KR20110088546A

KR20110088546A - 1,2-프로판디올의 발효에 의한 생산을 위한 기질로서의 수크로스의 사용

Info

Publication number: KR20110088546A
Application number: KR1020117012772A
Authority: KR
Inventors: 프랑수와 보엘케르; 레네르 피게; 필립 수카유
Original assignee: 메타볼릭 익스플로러
Priority date: 2008-11-07
Filing date: 2008-11-07
Publication date: 2011-08-03
Also published as: BRPI0823256B8; EP2346999B1; US20110217744A1; MX2011004842A; KR101395971B1; JP2012507992A; EP2346999A1; CA2741427A1; BRPI0823256B1; ES2429305T3; US9617567B2; AR074092A1; CN102272316B; US20150159181A1; CN102272316A; WO2010051849A1; BRPI0823256A2; DK2346999T3

Abstract

본 발명은 발효에 의한 1,2-프로판디올의 생산 방법에 관한 것이며, 수크로스 공급원을 포함하는 적절한 배지에서 1,2-프로판디올을 생산하는 미생물을 배양하는 단계, 및 생산되는 1,2-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하며, 상기 미생물은 1,2-프로판디올의 생산을 위한 단일 탄소 공급원으로써 수크로스를 이용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 양상에서, 수크로스의 공급원은 식물 바이오매스로부터 얻어지고, 수크로스의 공급원은 특히 사탕수수 액이다.

Description

1,2-프로판디올의 발효에 의한 생산을 위한 기질로서의 수크로스의 사용{USE OF SUCROSE AS SUBSTRATE FOR FERMENTATIVE PRODUCTION OF 1,2-PROPANEDIOL}

본 발명은 발효 공정, 미생물 및 발효에 유용한 기질에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 수크로스-함유 배지로부터, 특히 식물 바이오매스로부터 발효에 의한 1,2-프로판디올의 생산에 관한 것이다.

C3 디알콜인 1,2-프로판디올 또는 프로필렌 글리콜은 널리 사용되는 화학물질이다. 이는 불포화 폴리에스테르 수지, 액체 세제, 냉각제, 부동제 및 비행기용 제빙액의 성분이다. 프로필렌 글리콜은 1993-1994년부터, 프로필렌 유도체보다 독성이 강한 것으로 알려져 있는 에틸렌 유도체의 대체물로써 점증적으로 사용되어 왔다.

현재, 1,2-프로판디올은 다량의 물이 소모되는 프로필렌 산화물 수화 공정을 이용한 화학적 방법에 의해 제조된다. 프로필렌 산화물은 2가지 공정, 즉 에피클로르히드린을 이용한 공정 및 히드로과산화물을 이용한 공정 중 하나에 의해 제조될 수 있다. 두 경로 모두에서 독성이 높은 물질이 사용된다. 또한, 히드로과산화물 경로는 tert-부탄올 및 1-페닐 에탄올과 같은 부산물을 생산한다. 프로필렌의 제조가 유익하기 위해서는 이들 부산물에 대한 용도가 발견되어야 한다. 일반적으로, 화학적 경로에서 라세미 1,2-프로판디올이 생산되지만, 두 입체이성질체, 즉 (R)1,2-프로판디올 및 (S)1,2-프로판디올의 각각이 특정 용도에 유익하다 (예, 특수 화학물질 및 제약 제품에 대한 키랄 출발 물질).

1,2-프로판디올 생산에 관한 화학 공정의 단점은 생물학적 합성을 매력적인 대안으로 만든다. 2가지 경로는 미생물에 의해 당으로부터 1,2-프로판디올을 천연적으로 생산하는 것을 특징으로 한다. 제1 경로에서, 6-데옥시 당 (예, L-람노스 또는 L-푸코스)은 디히드록시아세톤 포스페이트 및 (S)-락트알데히드로 분해되고, 이는 (S)-1,2-프로판디올로 추가로 환원될 수 있다 (문헌[Badia et al., 1985]). 이 경로는 대장균(E. coli)에서 실용적이지만, 데옥시헥소스의 상승된 비용으로 인해 경제적으로 실현 가능한 공정을 달성할 수 없다. 제2 경로는, 메틸글리옥살 경로가 뒤따르는 당분해 (glycolysis) 경로를 통한 통상적인 당(예, 글루코스 또는 크실로스)의 대사이다. 디히드록시아세톤 포스페이트는 락트알데히드 또는 아세톨로 환원될 수 있는 메틸글리옥살로 전환된다. 그리고 나서, 두 화합물은 2차 환원 반응을 통해 1,2-프로판디올을 생산할 수 있다. 이러한 경로는 (R)-1,2-프로판디올의 천연 생산자, 가령 클로스트리듐 스페노이데스(Clostridium sphenoides) 및 써모안에어로박터 써모사카롤리티쿰(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)에 의해 이용된다. 이 두 유기체는 다른 당, 즉 단당류(헥소스에 해당하는 D-글루코스, D-만노스, D-갈락토스 및 펜토스에 해당하는 D-크실로스 또는 L-아라비노스) 또는 이당류(락토스 또는 셀로비오스) 또는 혼합물(문헌[Tran Din and Gottschalk, 1985, Cameron and Cooney, 1986, Sanchez-Rivera et al, 1987, Altaras et al, 2001])으로부터 1,2-프로판디올을 생산하는데 사용되어 왔다. 얻어진 최고 결과는 9 g/l의 역가 및 0.2 g/g의 글루코스로부터의 수율이었다(Sanchez-Rivera et al, 1987). 그러나, 이 유기체에 의해 얻어지는 성과의 개선은 이용가능한 유전자 도구의 부족 때문에 제한되기 쉬웠다. 같은 합성 경로가 대장균 또는 다른 장내세균(Enterobacteriaceae)에서 실용적이고 카메론의 그룹(Cameron et al, 1998, Altaras and Cameron, 1999, Altaras and Cameron, 2000) 및 베네트의 그룹 (Huang et al, 1999, Berrios-Rivera et al, 2003)은 D-글루코스 또는 D-프룩토스로 한정된 탄소 공급원을 가진 이 유기체 내 1,2-프로판디올의 생산에 대해서 몇 가지 조사를 수행해왔다. 혐기성 유가식(fed-batch) 발효조에서 얻어진 최고 결과는 글루코스로부터 0.19 g/g의 수율을 가진 4.5 g/l 1,2-프로판디올의 생산이었다(Altaras and Cameron, 2000). 비록 다른 탄소 공급원, 즉 갈락토스, 락토스, 수크로스 및 크실로스 뿐만 아니라 또한 글루코스를 사용하지만, 같은 접근법으로 더 낮은 역가 및 수율로 얻어진 결과도 또한 특허 WO 98/37204에 서술된다. 이당류(락토스 및 수크로스)로 얻어진 역가는 매우 낮았다(각각, 6 mg/l 및 7 mg/l). 더 좋은 생산 결과가 특허출원 WO 2005/073364 내 합리적으로 설계되고 진화된 대장균 균주로 서술되었다. 1.8 g/l의 1,2-프로판디올 역가를 소비된 글루코스의 0.35 g/g 수율과 함께 얻었다. 1,2-프로판디올 및 히드록시아세톤의 생산은 특허 WO 99/28481에서 재조합 효모를 사용하여 또한 서술되었다.

발효 배지에 사용된 탄소 공급원은 일반적으로 대부분 식물로부터 유도된 탄수화물로 구성된다. 수크로스를 사탕무, 사탕수수, 단수수, 사탕단풍, 사탕야자, 블루 아가베와 같은 사탕 식물로부터 얻는다. 전분은 식물에 가장 풍부한 저장 탄수화물이다. 가장 중요한 전분 공급원은 곡물(콘, 밀, 쌀), 카사바, 고구마 및 감자이다. 전분은 대부분 미생물에 의해 대사되지 않지만 전분 공장에 의해 발효성 공급원료로 처리될 수 있다. 이눌린 또는 이눌린유사 중합체(주로 프룩토스 유닛으로 구성)는 식물에 두 번째로 가장 풍부한 저장 탄수화물이고, 치커리, 예루살렘 아티초크(Jerusalem artichoke) 또는 달리아에서 발견된다. 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 리그닌으로 구성된 리그노셀루로스계 바이오매스는 또한 탄수화물의 유망한 공급원이지만 여전히 개발 중이다(Peters, 2006). 생물공학적으로 생산된 화학물질 상품의 가격이 주로 원재료의 가격(예, 발효 기질의 가격)과 관련되기 때문에, 글루코스 또는 수크로스와 같은 정제당의 사용은 산업적 규모 생산에 대해 경제적으로 지속가능한 선택안이 아니다. 발효성 당의 높은 함량을 함유하는 덜 비싼 기질이 필요하다. 이러한 점에서, 설탕 산업으로부터 나오는 수크로스 함유 탄소 공급원은 좋은 옵션에 해당한다.

몇 가지 단계의 사탕무 공정에 의해 16 내지 24% 수크로스를 함유하는 사탕무로부터 수크로스를 생산한다. 세정되고 세척된 사탕무를 코세트(cossette)라 불리는 긴 스트립으로 얇게 썰고, 이것을 분산에 의해 뜨거운 물로 추출하여 원액(raw juice)라고 불리고 10 내지 15% 수크로스를 함유하는 수크로스 액을 얻는다. 제2 단계는 석회 및 그 다음 불순물을 제거하는 이산화탄소를 사용하는 탄화 및 알칼리화에 의한 원액의 정제이고 묽은 액을 얻는다. 증발 공정은 물을 제거함으로써 묽은 액 내 수크로스 농도를 증가시켜서 50 내지 65%의 수크로스 함량을 가진 진한 액을 만든다. 이 농축된 수크로스 액을 그리고 나서 결정화하고 그 결정을 원심분리에 의해 분리하고, 그리고 나서 세척하고 건조하여 순수 당을 얻는다. 하나 이상의 결정화 단계가 적용되어 다양한 순도 등급의 수크로스를 얻을 수 있다. 사탕무 공정의 부산물은 펄프(다 써버린 코세트) 및 당밀(molasses)(여전히 40 내지 60%의 수크로스 함량을 가진 결정화장치로부터 남아있는 모액)을 포함한다.

설탕 산업에 의해 사탕수수(7 내지 20% 수크로스 함량)로부터 또한 수크로스를 생산한다. 추수된 사탕수수를 액(juice) 추출을 위한 분쇄 공정 전에 세정한다. 사탕수수의 구조를 부수고 그리고 나서 갈고 동시에 물로 수크로스를 추출하여 원액을 얻는다. 당을 빼버린 부서진 사탕수수를 바개스(bagasse)라고 부른다. 이 찌꺼기를 주로 연료 공급원으로 사용하여 공정 증기를 발생시킨다. 그 원액을 그리고 나서 석회를 첨가하여 투명하게 하고 가열하고 투명해진 액을 침전물로부터 분리한다. 공정의 마지막 단계, 농축된 시럽을 얻는 증발 및 결정화는 사탕무 공정에서와 본질적으로 동일하다. 사탕수수 공정의 부산물은 바개스, 원액의 투명화로부터의 필터 케이크 및 상이한 종류의 당밀을 포함하고, 여전히 상당한 양의 수크로스를 포함한다.

당 공정으로부터의 상이한 수크로스 함유 중간 생성물, 생성물 또는 부산물(원액, 묽은 또는 투명해진 액, 진한 액, 수크로스 시럽, 순수 수크로스, 당밀)은 발효 공급 원료로 사용될 수 있다. 예를 들어, 브라질 내 설탕 산업은 투명해진 사탕수수 액을 가솔린의 대체물로써 사용하기 위한 에탄올 생산에 사용하고 있다. 조 수크로스 함유 생성물을 사용하는 문헌 내 최근 실시예는 지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)에 의한 사탕무 분산액으로부터 에탄올 생산(문헌[Beckers et al., 1999]), 대장균에 의한 당밀로부터 D-락테이트의 생산(문헌[Shukla et al., 2004]) 및 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii)에 의한 사탕수수 당밀, 사탕수수 액 또는 사탕무 액으로부터의 D-락테이트의 생산(문헌[Calabia et al., 2007])을 포함한다.

두 상이한 시스템이 수크로스-양성 박테리아(예, 수크로스를 이용할 수 있는 박테리아) 내 수크로스의 흡수 및 이용에 대해 특징화되어 있다.

첫 번째 시스템은 공여자로써 포스포에놀 피루베이트(PEP)를 사용하여 수크로스가 흡수되고 인산화되어 세포내 수크로스-6-포스페이트를 생산하는 포스포에놀 피루베이트(PEP)-의존적 수크로스 포스포트랜스퍼라제 시스템(수크로스 PTS)에 기반한다. 수크로스-6-포스페이트는 그리고 나서 자당효소에 의해 D-글루코스-6-포스페이트 및 D-프룩토스로 가수분해된다. D-프룩토스는 ATP-의존적 프룩토키나아제에 의해 D-프룩토스-6-포스페이트로 추가로 인산화되고 그리고 나서 중앙 대사로 들어갈 수 있다. 이러한 시스템은 몇 가지 박테리아 종, 그램-양성뿐만 아니라 그램-음성에서 서술되었다. 장내세균 중에서, 야생형 클레브시엘라(Klebsiella)의 90% 초과, 대장균(Escherichia)의 50% 미만 및 살모넬라(Salmonella) 균주의 10% 미만이 수크로스 양성이다.

수크로스 PTS를 코딩하는 유전자 scrKYABR을 포함하는 접합성 플라스미드 pUR400는 살모넬라(Salmonella)로부터 단리되었다(문헌[Schmid et al., 1982, Schmid et al, 1988]).

두 번째 비-PTS 시스템은 더 최근에 대장균 EC3132에서 발견되었다(문헌[Bockmann et al., 1992]). 이 시스템은 수크로스를 코딩하는 유전자들 cscBKAR: 양성자 공동수송 수송 시스템(CscB), 프룩토키나아제(CscK), 자당효소(CscA) 및 수크로스-특이적 억제제(CscR)를 포함한다.

대장균(Escherichia coli) K12 및 그것의 유도체(MG1655 포함)는 수크로스를 이용할 수 없다. 그러나, 이 능력은 전술한 두 시스템을 코딩하는 유전자들의 수송에 의해 수여될 수 있다. 이것은 대장균 K12 내 플라스미드 pUR400(문헌[Schmid et al, 1982]) 또는 대장균의 수크로스 음성 균주 내 cscBKAR 유전자를 포함하는 대장균 다른 플라스미드(pKJL101-1 포함)(문헌[Jahreis et al., 2002])의 수송에 의하여 입증되었다. 산업적 응용에 관해서는, 수크로스로부터 트립토판 생산은 대장균 K12에 기록되었고(문헌[Tsunekawa et al., 1992]), 수소 생산은 pUR400 플라스미드를 운반하는 대장균 내에서 보여졌고(문헌[Penfold and Macaskie, 2004]) 그리고 PTS 및 비-PTS 둘 모두의 시스템의 수송에 의한 다른 아미노산의 생산은 특허 출원 EP1149911에서 보고되었다.

수크로스로부터의 1,2-프로판디올의 생산은 카메론 및 쿠니(1986)에 의해 클로스트리듐 써모사카롤리티쿰(Clostridium thermosaccharolyticum) (티. 써모사카롤리티쿰(T. thermosaccharolyticum)이라고 후에 개명됨)에 언급되었지만 오직 흔적량만이 보고되었고, 0.1 g/g 기질보다 더 높은 수율을 가진 3 g/l보다 더 높은 양은 다른 탄소 공급원으로 얻어졌다.

수크로스로부터의 1,2-프로판디올의 생산은 특허 출원 WO 98/37204에 또한 언급된다. 그러나, 플라스미드 pSEARX로 변형된 대장균 AA200 균주는 수크로스의 10 g/l로부터 오직 7 mg/l의 1,2-프로판디올을 생산하고, 반면에 같은 미생물이 단당류로부터는 49 내지 71 mg/l의 1,2-프로판디올을 생산한다. 생성물의 이러한 매우 낮은 수치는 수크로스로부터 1,2-프로판디올을 생산하는 이 유기체의 실제 능력에 대해 의심을 갖게 한다. 발명가의 견해로는, 대장균 K12로부터 유도되는 AA200 균주는, 수크로스를 유입하고 그리고 나서 대사하는 능력을 가지지 않는다.

이러한 사전 보고는 당업자에게 1,2-프로판디올을 생산하기 위해 수크로스를 사용하는 것은 좋은 선택이 아니었다는 것을 명확하게 보여줬다.

놀랍게도, 수크로스를 이용할 수 없는 대장균 균주에서 수크로스를 이용하기 위한 상이한 시스템을 도입함으로써, 본 발명의 발명가들은 수크로스로부터 1,2-프로판디올 생산에 대한 개선된 수율을 얻을 수 있었다.

게다가, 발명가들은 식물 공급원료로부터 액 또는 당밀과 같은 임의의 수크로스-함유 배지가 1,2-프로판디올의 발효에 의한 생산을 위한 기질로써 사용될 수 있다고 설명하였다.

본 발명은 발효에 의한 1,2-프로판디올의 생산 방법에 관한 것이며,

·수크로스 공급원을 포함하는 적절한 배지 내 1,2-프로판디올을 생산하는 미생물을 배양하는 단계, 및

·생산되는 1,2-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하며,

상기 미생물은 1,2-프로판디올의 생산을 위한 단일 탄소 공급원으로써 수크로스를 이용할 수 있다.

특히, 본 발명은 탄소의 단일 공급원으로써 수크로스를 이용할 수 있는 변형된 미생물의 사용을 기술하고, 상기 수크로스는 바이오매스, 특히 식물 바이오매스로부터 얻는다.

본원에 사용된 다음 용어들은 특허청구범위 및 명세서의 해석에 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 용어 '배양하는 것', '배양', '성장' 및 '발효'는 상호 교환적으로 사용되며 단일 탄소 공급원을 함유하는 적절한 성장 배지에서의 박테리아의 성장을 의미한다. 발효는 호기성, 미호기성 또는 혐기성 조건 하에서 수행될 수 있는 고전적인 공정이다.

본 발명에 따르면, 용어 '적절한 배지'는 미-생물의 성장을 위해 맞춰진 공지의 분자적 조성의 배지를 의미한다. 특히, 상기 배지는 하나 이상의 인 공급원 및 질소 공급원을 포함한다. 예를 들어, 상기 적절한 배지는 하나 이상의 탄소 공급원을 포함하고, 사용되는 박테리아에 맞춰진 공지의 세트 조성의 미네랄 배양 배지이다. 상기 적절한 배지는 질소의 공급원 및/또는 인의 공급원을 포함하는 임의의 액체를 또한 의미할 수도 있고, 상기 액체는 수크로스 공급원에 첨가 및/또는 혼합된다. 특히, 장내세균에 대한 미네랄 성장 배지는 따라서 M9 배지 (문헌[Anderson, 1946]), M63 배지 (문헌[Miller, 1992]) 또는 문헌[Schaefer et al. (1999)]에 의해 규정된 것과 같은 배지, 및 특히 하기 기재된 MML11PG1_100으로 명명되는 최소 배양 배지와 동일하거나 유사한 조성의 배지일 수 있다:

배지의 pH를 수산화나트륨으로 6.8로 조정한다.

탄소 공급원 '글루코스'는 이 배지 내에서 임의의 다른 탄소 공급원으로, 특히 수크로스 또는 사탕수수 액 또는 사탕무 액과 같은 임의의 수크로스 함유 탄소 공급원으로 대체될 수 있다.

클로스트리디아세아에(Clostridiaceae)에 대한 성장 배지는 클로스트리디알 성장 배지(CGM, 문헌[Wiesenborn et al., 1987]) 또는 문헌[Monot et al. (1982)] 또는 문헌[Vasconcelos et al. (1994)]에서 주어진 것과 같은 미네랄 성장 배지와 동일하거나 유사한 조성의 것일 수 있다.

용어 '수크로스'는 α(1,2) 글리코시드 결합에 의해 연결된 글루코스 및 프룩토스의 이당류를 말하며, 분자식 C₁₂H₂₂O₁₁을 가진다. 그것의 계통적 명칭은 α-D-글루코피라노실-(1↔2)-β-D-프룩토푸라노사이드이다.

용어 '수크로스 공급원' 또는 '수크로스의 공급원'은 상이한 농도, 특히 1 내지 100%의 수크로스로, 수크로스를 포함하는 임의의 배지, 액체 또는 고체를 말한다.

용어 '1,2-프로판디올을 생산하는 것'은 당업자에게 알려진 표준 분석 방법에 의해 분명하게 기록될 수 있는 배양 브로쓰(broth) 내 미생물의 생산을 의미한다. 1,2-프로판디올에 대한 HPLC의 정량화(이 화합물을 정량화하는데 사용되는 바람직한 기술임)의 한계는 25 mg/l이다. 따라서, 용어 "1,2-프로판디올을 생산하는 것"은 본 발명에 따라서 생산 수준이 25 mg/l를 초과해야하는 함을 의미한다.

용어 '단일 탄소 공급원으로써 수크로스를 이용할 수 있는'은 유일한 탄소 공급원으로써 수크로스를 포함하는 배지 내에서 미생물이 성장할 수 있는 것을 의미한다. 따라서, "1,2-프로판디올의 생산을 위한 단일 탄소 공급원으로써 수크로스를 이용할 수 있는 미생물"의 정의는 단일 탄소 공급원으로써 수크로스를 포함하는 배지 내에서 성장할 때, 미생물이 적어도 25 mg/l의 1,2-프로판디올을 생산할 수 있다는 것을 의미한다. 그러나 본 발명에 따른 1,2-프로판디올의 생산 방법에서, 배양 배지 내 수크로스 공급원은 헥소스(가령, 글루코스, 갈락토스 또는 락토스), 펜토스, 단당류, 이당류(가령, 수크로스, 셀로비오스 또는 말토스)), 올리고당, 전분 또는 그것의 유도체들, 헤미셀룰로스, 글리세롤 및 그것들의 조합물들과 같은 수크로스에 더하여 부가적인 탄소 공급원을 포함할 수 있다는 것이 이해된다.

본 발명의 바람직한 양상에 따라서, 미생물은 1,2-프로판디올의 생산을 위한 단일 탄소 공급원으로써 수크로스를 이용할 수 있도록 유전적으로 변형되었다.

본 발명의 특정 실시태양에서, 미생물은 PTS 수크로스 이용 시스템을 코딩하는 기능적 유전자를 포함한다. PTS 수크로스 이용 시스템은 포스포에놀피루베이트(PEP)-의존적 수크로스 포스포트랜스퍼라제 시스템(수크로스-PTS)에 의한 수크로스의 수송에 기반한 수크로스 이용을 위한 시스템이다. 포스포트랜스퍼라제 시스템은 포스페이트 공여자로써 PEP를 사용하여 당(예, 수크로스 또는 글루코스) 수송과 당 인산화를 결합한다. 세포 내로 수송 후, 수크로스-포스페이트는 자당효소에 의해 글루코스-6-포스페이트 및 프룩토스로 분해된다. 프룩토스는 그리고 나서 프록토키나아제에 의해 프록토스-6-포스페이트로 인산화된다. 이 PTS 수크로스 이용 시스템을 코딩하는 유전자는 조절 단백질에 의해 조절될 수 있다.

본 발명의 바람직한 양상에서, 미생물은 자연적으로 발현되거나 다음 유전자의 도입으로 변형된다: 살로넬라로부터의 scrKYABR (프룩토키나아제를 코딩하는 scrK, 포린을 코딩하는 scrY, 단백질 IIBC를 코딩하는 scrA, 수크로스-6-P 자당효소를 코딩하는 scrB, 억제제를 코딩하는 scrR). 상기 유전자 scrKYABR를 포함하는 접합성 플라스미드 pUR400는 미생물을 변형하는데 사용될 수 있다. 이 유전자들은 결합되어 모두 함께, 또는 하나 이상의 이 유전자들을 포함하는 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 특히, 유전자 scrR는 생략될 수 있다.

이 유전자들의 의미는 본 발명에 따른 더 포괄적인 의미를 가지고, 다른 미-생물 중 상응하는 유전자를 포함한다. 살모넬라로부터의 유전자의 젠뱅크(GenBank) 레퍼런스를 사용하여, 당업자는 살모넬라 이외의 다른 유기체 중에서 동등한 유전자를 결정할 수 있을 수 있다.

상동 서열 및 그들의 상동 백분율의 식별 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고, 웹사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)에 나타난 디폴트 파라미터와 함께 웹사이트에서 사용될 수 있는 블라스트(BLAST) 프로그램을 특히 포함한다. 얻어진 서열은 웹사이트(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)에 나타난 디폴트 파라미터와 함께, 예를 들어 프로그램 CLUSTALW를 사용하여 이용될(정렬될) 수 있다.

PFAM 데이터베이스(정렬 및 숨겨진 마르코브 모델들의 단백질 족 데이터베이스 http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)는 단백질 서열의 정렬의 큰 모음집이다. 각 PFAM은 다중 정렬을 가시화하고, 단백질 도메인을 보게 하고, 유기체 중 분포를 평가하고, 다른 데이터베이스에 접근을 얻고 공지의 단백질 구조를 가시화하게 하는 것을 가능하게 한다.

COG(단백질의 이종상동성군의 클러스터 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)를 14 가지 주요 계통 발생 계를 대표하는 66 완전하게 서열화된 단세포 게놈들로부터 유도된 단백질 서열들을 비교하여 얻는다. 각 COG는 3 가지 이상의 계로부터 규정되고, 고대의 보존된 도메인을 식별하는 것을 가능하게 한다.

박테리아 균주로 DNA를 도입하기 위해 당업자들은 현재 몇 가지 기술을 사용한다. 바람직한 기술은 당업자에게 잘 알려진, 전기 천공법이다.

본 발명의 다른 실시태양에서, 미생물은 비-PTS 수크로스 이용 시스템을 코딩하는 작용 유전자를 포함한다. 비-PTS 수크로스 이용 시스템은 포스포에놀피루베이트에 독립적인 시스템에 의한 수크로스의 수송에 기반한 수크로스 이용을 위한 시스템이다. 세포 내 수송 후, 수크로스는 자당효소에 의해 글루코스 및 프룩토스로 분해된다. 프룩토스는 그리고 나서 프룩토키나아제에 의해 프룩토스-6-포스페이트로 인산화되고 글루코스는 글루코키나아제에 의해 글루코스-6-포스페이트로 인산화된다. 상기 비-PTS 수크로스 이용 시스템을 코딩하는 유전자들은 조절 단백질에 의해 조절될 수 있다. 본 발명의 바람직한 양상에서, 미생물은 자연적으로 발현되거나 대장균 EC3132로부터의 유전자, 예를 들어, 수크로스를 코딩하는 유전자들 cscBKAR(양성자 공동수송 수송 시스템(cscB), 프룩토키나아제(cscK), 자당효소(cscA) 및 수크로스-특이적 억제제(cscR))의 도입으로 변형된다. 이 유전자들은 결합되어 모두 함께, 또는 하나 이상의 이 유전자들을 포함하는 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 특히, 유전자 cscR은 생략될 수 있다. 다른 유기체로부터의 상동 유전자들 또한 사용될 수 있다.

이 유전자들의 의미는 본 발명에 따른 더 포괄적인 의미를 가지고, 다른 미-생물 중 상응하는 유전자를 포함한다. 대장균으로부터의 유전자의 젠뱅크(GenBank) 레퍼런스를 사용하여, 당업자는 대장균 이외의 다른 유기체 중에서 동등한 유전자를 결정할 수 있을 수 있다(상기 참고).

본 발명의 특정 양상에서, 미생물은 1,2-프로판디올의 생합성 경로의 개선된 활성에 의해 특징화된다. 1,2-프로판디올의 생산에 최적화된 미생물이, 본원에 참고문헌으로 인용된, 특허 출원 WO 2005/073364, WO 2008/116853, WO 2008/116852 및 WO 2008/116848에 널리 공개되어 있다.

본 발명에 따른 미생물은 박테리아, 효모 또는 진균이다.

우선적으로, 미생물은 장내세균, 바실라세아에(Bacillaceae), 클로스트리디아세아에, 스트렙토미세타세아에(Streptomycetaceae) 및 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae)로 구성된 군으로부터 선택된다.

더 우선적으로, 미생물은 대장균, 폐렴 간균(Klebsiella pneumoniae), 써모아나에로박테리엄 써모사카롤리티쿰(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum), 클로스트리듐 스페노이데스(Clostridium sphenoides) 또는 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)로 구성된 군으로부터 선택된다.

발효 공정을 위한 배양 조건은 당업자에게 쉽게 규정될 수 있다. 특히, 박테리아는 20 ℃ 내지 55 ℃ 사이, 바람직하게는 25 ℃ 내지 40 ℃ 사이의 온도에서 발효되고, 클로스트리디아세아에는 약 35 ℃에서, 장내세균은 약 37 ℃에서 발효된다.

이 공정은 배치 공정, 유가식 공정 또는 연속식 공정 중 어느 것에서 수행될 수 있다. 발효는 호기성, 미호기성 또는 혐기성 조건 하에서 수행될 수 있는 고전적인 공정이다.

'호기성 조건 하'란, 기체를 액체 상에 용해시킴으로써 산소를 배양물에 공급하는 것을 의미한다. 이는 (1) 산소 함유 기체 (예, 공기)를 액체 상에 스파아징하거나 (2) 배양 배지를 함유하는 용기를 흔들어서 헤드 공간에 함유된 산소를 액체 상에 전달함으로써 달성될 수 있다. 혐기성 조건이 아닌 호기성 조건 하에서의 발효의 이점은 전자 수용체로서의 산소의 존재가 균주의 능력을 개선시켜 세포 과정을 위한 ATP 형태의 에너지가 더 많이 생성된다는 점이다. 따라서, 균주는 개선된 전체 물질대사를 갖게 된다.

미-호기성 조건은 낮은 백분율의 산소(예, 0.1 내지 10％의 산소(질소와 함께 100％가 달성됨)를 함유하는 기체의 혼합물이 사용됨)가 액체 상에 용해된 배양 조건으로서 정의된다.

혐기성 조건은 배양 배지에 산소가 전혀 제공되지 않은 배양 조건으로서 정의된다. 극혐기성 조건은 질소와 같은 불활성 기체를 배양 배지에 스파아징하여 미량의 다른 기체를 제거함으로써 달성된다. 균주에 의한 ATP 생성을 개선하고 그의 물질대사를 개선하기 위해 니트레이트가 전자 수용체로서 사용될 수 있다.

본 발명의 특정 양상에서, 수크로스 공급원은 바이오매스, 특히 식물 바이오매스로부터 얻어진다. 전체 식물 또는 식물의 임의의 특정 부분은 수크로스 공급원으로써 사용된 원재료를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 제조는 수크로스-함유 식물 바이오매스로부터 수크로스를 추출하는 당업자에게 알려진 임의의 처리에 기반을 둘 수 있다.

본 발명의 바람직한 양상에서, 수크로스 공급원은 사탕수수, 사탕무, 단수수, 사탕단풍, 사탕야자 및 블루 아가베로 구성되는 군 중에 선택된 식물로부터 얻어진다.

수크로스의 공급원은 특히 사탕수수 또는 사탕무로부터 얻어질 수 있다.

수크로스 공급원의 상이한 형태(가령, 액, 농축액, 시럽, 투명해진 액, 당밀 또는 결정화된 수크로스)가 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

바람직한 형태는 어떤 처리도 없이 식물로부터 바로 추출된, 사탕수수로부터의 원액이다. 간략하게, 추수된 사탕수수를 액 추출을 위한 분쇄 공정 전에 세정한다. 사탕수수의 구조를 부수고 그리고 나서 갈고 동시에 물로 수크로스를 추출하여 원액을 얻는다.

그 원액을 그리고 나서 석회를 첨가하여 투명하게 하고 가열하고 투명해진 액을 침전물로부터 분리한다. 증발에 의해 농축된 시럽을 얻는다.

본 발명의 다른 실시태양에서, 수크로스 공급원은 사탕수수 또는 사탕무 산업의 최종 생성물, 중간 생성물 또는 부산물일 수 있다.

일부 조 수크로스 공급원, 특히 상술한 바이오매스로부터 얻어진 것들이 탄소 공급원에 더하여 미생물의 성장에 사용될 수 있는 다른 영양분을 포함하기 때문에, 미생물 성장을 위한 적절한 배지는 수크로스의 공급원으로 구성되는 적절한 배지와 같은 수크로스 공급원 만을 사용하는 것, 또는 수크로스 공급원에 인의 공급원 및/또는 질소의 공급원을 보충하는 것 중 어느 하나에 의하여 설계될 수 있다.

우선적으로, 수크로스 공급원은 7% 이상의 수크로스를 포함한다.

실시예

실시예 1: 1,2- 프로판디올을 생산하고 단일 탄소 공급원으로써 수크로스를 이용할 수 있는 두 가지 대장균 균주의 구축:

혐기성 조건 하에서 케모스타트 배양 내 진화되고 최소 배지 내 성장에 맞춰진 대장균 균주 MG1655 Ipd *, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA::Cm, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd를 WO 2008/116852 내 서술된 것처럼 얻었다. 이 균주를 진화된 대장균 균주 MG1655 Ipd *, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA::Cm, ΔgloA, ΔaldA, Δa l dB, Δedd라고 명명하였다.

클로람페니콜 내성 카세트를 상기 진화된 균주에서 제거하고 균주 내 이미 만들어진 변형의 존재를 WO 2008/116852 내 이미 서술된 것처럼 확인하였다.

두 플라스미드를 사용하여 상기 대장균 균주에 수크로스를 이용하는 능력을 수여하였다:

- 문헌[Schmid et al. (1982)]에 서술된 것처럼 수크로스-PTS 시스템을 코딩하는 유전자를 포함하는 pUR400

- 문헌[Jahreis et al. (2002)]에 서술된 것처럼 수크로스 퍼미아제 및 키나아제 시스템을 코딩하는 유전자를 포함하는 pKJL101.1.

이 플라스미드를 전기 천공법을 사용하여 진화된 대장균 균주 MG1655 Ipd *, Δt p iA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd에 별도로 도입하였다.

얻어진 두 가지 균주를 각각 명명하였다:

- 진화된 대장균 MG1655 Ipd *, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA, ΔgloA, Δa l dA, ΔaldB, Δedd(pUR400), 및

- 진화된 대장균 MG1655 Ipd *, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA, ΔgloA, Δa l dA, ΔaldB, Δedd(pKJL101.1).

실시예 2: 단일 탄소 공급원으로써 수크로스를 가진 1,2- 프로판디올의 생산:

실시예 1에서 서술된 것처럼 얻어진 균주 및 대조군으로써 사용된 플라스미드가 없는 균주를 단일 탄소 공급원으로써 20 g/l 글루코스 또는 수크로스를 가진 최소 배지 MML11PG1_100(상기 조성물 참고) 내 호기성 조건 하에서 삼각 플라스크 분석으로 배양하였다. 탄소 공급원으로써 글루코스를 대조군으로써 사용하였다.

34 ℃에서 배양을 수행하였고 MOPS로 배양 배지를 완충함으로써 pH를 유지하였다.

배양의 마지막에서, 1,2-프로판디올, 및 발효 브로쓰 내 나머지 글루코스 또는 수크로스를 HPLC로 분석하였고 글루코스에 대한 1,2-프로판디올의 수율 또는 수크로스에 대한 1,2-프로판디올의 수율을 계산하였다.

ND는 "검출되지 않음"을 의미함.

n은 같은 실험의 반복 횟수임.

주어진 수들은 n 반복 동안 얻어진 수들의 평균 및 표준 편차임.

실시예 3: 탄소 공급원으로써 사탕수수 액을 가진 1,2- 프로판디올의 생산:

실시예 1에서 서술된 것처럼 얻어진 균주를 탄소 공급원으로써 사탕수수 액 (20 g/l 수크로스 동등물)을 가진 최소 배지 MML11PG1_100 내 호기성 조건 하에서 삼각 플라스크 분석으로 배양하였다.

이 실험에서 사용한 사탕수수 액을 남동 아시아 지역의 당 제분소로부터 얻었고 원액이 석회로 투명화된 직후에 모았다.

34 ℃에서 배양을 수행하였고 MOPS로 배양 배지를 완충함으로써 pH를 유지하였다. 배양의 마지막에서, 1,2-프로판디올, 및 발효 브로쓰 내 나머지 수크로스, 글루코스 및 프룩토스를 HPLC로 분석하였고 탄소 공급원의 총 합에 대한 1,2-프로판디올의 수율을 계산하였다.

n은 같은 실험의 반복 횟수임.

실시예 4: 사탕수수 액만을 가지거나 영양분을 보충한 1,2- 프로판디올의 생산:

실시예 1에서 서술된 것처럼 얻어진 균주를 보충물이 없거나 또는 포스페이트 및 암모늄((NH₄)₂HPO₄ 2.5 g/l), 철(Fe 시트레이트, H₂O 0.1 g/l) 및 티아민(0.02 g/l)로 보충된 것 각각의 희석된 사탕수수 액 (20 g/l 수크로스 동등물)을 포함하는 배지 내 호기성 조건 하에서 삼각 플라스크 분석으로 배양하였다.

34 ℃에서 배양을 수행하였고 MOPS (40 g/l)로 배양 배지를 완충함으로써 pH를 유지하였다. 배양의 마지막에서, 1,2-프로판디올, 및 발효 브로쓰 내 나머지 수크로스, 글루코스 및 프룩토스를 HPLC로 분석하였고 탄소 공급원의 총 합에 대한 1,2-프로판디올의 수율을 계산하였다.

n은 같은 실험의 반복 횟수임.

주어진 수들은 n 반복 동안 얻어진 수들의 평균 및 표준 편차임

참고문헌 (본문에서 인용한 순서를 따름)

Claims

수크로스 공급원을 포함하는 적절한 배지에서 1,2-프로판디올을 생산하는 미생물을 배양하는 단계, 및
생산되는 1,2-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하며,
상기 미생물은 1,2-프로판디올의 생산을 위한 단일 탄소 공급원으로써 수크로스를 이용할 수 있는,
발효에 의한 1,2-프로판디올의 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 미생물이 단일 탄소 공급원으로써 수크로스를 이용할 수 있도록 유전적으로 변형된 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미생물이 PTS 수크로스 이용 시스템을 코딩하는 작용 유전자를 갖는 방법.
제3항에 있어서, 상기 미생물이 유전자 scrKYABR의 도입으로 변형된 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미생물이 비-PTS 수크로스 이용 시스템을 코딩하는 작용 유전자를 갖는 방법.
제5항에 있어서, 상기 미생물이 유전자 cscBKAR의 도입으로 변형된 방법.
제1 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 박테리아, 효모 및 진균으로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
제7항에 있어서, 상기 미생물이 장내세균(Enterobacteriaceae), 바실라세아에(Bacillaceae), 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae), 스트렙토미세타세아에(Streptomycetaceae) 및 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae)로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
제8항에 있어서, 상기 미생물이 대장균(Escherichia coli), 폐렴 간균(Klebsiella pneumoniae), 써모아나에로박테리엄 써모사칼롤리티쿰(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum), 클로스트리듐 스페노이데스(Clostridium sphenoides) 또는 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
제1 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수크로스의 공급원이 바이오매스, 특히 식물 바이오매스로부터 얻어진 방법.
제10항에 있어서, 상기 수크로스의 공급원이 사탕수수, 사탕무, 단수수, 사탕단풍, 사탕야자 및 블루 아가베로 구성된 군 중에서 선택된 식물로부터 얻어진 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 수크로스의 공급원이 액, 농축액 또는 시럽, 투명액, 당밀 또는 결정화된 수크로스의 형태인 방법.
제10 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수크로스의 공급원이 사탕수수 또는 사탕무 산업의 최종 생성물, 중간 생성물 또는 부산물인 방법.
제1 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적절한 배지가 수크로스의 공급원으로 구성된 방법.
제1 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적절한 배지가 수크로스의 공급원에 더하여 하나 이상의 인 공급원 및/또는 질소 공급원을 포함하는 방법.
제1 내지 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수크로스 공급원이 7% 이상의 수크로스를 포함하는 방법.