasos de cristalización para obtener sacarosa de varios grados de pureza. Los subproductos del procesado de la remolacha azucarera incluyen pulpa (las virutas secas) y melazas (el licor original de la cristalización que aún tiene un contenido de sacarosa del 40 al 60%).

La industria azucarera también produce sacarosa a partir de la caña de azúcar (7 a 20% de contenido de sacarosa). La caña de azúcar recolectada se limpia antes del proceso de molido para extraer el jugo. La estructura de la caña se rompe y después se muele y a la vez la sacarosa se extrae con agua para obtener el jugo sin retinar. La caña prensada seca de azúcar se llama bagajo. Este residuo se usa principalmente como fuente de combustible para generar el vapor del proceso. El jugo sin retinar después se clarifica añadiendo cal seca y calentando y el jugo clarificado se separa del precipitado. Los últimos pasos del procedimiento, la evaporación para obtener un sirope concentrado y la cristalización, son esencialmente lo mismo para el procesado de la remolacha azucarera. Los subproductos del procesado de la caña de azúcar incluyen bagajo, la torta de filtración de la clarificación del jugo sin retinar y diferentes tipos de melazas, aún contienen una cantidad significativa de sacarosa.

Los diferentes productos intermedios que contienen sacarosa o subproductos de los procesados del azúcar (jugo bruto, jugo fino o clarificado, jugo grueso, sirope de sacarosa, sacarosa pura, melazas) pueden servir de materias primas para la fermentación. Por ejemplo, la industria azucarera de Brasil está usando el jugo de caña de azúcar clarificado para producir etanol y usarlo como sustituto de la gasolina. Los ejemplos recientes de la bibliografía que usan productos que contienen sacarosa cruda incluyen la producción de etanol a partir de jugo de difusión de remolacha azucarera por Zymomonas mobilis (Beckers y cois., 1999), producción de D-lactato a partir de melazas por E. coli (Shukla y cois., 2004) y producción de D-lactato a partir de melazas de caña de azúcar, jugo de caña de azúcar o jugo de remolacha azucarera por Lactobacillus delbrueckii (Calabia y cois., 2007).

Se han caracterizado dos sistemas diferentes para la ingesta y utilización de sacarosa en bacterias positivas para la sacarosa (es decir, bacterias capaces de utilizar sacarosa).

El primero se basa en un sistema sacarosa fosfotransferasa dependiente de fosfoenolpiruvato (PEP), o sacarosa PTS, en el que la sacarosa es ingerida y fosforilada usando fosfoenolpiruvato (PEP) como donante para producir sacarosa-6-fosfato intracelular. Después la sacarosa-6-fosfato se hidroliza hasta D-glucosa-6-fosfato y D-fructosa por una invertasa. La D-fructosa se fosforila adicionalmente a D-fructosa-6-fosfato por una fructoquinasa dependiente de ATP y después pasa al metabolismo central. Dicho sistema ha sido descrito en varias especies bacterianas, gram-positivas y gram-negativas. Entre las Enterobacteriaceae, más del 90% de Klebsiella silvestre pero menos del 50% de las cepas de Escherichia y menos del 10% de las cepas de Salmonella son positivas a sacarosa.

Se ha aislado un plásmido conjugativo pUR400 con los genes scrKYABR que codifican la sacarosa PTS a partir de Salmonella (Schmid y cois., 1982, Schmid y cois , 1988).

Más recientemente se descubrió un segundo sistema no PTS en E. coli EC3132 (Bockmann y cois., 1992). Este sistema implica los genes cscBKAR que codifican un sistema de transporte simporte sacarosa:protón (CscB), una fructoquinasa (CscK), una invertasa (CscA) y un represor específico de sacarosa (CscR).

Escherichia coli K12 y sus derivados (incluyendo MG1655) no pueden utilizar sacarosa. Sin embargo, esta capacidad puede conferirse transfiriendo los genes que codifican los dos sistemas descritos anteriormente. Eso ha sido demostrado transfiriendo el plásmido pUR400 en E. coli K12 (Schmid y cois., 1982) o diferentes plásmidos (incluyendo pKJL101-1 ) que portan los genes cscBKAR en una cepa negativa para sacarosa de E. coli (Jahreis y cois., 2002). Para aplicación industrial, la producción de triptófano a partir de sacarosa ha quedado documentada en E. coli K12 (Tsunekawa y cois., 1992), se demostró la producción de hidrógeno en E. coli con el plásmido pUR400 (Penfold y Macaskie, 2004) y la producción de diferentes aminoácidos transfiriendo ambos sistemas, PTS y no PTS, descritos en la solicitud de patente EP1 14991 1.

La producción de 1 ,2-propanodiol a partir de sacarosa es mencionada en Clostridium thermosaccharolyticum (denominado después T. thermosaccharolyticum) por Cameron y Cooney (1986) pero sólo se registraron trazas mientras que se obtuvo una cantidad de más de 3 g/l con producciones de más de 0.1 g/g con otras fuentes de carbono.

La producción de 1 ,2-propanodiol a partir de sacarosa también se menciona en la solicitud de patente WO 98/37204. Sin embargo, la cepa E. coli AA200 transformada con el plásmido pSEARX sólo produce 7 mg/l de 1 ,2-propanodiol a partir de 10 g/l sacarosa, mientras que el mismo microorganismo produce de 49 a 71 mg/l de 1 ,2-propanodiol a partir de monosacáridos. Estas cantidades tan bajas de producción plantean dudas sobre la verdadera capacidad de estos organismos para producir 1 ,2-propanodiol a partir de sacarosa. Según nuestra opinión, la cepa AA200, que deriva de E. coli K12, no debe tener la capacidad de importar y metabolizar la sacarosa.

Estos informes previos indican claramente a los expertos en la materia que el uso de sacarosa para producir 1 ,2-propanodiol no fue una buena opción.

Sorprendentemente, introduciendo diferentes sistemas para la utilización de sacarosa en las cepas de E. coli incapaces de utilizar la sacarosa, los inventores de la presente invención fueron capaces de obtener un mejor rendimiento para la producción de 1 ,2-propanodiol a partir de sacarosa.

Además, los inventores demostraron que cualquier medio que contenga sacarosa, como un jugo o una melaza procedente de materias primas vegetales, puede emplearse como sustrato para la producción fermentativa de 1 ,2-propanodiol.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está relacionada con un procedimiento para producir 1 ,2-propanodiol por fermentación, que comprende. - el cultivo de un microorganismo que produce 1 ,2-propanodiol en un medio apropiado que comprende una fuente de sacarosa y la recuperación del 1 ,2-propanodiol que se está produciendo, en el que el microorganismo es capaz de utilizar sacarosa como única fuente de carbono para la producción de 1 ,2-propanodiol.

En particular, la invención describe el uso de un microorganismo modificado capaz de usar sacarosa como única fuente de carbono, obteniéndose dicha sacarosa de biomasa, en particular de biomasa vegetal.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se usan en este documento, los siguientes términos se pueden utilizar para la interpretación de las reivindicaciones y la memoria descriptiva.

Según la invención, los términos "cultivar", "cultivo", "crecimiento" y "fermentación" se utilizan indistintamente para indicar el crecimiento de bacterias en un medio de crecimiento apropiado que contenga una fuente de carbono simple. La fermentación es un procedimiento clásico que se puede realizar en condiciones aerobias, microaerobias o anaerobias.

El término "medio apropiado" según la invención indica un medio de composición molecular conocida adaptado al crecimiento del microorganismo. En particular, dicho medio contiene al menos una fuente de fósforo y una fuente de nitrógeno. Dicho medio apropiado es por ejemplo un medio de cultivo mineral de composición conocida adaptado a las bacterias utilizadas, conteniendo al menos una fuente de carbono. Dicho medio apropiado también puede referirse a cualquier líquido que comprenda una fuente de nitrógeno y/o una fuente de fósforo, siendo añadido dicho líquido y/o mezclado con la fuente de sacarosa. En particular, el medio de crecimiento mineral para Enterobacteriaceae puede ser por lo tanto tener una composición idéntica o similar al medio M9 (Anderson, 1946), al medio M63 (Miller, 1992) o a un medio como el definido por Schaefer y cois. (1999) y, en particular, el medio de cultivo mínimo llamado MML1 PG1 100 descrito a continuación: CUADRO 1 Composición del medio mínimo MML11 PG1 100 con glucosa como fuente de carbono El pH del medio se ajusta a 6.8 con hidróxido de sodio.

La fuente de carbono "glucosa" puede sustituirse en este medio por cualquier otra fuente de carbono, en particular por sacarosa o cualquier fuente de carbono que contenga sacarosa, como jugo de caña de azúcar o jugo de remolacha azucarera.

El medio de crecimiento para Clostridiaceae puede tener una composición idéntica al medio de crecimiento de clostridios (CGM, Wiesenborn y cois., 1987) o un medio de crecimiento mineral como el indicado por Monot y cois. (1982) o Vasconcelos y cois. (1994).

El término "sacarosa" glucosa se refiere a un disacárido de glucosa y fructosa unido por un enlace a(1 ,2)-glicosídico, con la fórmula molecular C12H22O11. Su nombre sistemático es a-D-glucopiranosil- (1 <- 2)-ß-D-fructofuranósido.

El término "fuente de sacarosa" se refiere a cualquier medio, líquido o sólido, que contiene sacarosa en diferentes concentraciones, en particular de 1 a 100% de sacarosa.

El término "que produce 1 ,2-propanodiol" significa que la producción del microorganismo en el caldo de cultivo puede registrarse sin ambigüedades con los medios analíticos estándar conocidos por los expertos en la materia. El límite de cuantificación de 1 ,2-propanodiol por HPLC, que es la técnica preferente usada para cuantificar este compuesto, es de 25 mg/l. Por lo tanto, el término "que produce 1 ,2-propanodiol" significa según la invención que los niveles de producción son superiores a 25 mg/l.

El término "capaz de utilizar sacarosa como única fuente de carbono" indica que el microorganismo puede crecer en un medio que contiene sacarosa como única fuente de carbono. Por lo tanto, la definición de un "microorganismo capaz de utilizar sacarosa como única fuente de carbono para la producción de 1 ,2-propanodiol" significa que el microorganismo, cuando crece en un medio que contiene sacarosa como única fuente de carbono, puede producir al menos 25 mg/l de 1 ,2-propanodiol. Se entiende sin embargo, que en el procedimiento para producir 1 ,2-propanodiol según la invención, la fuente de sacarosa en el medio de cultivo puede comprender otras fuentes de carbono además de la de sacarosa, como hexosas (como glucosa, galactosa o lactosa), pentosas, monosacáridos, disacáridos (como sacarosa, celobiosa o maltosa)), oligosacáridos, almidón o sus derivados, hemicelulosa, glicerol y sus combinaciones.

Según un aspecto preferente de la invención, el microorganismo ha sido genéticamente modificado para poder utilizar sacarosa como única fuente de carbono, para la producción de 1 ,2-propanodiol.

En una modalidad específica de la invención, el microorganismo comprende genes funcionales que codifican un sistema de utilización de sacarosa PTS. Un sistema de utilización de sacarosa PTS es un sistema de utilización de sacarosa basado en el transporte de sacarosa por un sistema de sacarosa fosfotransferasa dependiente de fosfoenolpiruvato (PEP). Un sistema de fosfotransferasa acopla el transporte de un azúcar (p.ej., sacarosa o glucosa) con la fosforilzación del azúcar que usa PEP como donante de fosfato. Después del transporte hacia la célula, la sacarosa-fosfato es escindida en glucosa-6-fosfato y fructosa por una invertasa. La fructosa se fosforila en fructosa-6-fosfato por una fructoquinasa. Los genes que codifican este sistema de utilización de sacarosa PTS pueden controlarse mediante una proteína reguladora.

En un aspecto preferente de la invención, el microorganismo expresa de forma natural, o ha sido modificado con la introducción de los genes: scrKYABR (scrK que codifica un fructoquinasa, scrY que codifica una porina, scrA que codifica la proteína IIBC, scrB que codifica una sacarosa-6-? invertasa, scrR que codifica un represor) de Salmonella. Se podría utilizar un plásmido conjugativo pUR400 que porta dichos genes scrKYABR para transformar el microorganismo. Se pueden utilizar todos estos genes en combinación, o en cualquier combinación que comprenda al menos un de dichos genes. En particular, el gen scrR puede omitirse.

La designación de estos genes tiene un significado más general según la invención, y abarca los genes correspondientes en otros microorganismos. Utilizando las referencias del GenBank de los genes de Salmonella, los expertos en la materia pueden determinar los genes equivalentes en otros organismos que no sean Salmonella.

Los expertos en la materia conocen muy bien los medios de identificación de las secuencias homologas y su porcentaje de homología e incluyen, en particular, los programas BLAST que se pueden utilizar en la página Web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ con los parámetros predeterminados indicados en la página Web. Las secuencias obtenidas se pueden utilizar (alinear) con, por ejemplo, el programa CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/), con los parámetros predeterminados indicados en las páginas Web.

La base de datos PFAM (base de datos de familias de proteínas de alineaciones y modelos ocultos de Markov http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) es una gran recolección de alineaciones de secuencias de proteínas. Con cada PFAM se pueden visualizar múltiples alineaciones, ver dominios de proteínas, evaluar las distribuciones entre los organismos, obtener acceso a otras bases de datos y visualizar estructuras proteicas conocidas.

Las COG (agrupaciones de grupos ortólogos de proteínas http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) se obtienen comparando las secuencias de proteínas que derivan de 66 genomas unicelulares de secuencias completas que representan 14 líneas filogenéticas principales. Cada COG se define a partir de al menos tres líneas, lo que posibilita la identificación de dominios antiguos.

En la actualidad, hay varias técnicas que los expertos en la materia utilizan para introducir ADN en una cepa bacteriana. Una técnica preferente es la electroporación, muy conocida por los expertos en la materia.

En otra modalidad específica de la invención, el microorganismo comprende genes funcionales que codifican un sistema de utilización de sacarosa no PTS. Un sistema de utilización de sacarosa no PTS es un sistema para la utilización de sacarosa basado en el transporte de sacarosa por un sistema independiente del fosfoenolpiruvato. Después del transporte hacia la célula, la sacarosa es escindida en glucosa y fructosa por una invertasa. La fructosa después se fosforila en fructosa-6-fosfato por una fructoquinasa y la glucosa se fosforila en glucosa-6-fosfato por una glucoquinasa. Los genes que codifican este sistema de utilización de sacarosa no PTS pueden controlarse mediante una proteína reguladora. En un aspecto preferente de la invención, el microorganismo expresa de forma natural o ha sido modificado con la introducción de los genes de E. coli EC3 32, es decir, los genes cscBKAR que codifican un sistema de transporte simporte sacarosa:protón (cscB), una fructoquinasa (cscK), una invertasa (cscA) y un represor especifico de sacarosa (cscR). Se pueden utilizar todos estos genes en combinación, o en cualquier combinación que comprenda al menos un de dichos genes. En particular, el gen cscR puede omitirse. También se pueden utilizar genes homólogos de otros organismos.

La designación de estos genes tiene un significado más general según la invención, y abarca los genes correspondientes en otros microorganismos. Utilizando las referencias del GenBank de los genes de E. coli, los expertos en la materia pueden determinar los genes equivalentes en otros organismos que no sean la E. coli (ya tratado anteriormente en este documento! En un aspecto específico de la invención, el microorganismo se caracteriza por una actividad mejorada de la ruta de biosíntesis de 1 ,2-propanodiol. Los microorganismos optimizados para la producción de 1 ,2-propanodiol han sido extensamente descritos en las solicitudes de patente WO 2005/073364, WO 2008/1 16853, WO 2008/1 16852 y WO 2008/1 16848, que han sido incorporadas como referencias.

Los microorganismos según la invención son bacterias, levaduras u hongos.

Preferentemente, el microorganismo se selecciona entre el grupo formado por Enterobacte aceae, Bacillaceae, Clostridiaceae, Streptomycetaceae y Corynebacteríaceae.

Más preferentemente, el microorganismo se selecciona entre el grupo formado por Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Clostridium sphenoides o Saccharomyces cerevisiae.

Los expertos en la materia pueden definir fácilmente las condiciones de cultivo para el procedimiento de fermentación. En particular, las bacterias fermentan a temperaturas entre 20 °C y 55 °C, preferentemente entre 25 °C y 40 °C y preferentemente a aproximadamente 35 °C en el caso de Clostridiaceae y aproximadamente 37 °C en el caso de Enterobacteriaceae.

Este procedimiento se puede realizar en un proceso discontinuo, en un proceso por lotes o en un proceso continuo. La fermentación es un procedimiento clásico que se puede realizar en condiciones aerobias, microaerobias o anaerobias.

"En condiciones aerobias" se refiere a que se proporciona oxigeno al cultivo disolviendo el gas en la fase líquida. Esto se puede lograr (1) rociando el oxígeno que contiene gas (por ejemplo, aire) en la fase líquida o (2) agitando el recipiente que contiene el medio de cultivo para transferir el oxígeno presente en el espacio superior a la fase líquida. Las ventajas de la fermentación en condiciones aerobias en lugar de condiciones anaerobias es que la presencia de oxígeno como aceptor de electrones mejora la capacidad de la cepa de producir más energía en forma de ATP para los procesos celulares. Por lo tanto, se mejora el metabolismo general de la cepa.

Las condiciones microaerobias se definen como las condiciones de cultivo en las que se disuelven bajos porcentajes de oxigeno (por ejemplo, utilizando una mezcla de gas que contiene entre 0.1 y 10% de oxígeno, completado con nitrógeno hasta llegar al 100%) en la fase líquida.

Las condiciones anaerobias se definen como las condiciones de cultivo en las que no se proporciona oxígeno al medio de cultivo. Las condiciones estrictamente anaerobias se logran rociando un gas inerte como el nitrógeno en el medio de cultivo para extraer rastros de otros gases. Se puede utilizar el nitrato como un aceptor de electrones para mejorar la producción de ATP de la cepa y mejorar su metabolismo.

En un aspecto específico de la invención, la fuente de sacarosa se obtiene a partir de biomasa, en particular, a partir de biomasa vegetal. Para preparar la materia prima empleada como fuente de sacarosa, se puede utilizar toda la planta o una parte específica de la misma. La preparación puede basarse en cualquier tratamiento que los expertos en la materia conozcan para extraer sacarosa a partir de una biomasa vegetal que contenga sacarosa.

En un aspecto preferente de la invención, la fuente de sacarosa se obtiene a partir de una planta escogida entre el grupo formado por: caña de azúcar, remolacha azucarera, sorgo dulce, arce de azúcar, palmas de azúcar o agaves azules.

La fuente de sacarosa puede obtenerse en particular a partir de caña de azúcar o remolacha azucarera.

Según la invención, se pueden utilizar diferentes formas de fuente de sacarosa, como un juego, un jugo concentrado, un sirope, un jugo clarificado, melazas o sacarosa cristalizada.

Una forma preferente es el jugo sin retinar de la caña de azúcar, directamente extraído de la planta sin ningún tratamiento. En resumen, la caña de azúcar recolectada se limpia antes del proceso de molido para extraer el jugo. La estructura de la caña se rompe y después se muele y a la vez la sacarosa se extrae con agua para obtener el jugo sin refinar.

El jugo sin refinar después puede clarificarse añadiendo cal seca y calentando y el jugo clarificado se separa del precipitado. El sirope concentrado se obtiene por evaporación.

En otra modalidad de la invención, la fuente de sacarosa puede ser un producto final, un producto intermedio o un subproducto de la industria de la caña de azúcar o de la remolacha azucarera.

Como algunas fuentes de sacarosa crudas, particularmente las obtenidas a partir de la biomasa antes indicada, contienen otros nutrientes que pueden ser utilizados para el crecimiento del microorganismo además de la fuente de carbono, un medio apropiado para el crecimiento de microorganismos se puede diseñar usando sólo la fuente de sacarosa, es decir el medio apropiado está formado por la fuente de sacarosa, o complementando la fuente de sacarosa con una fuente de fósforo y/o una fuente de nitrógeno.

Preferentemente, la fuente de sacarosa comprende al menos un 7% de sacarosa.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Construcción de dos cepas de E. coli que producen 1 ,2-propanodiol y capaces de utilizar sacarosa como única fuente de carbono La cepa de E. coli MG1655 lpd AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA::Cm, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd se desarrolló en un cultivo en quimiostato en condiciones anaeróbicas y adaptada al crecimiento en medio mínimo, se obtuvo como se describe en el documento WO 2008/116852. Esta cepa se denominó cepa E. coli desarrollada MG1655 Ipd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA::Cm, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd.

El cásete de resistencia al cloranfenicol se eliminó en dicha cepa desarrollada y la presencia de las modificaciones previamente diseñadas en la cepa se comprobaron como se describió previamente en el documento WO 2008/116852.

Se usaron dos plásmidos para conferir la capacidad de utilizar sacarosa a dicha cepa de E. coli: - pUR400, que porta los genes que codifican el sistema sacarosa-PTS tal y como se describe en Schmid y cois. (1982) - pKJL101.1 , que porta los genes que codifican el sistema sacarosa-permeasa y quinasa como se describe en Jahreis y cois. (2002).

Estos plásmidos se introdujeron por separado en la cepa desarrollada de E. coli MG1655 Ipd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd por electroporación.

Las dos cepas obtenidas se nombraron respectivamente: - E. coli MG1655 Ipd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd (pUR400), desarrollada y - E. coli MG1655 Ipd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd (pKJL101.1) desarrollada.

EJEMPLO 2 Producción de 1 ,2-propanodiol con sacarosa como única fuente de carbono Las cepas obtenidas como se describen en el ejemplo 1 , y la cepa sin plásmido usada como control se cultivaron en un matraz Erlenmeyer en condiciones aeróbicas en un medio mínimo MML1 1 PG1_100 (la composición ha sido previamente descrita en este documento) con 20 g/l de glucosa o sacarosa como única fuente de carbono. Como control se usó glucosa como fuente de carbono.

El cultivo se realizó a 34 °C y el pH se mantuvo tamponando el medio de cultivo con MOPS.

Al final del cultivo, se analizó el 1 ,2-propanodiol, y la glucosa o la sacarosa residual en el caldo de fermentación mediante HPLC y se calcularon las producciones de 1 ,2-propanodiol a través de glucosa y 1 ,2-propanodiol a través de sacarosa.

CUADRO 2 producción de 1 ,2-propanodiol en medio mínimo con glucosa o sacarosa como fuente de carbono ND significa "no detectado". n es el número de repeticiones del mismo experimento.

Las cifras indicadas son la media y la desviación típica cifras obtenidas para n repeticiones.

EJEMPLO 3 Producción de 1 ,2-propanodiol con jugo de caña de azúcar como fuente de carbono Las cepas obtenidas como se describen en el ejemplo 1 se cultivaron en un matraz de Erlenmeyer en condiciones aeróbicas en un medio mínimo MML1 1 PG1_100 con jugo de caña de azúcar (equivalente a 20 g/l de sacarosa) como fuente de carbono.

El jugo de caña de azúcar usado en este experimento se obtuvo a partir de un molido de azúcar en el área del sudeste asiático y se recolectó justo después de la clarificación con cal seca del jugo sin refinar.

El cultivo se realizó a 34 °C y el pH se mantuvo tamponando el medio de cultivo con MOPS. Al final del cultivo, se analizó el 1 ,2-propanodiol y la sacarosa, la glucosa y la fructosa residuales en el caldo de fermentación mediante HPLC y la producción de 1 ,2-propanodiol a través de la suma de las fuentes de carbono.

CUADRO 3 producción de 1 ,2-propanodiol en medio mínimo con jugo de caña de azúcar como fuente de sacarosa n es el número de repeticiones del mismo experimento.

Las cifras indicadas son la media y la desviación típica de las cifras obtenidas para n repeticiones.

EJEMPLO 4 Producción de 1 ,2-propanodiol únicamente con jugo de caña de azúcar o suplementado con nutrientes Las cepas obtenidas del modo descrito en el ejemplo 1 se cultivaron en un matraz Erlenmeyer en condiciones aeróbicas en un medio que contiene jugo de caña de azúcar diluido (equivalente a 20 g/l de sacarosa) con o sin suplementación de fosfato de amonio ((NH4)2HP04 2,5 g/l), hierro (Citrato de Fe, H20 0.1 g/l) y tiamina (0.02 g/l).

El cultivo se realizó a 34 °C y el pH se mantuvo tamponando el medio de cultivo con MOPS (40 g/l). Al final del cultivo, se analizó el 1 ,2- propanodiol y la sacarosa, la glucosa y la fructosa residuales en el caldo de fermentación mediante HPLC y la producción de 1 ,2-propanodiol a través de la suma de las fuentes de carbono.

CUADRO 4 Producción de 1 ,2-propanodiol en jugo de caña de azúcar sin suplementación o jugo de caña de azúcar suplementado n es el número de repeticiones del mismo experimento.

Las cifras indicadas son la media y la desviación típica de las cifras obtenidas para n repeticiones.

REFERENCIAS (en orden de aparición en el texto) Badia J, Ros J, Aguilar J (1985), J. Bacteriol. 161 : 435-437 Tran Din K y Gottschalk G (1985), Arch. Microbiol. 142: 87-92 Cameron DC y Cooney CL (1986), Bio Technology, 4: 651 -654 Sanchez-Rivera F, Cameron DC, Cooney CL (1987), Biotechnol. Lett. 9: 449-454 Altaras NE, Etzel MR, Cameron DC (2001 ), Biotechnol. Prog. 17: 52-56 Cameron DC, Altaras NE, Hoffman ML, Shaw AJ (1998), Biotechnol. Prog. 14: 1 16-125 Altaras NE y Cameron DC (1999), Appl. Environ. Microbiol. 65: 1 180-1 85 Altaras NE y Cameron DC (2000), Biotechnol. Prog. 16: 940-946 Huang K, Rudolph FB, Bennett GN (1999), Appl. Environ. Microbiol. 65: 3244-3247 Berrios-Rivera SJ, San KY, Bennett GN (2003), J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30: 34-40 Peters D (2006), Biotechnol. J. 1 : 806-814 Beckers M, Linde R, Danilevich A, Kaminska E, Upite D, Vigants A, Scherbaka R (1999), Food Biotechnol. 13: 107-1 9 Shukla VB, Zhou S, Yomano LP, Shanmugam KT, Preston JF, I Ingram LO (2004), Biotechnol. Lett. 26: 689-693 Calabia BP y Tokiwa Y (2007), Biotechnol. Lett. 29: 1329- 332 Schmid K, Schupfner M, Schmitt R (1982), J. Bacteriol. 151 : 68- 76 Schmid K, Ebner R, Altenbuchner J, Schmitt R, Lengeler JW (1988), Mol. Microbiol. 2: 1-8 Schmid K, Schupfner M, Schmitt R (1982), J. Bacteriol. 151 : 68- 76 Bockmann J, Heuel H, Lengeler JW (1992), Mol. Gen. Genet. 235: 22-32 Jahreis K, Bentler L, Bockmann J, Hans S, Meyer A, Siepelmeyer J, Lengeler JW (2002), J. Bacteriol. 184: 5307-5316 Tsunekawa H, Azuma S, Okabe M, Okamoto R, Aiba S (1992), Appl. Environ. Microbiol. 58 2081-2088 Penfold DW y Macaskie LE (2004), Biotechnol. Lett. 26: 1879- 1883 Anderson EH (1946), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 32: 120-128 Miller (1992), A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, New York Schaefer U, Boos W, Takors R, Weuster-Botz D (1999), Anal. Biochem. 270: 88-96 Wiesenborn DP, Rudolph RB, Papoutsakis ET (1987), Appl.

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Claims (16)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Procedimiento para producir 1 ,2-propanodiol por fermentación, que comprende: - el cultivo de un microorganismo que produce 1 ,2-propanodiol en un medio apropiado que comprende una fuente de sacarosa y la recuperación del 1 ,2-propanodiol que se está produciendo, en el que el microorganismo es capaz de utilizar sacarosa como única fuente de carbono para la producción de 1 ,2-propanodiol.

2 - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el microorganismo ha sido genéticamente modificado para poder utilizar sacarosa como única fuente de carbono.

3. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque el microorganismo tiene genes funcionales que codifican un sistema de utilización de sacarosa PTS.

4. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el microorganismo ha sido modificado con la introducción de genes scrKYABR.

5.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque el microorganismo tiene genes funcionales que codifican un sistema de utilización de sacarosa no PTS.

6.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el microorganismo ha sido modificado con la introducción de genes cscBKAR.

7. - El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el microorganismo se selecciona del grupo formado por bacterias, levaduras y hongos.

8. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el microorganismo se selecciona del grupo formado por Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Clostridiaceae, Streptomycetaceae y Corynebacteriaceae.

9. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el microorganismo se selecciona entre el grupo formado por Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Clostridium sphenoides o Saccharomyces cerevisiae.

10.- El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado además porque dicha fuente de sacarosa se obtiene de biomasa, en particular a partir de biomasa vegetal.

1. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque dicha fuente de sacarosa se obtiene a partir de una planta escogida entre el grupo formado por: caña de azúcar, remolacha azucarera, sorgo dulce, arce de azúcar, palmas de azúcar o agaves azules.

12. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 10 u 1 1, caracterizado además porque dicha fuente de sacarosa está en forma de jugo, un jugo concentrado o un sirope, un jugo clarificado, melazas o sacarosa cristalizada.

13. - El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado además porque dicha fuente de sacarosa es un producto final, un producto intermedio o un subproducto de la industria de la caña de azúcar o de la remolacha azucarera.

14. - El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el medio apropiado está formado por una fuente de sacarosa.

15.- El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado además porque el medio apropiado contiene al menos una fuente de fósforo y/o una fuente de nitrógeno además de la fuente de sacarosa.

16.- El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado además porque dicha fuente de sacarosa comprende al menos un 7% de sacarosa.