CN115803443A

CN115803443A - 寡糖的制造

Info

Publication number: CN115803443A
Application number: CN202180049624.0A
Authority: CN
Inventors: M·彼得森; M·帕帕扎基斯; P·贝克尔; E·萨曼; P·佩尔蒂埃-帕因; K·B·坎普曼; T·约翰松; E·钱皮恩; G·戴卡尼
Original assignee: Glycom AS
Current assignee: Glycom AS
Priority date: 2020-07-13
Filing date: 2021-07-12
Publication date: 2023-03-14
Also published as: EP4179102A1; WO2022013143A1

Abstract

本发明涉及一种用于制造寡糖、优选3～8个单糖单元的寡糖、更优选3～5个单糖单元的寡糖、特别是HMO的基因修饰微生物，其包括一个或多个编码蔗糖利用系统的基因，因此该微生物可以使用蔗糖作为碳源和能量来源。

Description

寡糖的制造

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及使用基因修饰微生物特别是大肠杆菌(E.coli)，使用蔗糖作为其专用碳源的寡糖、特别是人乳寡糖(HMO)的微生物制备。

背景技术

近来，使用重组微生物的异种(foreign)或外源寡糖的发酵合成在商业和工业上已经变得备受关注。在这种合成中，目的寡糖将通过由微生物的一种或多种异源糖基转移酶介导的糖受体的酶促糖基化来合成，并且糖基化所需的一种或多种活化的糖核苷酸将由相同的微生物通过过表达一个或多个编码内源活化的糖核苷酸产生酶的基因而产生。这种合成的代谢途径需要碳源，其主要为简单的碳结构单元，通常为甘油或葡萄糖(参见，例如，WO 01/04341、Priem等人,Glycobiology 12,235(2002)、Fort等人,Chem.Comm.2558(2005)、Drouillard等人,Angew.Chem.Int.Ed.45,1778(2006)、WO 2010/070104、WO 2012/112777、WO 2013/182206、WO 2014/048439)。在一些合成中，如果乳糖用作受体，则其也可以是碳源(Lee等人,Microb.Cell Fact.11：48(2012))。由于对微生物进行了基因操作，利用抗生素抗性选择标记基因，以便将转化的微生物与接种物和发酵液中未转化的微生物分开。然而，已经通过将编码参与供体糖的从头生物合成的酶的基因整合进微生物的染色体中，避免了抗生素的使用(

等人,Microb.Cell Fact.12:40(2013))。

大约50％的野生型大肠杆菌能够利用蔗糖作为碳源和能量来源，但是它们中的大多数是致病的。在工业中合成化学物质主要使用的大肠杆菌菌株无法在蔗糖上存活和生长(Bruschi等人,Biotechnol.Adv.30,1001(2012))。然而，在某些情况下，蔗糖可以是更廉价的碳源和能量来源。出于这个原因，已经尝试了生成可以在蔗糖上存活并生长的大肠杆菌的suc⁺菌株(例如，GB 2155935 A、Sabri等人,Appl.Environ.Microbiol 79，478(2013))，并且通过它们来制备工业上可获利的产品，比如氨基酸、生物燃料、类胡萝卜素等(例如，EP-A-1149911、EP-A-2239336、EP-A-2371952、EP-A-2405006、WO 2010/051849、WO 2012/078311、Kim等人,Biores.Technol.130,288(2013))。然而，比起suc^-菌株，这些suc⁺转化株通常生产率较低(Khamduang等人,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.36,1267(2009))。

WO 2012/007481描述了表达蔗糖磷酸化酶或蔗糖转化酶结合果糖激酶的大肠杆菌转化株。从而，微生物能够利用蔗糖作为其主要碳源产生2’-岩藻糖基乳糖。而且，WO2014/067696、WO 2015/150328、WO 2019/043029和WO 2019/076941描述了包括能够使其在蔗糖上生长并分别产生岩藻糖、2’-FL、唾液乳糖和唾液酸的csc基因簇的大肠杆菌转化株。

然而，对于使用能够更有效地利用蔗糖作为碳源和能量来源的转化微生物制造寡糖、特别是HMO的替代方法，仍持续存在需求。

发明内容

本发明的第一方面涉及通过使碳水化合物受体糖基化来制造寡糖、优选3～8个单糖单元的寡糖、更优选3～5个单糖单元的寡糖、特别是HMO的方法，所述碳水化合物受体不是蔗糖，并优选为乳糖，所述方法包括以下步骤：

a)提供细胞，优选为大肠杆菌细胞，其可以使所述受体内化至所述细胞中，并且包括

-编码糖基转移酶的重组基因，所述糖基转移酶能够将活化的糖核苷酸的糖残基转移至内化在所述细胞中的所述受体，或者转移至从所述受体到所述寡糖的生物合成途径中的中间体，和

-在所述细胞中制造所述活化的糖核苷酸的生物合成途径，

b)在所述受体和蔗糖的存在下培养所述细胞，和

c)从所述细胞、从培养基或从二者中分离所述寡糖，

所述方法特征在于，所述细胞还包括一个或多个编码蔗糖利用系统、优选编码异源蔗糖利用系统、更优选编码异源PTS-依赖性蔗糖利用转运系统的基因，更优选scr基因，使得所述细胞可以使用蔗糖作为碳源、优选作为主要碳源、更优选作为唯一的碳源，用于制造所述活化的糖核苷酸，以及作为能量来源、优选作为主要能量来源、更优选作为唯一的能量来源，用于制造所述寡糖。

本发明的第二方面涉及一种细胞，优选为大肠杆菌细胞，其可以使碳水化合物受体内化至所述细胞中，所述碳水化合物受体不是蔗糖，并优选为乳糖，并且所述细胞包括：

-编码糖基转移酶的重组基因，所述糖基转移酶能够将活化的糖核苷酸的糖残基转移至内化在所述细胞中的所述受体，或者转移至从所述受体到所述寡糖的生物合成途径中的中间体，

-在所述细胞中制造所述活化的糖核苷酸的生物合成途径，和

-一个或多个编码蔗糖利用系统、优选编码异源蔗糖利用系统的基因，更优选scr基因，使得所述细胞可以使用蔗糖作为碳源，优选作为主要碳源，更优选作为唯一的碳源。

附图说明

图1意在对本发明进行进一步说明，而不意在限制本发明的主题。

改造的微生物是完全代谢活性的细胞，其中生长和寡糖合成可以同时进行。该细胞包括异源磷酸转移酶(PTS)-依赖性蔗糖利用转运系统，该系统含有蔗糖特异性孔蛋白(促进蔗糖通过外膜的扩散)、蔗糖转运蛋白(由细胞外蔗糖提供细胞内蔗糖-6-磷酸)和蔗糖-6-磷酸水解酶(提供葡萄糖-6-磷酸和果糖)。通过有机体自身的代谢系统，葡萄糖-6-磷酸和果糖的氧化提供了生物能量来源。另外，葡萄糖-6-磷酸和果糖作为碳源，用于在细胞的天然生物合成途径或细胞中表达的任何异源途径中产生糖核苷酸。这样产生的糖核苷酸是用于使由细胞通过特异性透性酶而内化的碳水化合物受体(例如乳糖)糖基化的供体，从而制造目的寡糖。糖基化由一种或多种糖基转移酶介导，所述糖基转移酶通过从质粒或染色体中表达异源基因而直接产生。有机体缺乏任何使细胞中的受体或者寡糖产物降解的酶。

图2说明在细胞中使用异源PTS-依赖性蔗糖利用转运系统在蔗糖上生长的能力。MDO菌株不含PTS-依赖性蔗糖利用转运系统，而MPLNnT则在蔗糖上生长。

具体实施方式

令人惊奇地发现，外源单糖或二糖受体，优选乳糖，可以通过微生物的转运机制而内化在合适的基因修饰微生物中，特别是大肠杆菌中，使得该碳水化合物受体可以在微生物中使用蔗糖作为其碳源和能量来源得以糖基化，并且能够以良好的产率制造和分离外源寡糖。从而，可以得到有效、价廉且易于扩大的寡糖制造方法。为了使该方法获得成功，需要特定的制造寡糖的微生物，该微生物可以在蔗糖上生存，利用蔗糖用于糖基化所必需的核苷酸糖供体的代谢合成，可以使简单的碳水化合物受体内化并且对它们进行糖基化反应以合成更复杂的寡糖。

因此，本发明第一方面涉及一种通过以下步骤制造寡糖的方法：

a)提供微生物细胞，优选大肠杆菌细胞，其可以使蔗糖和碳水化合物受体，优选乳糖，内化至所述细胞中，并且包括：

-编码糖基转移酶的重组基因，所述糖基转移酶能够将活化的糖核苷酸的糖残基转移至细胞内的受体，或者转移至从所述受体到所述寡糖的生物合成途径中的中间体，和

-用于从蔗糖制造活化的糖核苷酸的生物合成途径，

b)在受体和蔗糖的存在下，在含水培养基中培养细胞，和

c)从细胞、从培养基或从二者中分离寡糖产物。

该方法特征在于，细胞用一个或多个编码蔗糖利用系统的异种基因转化，所述蔗糖利用系统允许细胞使用蔗糖作为碳源、优选作为主要碳源、更优选作为唯一的碳源，用于通过细胞生物合成活化的糖核苷酸。用以转化细胞的蔗糖利用系统，还优选允许细胞使用蔗糖作为能量来源、优选作为主要能量来源、更优选作为唯一的能量来源，用于寡糖的生物合成。

根据本发明，术语“碳水化合物受体”或“受体”优选表示除了蔗糖及其糖苷之外的单糖或二糖。单糖受体或者二糖受体的单糖部分可以包括任意5～6个碳原子的糖部分，其为醛糖(例如，D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖等)、酮糖(例如，D-果糖、D-山梨糖、D-塔格糖等)、脱氧糖(例如，L-鼠李糖、L-岩藻糖等)或者脱氧氨基糖(例如，N-乙酰葡糖胺、N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰半乳糖胺等)。在糖苷型碳水化合物受体中，糖部分通过共价键或者连接基团(linker)连接至非糖残基(苷元(aglycon))，所述共价键是糖残基的糖苷碳原子与非糖部分的任意原子之间的直接键合，所述连接基团由一个、两个、三个或四个原子组成：如-O-、-C-、-NH-、-N(OH)-、-S-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-C(＝NH)-、-C(＝N-OH)-、-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-、-C(＝O)-S-、-S-C(＝O)-、-C(＝S)-O-、-O-C(＝S)-、-C(＝S)-S-、-S-C(＝S)-、-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-、-C(＝NH)-O-、-O-C(＝NH)-、-C(＝S)-NH-、-NH-C(＝S)-、-C(＝NH)-S-和-S-C(＝NH)-。因此，单糖或二糖残基还原端处的C-1(在醛糖的情况下)或C-2(在酮糖的情况下)异头碳原子与非糖部分通过共价键或者形成O-、N-、S-或C-糖苷的连接基团相连。优选地，这些具有或不具有连接基团的糖苷衍生物的苷元为下组中的一种：

a)-OR_A，其中R_A为直链或支链烃链，当饱和时，其具有1～24个、优选1～6个碳原子(如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正己基等)，或者当不饱和时，其具有2～24个、优选2～6个碳原子(如乙烯基、烯丙基、炔丙基等)，或者R_A表示芳基部分(同芳香族基团如苯基或萘基)，或者R_A表示可通过氢解作用除去的基团，即连接氧的键可以在催化量的钯、雷尼镍(Raney nickel)或其他已知用于氢解的金属催化剂的存在下通过氢加成而切除，结果使OH基团再生；这样的保护基团是本领域技术人员已知的，并在Protective Groups in Organic Synthesis,PGM Wuts and TW Greene,John Wiley&Sons2007中进行了讨论。合适的基团包括苯甲基、二苯基甲基(二苯甲基)、1-萘基甲基、2-萘基甲基或三苯基甲基(三苯甲基)基团。上述任意R_A基团可以任选地被一个或多个选自以下的基团取代：烷基(仅用于芳基和可通过氢解除去的基团)、羟基、烷氧基、羧基、氧代、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基羰基、芳氧基、芳基基氨基、芳基羰基、氨基、单烷基氨基和二烷基氨基、氨基甲酰基、单烷基氨基羰基和二烷基氨基羰基、烷基羰基氨基、氰基、烷酰氧基、硝基、烷硫基和卤素；在可通过氢解除去的基团的情况下，如果存在这样的取代，则优选在芳环上；

b)-X-R_B，其中X为N或S，并且R_B表示直链或支链烃链，当饱和时，其具有1～24个、优选1～6个碳原子(如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正己基等)，或者当不饱和时，其具有2～24个、优选2～6个碳原子(如乙烯基、烯丙基、炔丙基等)，或者R_B表示芳基部分(同芳香族基团如苯基或萘基)，或者R_B表示苯甲基。上述任意R_B基团可以任选地被一个或多个选自以下的基团：烷基(仅用于芳基和苯甲基)、羟基、烷氧基、羧基、氧代、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基羰基、芳氧基、芳基氨基、芳基羰基、氨基、单烷基氨基和二烷基氨基、氨基甲酰基、单烷基氨基羰基或二烷基氨基羰基、烷基羰基氨基、氰基、烷酰氧基、硝基、烷硫基和卤素；

c)将异头碳原子与相邻碳原子通过-NH-C(＝O)-O-桥彼此连接的基团，从而形成如下醛糖的情况所示的稠合五元环：

d)叠氮化物；

e)-NH-C(R”)＝C(R’)₂，其中每个R’独立地表示吸电子基团，其选自-CN、-COOH、-COO-烷基、-CO-烷基、-CONH₂、-CONH-烷基和-CON(烷基)₂，或者其中两个R’基团连接在一起形成-CO-(CH₂)_2-4-CO-，并因此与其连接的碳原子形成5～7元的环烷基-1,3-二酮，所述二酮中任意的亚甲基任选地被1或2个烷基取代，并且其中R”为H或烷基；

f)氨基酸残基，其可以为任何天然或非天然的氨基酸，即具有至少一个氨基作为取代基的链烷酸衍生物。优选地，氨基酸选自α-氨基酸和β-氨基酸，如Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、羟基脯氨酸、α-甲基丝氨酸、β-丙氨酸等。这些氨基酸可以直接或者通过如上所述的连接接团(例如，对于脲连接的糖肽，参见WO 2009/040363)连接到碳水化合物的C-1(在醛糖的情况下)或C-2(在酮糖的情况下)异头碳原子上，从而形成O-、N-、S-或C-糖苷。O-糖苷(O-糖基(O-glycans))可以通过含有OH-的氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、羟基脯氨酸等形成，N-糖苷(N-糖基)可以用任意氨基酸的α-、β-等氨基或者例如赖氨酸、天门冬酰胺或谷氨酰胺的侧链的额外的氨基制得，S-糖苷可以用半胱氨酸制得，而C-糖苷(C-糖基)含有将氨基酸的C原子与寡糖部分非还原端的异头碳原子连接的C-C键；

g)聚乙二醇残基。聚乙二醇(PEG)是分子式为C_2nH_4n+2O_n+1的水溶性聚醚，其具有氧乙烯(-CH₂-O-CH₂-或CH₂-CH₂-O-)重复单元，且其中n为2～100、优选2～50、特别是2～25、更特别是2～10。较低分子量的PEG可以以纯化形式使用，其称为“单分散性PEG”，也可以作为PEG的混合物使用，其称为“多分散性PEG”。就其几何形状而言，PEG可以是直链、支链、星型或梳型构造的。直链PEG优选为较低分子量PEG(即，n为2～10、优选3～6)。支链PEG优选具有3～10个直链的、优选较低分子量的、从中心核基团发出的PEG链。星型PEG优选具有10～100个直链或支链的、优选较低分子量的、从中心核基团发出的PEG链。梳型PEG具有多个直链、支链和/或星型的、优选较低分子量的、与聚合物骨架相连的PEG链。PEG的末端伯羟基可以通过醚键与烷基、优选甲基连接。此外，它们的末端羟基可以被氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰基胺基、巯基或烷硫基所代替，或者它们的末端羟基甲基可以被氧化成羧基，其可以是酯化的，或者以具有氨或伯胺或仲胺的酰胺形式存在。该连接为类似于糖苷的键；

h)聚乙烯醇残基。聚乙烯醇(PVA)是分子式为(C₂H₄O)_x的水溶性聚合物，具有-CH₂-CH(OH)-单体单元，其中x为任意所需整数。当连接至碳水化合物时，任意OH-基团可以被糖基化；

i)式A的α,β-不饱和酰胺基团

其中Q₁、Q₂、Q₃和Q₄独立地为H和C₁-C₆烷基，其中烷基可以任选地被卤素、OH、硝基或苯基取代。式A的残基经由其N原子通过共价键连接至糖，优选连接至N-糖苷形式的碳水化合物的异头碳原子；或者

j)式B的α,β-不饱和羰基基团

其中Q₁、Q₂和Q₃如式A的残基所定义。

优选地，碳水化合物受体为半乳糖基二糖、特别是乳糖。

此外，根据本发明，术语“寡糖产物”或“寡糖”优选表示如上所公开的碳水化合物受体的糖基化衍生物，其中糖基残基通过糖苷间键(interglycosidic linkage)连接至碳水化合物受体的碳水化合物部分。优选地，寡糖产物为3～8个单糖单元的寡糖、特别是3～5个单糖单元的寡糖、更特别是4个单糖单元的寡糖或3个单糖单元的寡糖。本发明的寡糖产物为重组产物，即，其通过基因修饰微生物制得，并且对该微生物来说是异种或异源的。

术语“生物合成途径中的中间体”在涉及寡糖或更具体地涉及HMO时，应理解为制备所需寡糖或HMO所需的反应步骤中的中间体寡糖或HMO。例如，LNT-II是LNT或LNnT生物合成途径中的中间体。

用于本发明的一些实施方式的方法中的基因修饰微生物或细胞可以选自细菌和酵母，优选细菌。细菌优选地选自：大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌属(Bacillusspp.)(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、幽门弯曲杆菌(Campylobacterpylori)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、水生嗜热菌(Thermophilusaquaticus)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、豆科植物根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitis)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、乳酸菌属(Lactococcus spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus spp.)、Micromomospora spp.、微球菌属(Micrococcus spp.)、红球菌属(Rhodococcus spp.)、假单胞菌(Pseudomonas)，其中优选大肠杆菌。

此外，根据本发明的一些实施方式，对微生物或细胞，优选大肠杆菌细胞进行基因修饰，使得其DNA序列中存在至少一种改变。该改变可以导致野生型细胞的原始特性发生变化，例如，由于引入了编码不存在于野生型细胞中的酶的表达的新遗传物质，经修饰的细胞能够进行额外的化学转化，或者由于单个基因/多个基因的去除或失活而不能进行转化如降解。在这方面，与天然存在的(野生型)变体相比，基因修饰细胞在其基因组中含有至少一种人工改变。通过改变，核酸构建体通过整合到基因组中或通过经由质粒添加而添加到细胞中，或者核酸序列从细胞基因组中删除或改变。无论是什么情况，如此转化的细胞具有与改变前不同的基因型，因此，经修饰的细胞显示出修饰的特征。优选地，当培养或发酵时，由于引入了异源核酸序列或修饰了天然核酸序列，其编码在野生型细胞中不表达的酶，基因修饰细胞可以进行至少一种额外的或改变的生化反应，或者由于缺失、添加或修饰了编码野生型细胞中存在的酶的核酸序列，基因修饰细胞不能进行一生化反应。基因修饰细胞可以通过众所周知的常规基因工程技术构建(例如Green和Sambrook:Molecular Cloning:Alaboratory Manual，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012)；Currentprotocols in molecular biology(Ausubel等人编辑)，John Wiley and Sons(2010))。

术语“宿主细胞”、“重组微生物或细胞”或“基因修饰微生物或细胞”可互换地用于表示这样的构建体。

术语“编码具有糖基转移酶活性的多肽的核酸序列”或“编码糖基转移酶的核酸序列”是指表达具有糖基转移酶活性的肽的基因、其功能片段或其密码子优化版本。

本上下文中的术语“基因”涉及编码核酸序列，包括基因组DNA和cDNA。

术语“启动子”是指参与RNA聚合酶结合以启动可操作连接基因转录的核酸序列，其中该基因包括编码DNA序列和其他(非编码)序列，例如位于编码序列上游的5’-非翻译区(5’-UTR)，其包括核糖体结合位点。在本发明的一些实施方式中，启动子是分离的DNA序列，即不是基因组DNA的整合DNA片段。启动子的核苷酸序列对应于被视为基因启动子区(例如大肠杆菌的glp操纵子或lac操纵子的启动子区)的细菌基因组DNA片段的核苷酸序列，或者与上述核苷酸序列具有至少80％同一性，优选90％～99.9％同一性，例如95％、98％，甚至更优选100％同一性。优选的启动子是SEQ ID NO:5的启动子。

术语“操纵子”是指基因组DNA或cDNA的功能单元，其含有受单个启动子控制的一组基因。“glp操纵子”是指参与细菌的甘油呼吸代谢的一组基因。优选地，DNA构建体中包括的glp操纵子启动子序列对应于被视为大肠杆菌相应glp操纵子的启动子区的基因组DNA片段的核苷酸序列，或者与上述核苷酸序列具有至少80％同一性，优选90～99.9％同一性，例如95％、98％，甚至更优选100％同一性；特别地，本发明一些实施方式的glp操纵子启动子的分离序列对应于具有GenBank ID：EG10396(glpFKX)、EG10391(glpABC)、EG10394(glpD)、EG10401(glpTQ)的序列上游的基因组序列的片段，或者与上述片段具有所述同一性百分比。本文所指的大肠杆菌基因组为E coli K-12MG1655的完整基因组DNA序列(GenBank ID:U00096.3)。

在一些实施方式中，glp操纵子的启动子与异源糖基转移酶基因和/或异源scr基因可操作地连接。优选地，这些基因在glpF启动子(WO 2019/123324，其内容通过引用并入本文)下表达，特别是在SEQ ID NO:5的glpF启动子下表达。本发明一些实施方式的方法还涉及将外源碳水化合物受体、优选乳酸转运至基因修饰微生物中用于糖基化，以制造异体目的寡糖，优选不会不利地影响细胞的基本功能或者破坏其完整性。在一实施方式中，转运经由被动机制发生，在这期间外源受体被动地扩散穿过细胞的质膜。受体进入微生物的扩散是发酵液与细胞的胞外和胞内空间之间相对于受体浓度差异的作用，借此受体从高浓度区转移至低浓度区。在另一实施方式中，受体借助于主动转运被内化。在此情况下，基因修饰微生物含有称作透性酶的转运蛋白，其起到酶的作用，借此，微生物能够接纳外源物质并使其集中在细胞质中。具体而言，乳糖透性酶(LacY)特异性作用于半乳糖、简单的半乳糖基二糖比如乳糖及其糖苷。对于要被内化的外源碳水化合物受体的糖部分的特异性，可以通过常规重组DNA操纵技术手段对微生物进行突变而改变。在优选的实施方式中，外源乳糖或其衍生物的内化经由乳糖透性酶介导的主动转运机制发生。基因修饰微生物优选缺乏任何可以使受体降解的酶活性(如LacZ)。类似地，微生物不能水解或降解寡糖产物或寡糖产物生物合成途径中的任何寡糖中间体。

而且，在本发明的方法中使用的基因修饰细胞包括一个或多个外源或重组的基因，其编码一种或多种能够将活化的糖核苷酸的糖残基转移至内化的受体的糖基转移酶。如果该基因或者其等同的DNA序列是重组的，则可以通过常规技术例如使用表达载体或者通过染色体整合被引入细胞中。异源核酸序列的来源可以是任何动物(包括人)或植物，真核细胞比如那些来自于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Saccharomycespombe)、白色念珠菌(Candida albicans)或者来自藻类的那些，原核细胞比如源自大肠杆菌、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、发光杆菌属(Photobacterium sp.)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、幽门弯曲杆菌(Campylobacter pylori)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、水生嗜热菌(Thermophilus aquaticus)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、豆科植物根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的那些，或者病毒。通过基因或等同DNA序列编码并表达的一种或多种糖基转移酶优选为葡萄糖基转移酶、半乳糖基转移酶、N-乙酰葡糖胺基转移酶、N-乙酰半乳糖胺基转移酶、葡糖醛酸基转移酶、木糖基转移酶、甘露糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸基转移酶等。在优选的实施方式中，糖基转移酶选自β-1,3-N-乙酰葡糖胺基-转移酶、β-1,6-N-乙酰葡糖胺基-转移酶、β-1,3-半乳糖基-转移酶、β-1,4-半乳糖基-转移酶、β-1,3-N-乙酰半乳糖胺基-转移酶、β-1,3-葡糖醛酸基-转移酶、α-2,3-唾液酸基-转移酶、α-2,6-唾液酸基-转移酶、α-2,8-唾液酸基-转移酶、α-1,2-岩藻糖基-转移酶、α-1,3-岩藻糖基-转移酶和α-1,4-岩藻糖基-转移酶。更优选地，糖基转移酶选自β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶、β-1,6-N-乙酰葡糖胺基转移酶、β-1,3-半乳糖基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶、α-2,3-唾液酸基转移酶、α-2,6-唾液酸基转移酶、α-1,2-岩藻糖基转移酶、α-1,3-岩藻糖基转移酶和α-1,4-岩藻糖基转移酶，其为来自参与构建HMO核心结构以及岩藻糖基化和/或唾液酸基化的HMO及其糖基衍生物的那些酶，其中苷元为在以上碳水化合物受体的基团处所定义的部分。编码上述转移酶的基因已在文献中有述。

用于本发明方法的基因修饰微生物或细胞能够从内化的前体/受体(优选乳糖)制备寡糖。所述细胞具有经由连续糖基化步骤从内化的单糖或二糖合成寡糖所必需的酶活性，其中内化的受体例如乳糖在第一糖基化步骤中被糖基化为三糖，然后该三糖在第二糖基化过程中被糖基化为四糖，等等。糖基化步骤由各自的糖基转移酶介导。在这方面，措辞“糖基转移酶能够将活化的糖核苷酸的糖残基转移至从所述受体到所述寡糖的生物合成途径中的中间体”或者“糖基转移酶可以将活化的糖核苷酸的糖残基转移至从所述受体到所述寡糖的生物合成途径中的中间体”指的是第二、第三等糖基化步骤。例如，如果由乳糖制造乳-N-四糖，则第一糖基转移酶(β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶)将UDP-GlcNAc的GlcNAc转移至内化的乳糖以形成乳-N-三糖II，然后第二糖基转移酶(β-1,3-半乳糖基转移酶)将UDP-Gal的Gal转移至先前形成的乳-N-三糖II(LNT-II)以形成乳-N-四糖。在这方面，乳-N-三糖II被认为是从乳糖到LNT的生物合成途径中的中间体。

在本发明的糖基转移酶介导的糖基化方法中，活化的糖核苷酸用作供体，所讨论的糖基转移酶将适当供体分子的单糖转移至受体分子。各个活化的糖核苷酸通常包括连接至核苷的磷酸化糖残基，并且特异性糖基转移酶仅接受特定的糖核苷酸。因此，优选以下的活化的糖核苷酸参与到糖基转移中：UDP-Glc、UDP-Gal、UDP-GlcNAc、UDP-GalNAc、UDP-葡萄糖醛酸、UDP-Xyl、GDP-Man、GDP-Fuc和CMP-唾液酸，特别优选选自UDP-Gal、UDP-GlcNAc、GDP-Fuc和CMP-唾液酸的那些。

在本发明方法中使用的基因修饰微生物具有通向上述活化的糖核苷酸的生物合成途径，即，其具有一组或多组基因，所述基因编码一种或多种负责合成一种或多种活化的糖核苷酸的酶，以备在培养时用于细胞中的糖基转移酶介导的反应中的糖基化。该组基因或者天然存在于细胞中，或者通过重组DNA操纵技术引入细胞中。通过细胞制造活化的糖核苷酸，在从碳源开始的各个糖核苷酸逐步反应序列的生物合成途径所涉及的酶的作用下发生(对于单糖代谢的综述参见例如，H.H.Freeze和A.D.Elbein:Essentials ofGlycobiology第二版(A.Varki等人编著)，Cold Spring Harbour Laboratory Press(2009)，第四章：Glycosylation precursors)。

应当强调的是，与转移糖基化的体外形式相比，通过基因修饰微生物经由其自身生物合成途径制造活化的糖核苷酸是有优势的，因为它避免了使用非常昂贵的外源加入的糖核苷酸型供体，因此供体由细胞原位形成，并且磷脂酰核苷离去基团在细胞中得以再循环。

此外，本发明的方法中使用的微生物包括编码蔗糖利用系统的基因，即，细胞具有分解代谢利用蔗糖作为碳源以及能量来源的能力。能够使细胞利用蔗糖的系统可以是该细胞的基因池中通常发现的系统，但优选为异源系统(即，源自于不同的有机体，并通过常规重组DNA操纵技术转移至宿主细胞)。通常，可以使用两种蔗糖分解代谢系统：i)磷酸烯醇丙酮酸(PEP)-依赖性磷酸转移酶系统(“PTS”)，其中蔗糖被转运至微生物中并伴随着磷酸化，以生成细胞内蔗糖-6-磷酸，其被水解为葡萄糖-6-磷酸和果糖，接着它们参与到细胞的中心碳代谢中。PTS可以由scr或sac基因编码；ii)非磷酸转移酶依赖性系统(“非-PTS”)，其中细胞外蔗糖在质子同向转运系统(蔗糖透性酶)的帮助下进入细胞，并且在转运之后，通过转化酶水解为葡萄糖和果糖，接着进行磷酸化。就此而言，csc调节子由编码负责非-PTS蔗糖利用的酶的基因组成。

在本发明方法的发酵期间，将制造寡糖的微生物用蔗糖喂养，蔗糖其经由糖酵解提供能量用于生长、繁殖和保持其结构。此外，细胞摄取的蔗糖经由蔗糖分解代谢提供用于合成细胞中发生的糖基化过程所必需的活化的糖核苷酸的前体。内化的碳水化合物受体参与到糖基转移酶诱导的糖基化反应中，其中细胞产生的活化的核苷酸供体的糖残基被转移，使得受体被糖基化。任选地，当细胞表达多于一种糖基转移酶时，可以发生额外的糖基化反应，导致目标寡糖的形成。当然，细胞优选缺乏任何可以降解细胞中产生的寡糖衍生物的酶活性。

在用于制造寡糖产物的方法的优选实现方式中，蔗糖利用系统是异源的。这是对工业上可获利的类似于寡糖制造的转化而言，当微生物、优选细菌、更优选大肠杆菌为经优化的菌株时的情况，因为这样的菌株通常没有利用蔗糖的能力。因此，应当使用合适的表达质粒或者经由染色体整合，在不能利用蔗糖的(蔗糖-)细胞中引入蔗糖摄取盒，以使其成为能够利用蔗糖的(蔗糖+)。更优选地，蔗糖途径基因包括PTS-依赖性蔗糖利用系统，并且特别地，蔗糖调节子为scr。具有scr基因的微生物为例如，沙门氏菌属(Salmonella ssp.)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。

scr基因包括以下者：scrY、scrA、scrB、scrR和scrK。基因scrA编码蔗糖转运蛋白Enzyme II^Scr，其经由通过细胞膜的主动转运和伴随的磷酸化由细胞外蔗糖提供细胞内蔗糖-6-磷酸。蔗糖特异性ScrY膜孔蛋白(由scrY编码)促进蔗糖通过外膜的扩散。ScrB转化酶(由scrB编码)通过水解将累积的蔗糖-6-磷酸分解为葡萄糖-6-磷酸和果糖。任选地，果糖激酶ScrK(由scrK编码)将果糖磷酸化为果糖-6-磷酸，然而这种酶的存在不是关键性的，因为果糖可以通过细胞拥有的其他机制被磷酸化。阻遏蛋白ScrR(由scrR编码)负向控制scrYAB基因的表达，并由蔗糖或果糖诱导。

在一实施方式中，使用质粒例如通过双质粒系统将异源scr基因引入微生物中，上述双质粒系统中一个含有scrA基因且另一个含有scrB基因。scrY、scrR和任选的scrK基因可以由任一质粒携带。在优选的实施方式中，异源scr基因被引入微生物的基因组中，即它们被插入所述微生物或细胞的基因组的某一位点(基因座)，优选可操作地连接到宿主细胞识别的一个或多个控制序列。

另外，优选地，编码糖基转移酶的基因也被插入宿主细胞的基因组中。在这方面，本发明的优选的制造寡糖的细胞是不含质粒的。细胞不含质粒的优点是寡糖(如HMO)的制造增加，并且碳水化合物副产物减少。

另外，优选地，在本发明的一些实施方式的方法中，不向发酵液中添加抗生素，也不在细胞库制备和接种繁殖过程中添加抗生素。

在本发明的方法中，要由微生物糖基化的碳水化合物受体可以为单糖或二糖，其选自半乳糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖基化的单糖、N-乙酰基-葡糖胺基化的单糖以及如上定义的其糖苷衍生物。所有这些碳水化合物衍生物均可以容易地被具有LacY透性酶的细胞通过主动转运吸收，并在糖基化之前积累在细胞中(WO 01/04341、Fort等人J.Chem.Soc.,Chem.Comm.2558(2005)、EP-A-1911850、WO 2013/182206、WO 2014/048439)。这是因为细胞能够使用其LacY透性酶将这些碳水化合物受体转运到细胞中，并且细胞缺乏任何可以降解这些受体的酶、特别是LacZ。优选地，细胞在lac操纵子上的lacA基因是缺失的或缺陷的。

根据另一优选的实施方式，在微生物中，用于lac阻遏物的lacI基因也是缺失或无活性的。在没有功能性阻遏物的情况下，对于任何启动子Plac控制下的基因，不需要诱导剂。

根据一实施方式，编码毒素溶细胞素A的hlyE基因是缺失的或失活的，以消除毒素意外表达的风险，从而获得更安全的生产菌株。

在一实施方式中，如果glp启动子用于在根据本发明的微生物或细胞中表达一个或多个重组基因(见上文)，则调节阻遏基因glpR可以被删除或失活(见WO 2019/123324)，这可以导致产物寡糖，特别是HMO达到更高的总产量。

根据一实施方式，在以下阶段，在含水培养基中培养本发明方法中所用的基因修饰细胞，特别是LacZ^-大肠杆菌细胞：

(a)由蔗糖确保的至少12小时，例如约18小时或20～25小时的指数级细胞生长阶段；然后

(b)连续添加蔗糖的第二(喂养)阶段，其确保有限的细胞生长，该细胞生长持续到蔗糖和优选大部分(例如至少60％)乳糖已被消耗，优选至少35小时，例如至少45小时、50至70小时或最多约130小时。

在喂养阶段，可以向培养基一次性、按顺序地或者连续地加入要被细胞内化并在其中糖基化的外源碳水化合物受体，优选乳糖。在该第二阶段，受体可以以纯的固体/液体或者以浓缩的水溶液或悬浮液的形式加入。寡糖的生产发生在该第二阶段，并且可以持续6～7天。优选地，该喂养阶段在允许以高细胞密度产生培养物的条件下进行。

本发明的一些实施方式的方法的特征在于，在微生物的生长阶段和生产阶段之间，不需要改变碳源和/或能量来源。

任选地，在细胞仍然具有乳糖阻遏基因lacI的情况下，该方法进一步包括向培养基中加入诱导剂，以诱导细胞表达参与受体转运和/或参与内化的受体糖基化和/或参与活化的糖核苷酸供体的生物合成的酶和/或蛋白质。诱导剂优选为异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，并且在喂养阶段的开始加入到培养基中。然而，如果细胞具有Lacl^-基因型的话，则没有必要使用诱导剂。

据信，上述本发明方法中所用的微生物在上述本发明的处理条件下是高度稳定的。因此，据信，相比于使用甘油和/或葡萄糖作为其碳源和/或能量来源的微生物，这些微生物可以使用蔗糖作为其碳源和能量来源至少以相同的生产率、并且以更可靠和可重现的方式，制造寡糖。有益的是，与利用葡萄糖或甘油的菌株相比，本发明方法中使用的基因修饰细胞的一些实施方式产生更少的碳水化合物副产物(例如2’-FL、DFL、LNT或LNT-II，取决于所需的产物是什么)，而HMO滴度和产量至少得以保持，或甚至略微增加。当异源PTS-依赖性蔗糖利用系统并入到宿主细胞的基因组中时，这些效果还要进一步增加。在本发明一实施方式中，当本发明的基因修饰微生物在蔗糖上生长时，与不含PTS依赖性蔗糖系统并因此在葡萄糖上生长的类似微生物相比较，相对于期望的HMO，其他HMO组分的量降低了至少10％、优选至少15％、优选至少20％、优选至少25％。在本发明一实施方式中，当本发明的基因修饰微生物在蔗糖上生长时，与不含PTS依赖性蔗糖系统并因此在葡萄糖上生长的类似微生物相比较，DFL/2’-FL比率降低了至少10％、至少15％、例如至少20％、例如至少25％。因此，使用蔗糖菌株是有益的，因为它有利于纯化过程。此外，蔗糖菌株制造的HMO具有极低的非特定杂质的总量。副产物形成减少提供了更大的上游工艺优化潜力，因为蔗糖菌株在生产中不会浪费那么多的能量。这意味着，与使用葡萄糖作为碳源时相比较，使用根据本发明的经修饰的微生物并使其在作为碳源的蔗糖上生长的制造寡糖例如HMO的方法，实现了碳/能量利用率的提高。此外，比起例如葡萄糖等单糖碳源，蔗糖更加耐受加热灭菌，因此由蔗糖菌株制造的HMO不含此类降解副产物，特别地，通过本发明的方法制造的HMO产物基本上不含异麦芽糖、曲二糖、龙胆二糖和黑曲霉糖。

在发酵过程结束时，寡糖产物已经累积在微生物的细胞内和细胞外基质中。产物已经优选地以被动方式从细胞中转运出来，到达上清液中，即，其可以穿过细胞膜扩散到外部。该转运可以通过一种或多种细胞中糖流出转运子，即促进糖衍生物从细胞流出到上清液的蛋白质得以促进。糖流出转运子可以是同源或异源的，并且在发酵的条件下可以是过表达的，以增强产生的寡糖衍生物的输出。对于要分泌的产物的糖部分的特异性，可以通过常规重组DNA操纵技术和蛋白质改造通过细胞的突变来改变。优选地，寡糖在细胞外基质中累积。另外可选地，寡糖可以通过以常规方式渗透细胞或破坏细胞壁而从细胞中转运出来，到达上清液中。

然后可以以常规方式将寡糖产物从在其中通过细胞产生寡糖产物的含水培养基中分离。

从培养基中分离寡糖的第一个步骤优选包括将寡糖从产生它的微生物中分离。这优选包括澄清培养基以除去通过培养基因修饰微生物产生的悬浮的颗粒和污染物，特别是细胞、细胞组分、不溶性代谢产物和碎片。在这一步骤中，可以以常规的方式澄清含有寡糖产物的含水培养基。优选地，通过离心和/或微滤和/或超滤来澄清培养基。

从培养基中分离寡糖的第二个步骤优选包括从含水培养基中基本上除去所有可能干扰后续分离步骤的蛋白质以及肽、氨基酸、RNA和DNA和任何内毒素和糖脂，优选在其已经被澄清之后进行。在这一步骤中，可以以常规的方式从培养基中除去蛋白质和相关的杂质。例如，通过超滤、切向流高效过滤、切向流超滤、亲和力色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱和/或凝胶过滤(即尺寸排阻色谱)，特别是通过色谱、更特别是通过离子交换色谱或疏水相互作用色谱，从培养基中除去蛋白质和相关的杂质。除了尺寸排阻色谱之外，蛋白质和相关杂质通过色谱介质或者所选择的膜而保持，而寡糖产物保留在含水培养基中。

如果需要，在已经将蛋白质和相关杂质从培养基中除去之后，随后可以将含水培养基中的寡糖产物与类糖(sugar-like)副产物和与培养基分离。这可以适当地通过对培养基进行色谱分离而完成。在中性寡糖产物的情况下这样的分离可以在色谱分离柱中进行，所述色谱分离柱填充有常规阳离子和/或阴离子交换树脂。酸性阳离子交换树脂可以为单价或二价阳离子形式，且优选为H⁺、K⁺、Na⁺、Mg²⁺或Ca²⁺的形式，特别是Ca²⁺。色谱分离可以以常规方式在溶液的pH为2～9的条件下进行。用于色谱分离的洗脱液优选为水，特别是去离子水，但是也可以使用含水盐溶液。还可以使用醇，如乙醇，以及含水的醇混合物。用离子交换树脂处理也可去除带电粒子和盐。

任选地，在从培养基中分离寡糖产物的任何阶段，可以将含有所述寡糖的水溶液用活性炭处理，优选地从溶液中去除有色体。

根据优选的实施方式，本发明的用于制造寡糖、优选在还原端具有乳糖单元的寡糖、或其糖苷的方法包括以下步骤：

(i)提供基因修饰细胞，所述细胞包括：

-编码糖基转移酶的重组基因，上述糖基转移酶能够将活化的糖核苷酸的糖残基转移至内化的乳糖或其糖苷，和

-活化的糖核苷酸的生物合成途径，

(ii)在外源乳糖或其糖苷以及蔗糖的存在下，培养基因修饰细胞，诱导

-外源乳糖或其糖苷被基因修饰细胞经由主动转运机制内化，和

-通过由细胞表达的糖基转移酶介导的糖基转移，从内化的乳糖或其糖苷形成在还原末端具有乳糖单元的寡糖或其糖苷，

(iii)从细胞、从培养基或者从二者中分离寡糖产物，

其特征在于，细胞还包括异源蔗糖利用系统、优选PTS-依赖性蔗糖利用系统、特别是其中蔗糖调节子为scr的PTS-依赖性蔗糖利用系统，以提供蔗糖作为碳源，用于通过所述细胞生物合成所述活化的糖核苷酸。

该优选方法中使用的基因修饰细胞，可以具有多于一个重组基因，其编码多于一种的糖基转移酶，所述糖基转移酶能够将活化的糖核苷酸的糖残基转移至内化的受体分子或者由相同的细胞产生的之前糖基化的受体，由此，通过由细胞表达的多种糖基转移酶介导的多重糖基转移，寡糖产物由内化的受体形成。因此，得到的寡糖产物可以为糖基化乳糖或其糖苷。糖基化乳糖优选为N-乙酰基-葡糖胺基化的、半乳糖基化的、岩藻糖基化的和/或唾液酸基化的乳糖。为了制造这些衍生物，细胞包括一个或多个编码N-乙酰基-葡糖胺基转移酶、半乳糖基转移酶、唾液酸基转移酶和/或岩藻糖基转移酶的重组基因，并且还包括生成相应的用作转移酶的糖供体的活化糖型核苷酸，即UDP-GlcNAc、UDP-Gal、GDP-Fuc和/或CMP-唾液酸的生物合成途径。

更优选地，通过本方法制得的寡糖产物的特征在于式1：

其中Y为OH或上文定义的非糖苷元，优选为OH，

R₁为岩藻糖基或H，

R₂为岩藻糖基或H，

R₃选自H、唾液酸基、N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基基团，其中N-乙酰基-乳糖胺基基团可以携带有包括一个或多个N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个或多个乳-N-二糖基基团的糖残基；N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基基团中的每一个均可以被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基取代，

R₄选自H、唾液酸基和N-乙酰基-乳糖胺基基团，其任选地被包括一个或多个N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个或多个乳-N-二糖基基团的糖残基取代；N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基基团中的每一个均可以被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基取代，

条件是R₁、R₂、R₃和R₄基团中的至少一个与H不同。

更优选地，由本方法制得的式1的化合物的特征可以在于式1a、1b或1c

其中Y、R₁和R₂如上文所定义，优选为OH，

R_3a为N-乙酰基-乳糖胺基，其任选地被包括一个N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个乳-N-二糖基基团的糖残基取代；N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基基团中的每一个均可以被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基所取代，

R_4a为H或N-乙酰基-乳糖胺基基团，其任选地被乳-N-二糖基基团取代；N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基基团中的每一个均可以被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基取代，

R_3b为乳-N-二糖基基团，其任选地被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基取代，

R_4b为H或N-乙酰基-乳糖胺基基团，其任选地被一个或两个N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个乳-N-二糖基基团取代；N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基基团中的每一个均可以被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基取代，

R₅独立地为H或唾液酸基，

并且其中R₁、R₂或R₅中的至少一个不为H。

再更优选地，根据通过本方法制得的式1a或1b的化合物的特征在于：

-R_3a的糖残基中的N-乙酰基-乳糖胺基基团通过1-3糖苷间键与另一N-乙酰基-乳糖胺基基团连接，

-R_3a的糖残基中的乳-N-二糖基基团通过1-3糖苷间键与N-乙酰基-乳糖胺基基团连接，

-R_4a的糖残基中的乳-N-二糖基基团通过1-3糖苷间键与N-乙酰基-乳糖胺基基团连接，

-R_4b的糖残基中的N-乙酰基-乳糖胺基基团通过1-3或1-6糖苷间键与另一N-乙酰基-乳糖胺基基团连接，

-R_4b的糖残基中的乳-N-二糖基基团通过1-3糖苷间键与N-乙酰基-乳糖胺基基团连接。

再更优选地，根据通过本方法制得的式1a、1b和1c的化合物为人乳寡糖(当Y为OH时)或其糖苷(当Y为非糖苷元时)。

通过本方法制得的式1a的优选化合物选自乳-N-新四糖(LNnT)、对-乳-N-六糖(pLNH)、对-乳-N-新六糖(pLNnH)、乳-N-新六糖(LNnH)、对-乳-N-八糖(pLNO)、乳-N-新八糖(pLNnO)及其糖苷，所有这些均可以任选地被一个或多个唾液酸和/或岩藻糖残基所取代。通过本方法制得的式1b的优选化合物选自乳-N-四糖(LNT)、乳-N-六糖(LNH)、乳-N-八糖(LNO)、异-乳-N-八糖(iLNO)、乳-N-十糖(LND)、乳-N-新十糖(LNnD)及其糖苷，所有这些均可以任选地被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基取代。

式1a或1b特别优选的化合物的特征在于：

-与N-乙酰基-乳糖胺基和/或乳-N-二糖基基团连接的岩藻糖残基

·通过1-2糖苷间键与乳-N-二糖基基团的半乳糖连接，和/或

·通过1-4糖苷间键与乳-N-二糖基基团的N-乙酰基-葡糖胺连接，和/或

·通过1-3糖苷间键与N-乙酰基-乳糖胺基基团的N-乙酰基-葡糖胺连接，

-与N-乙酰基-乳糖胺基和/或乳-N-二糖基基团连接的唾液酸残基

·通过2-3糖苷间键与乳-N-二糖基基团的半乳糖连接，和/或

·通过2-6糖苷间键与乳-N-二糖基基团的N-乙酰基-葡糖胺连接，和/或

·通过2-6糖苷间键与N-乙酰基-乳糖胺基基团的半乳糖连接。

根据最优选的方面，子式1a、1b或1c的化合物选自：2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、2’,3-二岩藻糖基乳糖(2’,3-DFL)、3’-唾液酸基乳糖(3’-SL)、6’-唾液酸基乳糖(6’-SL)、3’-唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖(3’S3FL)、乳-N-四糖(LNT)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-岩藻五糖I(LNFP-I)、乳-N-岩藻五糖II(LNFP-II)、乳-N-岩藻五糖III(LNFP-III)、乳-N-岩藻五糖V(LNFP-V)、唾液酸基乳-N-四糖a(LST-a)、唾液酸基乳-N-四糖b(LST-b)、唾液酸基乳-N-四糖c(LST-c)、唾液酸基岩藻糖基乳-N-四糖(FLST-a)、岩藻糖基唾液酸基乳-N-四糖(FLST-b)、岩藻糖基唾液酸基乳-N-新四糖(FLST-c)、乳-N-二岩藻-六糖I(LNDFH-I)、乳-N-二岩藻六糖II(LNDFH-II)、乳-N-新二岩藻六糖II(LNDFH-III)、二唾液酸基乳-N-四糖(DS-LNT)、岩藻糖基二唾液酸基乳-N-四糖(FDS-LNT I)、二唾液酸基岩藻糖基乳-N-四糖(FDS-LNT II)及其糖苷，或其盐。糖苷可以是α-或β-异头物，但优选为β-异头物。

一种优选的外源加入培养基中的碳水化合物受体为乳酸，且优选的寡糖产物为人乳寡糖(HMO)。HMO由还原端处的乳糖单元和一个或多个以下的单糖单元组成：N-乙酰基-葡糖胺、半乳糖、岩藻糖和唾液酸(参见：Urashima等人的Milk Oligosaccharides,NovaBiomedical Books,New York,2011,ISBN:978-1-61122-831-1；ChenAdv.Carbohydr.Chem.Biochem.72,113(2015))。为了制造HMO，细胞则包括一个或多个编码β-1,3-N-乙酰基-葡糖胺基转移酶、β-1,6-N-乙酰基-葡糖胺基转移酶、β-1,3-半乳糖基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶、α-2,3-唾液酸基转移酶、α-2,6-唾液酸基转移酶、α-1,2-岩藻糖基转移酶、α-1,3-岩藻糖基转移酶和/或α-1,4-岩藻糖基转移酶的重组基因，并且还包括产生相应的活化糖型核苷酸，即UDP-GlcNAc、UDP-Gal、GDP-Fuc和/或CMP-唾液酸的生物合成途径。

根据优选实施方式，本发明的方法涉及中性(非酸性)HMO的制造。中性HMO在其结构中不含唾液酸残基，因此可以是非岩藻糖基化的中性HMO(称为N-乙酰化HMO或核心HMO)和岩藻糖基化HMO。N-乙酰化HMO在其结构中仅具有三种类型的单糖：葡萄糖、半乳糖和N-乙酰基葡糖胺，N-乙酰化HMO优选选自乳-N-新四糖、对-乳-N-六糖、对-乳-N-新六糖、乳-N-新六糖、对-乳-N-八糖、乳-N-新八糖、乳-N-四糖、乳-N-六糖、乳-N-八糖、异-乳-N-八糖、乳-N-十糖和乳-N-新十糖，更优选乳-N-新四糖、乳-N-四糖、乳-N-六糖、对-乳-N-六糖、对-乳-N-新六糖和乳-N-新六糖。岩藻糖基化中性HMO组包括上文公开的N-乙酰化HMO，其为岩藻糖基化和二岩藻糖基化乳糖(2’-FL、3-FL、DFL)。

根据本发明，在优选实施方式中，该方法涉及中性HMO的制造，包括：

(i)提供基因修饰大肠杆菌细胞，所述细胞包括：

(ia)-编码N-乙酰基-葡糖胺基转移酶的重组基因，和一个或多个编码UDP-GlcNAc生物合成途径的基因，所述N-乙酰基-葡糖胺基转移酶能够将UDP-GlcNAc的GlcNAc转移至内化的乳糖，或者转移至从乳糖到所述中性HMO的生物合成途径中的中间体；和/或

-编码岩藻糖基转移酶的重组基因，和一个或多个编码GDP-Fuc生物合成途径的基因，所述岩藻糖基转移酶能够将GDP-Fuc的岩藻糖残基转移至内化的乳糖，或者转移至从乳糖到所述中性HMO的生物合成途径中的中间体，

(ib)-任选地，编码半乳糖基转移酶的重组基因，和一个或多个编码UDP-Gal生物合成途径的基因，所述半乳糖基转移酶能够将UDP-Gal的半乳糖残基转移至从乳糖到所述中性HMO的生物合成途径中的中间体，

(ii)在外源乳糖和蔗糖的存在下培养基因修饰大肠杆菌细胞，由此诱导：

-外源乳糖的内化，和

-在细胞内形成中性HMO，然后

(iii)从细胞、从培养基或从二者中分离中性HMO，

其特征在于，细胞还包括异源PTS-依赖性蔗糖利用系统，以提供蔗糖作为用于通过细胞生物合成UDP-GlcNAc和/或GDP-Fuc和任选的UDP-Gal的碳源以及能量来源，并作为用于制造所述中性HMO的能量来源。

异源PTS-依赖性蔗糖利用系统优选包括scr基因，更优选scrY、scrA、scrB和scrR，并且特别地不含scrK。

根据另一优选实施方式，本发明的制造N-乙酰化HMO，优选3～6个单糖单元的N-乙酰化HMO的方法包括以下步骤：

(i)提供基因修饰大肠杆菌细胞，其包括：

-编码N-乙酰基-葡糖胺基转移酶的重组基因，所述N-乙酰基-葡糖胺基转移酶能够将UDP-GlcNAc的GlcNAc转移至内化的乳糖，或者转移至从乳糖到所述N-乙酰化HMO的生物合成途径中的中间体，

-任选地，编码半乳糖基转移酶的重组基因，所述半乳糖基转移酶能够将UDP-Gal的半乳糖残基转移至N-乙酰基-葡糖胺基化的乳糖，或者转移至从乳糖到所述N-乙酰化HMO的生物合成途径中的中间体，和

-一个或多个编码UDP-GlcNAc及任选的UDP-Gal生物合成途径的基因，

(ii)在外源乳糖和蔗糖的存在下，培养基因修饰大肠杆菌细胞，从而诱导：

-外源乳糖的内化，和

-在细胞内形成N-乙酰化HMO，然后

(iii)从细胞、从培养基或从二者中分离N-乙酰化HMO，

其特征在于，细胞还包括异源PTS-依赖性蔗糖利用系统，以提供蔗糖作为用于通过细胞生物合成UDP-GlcNAc和任选的UDP-Gal的碳源以及能量来源，并作为用于制造所述N-乙酰化HMO的能量来源。

异源PTS-依赖性蔗糖利用系统优选包括scr基因，更优选包括scrY、scrA、scrB和scrR，并且特别是不含scrK。

如果N-乙酰基-葡糖胺基转移酶为β-1,3-N-乙酰基-葡糖胺基转移酶，并且细胞中不存在编码半乳糖基转移酶的重组基因，产物优选为乳-N-三糖II，如果细胞中还存在β-1,3-半乳糖基转移酶或者β-1,4-半乳糖基转移酶，则产物优选分别为LNT或LNnT。

根据另一优选实施方式，本发明的制造岩藻糖基化N-乙酰化HMO，优选LNFP-I、LNFP-II、LNFP-III、LNFP-V、LNFP-VI、LNDFH-I、LNDFH-II或LNDFH-III的方法，包括以下步骤：

(i)提供基因修饰大肠杆菌细胞，其包括：

-编码N-乙酰基-葡糖胺基转移酶的重组基因，和一个或多个编码UDP-GlcNAc生物合成途径的基因，所述N-乙酰基-葡糖胺基转移酶能够将UDP-GlcNAc的GlcNAc转移至内化的乳糖，或者转移至从乳糖到所述岩藻糖基化N-乙酰化HMO的生物合成途径中的中间体；

-编码岩藻糖基转移酶的重组基因，和一个或多个编码GDP-Fuc生物合成途径的基因，所述岩藻糖基转移酶能够将GDP-Fuc的岩藻糖残基转移至内化的乳糖，或者转移至从乳糖到所述岩藻糖基化N-乙酰化HMO的生物合成途径中的中间体，和

-编码半乳糖基转移酶的重组基因，和一个或多个编码UDP-Gal生物合成途径的基因，所述半乳糖基转移酶能够将UDP-Gal的半乳糖残基转移至从乳糖到所述岩藻糖基化N-乙酰化HMO的生物合成途径中的中间体，

(ii)在外源乳糖和蔗糖存在下培养基因修饰大肠杆菌细胞，从而诱导：

-外源乳糖的内化，和

-在细胞内形成岩藻糖基化N-乙酰化HMO，然后

(iii)从细胞、从培养基或从二者中分离岩藻糖基化N-乙酰化HMO，

其特征在于，所述细胞还包括异源PTS依赖性蔗糖利用系统，以提供蔗糖作为用于通过细胞生物合成UDP-GlcNAc、GDP-Fuc和任选的UDP-Gal的碳源以及能量来源，并作为用于制造所述岩藻糖基化N-乙酰化HMO的能量来源。

异源PTS-依赖性蔗糖利用系统优选包括scr基因，更优选scrY、scrA、scrB和scrR，并且特别地，不含scrK。

根据另一优选的实施方式，本发明的用于制备岩藻糖基化乳糖，优选2’-FL、3-FL或DFL的方法，包括以下步骤：

(i)提供基因修饰大肠杆菌细胞，其包括：

-编码岩藻糖基转移酶的重组基因，所述岩藻糖基转移酶能够将GDP-Fuc的岩藻糖残基转移至内化的乳糖，和

-一个或多个编码GDP-Fuc生物合成途径的基因，

(ii)在外源乳糖和蔗糖的存在下培养细胞进行培养，从而诱导：

-外源乳糖的内化，和

-岩藻糖基化乳糖的形成，然后

(iii)从细胞、从培养基或从二者中分离岩藻糖基化乳糖，

其特征在于，细胞还包括异源PTS-依赖性蔗糖利用系统，以提供蔗糖作为用于通过细胞生物合成GDP-Fuc的碳源以及能量来源，并作为用于制造所述岩藻糖基化乳糖的能量来源。

异源PTS-依赖性蔗糖利用系统优选包括scr基因，更优选包括scrY、scrA、scrB和scrR，其分别编码SEQ ID NO:1、2、3和4的蛋白质或其与相应序列具有至少85％、例如90％、例如95％、例如98％的同一性的同源物，并且特别地，不含scrK。

如果岩藻糖基转移酶为α-1,2-岩藻糖基转移酶，产物优选为2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)，如果岩藻糖基转移酶为α-1,3-岩藻糖基转移酶，产物优选为3-岩藻糖基乳糖(3-FL)，如果α-1,2-岩藻糖基转移酶和α-1,3-岩藻糖基转移酶二者都在细胞中表达，产物优选为二岩藻糖基乳糖(DFL)。

根据再另一个优选的实施方式，本发明的用于制备唾液酸基化HMO、优选3～5个单糖单元的唾液酸基化HMO的方法包括以下步骤：

(i)提供基因修饰大肠杆菌细胞，其包括：

-编码唾液酸基转移酶的重组基因，所述唾液酸基转移酶能够将CMP-唾液酸的唾液酸残基转移至内化的乳糖，或者转移至从乳糖到所述唾液酸基化HMO的生物合成途径中的中间体，和

-一个或多个编码CMP-唾液酸生物合成途径的基因，

(ii)在外源乳糖和蔗糖的存在下培养基因修饰大肠杆菌细胞，从而诱导：

-外源乳糖的内化，和

-唾液酸基化HMO的形成，然后

(iii)从细胞、从培养基或从二者中分离唾液酸基化HMO，

其特征在于，所述细胞还包括异源PTS-依赖性蔗糖利用系统，以提供蔗糖作为碳源以及能量来源，用于通过细胞生物合成CMP-唾液酸，以及作为用于制造所述唾液酸基化HMO的能量来源。

如果唾液酸基转移酶为α-2,3-唾液酸基转移酶，产物优选为3’-唾液酸基乳糖，如果唾液酸基转移酶为α-2,6-唾液酸基转移酶，产物优选为6’-唾液酸基乳糖。

根据另一个优选的实施方式，本发明的用于制备岩藻糖基化和唾液酸基化HMO、优选3～5个单糖单元的岩藻糖基化和唾液酸基化HMO的方法，包括以下步骤：

(i)提供基因修饰大肠杆菌细胞，其包括：

-编码唾液酸基转移酶的重组基因，所述唾液酸基转移酶能够将CMP-唾液酸的唾液酸残基转移至内化的乳糖，或者转移至从乳糖到所述岩藻糖基化和唾液酸基化HMO的生物合成途径中的中间体，

-编码岩藻糖基转移酶的重组基因，所述岩藻糖基转移酶能够将GDP-Fuc的岩藻糖残基转移至内化的乳糖，或者转移至从乳糖到所述岩藻糖基化和唾液酸基化HMO的生物合成途径中的中间体，和

-一个或多个编码CMP-唾液酸和GDP-Fuc生物合成途径的基因，

-外源乳糖的内化，和

-唾液酸基-岩藻糖基-乳糖的形成，然后

(iii)从细胞、从培养基或从二者中分离岩藻糖基化和唾液酸基化HMO，

其特征在于，所述细胞还包括异源PTS-依赖性蔗糖利用系统，以提供蔗糖作为用于通过细胞生物合成CMP-唾液酸和GDP-Fuc的碳源以及能量来源，并作为用于制造所述岩藻糖基化和唾液酸基化HMO的能量来源。

异源PTS-依赖性蔗糖利用系统优选包括scr基因，更优选包括scrY、scrA、scrB和scrR，其分别编码SEQ ID NO:1、2、3和4的蛋白质或其与相应序列具有至少85％、例如90％、例如95％、例如98％的同一性的同源物，并且特别地不含scrK。

如果唾液酸基转移酶为α-2,3-唾液酸基转移酶且岩藻糖基转移酶为α-1,3-岩藻糖基转移酶，产物优选为3’-唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖。

根据另一优选实施方式，本发明的用于制造岩藻糖基化LNT或LNnT的方法，包括以下步骤：

(i)提供基因修饰大肠杆菌细胞，其包括：

-编码N-乙酰基-葡糖胺基转移酶的重组基因，所述N-乙酰基-葡糖胺基转移酶能够将UDP-GlcNAc的GlcNAc转移至内化的乳糖，以产生乳-N-三糖II，

-编码半乳糖基转移酶的重组基因，所述半乳糖基转移酶能够将UDP-Gal的半乳糖残基转移至乳-N-三糖II，以产生LNT或LNnT，

-编码岩藻糖基转移酶的重组基因，所述岩藻糖基转移酶能够将GDP-Fuc的岩藻糖残基转移至LNT或LNnT，

-一个或多个编码GDP-Fuc生物合成途径的基因

-一个或多个编码UDP-GlcNAc和UDP-Gal生物合成途径的基因，

(ii)在外源乳糖和蔗糖存在下培养基因修饰大肠杆菌细胞，由此诱导：

-外源乳糖的内化，和

-岩藻糖基化LNT或LNnT的形成，然后

(iii)从细胞、从培养基或从二者中分离岩藻糖基化LNT或LNnT，

其特征在于，所述细胞还包括异源PTS-依赖性蔗糖利用系统，以提供蔗糖作为用于通过细胞生物合成UDP-GlcNAc、UDP-Gal和GDP-Fuc的碳源以及能量来源，并作为用于制造所述岩藻糖基化LNT或LNnT的能量来源。

异源PTS-依赖性蔗糖利用系统优选包括scr基因，更优选scrY、scrA、scrB和scrR，其分别编码SEQ ID NO:1、2、3和4的蛋白质或其与相应序列具有至少85％、例如90％、例如95％、例如98％的同一性的同源物，并且特别地不含scrK。

本发明的第二方面涉及提供一种基因修饰微生物，其可以使蔗糖和并非蔗糖的碳水化合物受体(优选为乳糖)或其糖苷内化至所述微生物中，并且包括：

-编码糖基转移酶的重组基因，所述糖基转移酶可以将活化的糖核苷酸的糖残基转移至微生物内的受体，

-用于由蔗糖产生活化的糖核苷酸的生物合成途径，和

-一个或多个编码异源PTS-依赖性蔗糖利用系统的基因，优选scr基因，使得所述细胞可以使用蔗糖作为碳源、优选作为主要碳源、更优选作为唯一的碳源，用于制造所述活化的糖核苷酸，并且作为能量来源、优选作为主要能量来源、更优选作为唯一的能量来源，从而制造在其结构中包括内化的碳水化合物受体的寡糖或其糖苷。

在第一方面中公开了内化的碳水化合物受体或寡糖产物的糖苷的苷元部分。

本发明的基因修饰微生物或细胞可以选自细菌和酵母，优选细菌。细菌优选地选自：大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、幽门弯曲杆菌(Campylobacter pylori)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、水生嗜热菌(Thermophilus aquaticus)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、豆科植物根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitis)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、乳酸菌属(Lactococcus spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus spp.)、Micromomospora spp.、微球菌属(Micrococcus spp.)、红球菌属(Rhodococcus spp.)、假单胞菌(Pseudomonas)，其中优选大肠杆菌，特别是E.coli K-12或E.coli BL-21。

此外，根据本发明的一些实施方式，对微生物或细胞，优选大肠杆菌细胞进行基因修饰，使得其DNA序列中存在至少一种改变。该改变可以导致野生型细胞的原始特性发生变化，例如，由于引入了编码不存在于野生型细胞中的酶的表达的新遗传物质，经修饰的细胞能够进行额外的化学转化，或者由于单个基因/多个基因的去除或失活而不能进行转化如降解。在这方面，与天然存在的(野生型)变体相比，基因修饰细胞在其基因组中含有至少一种人工改变。通过改变，核酸构建体通过整合到基因组中或通过经由质粒添加而添加到细胞中，或者核酸序列从细胞基因组中删除或改变。无论是什么情况，如此转化的细胞具有与改变前不同的基因型，因此，经修饰的细胞显示出修饰的特征。优选地，当培养或发酵时，由于引入了异源核酸序列或修饰了天然核酸序列，其编码在野生型细胞中不表达的酶，基因修饰细胞可以进行至少一种额外的或改变的生化反应，或者由于缺失、添加或修饰了编码野生型细胞中存在的酶的核酸序列，基因修饰细胞不能进行一生化反应。基因修饰细胞可以通过众所周知的常规基因工程技术构建(例如Green和Sambrook:Molecular Cloning:Alaboratory Manual，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012)；Currentprotocols in molecular biology(Ausubel等人编辑)，John Wiley and Sons(2010))。术语“宿主细胞”、“重组微生物或细胞”或“基因修饰微生物或细胞”可互换地用于表示这样的构建体。

术语“启动子”是指参与RNA聚合酶结合以启动可操作连接基因转录的核酸序列，其中该基因包括编码DNA序列和其他(非编码)序列，例如位于编码序列上游的5’-非翻译区(5’-UTR)，其包括核糖体结合位点。在本发明的一些实施方式中，启动子是分离的DNA序列，即不是基因组DNA的整合DNA片段。启动子的核苷酸序列对应于被视为基因启动子区(例如大肠杆菌的glp操纵子或lac操纵子的启动子区)的细菌基因组DNA片段的核苷酸序列，或者与上述核苷酸序列具有至少80％同一性，优选90％～99.9％同一性。术语“操纵子”是指参与细菌的甘油呼吸代谢的一组基因。优选地，DNA构建体中包括的glp操纵子启动子序列对应于被视为大肠杆菌相应glp操纵子的启动子区的基因组DNA片段的核苷酸序列，或者与上述核苷酸序列具有至少80％同一性，优选90～99.9％同一性；特别地，本发明一些实施方式的glp操纵子启动子的分离序列对应于具有GenBankID：EG10396(glpFKX)、EG10391(glpABC)、EG10394(glpD)、EG10401(glpTQ)的序列上游的基因组序列的片段，或者与上述片段具有所述同一性百分比。本文所指的大肠杆菌基因组为E coli K-12MG1655的完整基因组DNA序列(GenBank ID:U00096.3)。

在一些实施方式中，glp操纵子的启动子与异源糖基转移酶基因和/或异源scr基因可操作地连接。优选地，这些基因在glpF启动子(WO 2019/123324，其内容通过引用并入本文)下表达，更优选地通过SEQ ID NO:5的glpF启动子。

本发明的基因修饰微生物或细胞能够将外源碳水化合物受体、优选乳酸转运至细胞中用于糖基化，以产生异体目的寡糖，优选不会不利地影响细胞的基本功能或者破坏其完整性。在一实施方式中，转运经由被动机制发生，在这期间外源受体被动地扩散穿过细胞的质膜。受体进入微生物的扩散是发酵液与细胞的胞外和胞内空间之间相对于受体浓度差异的作用，借此受体从高浓度区转移至低浓度区。在另一实施方式中，受体借助于主动转运被内化。在此情况下，基因修饰微生物含有称作透性酶的转运蛋白，其起到酶的作用，借此，微生物能够接纳外源物质并使其集中在细胞质中。具体而言，乳糖透性酶(LacY)特异性作用于半乳糖、简单的半乳糖基二糖比如乳糖及其糖苷。对于要被内化的外源碳水化合物受体的糖部分的特异性，可以通过常规重组DNA操纵技术手段对微生物进行突变而改变。在优选的实施方式中，外源乳糖或其衍生物的内化经由乳糖透性酶介导的主动转运机制发生。基因修饰微生物优选缺乏任何可以使受体降解的酶活性(如LacZ)。类似地，微生物不能水解或降解寡糖产物或寡糖产物生物合成途径中的任何寡糖中间体。

而且，在本发明的方法中使用的基因修饰细胞包括一个或多个外源或重组的基因，其编码一种或多种能够将活化的糖核苷酸的糖残基转移至内化的受体的糖基转移酶。如果该基因或者其等同的DNA序列是重组的，则可以通过常规技术例如使用表达载体或者通过染色体整合被引入细胞中。异源核酸序列的来源可以是任何动物(包括人)或植物，真核细胞比如来自于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Saccharomycespombe)、白色念珠菌(Candida albicans)或者来自藻类的那些，原核细胞比如源自大肠杆菌、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、发光杆菌属(Photobacterium sp.)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、幽门弯曲杆菌(Campylobacter pylori)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、水生嗜热菌(Thermophilus aquaticus)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、豆科植物根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的那些，或者病毒。通过基因或等同DNA序列编码并表达的一种或多种糖基转移酶优选为葡萄糖基转移酶、半乳糖基转移酶、N-乙酰葡糖胺基转移酶、N-乙酰半乳糖胺基转移酶、葡糖醛酸基转移酶、木糖基转移酶、甘露糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸基转移酶等。在优选的实施方式中，糖基转移酶选自β-1,3-N-乙酰葡糖胺基-转移酶、β-1,6-N-乙酰葡糖胺基-转移酶、β-1,3-半乳糖基-转移酶、β-1,4-半乳糖基-转移酶、β-1,3-N-乙酰半乳糖胺基-转移酶、β-1,3-葡糖醛酸基-转移酶、α-2,3-唾液酸基-转移酶、α-2,6-唾液酸基-转移酶、α-2,8-唾液酸基-转移酶、α-1,2-岩藻糖基-转移酶、α-1,3-岩藻糖基-转移酶和α-1,4-岩藻糖基-转移酶。更优选地，糖基转移酶选自β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶、β-1,6-N-乙酰葡糖胺基转移酶、β-1,3-半乳糖基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶、α-2,3-唾液酸基转移酶、α-2,6-唾液酸基转移酶、α-1,2-岩藻糖基转移酶、α-1,3-岩藻糖基转移酶和α-1,4-岩藻糖基转移酶，其为来自参与构建HMO核心结构以及岩藻糖基化和/或唾液酸基化的HMO及其糖基衍生物的那些酶，其中苷元为在以上碳水化合物受体的基团处所定义的部分。编码上述转移酶的基因已在文献中有述。

本发明的基因修饰微生物或细胞能够从内化的前体/受体(优选乳糖，并且不受蔗糖)制造寡糖。所述细胞具有经由连续糖基化步骤从内化的单糖或二糖或其糖苷合成寡糖所必需的酶活性，其中内化的受体例如乳糖在第一糖基化步骤中被糖基化为三糖，然后该三糖在第二糖基化过程中被糖基化为四糖，等等。糖基化步骤由各自的糖基转移酶介导。

在糖基转移酶介导的糖基化方法中，活化的糖核苷酸用作供体，所讨论的糖基转移酶将适当供体分子的单糖转移至受体分子。各个活化的糖核苷酸通常包括连接至核苷的磷酸化糖残基，并且特异性糖基转移酶仅接受特定的糖核苷酸。因此，优选以下的活化的糖核苷酸参与到糖基转移中：UDP-Glc、UDP-Gal、UDP-GlcNAc、UDP-GalNAc、UDP-葡萄糖醛酸、UDP-Xyl、GDP-Man、GDP-Fuc和CMP-唾液酸，特别是选自UDP-Gal、UDP-GlcNAc、GDP-Fuc和CMP-唾液酸的那些。

本发明的基因修饰微生物具有通向上述活化的糖核苷酸的生物合成途径，即，其具有一组或多组基因，所述基因编码一种或多种负责合成一种或多种活化的糖基核苷酸的酶，以备在培养时用于细胞中的糖基转移酶介导的反应中的糖基化。该组基因或者天然存在于细胞中，或者通过重组DNA操纵技术引入细胞中。通过细胞制造活化的糖核苷酸，在从碳源开始的各个糖核苷酸逐步反应序列的生物合成途径所涉及的酶的作用下发生(对于单糖代谢的综述参见例如，H.H.Freeze和A.D.Elbein:Essentials of Glycobiology第二版(A.Varki等人编著)，Cold Spring Harbour Laboratory Press(2009)，第四章：Glycosylation precursors)。

此外，本发明的微生物包括编码蔗糖利用系统的基因，即，细胞具有分解代谢利用蔗糖作为碳源以及能量来源的能力。能够使细胞利用蔗糖的系统可以是该细胞的基因池中通常发现的系统，但优选为异源系统(即，源自于不同的有机体，并通过常规重组DNA操纵技术转移至宿主细胞)。通常，可以使用两种蔗糖分解代谢系统。根据磷酸烯醇丙酮酸(PEP)-依赖性磷酸转移酶系统(“PTS”)，蔗糖被转运至微生物中并伴随着磷酸化，以生成细胞内蔗糖-6-磷酸，其被水解为葡萄糖-6-磷酸和果糖，接着它们参与到细胞的中心碳代谢中。PTS可以由scr或sac基因编码。根据非磷酸转移酶依赖性系统(“非-PTS”)，细胞外蔗糖在质子同向转运系统(蔗糖透性酶)的帮助下进入细胞，并且在转运之后，通过转化酶水解为葡萄糖和果糖，接着进行磷酸化。就此而言，csc调节子由编码负责非-PTS蔗糖利用的酶的基因组成。

在优选的实施方式中，蔗糖利用系统是异源的。这是对工业上可获利的类似于寡糖制造的转化而言，当微生物、优选细菌、更优选大肠杆菌(例如K-12或BL21)为经优化的菌株时的情况，因为这样的菌株通常没有利用蔗糖的能力。因此，应当使用合适的表达质粒或者经由染色体整合，在不能利用蔗糖的(蔗糖-)细胞中引入蔗糖摄取盒，以使其成为能够利用蔗糖的(蔗糖+)。更优选地，蔗糖途径基因包括PTS-依赖性蔗糖利用系统，并且特别地，蔗糖调节子为scr。具有scr基因的微生物为例如，沙门氏菌属(Salmonella ssp.)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)。

表1：由scr基因编码的Scr蛋白的列表

在一实施方式中，使用质粒例如通过双质粒系统将异源scr基因引入微生物中，上述双质粒系统中一个含有scrA基因且另一个质粒含有scrB基因。scrY、scrR和任选的scrK基因可以由任一质粒携带。

在一实施方式中，scr基因选自表1中列出的序列。

在一实施方式中，scrY和scrA位于一个质粒上，并分别编码WP_004147437.1(SEQID NO:1)和AHM80898.1(SEQ ID NO:2)的多肽，scrB和scrR位于第二个质粒上，并分别编码CAA47974.1(SEQ ID NO:3)和CAA47975.1(SEQ ID NO:4)的多肽。

在一实施方式中，基因修饰微生物包括4个编码PTS-依赖性蔗糖利用系统的基因，其中所述基因编码

i)SEQ ID NO:1的蔗糖孔蛋白scrY或其同源物，该同源物与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性，例如与SEQ ID NO:1具有90％、95％或98％同一性；和

ii)SEQ ID NO:2的PTS透性酶scrA或其同源物，该同源物与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性，例如与SEQ ID NO:2具有90％、95％或98％同一性；和

iii)SEQ ID NO:3的蔗糖-6-磷酸水解酶scrB或其同源物，该同源物与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性，例如与SEQ ID NO:3具有90％、95％或98％同一性；和

iv)SEQ ID NO:4的阻遏蛋白scrR或其同源物，该同源物与SEQ ID NO:4具有至少85％同一性，例如与SEQ ID NO:4具有90％、95％或98％同一性。

在优选的实施方式中，异源scr基因被引入微生物的基因组中，即通过插入在所述微生物或细胞的基因组的某一位点(基因座)，优选可操作地连接到宿主细胞识别的一个或多个控制序列，对它们进行染色体整合。优选地，scrY和scrA可操作地连接到一个启动子元件(操纵子)，scrB和scrR可操作地连接到另一个启动子元件。两个启动子元件的序列对于两个操纵子可以是相同的。在优选的实施方式中，启动子元件是pglpF，特别是SEQ ID NO:5的pglpF启动子。其他pglpF启动子描述于WO2019/123324中，优选的pglpF启动子是SEQ IDNO:5的启动子。

在一实施方式中，scr基因被引入混合酸发酵途径。混合酸发酵产生最终产物的混合物，包括乳酸(酯/盐)、乙酸(酯/盐)、琥珀酸(酯/盐)、甲酸(酯/盐)和乙醇。这些最终产物的形成是由可导入scr基因的已知途径驱动的。

另外优选地，编码糖基转移酶的基因也被插入宿主细胞的基因组中(即染色体整合)。

另外优选地，如果在本发明的基因修饰细胞中存在有一个或多个参与寡糖(优选HMO)的制造所需的活化糖型核苷酸，优选UDP-GlcNAc、UDP-Gal、GDP-Fuc和/或CMP-唾液酸生物合成途径的基因，则他们也被插入宿主细胞的基因组中。

在这方面，本发明最优选的制造寡糖的细胞是不含质粒的。

与编码制造寡糖产物所必需的糖基转移酶的异源DNA序列可操作地连接的控制序列或启动子可以是任何合适的启动子。在一些实施方式中，使用glp操纵子的启动子，优选glpF或其变体(WO 2019/123324，其内容通过引用并入本文)。

要被本发明的微生物糖基化的碳水化合物受体可以是选自半乳糖、N-乙酰基-葡糖胺、半乳糖基化单糖、N-乙酰基-葡糖胺基化单糖、乳糖及其上文定义的糖苷衍生物的单糖或二糖。所有这些碳水化合物衍生物可以容易地通过主动转运被具有LacY透性酶的细胞吸收，并在被糖基化之前在细胞中积累(WO 01/04341、Fort等人,J.Chem.Soc.,Chem.Comm.2558(2005)、EP-A-1911850、WO 2013/182206、WO 2014/048439)。这是因为细胞能够利用其LacY透性酶将这些碳水化合物受体转运到细胞中，并且细胞缺乏任何可以降解这些受体的酶，特别是LacZ，这可以通过删除或突变lacZ基因使其不能表达功能性LacZ来实现。优选地，细胞在lac操纵子上的lacA基因是缺失的或缺陷的。

根据另一优选实施方式，在微生物中，lac阻遏物的lacI基因也是缺失的或无活性的。在没有功能性阻遏物的情况下，对于任何在启动子Plac的控制下的基因，不需要诱导物来表达。

据信，上述本发明的微生物在上述本发明的处理条件下是高度稳定的。因此，据信，相比于使用甘油和/或葡萄糖作为其碳源和/或能量来源的微生物，这些微生物可以使用蔗糖作为其碳源和能量来源至少以相同的生产率、并且以更可靠和可重现的方式，制造寡糖。有益的是，与利用葡萄糖或甘油的菌株相比，本发明方法中使用的基因修饰细胞产生更少的碳水化合物副产物，而HMO滴度和产量至少得以保持，或甚至略微增加。因此，使用蔗糖菌株是有益的，因为它有利于纯化过程。此外，蔗糖菌株制造的HMO具有极低的非特定杂质的总量。副产物形成减少提供了更大的上游工艺优化潜力，因为蔗糖菌株在生产中不会浪费那么多的能量。此外，比起例如葡萄糖等单糖碳源，蔗糖更加耐受加热灭菌，因此由蔗糖菌株制造的HMO不含此类降解副产物。特别地，HMO产物不含异麦芽糖、曲二糖、龙胆二糖和黑曲霉糖。

本发明的基因修饰细胞可以具有多于一个重组基因，其编码多于一种的糖基转移酶，所述糖基转移酶能够将活化的糖核苷酸的糖残基转移至内化的受体分子或者由相同的细胞产生的之前糖基化的受体，由此，通过由细胞表达的多种糖基转移酶介导的多重糖基转移，寡糖产物由内化的受体形成。因此，得到的寡糖产物可以是糖基化乳糖或其糖苷。糖基化乳糖优选为N-乙酰基-葡糖胺基化的、半乳糖基化的、岩藻糖基化的和/或唾液酸基化的乳糖。为了制造这些衍生物，细胞包括一个或多个编码N-乙酰基-葡糖胺基转移酶、半乳糖基转移酶、唾液酸基转移酶和/或岩藻糖基转移酶的重组基因，并且还包括通向相应的活化糖型核苷酸，即UDP-GlcNAc、UDP-Gal、GDP-Fuc和/或CMP-唾液酸的生物合成途径。

根据优选的实施方式，基因修饰大肠杆菌细胞适合于制造中性HMO，优选3～6个单糖单元的中性HMO，并且包括：

其特征在于，细胞还包括异源PTS-依赖性蔗糖利用系统，以提供蔗糖作为用于通过细胞生物合成UDP-GlcNAc和/或GDP-Fuc和任选的UDP-Gal的碳源以及能量来源，并作为用于制造所述中性HMO的能量来源。异源PTS-依赖性蔗糖利用系统优选包括scr基因，更优选scrY、scrA、scrB和scrR，其分别编码SEQ ID NO:1、2、3和4的蛋白质或其同源物，该同源物与相应序列具有至少85％、例如90％、例如95％、例如98％同一性，并且特别地不含scrK。

根据优选的实施方式，基因修饰大肠杆菌细胞适合于制造N-乙酰化HMO，优选3～6个单糖单元的N-乙酰化HMO，其包括：

其特征在于，细胞还包括异源PTS-依赖性蔗糖利用系统，以提供蔗糖作为用于通过细胞生物合成UDP-GlcNAc和任选的UDP-Gal的碳源以及能量来源，并作为用于制造所述N-乙酰化HMO的能量来源。异源PTS-依赖性蔗糖利用系统优选包括scr基因，更优选scrY、scrA、scrB和scrR，其分别编码SEQ ID NO:1、2、3和4的蛋白质或其同源物，该同源物与相应序列具有至少85％、例如90％、例如95％、例如98％同一性，并且特别地不含scrK。

根据另一优选实施方式，基因修饰大肠杆菌细胞适合于制造岩藻糖基化N-乙酰化HMO，优选LNFP-I、LNFP-II、LNFP-III、LNFP-V、LNFP-VI、LNDFH-I、LNDFH-II或LNDFH-III，其包括：

其特征在于，所述细胞还包括异源PTS依赖性蔗糖利用系统，以提供蔗糖作为用于通过细胞生物合成UDP-GlcNAc、GDP-Fuc和UDP-Gal的碳源以及能量来源，并作为用于制造所述岩藻糖基化N-乙酰化HMO的能量来源。异源PTS依赖性蔗糖利用系统优选包括scr基因，更优选scrY、scrA、scrB和scrR，其分别编码SEQ ID NO:1、2、3和4的蛋白质或其同源物，该同源物与相应序列具有至少85％、例如90％、例如95％、例如98％的同一性，并且特别地不含scrK。

根据再另一优选的实施方式，基因修饰大肠杆菌细胞适合于制造岩藻糖基化HMO，优选2’-FL、3-FL或DFL，其包括：

-一个或多个编码GDP-Fuc生物合成途径的基因，

其特征在于，细胞还包括异源PTS-依赖性蔗糖利用系统，以提供蔗糖作为用于通过细胞生物合成GDP-Fuc的碳源以及能量来源，并作为用于制造所述岩藻糖基化HMO的能量来源。异源PTS依赖性蔗糖利用系统优选包括scr基因，更优选scrY、scrA、scrB和scrR，其分别编码SEQ ID NO:1、2、3和4的蛋白质或其同源物，该同源物与相应序列具有至少85％、例如90％、例如95％、例如98％的同一性，并且特别地不含scrK。

如果岩藻糖基转移酶为α-1,2-岩藻糖基转移酶，产物优选为2’-岩藻糖基乳糖，如果岩藻糖基转移酶为α-1,3-岩藻糖基转移酶，产物优选为3-岩藻糖基乳糖，如果α-1,2-岩藻糖基转移酶和α-1,3-岩藻糖基转移酶二者都在细胞中表达，产物优选为二岩藻糖基乳糖。

根据再另一优选的实施方式，基因修饰大肠杆菌细胞适合于制造唾液酸基化HMO、优选3～5个单糖单元的唾液酸基化HMO、更优选唾液酸基化乳糖，其包括：

-一个或多个编码CMP-唾液酸生物合成途径的基因，

其特征在于，所述细胞还包括异源PTS-依赖性蔗糖利用系统，以提供蔗糖作为用于通过细胞生物合成CMP-唾液酸的碳源以及能量来源，并作为用于制造所述唾液酸基化HMO的能量来源。异源PTS-依赖性蔗糖利用系统优选包括scr基因，更优选包括scrY、scrA、scrB和scrR，其分别编码SEQ ID NO:1、2、3和4的蛋白质或其与相应序列具有至少85％、例如90％、例如95％、例如98％的同一性的同源物，并且特别地，不含scrK。

根据再另一个优选的实施方式，基因修饰大肠杆菌细胞适合于制造岩藻糖基化和唾液酸基化HMO、优选3～5个单糖单元的岩藻糖基化和唾液酸基化HMO，其包括：

-一个或多个编码CMP-唾液酸和GDP-Fuc生物合成途径的基因，

其特征在于，所述细胞还包括异源PTS-依赖性蔗糖利用系统，以提供蔗糖作为用于通过细胞生物合成CMP-唾液酸和GDP-Fuc的碳源以及能量来源，并作为用于制造所述岩藻糖基化和唾液酸基化HMO的能量来源。异源PTS-依赖性蔗糖利用系统优选包括scr基因，更优选包括scrY、scrA、scrB和scrR，并且特别地，不含scrK。

根据另一优选的实施方式，基因修饰大肠杆菌细胞适合于制造岩藻糖基化LNT或LNnT的方法，其包括：

-一个或多个编码GDP-Fuc生物合成途径的基因

-一个或多个编码UDP-GlcNAc和UDP-Gal生物合成途径的基因，

其特征在于，所述细胞还包括异源PTS-依赖性蔗糖利用系统，以提供蔗糖作为用于通过细胞生物合成UDP-GlcNAc、UDP-Gal和GDP-Fuc的碳源以及能量来源，并作为用于制造所述岩藻糖基化LNT或LNnT的能量来源。异源PTS-依赖性蔗糖利用系统优选包括scr基因，更优选scrY、scrA、scrB和scrR，并且特别地不含scrK。

实施方式

本发明具体公开了以下实施方式：

1.一种用于制造寡糖或所述寡糖的糖苷的基因修饰微生物，包括：

a.编码糖基转移酶的重组基因，所述糖基转移酶可以将活化的糖核苷酸的糖残基转移至碳水化合物受体或所述受体的糖苷，

b.从蔗糖制造所述活化的糖核苷酸的生物合成途径，和

c.编码PTS-依赖性蔗糖利用系统的核酸序列，其中所述核酸序列编码：

i)SEQ ID NO:1的蔗糖孔蛋白scrY或其与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性，例如与SEQ ID NO:1具有90％、95％或98％同一性的同源物；和

ii)SEQ ID NO:2的PTS透性酶scrA或其与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性，例如与SEQ ID NO:2具有90％、95％或98％同一性的同源物；和

iii)SEQ ID NO:3的蔗糖-6-磷酸水解酶scrB或其与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性，例如与SEQ ID NO:3具有90％、95％或98％同一性的同源物；和

iv)SEQ ID NO:4的阻遏蛋白scrR或其与SEQ ID NO:4具有至少85％同一性，例如与SEQ ID NO:4具有90％、95％或98％同一性的同源物。

2.一种用于制造寡糖或所述寡糖的糖苷的基因修饰微生物，包括：

-编码糖基转移酶的重组基因，所述糖基转移酶可以将活化的糖核苷酸的糖残基转移至碳水化合物受体或所述受体的糖苷，

-从蔗糖制造所述活化的糖核苷酸的生物合成途径，和

-一个或多个编码异源PTS-依赖性蔗糖利用系统的基因，使得所述细胞能够使用蔗糖作为用于制造所述活化的糖核苷酸的碳源，并作为用于制造所述寡糖的能量来源，

其中所述碳水化合物受体不是蔗糖，并且所述异源PTS-依赖性蔗糖利用系统包括由scr基因编码的蛋白质，scrY用于蔗糖孔蛋白，scrA用于PTS透性酶，scrB用于蔗糖-6-磷酸水解酶，scrR用于阻遏蛋白。

3.实施方式1或2所述的基因修饰微生物，其中糖基转移酶可以将糖残基转移至微生物内化的碳水化合物受体。

4.实施方式1至3中任一项所述的基因修饰微生物，其中糖基转移酶可以将活化的糖核苷酸的糖残基转移至从所述受体到所述寡糖的生物合成途径中的中间体。

5.实施方式1至4中任一项所述的基因修饰微生物，其中重组寡糖或碳水化合物受体的糖苷中的苷元选自：

--OR_A，其中R_A为直链或支链烃链，当饱和时，其具有1～24个、优选1～6个碳原子，或者当不饱和时，其具有2～24个、优选2～6个碳原子，或者R_A表示芳基部分，或者R_A表示可通过氢解作用除去的基团，

--X-R_B，其中X为N或S，且R_B表示直链或支链烃链，当饱和时，其具有1～24个、优选1～6个碳原子，或者当不饱和时，其具有2～24个、优选2～6个碳原子，或者R_B表示芳基部分，或者R_B表示苯甲基，

-将异头碳原子与相邻碳原子通过-NH-C(＝O)-O-桥彼此连接的基团，从而形成以醛糖的情况示出的稠合五元环：

-叠氮化物，

--NH-C(R”)＝C(R’)₂，其中每个R’独立地为选自-CN、-COOH、-COO-烷基、-CO-烷基、-CONH₂、-CONH-烷基和-CON(烷基)₂的吸电子基团，或者其中两个R’基团连接在一起形成-CO-(CH₂)_2-4-CO-，并由此与其连接的碳原子形成5～7元的环烷基-1,3-二酮，在所述二酮中任意的亚甲基任选被1或2个烷基取代，并且其中R”为H或烷基，

-氨基酸残基，

-聚乙二醇残基，

-聚乙烯醇残基，和

-式A的α,β-不饱和酰胺基基团或者式B的α,β-不饱和羰基基团

其中Q2、Q3和Q4独立地为H和C₁-C₆烷基，其中烷基任选被卤素、OH、硝基或苯基取代。

6.实施方式1至5中任一项所述的基因修饰微生物，其为大肠杆菌。

7.实施方式1至6中任一项所述的基因修饰微生物，其中一个或多个以下基因是缺失的或失活的：glpR、lacZ、lacI、lacA和hlyE。

8.实施方式7所述的基因修饰微生物，其中lacZ是缺失的或失活的，并且任选地一个或多个以下基因是缺失的或失活的：glpR、lacI、lacA和hlyE。

9.实施方式1至7中任一项所述的基因修饰微生物，其中编码糖基转移酶的重组基因被染色体整合在所述微生物中。

10.实施方式9的基因修饰微生物，其不含质粒。

11.实施方式1至10中任一项所述的基因修饰微生物，其中糖基转移酶可操作地连接到glp，例如glpF启动子，例如SEQ ID NO:5的glpF启动子。

12.实施方式1至11中任一项所述的基因修饰微生物，其中scr基因被染色体整合在所述微生物的基因组中。

13.实施方式12所述的基因修饰微生物，其中scrY和scrA可操作地连接，scrB和scrR可操作地连接。

14.实施方式2至13中任一项所述的基因修饰微生物，其中scrYA基因存在于SEQID NO:6或编码相同蛋白质的同源序列中。

15.实施方式2至14中任一项所述的基因修饰微生物，其中scrBR基因存在于SEQID NO:7或编码相同蛋白质的密码子同源序列中。

16.实施方式1至15中任一项所述的基因修饰微生物，其中scr基因可操作地连接到glp，例如glpF启动子，例如SEQ ID NO:5的glpF启动子。

17.实施方式1至16中任一项所述的基因修饰微生物，其中scrYA和scrBR基因整合在混合酸发酵途径中的两个位点处。

18.实施方式1至17中任一项所述的基因修饰微生物，其是不含质粒的。

19.实施方式1至18中任一项所述的基因修饰微生物，用于制备式1的寡糖

其中：

Y是

--OH

--X-R_B，其中X为N或S，并且R_B表示直链或支链烃链，当饱和时，其具有1～24个、优选1～6个碳原子，或者当不饱和时，其具有2～24个、优选2～6个碳原子，或者R_B表示芳基部分，或者R_B表示苯甲基，

-叠氮化物，

-氨基酸残基，

-聚乙二醇残基，

-聚乙烯醇残基，和

-式A的α,β-不饱和酰胺基基团或者式B的α,β-不饱和羰基基团

其中Q2、Q3和Q4独立地为H和C₁-C₆烷基，其中烷基任选被卤素、OH、硝基或苯基取代，

R₁是岩藻糖基或H，

R₂是岩藻糖基或H，

R₃选自H、唾液酸基、N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基基团，其中N-乙酰基-乳糖胺基基团任选地携带包括一个或多个N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个或多个乳-N-二糖基基团的糖残基；N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基基团中的每一个任选地被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基取代，

R₄选自H、唾液酸基和N-乙酰基-乳糖胺基基团，其任选被包括一个或多个N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个或多个乳-N-二糖基的糖残基取代；N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基中的每一个任选地被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基取代，

条件是R₁、R₂、R₃和R₄基团中的至少一个与H不同。

20.实施方式19所述的基因修饰微生物，其中Y是-OH。

21.实施方式19或20所述的基因修饰微生物，其中式1的寡糖表示人乳寡糖(HMO)。

22.实施方式21所述的基因修饰微生物，其中所述微生物是大肠杆菌，所述HMO是中性HMO，并且所述大肠杆菌包括：

(i)-编码N-乙酰基-葡糖胺基转移酶的重组基因，和一个或多个编码UDP-GlcNAc生物合成途径的基因，所述N-乙酰基-葡糖胺基转移酶能够将UDP-GlcNAc的GlcNAc转移至内化的乳糖，或者转移至从乳糖到所述中性HMO的生物合成途径中的中间体；和/或

(ii)-任选地，编码半乳糖基转移酶的重组基因，和一个或多个编码UDP-Gal生物合成途径的基因，所述半乳糖基转移酶能够将UDP-Gal的半乳糖残基转移至从乳糖到所述中性HMO的生物合成途径中的中间体。

23.实施方式21的基因修饰微生物，其中所述微生物是大肠杆菌，所述HMO是N-乙酰化HMO，并且所述大肠杆菌包括：

-任选地，编码半乳糖基转移酶的重组基因，所述半乳糖基转移酶能够将UDP-Gal的半乳糖残基转移至N-乙酰基-葡糖胺基化乳糖，或者转移至从乳糖到所述N-乙酰化HMO的生物合成途径中的中间体，和

-一个或多个编码UDP-GlcNAc和任选地UDP-Gal生物合成途径的基因。

24.实施方式22或23的基因修饰微生物，其中：

-N-乙酰基-葡糖胺基转移酶是β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶，细胞中不存在编码半乳糖基转移酶的重组基因，N-乙酰化HMO是乳-N-三糖II，

-N-乙酰基-葡糖胺基转移酶是β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶，半乳糖基转移酶是β-1,3-半乳糖基转移酶，N-乙酰化HMO是乳-N-四糖，或

-N-乙酰基-葡糖胺基转移酶是β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶，半乳糖基转移酶是β-1,4-半乳糖基转移酶，N-乙酰化HMO是乳-N-新四糖。

25.实施方式21的基因修饰微生物，其中所述微生物是大肠杆菌，所述HMO是N-乙酰化HMO，并且所述大肠杆菌包括：

-编码N-乙酰基-葡糖胺基转移酶的重组基因，和一个或多个编码UDP-GlcNAc生物合成途径的基因，所述N-乙酰基-葡糖胺基转移酶能够将UDP-GlcNAc的GlcNAc转移至内化的乳糖，或者转移至从乳糖到所述岩藻糖基化N-乙酰化HMO的生物合成途径中的中间体；和

-编码半乳糖基转移酶的重组基因，和一个或多个编码UDP-Gal生物合成途径的基因，所述半乳糖基转移酶能够将UDP-Gal的半乳糖残基转移至从乳糖到所述岩藻糖基化N-乙酰化HMO的生物合成途径中的中间体。

26.实施方式21所述的基因修饰微生物，其中所述微生物是大肠杆菌，所述HMO是2’-FL、3-FL或DFL，并且所述大肠杆菌包括：

-一个或多个编码GDP-Fuc生物合成途径的基因。

27.实施方式26所述的基因修饰微生物，其中与在葡萄糖上生长的有机体相比较，基因修饰生物在蔗糖上生长时，DFL/2’-FL比率降低了至少15％，优选至少20％。

28.实施方式21所述的基因修饰微生物，其中所述微生物是大肠杆菌，所述HMO是唾液酸基化HMO，并且所述大肠杆菌包括：

-一个或多个编码CMP-唾液酸生物合成途径的基因。

29.实施方式21所述的基因修饰微生物，其中所述微生物是大肠杆菌，所述HMO是岩藻糖基化和唾液酸基化的HMO，并且所述大肠杆菌包括：

-编码唾液酸基转移酶的重组基因，所述唾液酸基转移酶能够将CMP-唾液酸的唾液酸残基转移至内化的乳糖，或者转移至从乳糖到所述岩藻糖基化和唾液酸基化的HMO的生物合成途径中的中间体，和

-编码岩藻糖基转移酶的重组基因，所述岩藻糖基转移酶能够将GDP-Fuc的岩藻糖残基转移至内化的乳糖，或者转移至从乳糖到所述岩藻糖基化和唾液酸基化的HMO的生物合成途径中的中间体，和

-一个或多个编码CMP-唾液酸和GDP-Fuc生物合成途径的基因。

30.实施方式21至29中任一项所述的基因修饰微生物，其中所述大肠杆菌选自K12或B21。

31.一种通过将碳水化合物受体或所述受体的糖苷糖基化制造寡糖或所述寡糖的糖苷的方法，其中所述碳水化合物受体不是蔗糖，所述方法包括以下步骤：

a)提供实施方式1至30中任一项所述的基因修饰微生物，

b)在所述受体和蔗糖存在下培养所述细胞，和

c)从所述细胞、从培养基或从二者中分离所述寡糖。

32.实施方式31所述的方法，其中所述基因修饰微生物是大肠杆菌，例如K12或B21。

33.实施方式31或32所述的方法，其中所述寡糖是人乳寡糖(HMO)。

34.实施方式31所述的方法，其中所述HMO是中性HMO。

35.实施方式34所述的方法，其中所述中性HMO是N-乙酰化HMO，其选自乳-N-新四糖、对-乳-N-六糖、对-乳-N-新六糖、乳-N-新六糖、对-乳-N-八糖、乳-N-新八糖、乳-N-四糖、乳-N-六糖、乳-N-八糖、异-乳-N-八糖、乳-N-十糖和乳-N-新十糖，更优选地选自乳-N-新四糖、乳-N-四糖、乳-N-六糖、对-乳-N-六糖、对-乳-N-新六糖和乳-N-新六糖。

36.实施方式34或35所述的方法，其中所述HMO选自LNT或LNnT。

37.实施方式34所述的方法，其中所述中性HMO是岩藻糖基化HMO。

38.实施方式34或37所述的方法，其中所述中性HMO是选自2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖或二岩藻糖基乳糖的岩藻糖基化乳糖。

39.实施方式34或38所述的方法，其中所述中性HMO是2’-岩藻糖基乳糖。

40.实施方式36或39所述的方法，其中与在葡萄糖上生长的有机体相比较，所述基因修饰生物在蔗糖上生长时，其它HMO组分的量降低了至少10％、优选至少15％、优选至少20％、优选至少25％。

41.实施方式31至40中任一项所述的方法，其中从培养液和细胞中分离的寡糖基本上不含异麦芽糖、曲二糖、龙胆二糖和黑曲霉糖。

序列描述

实施例

实施例1：通过利用利用甘油或蔗糖的大肠杆菌制造LNnT的比较试验

细菌菌株：

两种菌株均由获自德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganism)(参照DSM 5346)的大肠杆菌(Escherichia coli)K12菌株DH1通过以下方法构建：使lacZ nanKETA lacA melA wcaJ mdoH基因缺失，并插入Plac启动子，保留参与UDP-GlcNAc和UDP-Gal生物合成的基因。甘油利用菌株(菌株I)含有pBBR3-lgtA-tet质粒和pBS-galT-amp质粒，所述pBBR3-lgtA-tet质粒携带有β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶的脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)的lgtA基因和四环素抗性基因，所述pBS-galT-amp质粒携带有β-1,4-半乳糖基转移酶的幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)的galT基因和氨苄青霉素抗性基因。蔗糖利用菌株(菌株II)含有以下两种质粒：

-pBS-scrBR-galT-amp，其是携带有编码β-1,4-半乳糖基转移酶的galT基因、编码蔗糖阻遏物的scrR基因、编码蔗糖-6-磷酸水解酶的scrB基因和氨苄青霉素抗性基因的pUC衍生物；

-pBBR3-scrYA-lgtA-tet，其是携带有编码β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶的lgtA基因、编码PTS系统蔗糖特异性EIIBC组分的scrA基因、编码蔗糖孔蛋白的scrY基因和四环素抗性基因的pBBR1-MCS3衍生物。

发酵步骤：

将葡萄糖、甘油、蔗糖和乳糖各自在120℃下进行灭菌。将异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)过滤灭菌。

在含有大约0.9升矿物培养基的3升发酵罐中进行培养(Samain等人的J.Biotechnol.72,33(1999)；对于蔗糖系统而言不含抗生素)。温度保持在33℃，用28％的NH₄OH将pH调节至6.8。将包括在LB培养基(20ml)或者M9培养基(20ml)中的生产菌株的接种物加入到发酵罐中，所述LB培养基补充有氨苄青霉素和四环素，用于菌株I，所述M9培养基补充有蔗糖，用于菌株II。指数级生长阶段以接种开始，直到初始加入到培养基中的碳源(用于菌株I的葡萄糖或用于菌株II的蔗糖，≈17.5g/l)耗尽而结束。然后在开始用碳源(500g/l溶液，对菌株I为4.5g/h甘油，对菌株II为3g/h的蔗糖)喂养之前加入乳糖溶液(70g乳糖/500ml水)。还加入诱导剂(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，IPTG，1～2ml 50mg/ml的溶液)。甘油喂养的发酵(菌株I)持续90小时，之后细胞死亡(LNnT滴度：45g/l)。在116小时之后蔗糖喂养的发酵(菌株II)产生了浓度为56g/l的LNnT。

实施例2：通过利用蔗糖的大肠杆菌制造2’-FL

细菌菌株：

菌株由获自德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganism)(参照DSM 5346)的大肠杆菌(Escherichia coli)K12菌株DH1通过以下方法构建：使lacZnanKETA lacA melA wcaJ mdoH基因缺失，并且在gmd基因上游插入Plac启动子。此外，菌株含有以下质粒：

-pBS-futC-scrBR-amp，其是携带有编码α-1,2-岩藻糖基转移酶的futC基因、编码蔗糖阻遏物的scrR基因、编码蔗糖-6-磷酸水解酶的scrB基因和氨苄青霉素抗性基因的pUC衍生物；

-pBBR3-GMAB-scrYA-tet，其是携带有参与GDP-Fuc生物合成的manB、manC、gmd和wcaG基因，编码PTS系统蔗糖特异性EIIBC组分的scrA基因、编码蔗糖孔蛋白的scrY基因和四环素抗性基因的pBBR1-MCS3衍生物。

发酵步骤：

将蔗糖和乳糖各自在120℃下进行灭菌。将异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)过滤灭菌。

在含有大约0.9升矿物培养基的2升发酵罐中进行培养(Samain等人的J.Biotechnol.72,33(1999)；不含抗生素)。温度保持在33℃，用28％的NH₄OH将pH调节至6.8。将包括在补充有蔗糖的M9培养基(20ml)中的生产菌株的接种物加入到发酵罐中。指数级生长阶段以接种开始，直到初始加入到培养基中的蔗糖(≈22g/l)耗尽而结束。然后加入诱导剂(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，IPTG，1～2ml 50mg/ml的溶液)。用乳糖+蔗糖喂养(每升水中160g乳糖+500g蔗糖)以9ml/h的速率开始，进行6小时，然后以6ml/h的速率继续进行115小时。在发酵结束时上清液中的2’-FL的浓度大约为100g/l。

实施例3：通过利用葡萄糖或蔗糖的大肠杆菌制造2’-FL的比较试验

使用标准DNA操纵技术完成染色体DNA中的基因靶向，例如如Warming等人NucleicAcids Res.33,e36(2005)中所公开的。如Herring等人.Gene 311,153(2003)所述，通过基因Gorging在染色体DNA中插入基因盒。

菌株来源于大肠杆菌平台菌株，其由大肠杆菌K12 DH1(基因型：Fˉ,

gyrA96,recA1,relA1,endA1,thi-1,hsdR17,supE44，获自德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)(DSMZ)，www.dsmz.de，参照DSM4235)通过以下方法构建：破坏(删除)基因lacZ、nanKETA、lacA、melA、wcaJ、mdoH，并在gmd基因上游插入Plac启动子。此外，将两拷贝在glpF启动子的控制下编码α1,2-岩藻糖基转移酶的密码子优化的futC整合到大肠杆菌平台菌株的基因组(染色体)中与糖代谢相关的基因座上，并在glpP启动子的控制下表达(参见WO 2019/123324)；将单个拷贝的荚膜异多糖酸簇(gmd-wcaG-wcaH-wcaI-manC-manB)整合在参与替代碳源的利用的基因座中，并在glpF启动子的控制下表达；将lacI从lac操纵子中删除(ΔlacI)；删除编码毒素溶细胞素A的hlyE基因(为了获得更安全的生产菌株，消除毒素意外表达的风险)；和删除作为glpF启动子的阻遏物的功能调节基因glpR(参见WO 2019/123324)。产生的菌株在葡萄糖上生长时能够产生2’-FL，然而，其不能在蔗糖上生长(菌株1)。

为了使其能够在蔗糖上生长，将菌株1通过以下方法进一步修饰：a)将来自肺炎克雷伯菌的scrYA(GeneBank登录号：X57401.1或本文的SEQ ID NO:6)插入到另一个参与糖代谢的基因座中，并在具有修饰的SD序列(PglpF_SD1，参见WO 2019/123324和本文的SEQ IDNO:5)的glpF启动子的控制下表达，b)将来自鼠伤寒沙门菌(Salmonella thyphimurium)的scrBR(GeneBank登录号：X67750.1，或本文的SEQ ID NO:7)插入到能够在Pscr启动子的控制下进行糖代谢的基因座之一中(菌株2)。这些菌株不含质粒。

发酵在250ml发酵罐(DASBOX Mini Bioreactor system，Eppendorf)中进行，以100ml无血清(defined)矿物培养基开始，该培养基由25g/kg碳源(葡萄糖或蔗糖)、(NH₄)₂HPO₄、KH₂PO₄、MgSO₄ x 7H₂O、KOH、NaOH、微量元素溶液、柠檬酸、消泡剂和硫胺素组成。微量元素溶液含有硫酸盐形式的Mn、Cu、Fe、Zn和柠檬酸。接种前以80g/kg添加乳糖。通过用14％NH₄OH溶液滴定将整个发酵过程的pH控制在6.8。使用空气以1vvm曝气，溶解氧控制在空气饱和度的20％以上。通过接种2％(v/v)的在类似培养基中生长的预培养物开始发酵。在耗尽包含在分批培养基中的碳源后，以恒定的进料速率以碳受限(carbon-limited)的方式连续进料含有葡萄糖或蔗糖、MgSO₄ x 7H₂O、微量金属溶液和乳糖的无菌进料溶液。在整个发酵过程中直至发酵结束，培养液中的乳糖浓度保持在15g/kg以上。发酵的结束在约120小时。

在整个发酵过程中，进行取样，以使用HPLC测定2’-FL、DFL、乳糖和其他次要副产物的浓度。将全部培养液样品用去离子水稀释三倍并煮沸20分钟。在这之后，以17000g离心3分钟，之后通过HPLC分析所得上清液。上述测量值用于准确计算2’-FL滴度、DFL/2’-FL比率和碳源上2’-FL的产率。

虽然两个测试菌株之间的唯一变化是在染色体上引入蔗糖操纵子基因，但下表2中的发酵数据显示出以下的清楚的证据：与葡萄糖参考菌株相比，在发酵结束时，DFL形式的副产物的形成显著减少了约25％，而2’-FL滴度和产率至少得以保持，或甚至略微增加。因此，蔗糖技术的使用是有益的，因为它有利于纯化过程。DFL形成减少将进一步提供更大的上游工艺优化潜力，因为蔗糖菌株在制造GDP岩藻糖前体时不会浪费那么多的能量。

表2

*EoF＝发酵结束119.3h(±1.4h)

**SD＝标准偏差

实施例4：通过利用葡萄糖或蔗糖的大肠杆菌制造2’-FL的比较试验

该试验包括上文实施例3中公开的菌株1和称为菌株2’的经修饰的菌株2，其与上文实施例3中公开的菌株2的不同之处在于调节基因glpR没有删除，从而保持功能性。

根据实施例3中公开的条件，在同等的工业化条件下分别用葡萄糖(对于菌株1)和蔗糖(对于菌株2’)进行发酵。使用相同的单元步骤操作，在不结晶的情况下，从培养液中纯化并分离产物2’-FL。

对纯化后的样品的分析表明，特定碳水化合物杂质的存在具有实质性差异。菌株1(用葡萄糖发酵)的产物具有超过2w/w％的葡萄糖降解产物，其中含有(除其他产物外)异麦芽糖、曲糖二糖、龙胆二糖和黑曲霉糖，而菌株2’(用蔗糖发酵)的产物则完全不含这些杂质。此外，与葡萄糖制造的产物相比，蔗糖制造的产物具有极低的非特定杂质的总量，即0.05w/w％vs 0.26w/w％。因此，蔗糖技术的总体优势是双重的，首先是获得具有更高纯度的产物(从而减轻了昂贵结晶的需要)，其次是提高了2％的碳效率，因为加热灭菌时碳源没有转化为不可代谢的碳水化合物杂质。

实施例5：制造LNT的比较试验

gyrA96,recA1,relA1,endA1,thi-1,hsdR17,supE44，获自德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)(DSMZ)，www.dsmz.de，参照DSM4235)通过以下方法构建：破坏(删除)基因lacZ、nanKETA、lacA、melA、wcaJ、mdoH，并在gmd基因上游插入Plac启动子。此外，将三拷贝的β1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶的密码子优化的lgtA编码序列整合到大肠杆菌平台菌株的基因组(染色体)中与糖代谢相关的基因座上，并在glpF启动子的控制下表达；将两拷贝的编码β1,3-半乳糖基转移酶的密码子优化的galTK拷贝(WO2020/115671)整合到大肠杆菌平台菌株的基因组中参与糖代谢的另一个基因座上，并在glpF启动子的控制下表达。蔗糖操纵子scrYABR(同时分成scrYA和scrBR)的基因整合在混合酸发酵途径的两个位点上，从而删除在厌氧条件下，而不是在正常的好氧发酵条件下，导致不希望的发酵代谢物形成的基因。此外，将含有glpF启动子的表达盒插入到参与替代碳源的利用的基因座中，上述glpF启动子连接到编码来自Rosenbergiella nectarea(GenBank登录号：WP_092672081.1)的推定MFS转运蛋白的密码子优化的DNA，所述推定MFS转运蛋白促进LNT从细胞中的输出。此外，删除了lacI和hlyE。如此构建的菌株是不含质粒的，能够在葡萄糖和蔗糖上生长。

发酵在250ml发酵罐(DASBOX Mini Bioreactor system，Eppendorf)中进行，以100ml无血清矿物培养基开始，该培养基由30g/kg碳源(葡萄糖或蔗糖)、(NH₄)₂HPO₄、KH₂PO₄、MgSO₄ x 7H₂O、KOH、NaOH、微量元素溶液、柠檬酸、消泡剂和硫胺素组成。微量元素溶液含有硫酸盐形式的Mn、Cu、Fe、Zn和柠檬酸。在分批阶段结束后约5小时，即在约18～19小时经过的发酵时间(ELT)时，通过推注(bolus)添加80g/kg提供乳糖。通过用14％ NH₄OH溶液滴定将整个发酵过程的pH控制在6.8。使用空气以1vvm曝气，溶解氧控制在空气饱和度的23％以上。通过接种2％(v/v)的在类似培养基中生长的预培养物开始发酵。在耗尽包含在分批培养基中的碳源之后，以恒定的进料速率以碳受限的方式连续进料含有葡萄糖或蔗糖、(NH₄)₂SO₄、微量金属溶液和消泡剂的无菌进料溶液。在蔗糖发酵中，乳糖在72.8小时ELT时几乎耗尽，而在葡萄糖发酵中仍在8～10g/l左右，这表明乳糖利用率、从而产物的形成较高。在72.8小时时，采集发酵结束样品并进行分析。

在整个发酵过程中，进行取样，以确定LNT和乳糖的浓度。将全部培养液样品用去离子水稀释三倍并煮沸20分钟。在这之后，以17000g离心3分钟，之后通过HPLC分析所得上清液。HPLC测量用于准确计算LNT滴度、副产物比率(未示出)和碳源上LNT的累积产率。后者还考虑了进料速率和稀释度的较小变化，因此是直接比较的重要参数。

本研究描述了蔗糖利用菌株在以蔗糖与葡萄糖作为碳源的发酵中的直接比较。除了所使用的碳源类型之外，这些过程都是相同的。数据清楚地证明，蔗糖在LNT生产率和碳产率方面具有优越性。下表3显示，当使用蔗糖代替葡萄糖时，平均碳产率(carbon yield)增加了17％。这也反映在发酵结束时最终LNT滴度提高了19％，乳糖消耗率增加(乳糖仅通过推注添加而不是在进料溶液中添加)。总体而言，蔗糖技术的使用是有益的，因为它不仅由于较高的最终滴度而促进了纯化过程，而且还导致更有效的碳源到产物的转化。

表3：具有和不具有异源PTS-依赖性蔗糖利用系统的菌株的LNT制造。

*EoF＝发酵结束72.8小时

实施例6没有scr基因的菌株不能在蔗糖上生长

该实施例说明，用于构建上述菌株的背景菌株不能在蔗糖上生长。

背景菌株MDO由大肠杆菌K12 DH1构建。大肠杆菌K12 DH1基因型为：F^-,λ^-,gyrA96,recA1,relA1,endA1,thi-1,hsdR17,supE44。除了大肠杆菌K12 DH1基因型外，MDO还具有以下修饰：lacZ：缺失1,5kbp，lacA：缺失0,5kbp，nanKETA：缺失3,3kbp，melA：缺失0,9kbp，wcaJ：缺失0,5kp，mdoH：缺失0,5kbp，以及在gmd基因上游插入Plac启动子。

菌株MPLNnT可以制造四糖HMO，LNnT，而MDO菌株不形成生物技术目的产物。菌株MPLNnT携带负责LNnT生物合成的基因，即来自脑膜炎奈瑟菌的lgtA(编码β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶)和来自幽门螺旋杆菌的galT(编码β-1,4-半乳糖基转移酶)，以及四个额外的赋予在作为唯一碳源和能量来源的蔗糖上进行生长的能力的基因。这四个基因被组织成两个操纵子，scrBR和scrYA，分别由野生型蔗糖启动子(Pscr)和合成双启动子(PglpF_SD1-Pscr)控制，并整合到基因组中。

使用4天方案在96孔微量滴定板中培养菌株。在最初的24小时内，细胞生长至高密度，而在接下来的72小时内，将细胞转移至含有蔗糖作为唯一碳源和能量来源的培养基中。具体而言，在第1天期间，使用含有20％葡萄糖的Luria-Bertani培养液制备新鲜接种物。将制备的培养物在34℃孵育24小时后，将细胞转移至补充有硫酸镁和硫胺素的基础最低培养基(200μL)中，向其中给细胞提供20％葡萄糖溶液和15g/L蔗糖溶液作为碳源的初始推注。接种新培养基后，在28℃下以1200rpm振荡细胞72小时。细胞在与ThermoFisherScientific的Varioskan LUX Multimode Microplate Reader兼容的微量滴定板中以分批培养模式生长。

在本实施例中，证明了背景菌株MDO不能在蔗糖上生长，而具有染色体整合的scrBR和scrYA基因的菌株则非常有效地在蔗糖上生长(图2)。

MPLNnT菌株也进行了发酵，并且已经显示出在蔗糖上生长时，能够产生相对于所产生HMO的总量在83％～85％之间的LNnT。

实施例7scrYA和scrBR的基因组整合与质粒表达

分析了相比于从高拷贝数表达质粒进行表达，将HMO制造必需的基因整合到基因组中的益处进行了分析。

将实施例2的含质粒菌株和实施例4的染色体菌株2’进行头对头分析比较。实施例4的染色体菌株2’具有两拷贝的futC，这对于实现与从实施例2中的高表达质粒pBS获得的futC水平相似的futC水平是必要的。此外，实施例2的菌株中的表达质粒具有抗生素标记(amp和tet)，以确保质粒在繁殖时保持在细胞内，染色体菌株中则不需要这样的标记，这在制造中具有优势，因为可以在细胞库和繁殖期间避免抗生素。

在基于实施例3中公开的条件的同等工业化条件下，两种菌株分别用蔗糖发酵。使用相同的单元步骤操作，在不结晶的情况下，从培养基中纯化并分离产物2’-FL。

结果见下表4。

表4.质粒菌株和染色体菌株中2’-FL的表达

由此可以看出，对于染色体菌株，2’FL产率略高(但在统计学上是显著的)。此外，对于染色体菌株，DFL副产物的数量减少，DFL/2’FL比率降低，这有益于下游的处理，因为获得纯2’FL所需去除的副产物较少。

序列表

<110> 格礼卡姆股份公司

<120> 寡糖的制造

<130> 156WO00

<150> PA 2020 00838

<151> 2020-07-13

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 505

<212> PRT

<213> 肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)

<400> 1

Met Tyr Lys Lys Arg Lys Leu Ala Ile Leu Ile Ala Leu Leu Thr Gly

1 5 10 15

Thr Ala Ala Ala His Gly Gln Thr Asp Leu Asn Ser Ile Glu Ala Arg

20 25 30

Leu Ala Ala Leu Glu Lys Arg Leu Gln Asp Ala Glu Thr Arg Ala Ser

35 40 45

Thr Ala Glu Ser Arg Ala Ala Ser Ala Glu Gln Lys Val Gln Gln Leu

50 55 60

Thr Gln Gln Gln Gln Gln Thr Gln Ala Thr Thr Gln Gln Val Ala Arg

65 70 75 80

Arg Thr Thr Gln Leu Glu Glu Lys Ala Glu Arg Pro Gly Gly Phe Glu

85 90 95

Phe His Gly Tyr Ala Arg Ser Gly Val Ile Met Asn Asp Ser Ala Ala

100 105 110

Ser Thr Lys Ser Gly Ala Tyr Met Thr Pro Ala Gly Glu Thr Gly Gly

115 120 125

Ala Ile Gly Arg Leu Gly Asn Gln Ala Asp Thr Tyr Val Glu Met Asn

130 135 140

Leu Glu His Lys Gln Thr Leu Asp Asn Gly Ala Thr Thr Arg Phe Lys

145 150 155 160

Val Met Val Ala Asp Gly Gln Thr Thr Tyr Asn Asp Trp Thr Ala Ser

165 170 175

Ser Ser Asp Leu Asn Val Arg Gln Ala Phe Val Glu Leu Gly Asn Leu

180 185 190

Pro Thr Phe Glu Gly Pro Phe Lys Gly Ser Thr Leu Trp Ala Gly Lys

195 200 205

Arg Phe Asp Arg Asp Asn Phe Asp Ile His Trp Ile Asp Ser Asp Val

210 215 220

Val Phe Leu Ala Gly Thr Gly Gly Gly Ile Tyr Asp Val Lys Trp Asn

225 230 235 240

Asp Ser Leu Arg Ser Asn Phe Ser Leu Tyr Gly Arg Asn Phe Gly Asp

245 250 255

Ile Ala Asp Ser Ser Asn Ser Val Gln Asn Tyr Ile Val Ser Met Asn

260 265 270

Asn Phe Ala Gly Pro Val Gln Met Met Val Ser Gly Met Arg Ala Lys

275 280 285

Asp Asn Asp Asp Arg Gln Asp Ala Asn Gly Asn Leu Val Lys Gly Asp

290 295 300

Ala Ala Asn Thr Gly Val His Ala Leu Leu Gly Leu His Asn Glu Ser

305 310 315 320

Phe Tyr Gly Leu Arg Asp Gly Thr Ser Lys Thr Ala Leu Leu Tyr Gly

325 330 335

His Gly Leu Gly Ala Glu Val Lys Gly Ile Gly Ser Asp Gly Ala Leu

340 345 350

Arg Pro Gly Ala Asn Thr Trp Arg Phe Ala Ser Tyr Gly Thr Thr Pro

355 360 365

Leu Ser Asp Arg Trp Phe Ile Ala Pro Ala Val Leu Ala Gln Ser Ser

370 375 380

Lys Asp Arg Tyr Val Asp Gly Asp Ser Tyr Gln Trp Ala Thr Leu Asn

385 390 395 400

Leu Arg Leu Ile Gln Glu Val Thr Gln Asn Phe Ala Leu Ala Trp Glu

405 410 415

Gly Ser Tyr Gln Tyr Met Asp Leu Gln Pro Glu Gly Tyr Asn Asp Arg

420 425 430

His Ala Val Asn Gly Ser Phe Tyr Lys Leu Thr Phe Ala Pro Thr Phe

435 440 445

Lys Val Gly Ser Ile Gly Asp Phe Phe Ser Arg Pro Glu Ile Arg Phe

450 455 460

Tyr Thr Ser Trp Met Asp Trp Ser Lys Lys Leu Asp Asn Tyr Ala Asn

465 470 475 480

Asp Asp Ala Leu Gly Ser Asn Gly Phe Lys Ser Gly Gly Glu Trp Ser

485 490 495

Phe Gly Met Gln Met Glu Thr Trp Phe

500 505

<210> 2

<211> 462

<212> PRT

<213> 肺炎克雷伯菌

<400> 2

Met His Leu Glu Gly Thr Met Asp Phe Glu Gln Ile Ser Arg Ser Leu

1 5 10 15

Leu Pro Leu Leu Gly Gly Lys Glu Asn Ile Ala Ser Ala Ala His Cys

20 25 30

Ala Thr Arg Leu Arg Leu Val Leu Val Asp Asp Ala Leu Ala Asp Gln

35 40 45

Gln Ala Ile Gly Lys Ile Asp Gly Val Lys Gly Cys Phe Arg Asn Ala

50 55 60

Gly Gln Met Gln Ile Ile Phe Gly Thr Gly Val Val Asn Lys Val Tyr

65 70 75 80

Ala Ala Phe Ile Gln Ala Ala Gly Ile Ser Glu Ser Ser Lys Ser Glu

85 90 95

Ala Ala Asp Leu Ala Ala Lys Lys Leu Asn Pro Phe Gln Arg Ile Ala

100 105 110

Arg Leu Leu Ser Asn Ile Phe Val Pro Ile Ile Pro Ala Ile Val Ala

115 120 125

Ser Gly Leu Leu Met Gly Leu Leu Gly Met Val Lys Thr Tyr Gly Trp

130 135 140

Val Asp Pro Ser Asn Ala Leu Tyr Ile Met Leu Asp Met Cys Ser Ser

145 150 155 160

Ala Ala Phe Ile Ile Leu Pro Ile Leu Ile Gly Phe Thr Ala Ala Arg

165 170 175

Glu Phe Gly Gly Asn Pro Tyr Leu Gly Ala Thr Leu Gly Gly Ile Leu

180 185 190

Thr His Pro Ala Leu Thr Asn Ala Trp Gly Val Ala Ala Gly Phe His

195 200 205

Thr Met Asn Phe Phe Gly Ile Glu Val Ala Met Ile Gly Tyr Gln Gly

210 215 220

Thr Val Phe Pro Val Leu Leu Ala Val Trp Phe Met Ser Met Val Glu

225 230 235 240

Lys Arg Leu Arg Arg Val Ile Pro Asp Ala Leu Asp Leu Ile Leu Thr

245 250 255

Pro Phe Leu Thr Val Ile Ile Ser Gly Phe Ile Ala Leu Leu Leu Ile

260 265 270

Gly Pro Ala Gly Arg Ala Leu Gly Asp Gly Ile Ser Phe Ile Leu Ser

275 280 285

Thr Leu Ile Ser His Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Phe Gly Gly

290 295 300

Leu Tyr Ser Val Ile Val Ile Thr Gly Ile His His Ser Phe His Ala

305 310 315 320

Ile Glu Ala Gly Leu Leu Gly Asn Pro Ser Ile Gly Val Asn Phe Leu

325 330 335

Leu Pro Ile Trp Ala Met Ala Asn Val Ala Gln Gly Gly Ala Cys Phe

340 345 350

Ala Val Trp Phe Lys Thr Lys Asp Ala Lys Ile Lys Ala Ile Thr Leu

355 360 365

Pro Ser Ala Phe Ser Ala Met Leu Gly Ile Thr Glu Ala Ala Ile Phe

370 375 380

Gly Ile Asn Leu Arg Phe Val Lys Pro Phe Ile Ala Ala Leu Val Gly

385 390 395 400

Gly Ala Ala Gly Gly Ala Trp Val Val Ser Met His Val Tyr Met Thr

405 410 415

Ala Val Gly Leu Thr Ala Ile Pro Gly Met Ala Ile Val Gln Ala Ser

420 425 430

Ser Leu Leu Asn Tyr Ile Ile Gly Met Ala Ile Ala Phe Ala Val Ala

435 440 445

Phe Ala Leu Ser Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Thr Asp Ala Glu

450 455 460

<210> 3

<211> 466

<212> PRT

<213> 鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)

<400> 3

Met Ser Leu Pro Ser Arg Leu Pro Ala Ile Leu Gln Ala Val Met Gln

1 5 10 15

Gly Gln Pro Arg Ala Leu Ala Asp Ser His Tyr Pro Arg Trp His His

20 25 30

Ala Pro Val Thr Gly Leu Met Asn Asp Pro Asn Gly Phe Ile Glu Phe

35 40 45

Ala Gly Arg Tyr His Leu Phe Tyr Gln Trp Asn Pro Leu Ala Cys Asp

50 55 60

His Thr Phe Lys Cys Trp Ala His Trp Ser Ser Ile Asp Leu Leu His

65 70 75 80

Trp Gln His Glu Pro Ile Ala Leu Met Pro Asp Glu Glu Tyr Asp Arg

85 90 95

Asn Gly Cys Tyr Ser Gly Ser Ala Val Asp Asn Asn Gly Thr Leu Thr

100 105 110

Leu Cys Tyr Thr Gly Asn Val Lys Phe Ala Glu Gly Gly Arg Thr Ala

115 120 125

Trp Gln Cys Leu Ala Thr Glu Asn Ala Asp Gly Thr Phe Arg Lys Ile

130 135 140

Gly Pro Val Leu Pro Leu Pro Glu Gly Tyr Thr Gly His Val Arg Asp

145 150 155 160

Pro Lys Val Trp Arg His Glu Asp Leu Trp Tyr Met Val Leu Gly Ala

165 170 175

Gln Asp Arg Gln Lys Arg Gly Lys Val Leu Leu Phe Ser Ser Ala Asp

180 185 190

Leu His Gln Trp Thr Ser Met Gly Glu Ile Ala Gly His Gly Ile Asn

195 200 205

Gly Leu Asp Asp Val Gly Tyr Met Trp Glu Cys Pro Asp Leu Phe Pro

210 215 220

Leu Gly Asp Gln His Ile Leu Ile Cys Cys Pro Gln Gly Ile Ala Arg

225 230 235 240

Glu Glu Glu Cys Tyr Leu Asn Thr Tyr Pro Ala Val Trp Met Ala Gly

245 250 255

Glu Phe Asp Tyr Ala Ala Gly Ala Phe Arg His Gly Glu Leu His Glu

260 265 270

Leu Asp Ala Gly Phe Glu Phe Tyr Ala Pro Gln Thr Met Leu Thr Ser

275 280 285

Asp Gly Arg Arg Leu Leu Val Gly Trp Met Gly Val Pro Glu Gly Glu

290 295 300

Glu Met Leu Gln Pro Thr Leu Asn Asn Gly Trp Ile His Gln Met Thr

305 310 315 320

Cys Leu Arg Glu Leu Glu Phe Ile Asn Gly Gln Leu Tyr Gln Arg Pro

325 330 335

Leu Arg Glu Leu Ser Ala Leu Arg Gly Glu Ala Asn Gly Trp Ser Gly

340 345 350

Asn Ala Leu Pro Leu Ala Pro Met Glu Ile Asp Leu Gln Thr Arg Gly

355 360 365

Gly Asp Met Leu Ser Leu Asp Phe Gly Gly Val Leu Thr Leu Glu Cys

370 375 380

Asp Ala Ser Gly Leu Arg Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala Ser Asp Glu

385 390 395 400

Met His Tyr Arg Tyr Trp Arg Gly Asn Val Arg Ser Leu Arg Val Phe

405 410 415

Ile Asp Gln Ser Ser Val Glu Ile Phe Ile Asn Gly Gly Glu Gly Val

420 425 430

Met Ser Ser Arg Tyr Phe Pro Ala Cys Ser Gly Gln Leu Thr Phe Ser

435 440 445

Gly Ile Thr Pro Asp Ala Phe Cys Tyr Trp Pro Leu Arg Thr Cys Met

450 455 460

Val Glu

465

<210> 4

<211> 334

<212> PRT

<213> 鼠伤寒沙门菌

<400> 4

Met Lys Thr Lys Arg Val Thr Ile Lys Asp Ile Ala Glu Gln Ala Gly

1 5 10 15

Val Ser Lys Ala Thr Ala Ser Leu Val Leu Asn Gly Arg Gly Lys Glu

20 25 30

Leu Arg Val Ala Gln Glu Thr Arg Glu Arg Val Leu Ser Ile Ala Arg

35 40 45

Lys His His Tyr Gln Pro Ser Ile His Ala Arg Ser Leu Arg Asn Asn

50 55 60

Arg Ser His Thr Ile Gly Leu Val Val Pro Glu Ile Thr Asn His Gly

65 70 75 80

Phe Ala Val Phe Ala His Glu Leu Glu Met Leu Cys Arg Glu Ala Gly

85 90 95

Val Gln Leu Leu Ile Ser Cys Thr Asp Glu Asn Pro Gly Gln Glu Ser

100 105 110

Val Val Val Asn Asn Met Ile Ala Arg Gln Val Asp Gly Met Ile Val

115 120 125

Ala Ser Cys Met His Asn Asp Ala Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Gln Gln

130 135 140

Leu Pro Val Val Leu Phe Asp Arg Cys Pro Asn Glu Ser Ala Leu Pro

145 150 155 160

Leu Val Met Thr Asp Ser Ile Thr Pro Thr Ala Glu Leu Ile Ser Arg

165 170 175

Ile Ala Pro Gln His Ser Asp Glu Phe Trp Phe Leu Gly Gly Gln Ala

180 185 190

Arg Leu Ser Pro Ser Arg Asp Arg Leu Thr Gly Phe Thr Gln Gly Leu

195 200 205

Ala Gln Ala Gly Ile Ala Leu Arg Pro Glu Trp Val Ile Asn Gly Asn

210 215 220

Tyr His Pro Ser Ser Gly Tyr Glu Met Phe Ala Ala Leu Cys Ala Arg

225 230 235 240

Leu Gly Arg Pro Pro Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Cys Gly Leu Leu

245 250 255

Glu Gly Val Leu Arg Tyr Met Ser Gln His His Leu Leu Asp Ser Asp

260 265 270

Ile His Leu Thr Ser Phe Asp Asp His Tyr Leu Tyr Asp Ser Leu Ser

275 280 285

Leu Arg Ile Asp Thr Val Gln Gln Asp Asn Arg Gln Leu Ala Trp His

290 295 300

Cys Tyr Asp Leu Ile Ser Gln Leu Ile Glu Gly Asp Thr Pro Glu Thr

305 310 315 320

Leu Gln Arg Tyr Leu Pro Ala Thr Leu Gln Phe Arg His Gln

325 330

<210> 5

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 启动子

<400> 5

gcggcacgcc ttgcagatta cggtttgcca cacttttcat ccttctcctg gtgacataat 60

ccacatcaat cgaaaatgtt aataaatttg ttgcgcgaat gatctaacaa acatgcatca 120

tgtacaatca gatggaataa atggcgcgat aacgctcatt ttatgacgag gcacacacat 180

tttaagttcg atatttctcg tttttgctcg ttaacgataa gtttacagca tgcctacaag 240

catcgtggag gtccgtgact ttcacgcata caacaaacat taaccaagga ggaaacagct 300

<210> 6

<211> 3155

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 启动子-操纵子

<400> 6

cccttgggcc ggttaacggc ccactttgct ggcgacatca caattcttaa accggtttag 60

caatttttat tttcaccgcg ttaccgacat gtttaccata tcaactaaac cggtttagca 120

aacattagca cactcactga tttacctttg gatgtcacca acatgtataa aaaacggaag 180

ttagccattc ttattgcttt gctaaccggc accgccgccg cccatgggca gacagacctg 240

aacagcattg aagcgcgtct cgccgccctg gaaaaacgcc tgcaggacgc cgagacccgc 300

gccagcactg ccgaaagccg cgccgcctca gcggagcaga aagttcagca gttaacccag 360

cagcagcagc aaacccaggc caccacccag caggtggcca ggcgcaccac tcaactggaa 420

gaaaaagccg aacggcccgg cggctttgag ttccatggct atgcgcgttc cggggtgatc 480

atgaacgact cggccgccag taccaaatcc ggcgcttata tgacccccgc cggggagacc 540

ggcggcgcca ttggtcgcct gggcaaccag gccgacacct atgtggaaat gaacctcgaa 600

cataaacaga ccctggacaa cggggcgacc acccgtttca aagtgatggt ggccgacgga 660

cagaccacct ataacgactg gacggcaagc agcagcgacc tgaacgtacg ccaggcgttc 720

gtcgagctgg gcaatctgcc gaccttcgaa ggcccgttca aaggctcgac cctgtgggcc 780

gggaaacgct ttgaccgcga caacttcgac atccactgga ttgactcgga tgtggtgttc 840

ctcgccggga ccggcggcgg gatctacgac gtgaaatgga acgacagcct gcgcagcaac 900

ttctcgttat acggccgcaa ctttggcgat attgccgaca gcagcaacag cgtgcagaac 960

tatatcgtca gcatgaataa ctttgccggc ccggtgcaga tgatggtcag cgggatgcgg 1020

gcgaaagata atgacgaccg ccaggacgcg aacggcaatc tggtgaaagg cgatgccgct 1080

aacaccgggg ttcatgccct gctgggcctg cacaatgaga gcttctatgg cctgcgcgac 1140

gggaccagca aaacggccct gctgtacggc cacgggctgg gcgccgaggt taaaggcatc 1200

ggctccgacg gcgcgctgcg cccgggggcc aatacctggc gcttcgccag ctatggcact 1260

acgccgctga gcgatcgctg gtttattgcc ccggccgtgc tggcgcagag cagtaaagat 1320

cgttatgtcg atggcgacag ctatcagtgg gccaccctca acctgcgtct gattcaggaa 1380

gtgacgcaga acttcgccct cgcctgggag ggcagctatc agtacatgga tctgcagcct 1440

gaaggctaca acgatcgcca tgcggtcaat ggcagcttct acaagctgac cttcgccccg 1500

accttcaagg tgggcagcat cggcgacttc ttctcgcggc cggagatccg cttctataca 1560

tcgtggatgg actggagcaa aaaactggac aactacgcca acgatgacgc gttaggcagc 1620

aacggattca aatcgggcgg cgaatggtcg ttcggtatgc aaatggagac ctggttctga 1680

cggccaccgg ggcgacaggg taaataacac ataaatataa ggttcgcggc gcctgccacg 1740

gctggcgccg cccacgccat atcatcatgc atttagaggg tactatggat tttgaacaga 1800

tttcccgctc actgcttccc ctgctgggcg gcaaggaaaa tatcgccagc gccgcgcact 1860

gcgccacccg cctgcggctg gtgctggtcg acgacgcgct cgccgatcag caggcgattg 1920

gcaaaatcga cggggtgaaa ggctgctttc gcaatgccgg acagatgcag atcatcttcg 1980

gcaccggggt ggtcaataaa gtctatgccg cctttatcca ggccgcaggc atcagcgaat 2040

cgagcaaatc cgaagccgcc gacctggcgg cgaaaaagct gaacccgttc cagcgcatcg 2100

cccgcctgct gtccaacatc ttcgtgccga ttattccggc catcgtcgcc tccggcctgc 2160

tgatgggcct gctggggatg gtgaaaacct acggttgggt cgacccgagc aacgctctct 2220

atatcatgct ggatatgtgc agttcggcgg cgtttatcat tctgccgatc ctgatcggct 2280

ttaccgccgc ccgcgaattt ggcggtaacc cctatctggg cgcgaccctc ggcggtatcc 2340

tcacccaccc ggcgctgacc aacgcctggg gcgtcgccgc cggcttccac accatgaatt 2400

tcttcggcat cgaagtggcg atgatcggct accagggcac cgtcttcccg gtgctgctgg 2460

cggtgtggtt tatgagcatg gtcgagaagc ggctgcgccg cgtgatccct gacgcgctgg 2520

acctgatcct cactccgttc ctgacggtga ttatctccgg ctttatcgcc ctgctgctga 2580

tcggcccggc cggtcgcgcg ctcggcgacg gcatttcgtt tatcctcagc acgcttatca 2640

gccatgccgg ctggctggcg ggcctgctgt tcggcggcct ctattcggtg atcgtcatta 2700

ccggtatcca tcacagcttc catgccatcg aggccggact gctgggcaac ccatcgattg 2760

gcgtcaactt cctgctgccg atctgggcga tggccaacgt cgcccagggc ggcgcctgct 2820

ttgcggtgtg gtttaaaacc aaagatgcca aaataaaagc catcaccctg ccgtcggcgt 2880

tttcggcgat gctggggatc accgaggcgg caatcttcgg gattaacctg cgctttgtga 2940

aaccgtttat cgccgcgctg gtgggcggtg ccgccggcgg cgcctgggtg gtgtcgatgc 3000

acgtctacat gaccgcggtg ggcctgacgg cgatcccggg aatggctatc gtgcaggcca 3060

gctcgctgct gaactacatt atcggaatgg cgatcgcctt cgccgtggcc ttcgcgctct 3120

ctctgacgct gaaatacaaa acggacgctg aataa 3155

<210> 7

<211> 2435

<212> DNA

<213> 鼠伤寒沙门菌

<400> 7

atgtctcttc catcacgact gcctgcgatt ttgcaggccg taatgcaggg ccagccgcgc 60

gcgctggccg atagccacta tccgcgctgg caccatgcgc cggtcaccgg gctgatgaac 120

gaccccaacg gctttatcga atttgccgga cgctatcatc tgttttatca gtggaacccg 180

ctcgcctgcg atcatacgtt taagtgctgg gcgcactgga gttccatcga tctgctgcac 240

tggcagcatg agcccattgc gctgatgccg gacgaagagt atgaccgtaa cggctgctac 300

tccggcagcg cggtggataa caacggtacg cttaccctgt gctataccgg caacgtgaag 360

tttgccgagg gagggcgaac cgcctggcaa tgcctggcaa cggaaaacgc tgacggcacc 420

ttccgcaaaa tcggtccggt cctgccgctg ccggagggct acaccggcca tgtgcgcgac 480

ccaaaagtct ggcgacacga agacctgtgg tacatggtgc tgggcgcgca ggatcggcaa 540

aagcgcggca aggtgctgct gttcagctct gcggatctcc atcagtggac gagtatgggt 600

gaaatcgccg gccacggcat caatggcctc gacgacgtcg gctatatgtg ggagtgcccg 660

gatctttttc cactcggcga ccagcatatt ctaatctgct gtccgcaggg gattgcccgt 720

gaggaagagt gctacctgaa cacctacccg gcagtatgga tggcgggcga gtttgattac 780

gctgctggcg ctttcagaca cggcgaactg cacgaactgg acgccgggtt tgagttctac 840

gccccgcaaa ccatgcttac cagtgatggc cgtcgtctgc tggtcggctg gatgggcgtg 900

ccggagggcg aagagatgct tcagccgacc ctgaacaacg gctggattca tcagatgacc 960

tgcctgcgtg agctggagtt tatcaacggt cagctctatc agcgtccgct acgggaactg 1020

agcgccctgc gcggtgaagc gaacggctgg tcggggaacg ccctgccgct ggcaccgatg 1080

gaaatcgatt tgcaaacccg cgggggcgat atgttgagcc tcgattttgg cggcgtatta 1140

acccttgagt gcgatgccag cggactccgc ctggcccgac gcagtctcgc cagtgacgag 1200

atgcattatc gttactggcg cggaaacgtc cgctcgctgc gtgttttcat cgaccagtcg 1260

agcgtggaga ttttcataaa cggcggtgaa ggggtgatga gcagccgcta cttcccggcc 1320

tgctccggtc agctaacatt ctccggcatc acgccggacg cattctgcta ctggccgctg 1380

cgaacttgca tggtagaata agcgttttgc ttcaggctca tggcgtcgta atgaaaacca 1440

aacgcgtaac cattaaagat atagcggaac aggctggcgt ctccaaagcg accgccagct 1500

tggtactgaa tggtcgtggc aaggagctgc gcgtggcgca ggaaacgcgt gagcgcgtac 1560

tgtcgattgc ccgtaagcat cactatcagc caagcattca tgcccgctcg ctgcgcaaca 1620

accgcagcca caccatcggg ctggtggtgc cggagatcac caaccacggc tttgcggtct 1680

ttgcccatga gctggagatg ctgtgccgcg aggcgggcgt ccagctgttg atctcttgta 1740

ctgatgaaaa ccccggtcag gagagcgtgg tggtcaataa tatgattgcc cgccaggttg 1800

acgggatgat cgtcgcttcc tgtatgcaca acgatgccga ctatctcaaa ctcagccaac 1860

agctgccagt ggtgctgttt gaccggtgcc ccaatgaaag cgcgctgccg ctggtaatga 1920

ccgattcgat taccccaacg gcggaactga tttcccgcat cgcgcctcag catagcgatg 1980

agttctggtt tttaggcggt caggcgcgtc tgtcgccctc ccgcgatcgt ctgaccgggt 2040

tcacgcaggg tttggctcag gcgggtattg ccctgcgccc ggaatgggtg atcaacggca 2100

attaccaccc cagctccggc tatgagatgt ttgccgcact ctgcgcgcgc cttgggcggc 2160

cgcctaaggc gctattcacc gccgcctgcg ggctgctcga aggggttctg cgctatatga 2220

gccagcacca tttactcgat tccgatattc atctgacgag ctttgacgat cactatcttt 2280

atgattcgct gtcgctgcgt atcgacactg tccagcagga taatcgccag ctggcctggc 2340

actgctacga tctgataagc cagctgatcg agggcgatac gcccgaaacg ctacaacgct 2400

acctgcccgc aaccctgcaa tttcggcatc agtaa 2435

Claims

a.编码糖基转移酶的重组基因，所述糖基转移酶能够将活化的糖核苷酸的糖残基

i.转移至碳水化合物受体或所述受体的糖苷，其中所述受体被微生物内化，和/或

ii.转移至从所述受体到所述寡糖的生物合成途径中的中间体，

b.用于从蔗糖制造所述活化的糖核苷酸的生物合成途径，和

c.一个或多个编码异源PTS-依赖性蔗糖利用系统的基因，使得所述细胞能够使用蔗糖作为用于制造所述活化的糖核苷酸的碳源，并作为制造所述寡糖的能量来源，

其中所述碳水化合物受体不是蔗糖，或所述受体的糖苷，并且所述异源PTS-依赖性蔗糖利用系统包括由scr基因编码的蛋白质，scrY用于蔗糖孔蛋白，scrA用于PTS透性酶，scrB用于蔗糖-6-磷酸水解酶，scrR用于阻遏蛋白，

并且其中编码糖基转移酶的重组基因插入微生物的基因组中，和/或scr基因插入微生物的基因组中。

2.根据权利要求1所述的基因修饰微生物，其是不含质粒的。

3.根据权利要求1或2所述的基因修饰微生物，其中所述scr基因可操作地连接到glp启动子，例如glpF启动子，如SEQ ID NO:5的glpF启动子。

4.根据权利要求1至3所述的基因修饰微生物，其中寡糖或碳水化合物受体的糖苷中的苷元选自：

--OR_A，其中R_A为直链或支链烃链，当饱和时，其具有1～24个、优选1～6个碳原子，或者当不饱和时，其具有2～24个、优选2～6个碳原子，或者R_A表示芳基部分，或者R_A表示能通过氢解作用除去的基团，

-叠氮化物，

-氨基酸残基，

-聚乙二醇残基，

-聚乙烯醇残基，和

-式A的α,β-不饱和酰胺基基团或者式B的α,β-不饱和羰基基团

5.根据权利要求1至4中任一项所述的基因修饰微生物，其为大肠杆菌(E.coli.)。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的基因修饰微生物，其中一个或多个以下基因是缺失的或失活的：lacZ、lacI、lacA和hlyE。

7.根据权利要求6所述的基因修饰微生物，其中lacZ是缺失的或失活的，并且任选地一个或多个以下基因是缺失的或失活的：lacI、lacA和hlyE。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的基因修饰微生物，用于制造式1的寡糖：

其中：

Y是

--OH

-叠氮化物，

-氨基酸残基，

-聚乙二醇残基，

-聚乙烯醇残基，或

-式A的α,β-不饱和酰胺基基团或者式B的α,β-不饱和羰基基团

其中Q2、Q3和Q4独立地为H和C₁-C₆烷基，所述烷基任选被卤素、OH、硝基或苯基取代，

R₁是岩藻糖基或H，

R₂是岩藻糖基或H，

条件是R₁、R₂、R₃和R₄基团中的至少一个与H不同。

9.根据权利要求8所述的基因修饰微生物，其中Y是-OH。

10.根据权利要求9所述的基因修饰微生物，其中式1的寡糖表示人乳寡糖(HMO)。

11.根据权利要求10所述的基因修饰微生物，其中所述微生物是大肠杆菌，所述HMO是中性HMO，并且所述大肠杆菌包括：

i.编码N-乙酰基-葡糖胺基转移酶的重组基因，和一个或多个编码UDP-GlcNAc生物合成途径的基因，所述N-乙酰基-葡糖胺基转移酶能够将UDP-GlcNAc的GlcNAc转移至内化的乳糖，或者转移至从乳糖到所述中性HMO的生物合成途径中的中间体；和/或

ii.编码岩藻糖基转移酶的重组基因，和一个或多个编码GDP-Fuc生物合成途径的基因，所述岩藻糖基转移酶能够将GDP-Fuc的岩藻糖残基转移至内化的乳糖，或者转移至从乳糖到所述中性HMO的生物合成途径中的中间体，和

iii.任选地，编码半乳糖基转移酶的重组基因，和一个或多个编码UDP-Gal生物合成途径的基因，所述半乳糖基转移酶能够将UDP-Gal的半乳糖残基转移至从乳糖到所述中性HMO的生物合成途径中的中间体。

12.根据权利要求10所述的基因修饰微生物，其中所述微生物是大肠杆菌，所述HMO是N-乙酰化HMO，并且所述大肠杆菌包括：

i.编码N-乙酰基-葡糖胺基转移酶的重组基因，所述N-乙酰基-葡糖胺基转移酶能够将UDP-GlcNAc的GlcNAc转移至内化的乳糖，或者转移至从乳糖到所述N-乙酰化HMO的生物合成途径中的中间体，和

ii.任选地，编码半乳糖基转移酶的重组基因，所述半乳糖基转移酶能够将UDP-Gal的半乳糖残基转移至N-乙酰基-葡糖胺基化的乳糖，或者转移至从乳糖到所述N-乙酰化HMO的生物合成途径中的中间体；和

iii.一个或多个编码UDP-GlcNAc和任选的UDP-Gal的生物合成途径的基因。

13.根据权利要求12所述的基因修饰微生物，其中：

i.N-乙酰基-葡糖胺基转移酶是β-1,3-N-乙酰基-葡糖胺基转移酶，细胞中不存在编码半乳糖基转移酶的重组基因，N-乙酰化HMO是乳-N-三糖II，或

ii.N-乙酰基-葡糖胺基转移酶是β-1,3-N-乙酰基-葡糖胺基转移酶，半乳糖基转移酶是β-1,3-半乳糖基转移酶，N-乙酰化HMO是乳-N-四糖，或

iii.N-乙酰基-葡糖胺基转移酶是β-1,3-N-乙酰基-葡糖胺基转移酶，半乳糖基转移酶是β-1,4-半乳糖基转移酶，N-乙酰化HMO是乳-N-新四糖。

14.根据权利要求10所述的基因修饰微生物，其中所述微生物是大肠杆菌，所述HMO是N-乙酰化HMO，并且所述大肠杆菌包括：

i.编码N-乙酰基-葡糖胺基转移酶的重组基因，和一个或多个编码UDP-GlcNAc生物合成途径的基因，所述N-乙酰基-葡糖胺基转移酶能够将UDP-GlcNAc的GlcNAc转移至内化的乳糖，或者转移至从乳糖到所述岩藻糖基化N-乙酰化HMO的生物合成途径中的中间体；和

ii.编码岩藻糖基转移酶的重组基因，和一个或多个编码GDP-Fuc生物合成途径的基因，所述岩藻糖基转移酶能够将GDP-Fuc的岩藻糖残基转移至内化的乳糖，或者转移至从乳糖到所述岩藻糖基化N-乙酰化HMO的生物合成途径中的中间体，和

iii.编码半乳糖基转移酶的重组基因，和一个或多个编码UDP-Gal生物合成途径的基因，所述半乳糖基转移酶能够将UDP-Gal的半乳糖残基转移至从乳糖到所述岩藻糖基化N-乙酰化HMO的生物合成途径中的中间体。

15.根据权利要求10所述的基因修饰微生物，其中所述微生物是大肠杆菌，所述HMO是2’-FL、3-FL或DFL，并且所述大肠杆菌包括：

i.编码岩藻糖基转移酶的重组基因，所述岩藻糖基转移酶能够将GDP-Fuc的岩藻糖残基转移至内化的乳糖，和

ii.一个或多个编码GDP-Fuc生物合成途径的基因。

16.根据权利要求15所述的基因修饰微生物，其中与不含PTS-依赖性蔗糖系统并且在葡萄糖上生长的类似微生物相比，所述基因修饰生物在蔗糖上生长时，DFL/2’-FL比率降低了至少15％，优选至少20％。

17.根据权利要求10所述的基因修饰微生物，其中所述微生物是大肠杆菌，所述HMO是唾液酸基化HMO，并且所述大肠杆菌包括：

i.编码唾液酸基转移酶的重组基因，所述唾液酸基转移酶能够将CMP-唾液酸的唾液酸残基转移至内化的乳糖，或者转移至从乳糖到所述唾液酸基化HMO的生物合成途径中的中间体，和

ii.一个或多个编码CMP-唾液酸生物合成途径的基因。

18.根据权利要求10所述的基因修饰微生物，其中所述微生物是大肠杆菌，所述HMO是岩藻糖基化和唾液酸基化HMO，并且所述大肠杆菌包括：

i.编码唾液酸基转移酶的重组基因，所述唾液酸基转移酶能够将CMP-唾液酸的唾液酸残基转移至内化的乳糖，或者转移至从乳糖到所述岩藻糖基化和唾液酸基化HMO的生物合成途径中的中间体，

ii.编码岩藻糖基转移酶的重组基因，所述岩藻糖基转移酶能够将GDP-Fuc的岩藻糖残基转移至内化的乳糖，或者转移至从乳糖到所述岩藻糖基化和唾液酸基化HMO的生物合成途径中的中间体，和

iii.一个或多个编码CMP-唾液酸和GDP-Fuc生物合成途径的基因。

19.一种通过使碳水化合物受体或所述受体的糖苷糖基化制造寡糖或所述寡糖的糖苷的方法，其中所述碳水化合物受体不是蔗糖，所述方法包括以下步骤：

a.提供根据权利要求1至18中任一项所述的基因修饰微生物，

b.在所述受体和蔗糖存在下培养所述细胞，和

c.从所述细胞、从培养基或从二者中分离所述寡糖。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述基因修饰微生物是大肠杆菌。

21.根据权利要求19或20所述的方法，其中与使用葡萄糖作为碳源时相比，蔗糖碳源的利用率提高。

22.根据权利要求19至21所述的方法，其中所述寡糖是人乳寡糖(HMO)。

23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中从所述细胞、从培养基或从二者中分离的寡糖基本上不含异麦芽糖、曲二糖、龙胆二糖和黑曲霉糖。