CN101875912A - 一种可降低发酵副产物的乙醇发酵工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可降低发酵副产物的乙醇发酵工程菌，其特征是大肠杆菌的丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脱氢酶基因失活，且大肠杆菌中转入了运动发酵单胞菌基因。用本发明的工程菌发酵六碳糖和五碳糖生产乙醇时，不产生乳酸和甲酸，减少了副产物，从而提高了乙醇产率。

Description

一种可降低发酵副产物的乙醇发酵工程菌

技术领域

本发明涉及一种可降低发酵副产物的乙醇发酵工程菌，本发明还涉及所述工程菌的制备方法及其在发酵生产乙醇中的应用。

背景技术

许多植物，尤其是一些常被废弃的植物中纤维素含量较高，如在农作物秸秆和残留物中，纤维素和半纤维素的含量可占到干重的75％以上。如果能用于发酵生产乙醇，是非常好的利用方式。

纤维素主要是由六碳糖和五碳糖，如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖等组成。

大肠杆菌含有利用六碳糖和五碳糖的所有必需酶，可发酵某些六碳糖和五碳糖。但是利用未经改造的野生型大肠杆菌发酵生产乙醇，产率很低，且副产物多，在产业上并不可行。

中国专利200710177003.2公开了一种大肠杆菌乙醇发酵工程菌，将大肠杆菌JML09通过乙醇的多代筛选得到突变株，然后转入了运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因II和丙酮酸脱羧酶基因，在分别以木糖和葡萄糖为碳源发酵生产乙醇时，乙醇产率达到了理论产率的79％和87％。

但是，已知在六碳糖和五碳糖的发酵过程中会积累很多有机酸类中间代谢的副产物，如甲酸和乳酸等，乙醇仅占很少一部分。副产物的问题不仅影响了乙醇产量，还存在后续处理时与副产物分离的工艺问题。

因此，设法在发酵时降低副产物，在利用纤维素发酵生产乙醇的技术中是亟待解决的问题。

发明内容：

本发明的目的是提供一种新型大肠杆菌乙醇发酵工程菌，使其在用五碳糖和六碳糖做底物发酵生产乙醇时能减少副产物，从而提高乙醇产率。

具体目的是对大肠杆菌的乙醇代谢途径进行改造，敲除积累副产物的基因，减少发酵时副产物的形成；同时引入高效的乙醇发酵途径，使乙醇成为主要发酵产物。在高浓度乙醇下依然能够保持较高的发酵速率，而且有较高的乙醇产率。

本发明用以下两种方式达到了本发明的上述目的：

1、对产乙醇的大肠杆菌突变株进行了基因改造。

将大肠杆菌通过Red重组系统将丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脱氢酶基因突变，从而不能积累甲酸和乳酸等副产物，得到减少副产物的突变株。所述Red重组系统来源于Datsenko and Wanner(见Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97(12)，6640-6645)。

2、在去除副产物的突变株中转入了运动发酵单胞菌基因

所述运动发酵单胞菌基因是产乙醇的乙醇脱氢酶基因II和丙酮酸脱羧酶基因，两个基因在可被大肠杆菌RNA聚合酶高效识别的强启动子Ptac启动下发生共表达，得到高产乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌。

由于引入同型乙醇发酵途径，控制其细胞内的碳代谢向生成乙醇的方向进行，使得其发酵主产物为乙醇。

在本发明的一个实施例中，大肠杆菌乙醇发酵工程菌的具体制备方法是：

1、通过Red重组系统分别突变失活大肠杆菌MG1655丙酮酸甲酸裂解酶和乙醇脱氢酶基因，从而减少副产物甲酸和乳酸的产生，在无氧的条件下使其碳代谢和能量代谢流向生产乙醇的方向，达到积累乙醇的目的。

2、将包含有SD序列的运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因经过PCR克隆后连接到pGEM-T easy载体上，经过酶切后置于含有可被大肠杆菌RNA聚合酶高效识别的强启动子Ptac的表达载体pZY507上，使得乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因在大肠杆菌中发生共转录和共表达，得到大肠杆菌乙醇发酵工程菌。

经实验证实，用本发明所提供的大肠杆菌乙醇发酵工程菌在发酵五碳糖和六碳糖生产乙醇时，其发酵葡萄糖转化率达到理论产值的(97％)发酵木糖的转化率达到理论产值的(96％)

本发明的优点是：

1.将丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脱氢酶基因突变，从而不能积累甲酸和乳酸等副产物，在发酵生产乙醇时降低了副产物的含量；

2.同时共同转录和表达运动发酵单胞菌的外源基因，乙醇成为主产物。

本发明以具有乙醇耐受性大肠杆菌MG1655构建发酵乙醇的双突变株，从而降低副产物的积累，使得工程菌能够生产高浓度乙醇，同时可以耐受高浓度乙醇；

利用了含有能被大肠杆菌RNA聚合酶高效识别的强启动子Ptac的表达载体使运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因在大肠杆菌耐乙醇突变株ET1中共同转录和表达。使得其发酵主产物为乙醇，在提高乙醇产率的同时降低了后续纯化，如蒸馏过程中的投入。

具体实施方式

实施例1耐乙醇大肠杆菌乙醇发酵工程菌的制备

A、大肠杆菌乙醇耐受株MG1655的筛选

大肠杆菌MG1655，JML09，BW25113，BL21，BW25141在LB培养基培养，生长到对数期后转接到含有4％，6％乙醇的LB培养基培养中，(乙醇经过0.45μm的滤膜过滤除菌后加入到LB培养基中)，12h，24h分别测定液体LB培养基中OD₆₀₀的吸光值来测量筛选菌株之间生长速度的差异。比较OD₆₀₀得出结论，MG1655在乙醇耐受性方面优于其他大肠杆菌。

B、大肠杆菌产乙醇丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脱氢酶基因突变株的筛选

利用氯化钙将大肠杆菌MG1655制成感受态细胞，经热激(42℃90秒，冰上120秒)转化后，将辅助质粒PKD46转入MG1655，在含有20μg/mL的氨苄青霉素筛选转化子。

根据Datsenko and Wanner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97(12)，6640-6645)Red重组先得到的pflB(丙酮酸甲酸裂解酶)突变株，然后得到ldhA(乳酸脱氢酶)基因的突变的双突变株。根据这个方法：

以SEQ ID NO：1(5′-GTCCGAGC TTAATGAAAAG-3′)和SEQ ID NO：2(5′-AAGTCCACTGGATAGCTT-3′)为引物，扩增pflB两端同源臂与pUC4K的卡那抗性盒的线性片段基因，其产物大小为1544bp，将PCR产物回收做线性转化。

PCR反应体系(pUC4K)

10×PCR buffer    2μL

2.5mMdNTP         2μL

50pM gfo1         2μL

50pM gfo2         2μL

模板DNA           5ng

5U/μLTaq酶          0.25μL

加无菌水至20μL

PCR反应条件：

1、94℃预变性        300s

2、94℃              30s

50℃                 30s

72℃                 60s

(30个循环)

3、72℃              5min

以SEQ ID NO：3(5′-ATTCATTAAA TCCGCCAGCT TATAAG-3′)和SEQ ID NO：4(5′-ATCCAGGTGT TAGGCAGCATG-3′)扩增带有ldhA两端同源臂及PKD3的氯霉素抗性盒的片段，其产物大小为1918bp，PCR片段进行回收，然后线性转化。

PCR反应体系(PkD3)

10×PCR buffer    2μL

2.5mMdNTP         2μL

50pM pflB-F       2μL

50pM pflB-R       2μL

模板DNA           5ng

5U/μL Taq酶      0.25μL

加无菌水至20μL

PCR反应条件：

1、94℃预变性     300s

2、94℃           30s

60℃              30s

72℃              40s

(30个循环)

3、72℃           10min

将得到的PCR线性片段通过琼脂糖胶回收，并且电激转化含有温度敏感型质粒PKD46的MG1655丙酮酸甲酸裂解酶突变株。pKD46(Datsenko and Wanner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97：12：6640-45)包含有一段噬菌体X(GenBank accession No.J02459)基因，包含有lambda Red同源重组系统(.gamma.，.beta.，exo genes)，在一个阿拉伯糖诱导的启动子的控制下。通过PKD46可以将PCR回收片段插入到MG1655的基因组中。

电激转化感受态制作方法如下：

1)过夜培养含有PKD46E.coli MG1655，30℃

2)按1％接种到50mL的LB中，氨苄青霉素(20μg/mL)和L-阿拉伯糖(1mM)，30℃培养到OD₆₀₀在0.6左右收集。

3)迅速将培养物置于冰浴15-30min。

4)用10％的甘油洗三次菌体，4000×g，10min。

5)电激加入50mL和100ng的PCR片段，电激之后加入1mL的LB培养基，37℃轻柔振荡下培养1h，然后涂布在加了Km抗性LB平板上37℃培养，12-16h出现重组子。

6)将筛选的重组子涂布在42℃的平板上去除PKD46，通过氨苄青霉素抗性验证PKD46是否存在。

验证突变株

pflB-ldhA双突变株通过PCR验证，通过验证引物：以SEQ ID NO：5(5′-CTGACAAAAAAGGCTCTCGCG-3′)和SEQ ID NO：6(5′-TCGGTGGTGGTTTGTTGG-3′)扩增带有pflB两端同源臂及pUC4K的卡那霉素抗性盒的片段，其产物大小为4104bp，野生型是2494bp。

分别以野生型基因组和突变株基因组做PCR，PCR程序如下：

10×PCR buffer    2μL

2.5mMdNTP         2μL

50pM yz-F         2μL

50pM yz-R         2μL

模板DNA           5ng

5U/μL Taq酶      0.25μL

加无菌水至20μL

PCR反应条件：

1、94℃预变性     300s

2、94℃           30s

48℃(ldhA 60°)   30s

72℃              40s

(30循环)

3、72℃           10min

以SEQ ID NO：7(5′-GTCATT ACTTACACAT CCCGC-3′)和SEQ ID NO：8(5′-TAGTGTAGGC GCAACCTTCA-3′)扩增带有ldhA两端同源臂及PKD3的氯霉素抗性盒的片段，其产物大小为1446bp，野生型是1246bp。

C、大肠杆菌MG1655运动发酵单胞菌XW101乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因的克隆

以SEQ ID NO：9(5′-GGATCCGTGTTTTGAATATATGGA-3′)和SEQ ID NO：10(5′-GCATGCTAGAGGAGCTTGTTAACAG-3′)为引物，扩增运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因，其产物大小为1800bp；以SEQ ID NO：11(5′-GCGAGCTCAGTATGTAGGGTGAGG-3′)和SEQ ID NO：12(5′-GTCGACTTAGAAAGCGCTCAGGAA-3′)为引物，扩增运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因，其产物大小为1200bp。并分别克隆到pGEM-T easy(Promega)载体上，经测序分析后，与已报道的运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因的同源性为99％，经过酶切后将pdc和adhB基因连接到表达载体pZY507上得到质粒pZY507bc。

PCR反应体系(Z.m pdc)：

10×PCR buffer   2μL

2.5mMdNTP        2μL

10×BSA          2μL

50pM gfo1        2μL

50pM gfo2        2μL

模板DNA          5ng

5U/μL Taq酶     0.25μL

加无菌水至20μL

PCR反应条件：

1、94℃预变性    300s

2、94℃          30s

56℃             30s

72℃             60s

(28个循环)

3、72℃            5min

PCR反应体系(Z.m adhB)：

10×PCR buffer     2μL

2.5mM dNTP         2μL

10×BSA            2μL

50pM gfo1        2μL

50pM gfo2        2μL

模板DNA          5ng

5U/μLTaq酶      0.25μL

加无菌水至20μL

PCR反应条件：

1、94℃预变性    300s

2、94℃          30s

62℃             30s

72℃             40s

(28个循环)

3、72℃          5min

连接体系与连接反应：

2×buffer            5μL

pGEM-T easy          1μL

PCR产物              1μL

T₄连接酶(3U/μL)     1μL

加水至10μL，4℃过夜连接。

D、高产乙醇突变株的大肠杆菌乙醇工程菌的构建

利用氯化钙将大肠杆菌乙醇耐受突变株MPL制成感受态细胞，经热激(42℃90秒，冰上120秒)转化后，在含有25μg/mL的氯霉素和卡那霉素的LB培养基上工程菌株，得到工程菌株MPL-pzy507bc。

E、运动发酵单胞菌XW101醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因的验证

采用B中的引物，以工程菌株MPL-pZY507bc的质粒为模板(反应条件和反应体系如B中所述)，可分别扩增到大小约1.2kb和1.8kb的条带，利用RNA试剂盒提取ET1bc的总RNA，经反转录后PCR扩增到一条3.0kb的条带，说明运动发酵单胞菌XW101醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因在大肠杆菌中做为一个转录单元发生了共转录。

实施例2工程菌株MPL-pzy507bc发酵生产乙醇

1.培养条件

1.1M9培养基，成分为：

葡萄糖2％、Na₂HPO₄·7H₂O 64g、KH₂PO₄15g、NaCl 2.5g、NH₄Cl 5.0g、121℃，15min。1mol/L MgSO₄2mL、1mol/L CaCl₂0.1mL，终体积1L；

木糖10％Na₂HPO₄·7H₂O 64g、KH₂PO415g、NaCl 2.5g、NH₄Cl 5.0g、121℃，15min。1mol/L MgSO₄2mL、1mol/L CaCl₂0.1mL，终体积1L；

1.2培养和发酵条件

将MPL-pZY507bc接种到M9培养基中，培养到OD₆₀₀＝0.2左右时加入1.0mM的IPTG诱导，当MPL-pZY507bc生长到OD₆₀₀＝1.0时离心收集菌体，接种到1.1所述的发酵培养基中，接种后使其OD₆₀₀值大约为1.0左右，37℃厌氧培养。

2.发酵液中残留糖的测定方法

采用高效液相色谱检测发酵液中的残留糖含量，测定条件如下，检测器：Waters410示差折光检测器；柱温：35；色谱柱：大连依利特公司HypersilNH₂(4.6mmi.d.×250mm5μm，)；流动相：V(乙腈)∶V(水)＝80∶20；流速：1mL·min^-1，进样量10μm。

3.乙醇的测定方法

采用GC-17A岛津气相色谱仪检测发酵液中的乙醇含量，FID检测器。

色谱柱：CP-Wax57CB毛细管柱，长50m，内径0.25mm，膜厚0.2μm。

色谱条件柱温：130℃。

检测器温度：180℃。

进样器温度：180℃。

载气：高纯氮；氢气流速：50mL/min；空气：500mL/min；尾吹：30.0mL/min。

进样量：0.5μL。

4.有机酸的测定方法

采用安捷伦(Agilent)高效液相色谱检测发酵液中的有机酸含量，测定条件如下：Waters410示差折光检测器；柱温：35℃；色谱柱：美国伯乐公司Aminex HPX-87H(7.8mmi.d.×300mm5μm，)；流动相：H₂SO₄(5mM)；流速：0.8mL·min^-1，进样量10μm。

5.试验方法

说明：所有利用农作物秸秆进行乙醇生产的技术都是将其经过酶解或者酸解处理成为五碳或者六碳糖以后再进行发酵的。因此，本试验以2％的木糖和葡萄糖为发酵底物，用20mLM9培养基，在37℃的发酵条件下，经过42小时发酵后，检测：

1)MPL-pzy507bc发酵产物中有机酸副产物；

2)残留糖和发酵产物乙醇含量。

6、试验结果

6.1发酵产物中有机酸的含量，见表1。

表1发酵产物中有机酸含量

在MPL-pzy507bc发酵产物中没有检测到甲酸和乳酸。

6.2发酵液中所测得的残留糖和乙醇含量，见表2。

表2糖和乙醇含量

在分别以木糖和葡萄糖为碳源发酵生产乙醇时，乙醇产率达到了理论产率的96％和97％。

6.试验结论

1)用本发明的菌株MPL-pzy507bc，不产生副产物甲酸和乳酸。

2)糖的转化率高。

证明本发明制备的工程菌在用农作物秸秆等分解后的主要产物五碳糖和六碳糖做底物发酵生产乙醇时，乙醇产率高。

Claims (8)

1.一种可降低发酵副产物的乙醇发酵工程菌，其特征是大肠杆菌的丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脱氢酶基因失活，且大肠杆菌中转入了运动发酵单胞菌基因。

2.权利要求1所述的工程菌，所述大肠杆菌是大肠杆菌MG1655菌株，所述运动发酵单胞菌基因是运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因II和丙酮酸脱羧酶基因。

3.权利要求1所述的工程菌的制备方法，步骤为：

1)大肠杆菌根据Red重组系统分别突变其丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脱氢酶基因，得到了发酵时不产生乳酸和甲酸的突变株；

2)在步骤1)所述突变株中转入运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因II和丙酮酸脱羧酶基因，该两个基因在强启动子Ptac启动下发生共表达。

4.权利要求3所述的工程菌的制备方法，所述大肠杆菌是大肠杆菌MG1655菌株。

5.权利要求3所述的工程菌的制备方法，所述转入运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因II和丙酮酸脱羧酶基因的方法是：将包含有SD序列的运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因经过PCR克隆后连接到pGEM-T easy载体上，经过酶切后置于含有可被大肠杆菌RNA聚合酶高效识别的强启动子Ptac的表达载体pZY507上，使得乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因在大肠杆菌中发生共转录和共表达。

6.权利要求1或2所述的工程菌在用五碳糖和六碳糖做底物发酵生产乙醇中的应用。

7.一种可降低发酵副产物的乙醇发酵工程菌突变株，其特征是将丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脱氢酶基因突变，同时转入运动发酵单胞菌基因。

8.权利要求7所述的突变株的制备方法，其特征是通过Red重组系统突变大肠杆菌MG1655菌株的丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脱氢酶基因，经过筛选后得到重组子，挑选生长迅速的单菌落转入运动发酵单胞菌基因进行发酵培养。