KR101083136B1 - Ｌ-아미노산 생산용 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 수크로스를 주 탄소원으로 이용할 수 있으며, L-아미노산 생산능을 가지는 형질전환된 미생물 및 당해 미생물을 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

대장균, 수크로스, 만노키나아제, 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제, 수크로스 전사 조절자, L-아미노산

Description

Ｌ-아미노산 생산용 미생물 및 이를 이용하여 Ｌ-아미노산을 생산하는 방법 {MICROORGANISMS FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS AND PROCESS FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS USING THEM}

본 발명은 수크로스를 주 탄소원으로 이용하여 고수율의 L-아미노산을 생산하는 형질전환된 미생물 및 이를 이용한 L-아미노산 생산 방법에 관한 것이다.

발효 산업에 주로 이용되는 전분당은 최근 바이오 연료 개발이 가속화됨에 따라 수요가 급증하고, 이상 기후에 의한 작물의 흉작으로 가격이 급상승하고 있다. 이러한 전분당에 비해 값이 싼 수크로스 또는 수크로스를 다량 포함하는 당밀 (molasses)을 발효산업의 탄소원으로 이용할 경우, 보다 높은 원가 경쟁력을 확보할 수 있는 장점이 있다. 자연계에 존재하는 대장균의 약 50 % 정도는 수크로스를 대사할 수 있는 능력을 가지고 있지만, 발효 산업에 주로 이용되고 있는 대장균 K12 균주, B 균주 및 C 균주 등은 수크로스 자화능이 없다(Mol. Microbiol. (1998) 2:1-8, Can. J. Microbiol. (1999) 45:418-422). 그러므로 수크로스 자화능과 관련된 유전자들을 규명하고 이를 개량하여 강화된 수크로스 자화능 관련 유전자들을 확보하는 일과 이들을 수크로스 비자화성 산업용 대장균에 도입하여 목적하는 대사 산물을 생산하는 것은 발효산업의 가장 중요한 연구주제 중 하나이다.

산업용 대장균에 수크로스 자화능을 부여할 수 있는 방법으로서, 수크로스 자화능이 있는 미생물 유래의 수크로스 이용성 유전자 또는 유전자군을 도입하는 방법이 주로 이용되고 있다. 그 예로, 엔테로박테리아세 (Enterobacteriaceae) 과에 속하는 살모넬라 (Salmonella) 종 (J. Bacteriol. (1982) 151:68-76, Mol. Microbiol. (1998) 2:1-8, J. Bacteriol. (1991) 173:7464-7470, 미국등록특허 제7,179,623호), 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae) (J. Gen. Microbiol. (1988) 134:1635-1644), 어위니아 아미노보라 (Erwinia amylovora) (J. Bacteriol. (2000) 182:5351-5358)에 존재하는 scr 레귤론(regulon)을 대장균 K12에 형질전환하여 수크로스 자화능을 부여한 것은 이미 당업계에 잘 알려져 있다. 또한 수크로스 자화능을 가지는 non-K12 대장균 또는 병원성 대장균 (Appl. Environ. Microbiol. (1992) 58:2081-2088, 미국 등록특허 제6,960,455호) 유래의 csc 레귤론을 도입한 경우, 대장균 AB1281 (미국 등록특허 제4,806,480호)의 접합 플라스미드(conjugative plasmid) scr53에 존재하는 수크로스 이용성 유전자 군을 도입한 경우 및 그람 양성 미생물인 스트렙토코코스 뮤탄스 (Streptococcus mutans) (J. Bacteriol. (1989) 171:263-271) 및 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) (J. Bactreriol. (1989) 171:1519-1523) 유래의 scr 레귤론, sac 오페론 (operon)을 도입한 경우도 알려져 있다.

수크로스를 이용할 수 있는 시스템은 크게 Scr-PTS 시스템과 Scr-non PTS 시스템으로 나눌 수 있다. 대부분의 수크로스를 이용할 수 있는 미생물은 Scr-PTS (phosphoenolpyruvate dependent sucrose phosphotransferase) 시스템을 가진다.

Scr-PTS 시스템의 대표적인 예로써 그람 음성 미생물인 살모렐라 타이퓨뮤리움(Salmonella typhmurium)의 접합 플라스미드 pUR400이나 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae)의 염색체상에 존재하는 scr 레귤론을 들 수 있다. scr 레귤론은 도 1에서 보는 바와 같이 scrK (fructokinase), scrY (sucrose porin), scrA (sucrose-specific EIIBC component), scrB (sucrose-6-phosphate hydrolase) 및 scrR (LacI-related sucrose-specific repressor)의 5개의 유전자로 구성되어 있으며, 두 개의 오페론인 scrK 및 scrYAB는 ScrR 리프레서(repressor)에 의하여 음성적으로 조절되고 있다(Mol. Microbiol. (1993) 9:195-209). 그람 양성균의 Scr-PTS 시스템은 스트렙토코코스 뮤탄스 (Streptococcus mutans)의 scr 레귤론이 있으며, scrK, scrA, scrB 및 scrR 유전자로 구성되어 있다(J. Bacteriol. (2003) 185:5791-5799).

Scr-PTS 시스템은 낮은 농도의 수크로스까지 효율적으로 유입할 수 있다는 장점은 있으나, PEP(Phosphoenolpyruvate)를 소모하여 수크로스를 유입하므로 세포내의 PEP 풀(pool)을 감소시키는 단점이 있다. PEP는 중앙 대사경로에서 중요한 중간체(metabolite)로써, 당(sugar) PTS 시스템의 포스페이트 공여자(phosphate donor)의 역할 뿐만이 아니라, 피루베이트 카이네이즈(pyruvate kinase)에 의해 촉매되는 ATP 생성 반응에 관여하기도 하며, 몇 가지 아미노산이나 옥살로아세테이 트(oxaloacetate, OAA)의 직접적인 전구체로도 작용한다(Metab. Eng. (2002) 4:124-137, Microb. Cell Fact. (2005) 4:14). 특히 OAA는 쓰레오닌, 이소로이신 메티오닌, 라이신, 아스파라진 및 아스파틱산 등의 아미노산의 탄소골격(carbon skeleton)으로 이용된다 (미국 등록특허 제6,960,455호).

PEP의 대부분은 당 PTS 시스템에 의해 가장 많이 소모되는 것으로 알려져 있다. 탄소원으로서 글루코스가 포함된 최소배지에서 글루코스 PTS 시스템에 소모되는 PEP의 양은 전체 PEP의 50 %에 이른다고 한다(Microb. Cell Fact. (2005) 4:14). 따라서 당 PTS 시스템 대신 당 non-PTS 시스템을 이용한다면, 세포 내의 PEP 풀을 증가시킬 수 있으며 증가된 PEP를 발효산물의 생합성에 이용함으로써 생산성 및 수율을 향상시킬 수 있다. 최근 대장균의 당 PTS 시스템을 이용할 때보다 당 non-PTS 시스템을 이용할 경우, 아미노산이나 방향족 화합물(aromatic compound)의 수율과 생산성이 증가한다는 사례가 많이 보고되고 있다(Biotechnol. Bioeng. (2001) 74: 364-375, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2001) 57:186-191, Metab. Eng. (2005) 7:70-87).

따라서 수크로스 이용에 있어서도 Scr-PTS 시스템보다는 수크로스 유입시 PEP를 소모하지 않는 Scr-non PTS 시스템을 이용하는 것이 더 바람직할 것이다. 이러한 장점을 가진 Scr-non PTS 시스템을 발효에 이용한 예도 몇 가지 알려져 있다. 아지노모토(Ajinomoto)사의 경우 EC3132 유래의 cscBKA를 대장균에 도입하여 쓰레오닌, 이소루이신 및 트립토판 등의 생산에 이용하였다 (미국 등록특허 제6,960,455호). 또한 듀퐁 (DuPont)사는 대장균 ATCC13281 유래 cscBKAR을 대장균 K12에 도입하고 수크로스를 사용하여 타이로신 (tyrosine)을 생산하기도 하였다(Appl. Microbiol. Biotechol. (2007) 74:1031-1040). KO11 유래의 cscBKAR을 락테이트(lactate)을 생산하는 대장균에 도입하여 수크로스와 당밀로부터 락테이트를 생산한 사례도 알려져 있다 (Biotechnol. Lett. (2004) 26:689-693).

Scr-non PTS 시스템은 프로톤 심포트 타입 수크로스 퍼미아제 (proton symport-type sucrose permease)를 이용하는 시스템으로 이 수크로스 퍼미아제를 코딩하는 cscB를 포함하는 csc 유전자군이 잘 알려져 있다. csc 레귤론의 경우 수크로스 자화능이 있는 대장균 유래의 것들이 많으며, 그 예로 야생형 대장균 중 EC3132의 csc 레귤론 (GenBank accession number X81461, Mol. Gen. Genet. (1992) 235:22-32, 미국 등록특허 제6,960,455호), 대장균 KO11 csc 레귤론(GenBank accession number AY314757, Biotechnol. Lett. (2004) 26:689-693), 병원성 대장균 O157:H7의 csc 레귤론(J. Bacteriol. (2002) 184:5307-5316), 및 ATCC13281의 csc 레귤론(GenBank accession number DQ777770, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2007) 74:1031-1040)이 알려져 있다.

csc 레귤론은 cscB (proton symport-type sucrose permease), cscK (fructokinase), cscA (sucrose hydolase), cscR (LacI-related sucrose-specific repressor)로 구성되어 있으며, 2개의 오페론, cscKB와 cscA는 CscR에 의해 음성적으로 조절을 받는다(J. Bacteriol. (2002) 184: 5307-5316).

CscB는 프로톤 심포트 타입(proton symport-type)의 수크로스 퍼미아제로써, 수소의 농도 구배에 의해 외부의 수크로스가 세포 내로 유입된다. CscB는 Scr-PTS 시스템과 비교했을 때 Scr-non PTS 시스템의 가장 큰 특징을 보여주는 단백질로써, Scr-PTS 시스템의 ScrA 에 비해 수크로스에 대한 Km 값이 상대적으로 높다. ScrA의 경우 수크로스에 대한 Km 값이 10 μM (J. Bacteriol. (1982) 151:68-76)인 반면, CscB의 경우 Km 값이 1.0 mM (Biochem. BiophysRes. Commun. (1995) 208:1116-1123)인 것으로 알려져 있다. 따라서 csc 레귤론이 도입된 대장균은 0.2% 이하의 수크로스가 포함된 배지에서 대수 증식기 (doubling time)가 20 시간에 이른다(J. Bacteriol. (2002) 184:5307-5316). CscA는 수크로스 하이드로라제(sucrose hydrolase) 활성을 가지며, 세포 내로 유입된 수크로스를 글루코스와 프락토오즈로 가수분해시킨다. CscK는 프락토카이네이즈(fructokinase) 활성을 가지며, 프락토오즈를 프락토오즈-6-포스페이트(fructose-6-phosphate)로 전환시킨다.

한편, Mak는 ATP를 소모하며 만노오스, 프락토오즈를 포함한 헥소스 (hexose)를 6-포스포-에스터(6-phospho-ester) 형태로 전환해주는 카이네이즈 (kinase) 활성을 가진다. 특히 엔테릭 박테리아 (enteric bacteria)의 야생형 Mak (Mak-o)를 코딩하는 유전자(mak 또는 yajF)는 크립틱 (cryptic) 유전자로 알려져 있으며, mak의 프로모터 -35 부위의 염기서열 변이에 의한 Mak (Mak⁺)는 활성이 크게 증가한다고 알려져 있다(J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (2001) 3:355-359, Biochemistry (2005) 44:10776-10783). Mak는 만노오스, 프락토오즈 이외에도 또 다른 기질 글루코스, 소오보오스 및 글루코사민을 인산화시킬 수 있다.

이와 같은 배경하에서, 본 발명자는 수크로스를 고효율적으로 이용하는 미생물을 개발하기 위한 일환으로써, 수크로스 대사에 관여할 것으로 예상되는 유전자들을 탐색하는 연구를 수행하던 중, 수크로스 대사에 있어서 만노키나아제가 중요한 역할을 할 것이라는 사실을 밝혀내게 되었다. 즉, 만노키나아제가 불활성화된 대장균에 온전한 csc 레귤론을 도입하더라도, 만노키나아제가 불활성화되지 않는 야생형 대장균에 비해 수크로스 이용속도가 감소되는 사실을 확인하게 되었으며, 이러한 사실에 근거하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 하나의 목적은 수크로스를 주 탄소원으로 이용하는 L-아미노산 생산능이 향상된 에스케리키아속 미생물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 수크로스 비자화성 미생물에 수크로스 퍼미아제(sucrose permease), 수크로스 하이드로라제(sucrose hydrolase) 및 수크로스 전사 조절자(sucrose transcriptional regulator)의 활성을 부여하고, 만노키나아제(mannokinase)의 활성이 강화된 것을 특징으로 하는 증가된 L-아미노산 생산능 및 수크로스 자화능을 갖는 에스케리키아속 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 에스케리키아속 미생물을 이용하여 L-아미노산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 수크로스 비자화성 미생물에 수크로스 퍼미아제(sucrose permease), 수크로스 하이드로라제(sucrose hydrolase) 및 수크로스 전사 조절자(sucrose transcriptional regulator)의 활성을 부여하고, 만노키나아제(mannokinase)의 활성이 강화된 것을 특징으로 하는 증가된 L-아미노산 생산능 및 수크로스 자화능을 갖는 에스케리키아속 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 수크로스 퍼미아제는 외부의 수크로스를 세포 내로 유 입하는 활성을 가지는 펩타이드이며, 수크로스 하이드로라제는 수크로스를 글루코스와 프락토스로 가수분해하는 활성을 가지는 펩타이드이며, 수크로스 전사 조절자는 수크로스 퍼미아제 및 수크로스 하이드로라제를 코딩하는 유전자들의 전사를 조절하는 활성을 가지는 펩타이드를 의미한다. 상기 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제 및 수크로스 전사 조절자의 활성은 수크로스 자화능이 존재하는 미생물에 존재하지만, 에스케리키아속 미생물, 특히 산업적으로 이용되는 산업용 대장균 K12 균주, B 균주 및 C 균주에는 존재하지 않는다.

상기 수크로스 비자화성 에스케리키아 속 미생물에 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제 및 수크로스 전사 조절자의 활성을 부여하도록 하는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하다. 바람직한 활성 부여 방법은 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제 및 수크로스 전사 조절자를 암호화하는 유전자를 벡터에 도입하고, 그 재조합 벡터로 수크로스 비자화성 L- 아미노산 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물을 형질전환시키는 것이다. 상기 수크로스 퍼미아제를 코딩하는 유전자, 수크로스 하이드로라제를 코딩하는 유전자, 수크로스 전사 조절자를 코딩하는 유전자는 바람직하게 수크로스 자화능이 있는 미생물, 바람직하게는 수크로스 자화능이 있는 에스케리아속 미생물, 보다 바람직하게는 수크로스 자화능이 있는 대장균으로부터 유래할 수 있다. 수크로스 자화능이 있는 대장균의 예로는 대장균 ATCC9637 (Appl. Environ. Microbiol. (1989) 55:1943-1948) 등이 있다. 상기 대장균 ATCC9637로부터 얻어지는 수크로스 퍼미아제를 코딩하는 유전자 (cscB)를 서열번호 4로, 수크로스 하이드로라제를 코딩하는 유전자(cscA) 서열번호 6으로, 수크로스 전사 조절자를 코딩하는 유전자(cscR)를 서열번호 7로 각각 나타내었다.

하나의 구체적인 실시에서, 본 발명자는 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제 및 수크로스 전사 조절자를 암호화하는 유전자로서, csc 레귤론으로부터 유래된 서열번호 4, 6 및 7의 cscB, cscA, 및 cscR 유전자를 포함하는 cscBAR 유전자를 벡터에 도입하고, 그 재조합 벡터로 수크로스 비자화성 L- 아미노산 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물을 형질전환시켜 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 만노키나아제(mannokinase)는 만노오스 등의 헥소스(hexose)를 ATP를 이용하여 6-포스포-에스터 형태로 전환해 주는 활성을 가지는 펩티드를 말한다. 본 발명은 수크로스 비자화성 에스케리키아속 미생물에서 만노키나아제의 활성이 본래의 활성보다 강화(또는 증가)된 것을 특징으로 한다. 상기"본래의 화성"이란 어떠한 유전적 조작이나 변형이 없는 수크로스 비자화성 에스케리키아속 미생물이 가지고 있는 활성을 의미한다. 또한, 상기 "강화" 또는 "증가"는 수크로스 비자화성 에스케리키아속 미생물의 본래의 활성보다 향상된 것을 의미한다.

본 발명의 만노키나아제 활성을 강화(또는 증가)시키는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하다. 그 방법의 예는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 만노키나아제를 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 염색체에 삽입하는 방법 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 벡터 시스템에 도입하는 방법 등에 의하여 만노키나아제를 코딩하는 염기서열의 카피수를 증가시키는 방법, 강한 프로모터로 교체하는 방법, 프로모터에 변이를 도입하는 방법, 및 유전자 변이에 의한 방법 등이 있다. 하나의 구체적 실시에서, 아미노산 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물의 만노키나아제의 활성을 강화시키기 위해 만노키나아제를 암호화하는 유전자를 벡터에 도입하고 에스케리키아속 미생물을 형질전환시킴으로써 상기 유전자의 카피수를 증가시키는 방법을 사용할 수 있다.

만노키나아제를 암호화하는 유전자는 수크로스 비자화성 에스케리키아속 미생물에 작동 가능한 염기서열을 가지는 유전자이면 족하며, 바람직하게는 엔테릭 박테리아 (enteric bacteria)의 야생형 Mak (Mak-o)를 코딩하는 유전자인 mak 유전자이다. 구체적인 일 실시예에서는 대장균에서 유래하였으며, 바람직하게는 서열번호 15의 염기서열 (GenBank accession number AC000091)을 가지는 폴리뉴클레오타이드를 사용하였다. 한편, 상기 만노키나아제를 코딩하는 염기서열은 그 활성을 유지하는 한 일정 정도 변형이 가능한 것은 당업자에게 자명할 것이다. 본 기술 분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 70 % 이상의 상동성이 유지되는 염기서열이 본 발명에서 목적하는 유전자의 활성을 보유하는 한, 본 발명의 상기 염기서열로부터 유래된 것과 균등한 것임을 쉽게 이해할 것이다.

본 발명에 있어서 상기 만노키나아제, 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제 및 수크로스 전사 조절자의 L-아미노산 생산능 및 수크로스 자화능을 추가적으로 향상시키기 위하여, 상기 활성을 보유한 펩티드를 코딩하는 유전자의 카 피수를 증가시키는 방법, 프로모터를 개량하는 방법, 무작위 돌연변이법 (random mutagenesis) 또는 부위 특이적 돌연변이법 (site-directed mutagenesis)을 이용하는 방법 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시에서는 만노키나아제, 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제 및 수크로스 전사 조절자를 코딩하는 유전자를 포함하는 염기서열을 하이드록실아민 (hydroxylamine)을 처리하여 무작위 변이를 유발하는 방법 (Methods Enzymol. (1991) 194:302-318)을 이용하였다.

따라서, 바람직한 일 양태로서 본 발명은 상기 변이 유발 방법에 의해 변이된 염기서열 또는 아미노산 서열에 변이가 있는 변이체에 의해 향상된 L-아미노산 생산능 및 수크로스 자화능을 갖는 에스케리키아속 미생물에 관한 것이며, 바람직하게 상기 변이체는 만노키나아제, 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제 및 수크로스 전사 조절자 중의 염기서열에 변이가 하나 또는 그 이상의 변이가 존재하는 변이체이다. 보다 바람직하게는 만노키나아제, 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제 및 수크로스 전사 조절자 중의 아미노산 서열에 하나 또는 그 이상의 변이가 존재하는 변이체이다. 가장 바람직하게는 수크로스 전사 조절자의 130번째 아미노산이 히스티딘에서 타이로신으로 치환된 변이체이고, 바람직하게 이러한 변이체는 서열번호 17로 정의되는 변이된 수크로스 전사 조절자를 갖는다.

이와 같은 변이체를 벡터에 도입하고, 그 재조합 벡터를 수크로스 비자화성 L-아미노산 생산능을 가지는 에스케리키아 속 미생물에 형질전환시키는 방법에 의해 본 발명에 따른 향상된 L-아미노산 생산능 및 수크로스 자화능을 갖는 에스케 리키아속 미생물을 제공할 수 있다. 구체적인 일 실시에서, 본 발명자는 서열번호 18로 정의되는 벡터 pAcscBAR'-mak 플라스미드를 사용하여 수크로스 비자화성 에스케리키아속 미생물을 향상된 L-아미노산 생산능 및 수크로스 자화능을 갖는 에스케리키아속 미생물로 형질전환시킬 수 있다.

본 발명에서 "벡터"란 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제, 수크로스 전사 조절자 및 만노키나아제를 암호화하는 유전자를 숙주세포인 수크로스 비자화성 에스케리키아속 미생물로 도입하여 본 발명에 따른 에스케리키아속 미생물을 제공하는데 사용되는 핵산 화합물로서, 목적 단백질을 발현하기 위한 통상의 필수적인 발현 요소를 포함한다. 구체적으로, 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈 및 폴리아데보화 서열과 같은 조절서열을 가지며, 이의 다양한 변형이 가능하다. 또한, 인핸서 서열 또는 분비 서열을 포함할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322 및 pMW118 벡터 등을 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "형질전환"은 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 유전자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 유전자는 숙주세포내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

본 발명의 미생물은 수크로스 비자화성을 갖는 L-아미노산 생산 가능 미생물로서, 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제 및 수크로스 전사 조절자의 활성이 부여되고 만노키나아제의 활성이 강화되어 L-아미노산 생산능이 향상됨과 동시에 수크로스 자화능을 갖는 미생물을 말한다. 따라서, 본 발명의 미생물은 상기 특성을 보유하는 한 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함하며, 이의 예로 는 에스케리키아 (Escherichia) 속, 어위니아 (Erwinia) 속, 세라티아 (Serratia) 속, 프로비덴시아 (Providencia) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 있다. 바람직하게 본 발명의 미생물은 에스케리키아 속에 속하는 미생물이며, 보다 바람직하게는 대장균이다.

본 발명에 있어서 "L-아미노산"은 L-쓰레오닌, O-석시닐-호모세린(O-succinyl-homoserine), O-아세틸-호모세린(O-Acetyl-homoserine), L-메티오닌, L-라이신, L-호모세린, L-이소루신, L-발린 및 L-트립토판 등이다. 바람직하게 상기 L-아미노산은 L-쓰레오닌, O-석시닐-호모세린, O-아세틸-호모세린 및 L-트립토판이다.

구체적인 일 실시에서, 본 발명자는 특히 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 대장균이 cscBAR'-mak 유전자군을 포함한 서열변호 18의 염기서열을 갖는 벡터로 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 대장균 ABA5G 균주를 형질전환 하였으며, 제작된 균주를 대장균 CA03-0308로 명명하고, 2008년 12월 23일자로 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제 1동 361-221 번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM10978P로 기탁하였다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은, 상기 향상된 L-아미노산 생산능 및 수 크로스 자화능을 갖는 에스케리키아 속 미생물을 수크로스가 주 탄소원으로 포함되어 있는 배지에 배양하여 아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명은 탄소원으로서 수크로스가 전체 또는 일부 포함된 배양 배지에 상기의 수크로스 자화능을 가지고 L-아미노산을 생산하는 미생물을 접종하여 배양하는 단계; 및 상기 배양물로부터 L-아미노산을 분리하는 단계를 포함하는, 수크로스를 포함한 탄소원에서 상기 에스케리키아 속 미생물을 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 배양과정은 당 업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양방법의 예에는 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 만족시켜야 한다.

본 발명에서 사용되는 배지는 수크로스를 주탄소원으로 사용한다. 주탄소원으로 사용되는 수크로스는 수크로스를 다량으로 포함한 당밀 등의 형태로 탄소원으로 제공될 수 있으며, 수크로스 또는 당밀 외에 적정량의 탄소원을 제한없이 다양하게 포함할 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에 포함되는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐 -함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산 철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한 배양 중에는 지방산 폴리클리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속 될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 100 시간이다.

본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 아미노산을 수집 및 회수하는 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 아미노산을 수집할 수 있다.

본 발명은 따른 향상된 L-아미노산 생산능 및 수크로스 자화능을 갖는 에스케리키아속 미생물을 사용하여 L-아미노산을 생산하는 경우, 발효산업에 주로 이용 되었던 전분당 이외에 수크로스를 주탄소원으로 이용함으로써 급변하는 세계 곡물가에 유연하게 대처할 수 있을 뿐만 아니라 고수율의 L-아미노산을 생산할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 수크로스 이용성 유전자 csc regulon의 획득 및 클로닝

Scr-non PTS 시스템인 cscBKAR 유전자는 미국생물자원센터 (American Type Culture Collection)로부터 구매한 대장균 W 균주 (ATCC9637)의 염색체를 주형으로 PCR법을 통하여 증폭하였다. 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 PCR 법을 통하여 게놈상에 연속적으로 존재하는 4종의 유전자 전부를 단일 폴리뉴클레오티드로 증폭하였으며, 서열번호 1의 프라이머는 제한 효소 EagI 부위를 가지고 있고, 서열번호 2의 프라이머는 XbaI 부위를 가지고 있다. 이때 이용한 프라이머는 미국 국립보건원 진뱅크 (NIH GeneBank)에 등록되어 있는 EC3132의 cscBKAR 유전자 (GenBank accession number X81461) 및 주변 염기서열에 대한 정보를 바탕으로 제작하였다.

서열 번호 1: 5' CTTACGGCCGGAGTACATTTGAGCGACTGT 3'

서열 번호 2: 5' CGACTCTAGACTCGTTGGCGAGAACAGAGG 3'

PCR법의 조건은 94 ℃에서 3분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 5분 중합을 25회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 5199 bp의 폴리뉴클레오티드를 획득할 수 있었다. 얻어진 폴리뉴클레오티드를 EagI 및 XbaI의 제한 효소 처리를 한 후 pACYC184 벡터의 EagI, XbaI자리에 클로닝하여 대장균 DH5α에 형질전환한 후 1 % 수크로스가 포함되어 있는 맥콘키 고체배지 (MacConkey agar plate)에 도말하였다. 콜로니중 진한 자주색 (purple color)을 띠는 콜로니를 선별한 후 통상에 알려진 플라스미드 미니프렙법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다.

실시예 2. 획득된 cscBKAR 유전자의 염기서열 결정

획득된 플라스미드를 pAcscBKAR로 명명하고, EagI 및 XbaI 자리에 클로닝된 cscBKAR의 DNA 염기서열 (서열번호 3)을 결정하였을 때, 141번째부터 1388번째 염기서열은 cscB 유전자 (서열번호 4), 1460번째부터 2374번째 염기서열은 cscK 유전자 (서열번호 5), 2590번째부터 4023번째 염기서열은 cscA 유전자 (서열번호 6), 4031번째부터 5026번째 염기서열은 cscR 유전자 (서열번호 7)로 밝혀졌다.

실시예 3. MG1655 mak 유전자 결손 균주 제작

수크로스 대사에 주요하게 영향을 주는 유전자를 탐색하기 위하여, 수크로 스 대사에 관여할 것으로 예상되는 몇 가지 유전자를 선별하고, 그 유전자가 각각 결손 되어 있는 변이 대장균 K12를 제작하였다. 각 유전자가 결손된 변이체 대장균 K12는 원스탭 불화성화 방법 (Proc. Natl. Acad. Sci. (2000) 97:6640-6645) 에 의해 제작하였으며, 항생제 내성부여 표식 유전자를 제거하였다. 특히, mak 결손 균주를 제작하기 위해서, 서열번호 8 과 서열번호 9의 프라이머 쌍과 pKD4 플라스미드 (Proc. Natl. Acad. Sci. (2000) 97:6640-6645, GenBank No. AY048743)를 이용하여 PCR 반응을 수행하고, 그 결과 획득한 DNA 단편을 pKD46 (Proc. Natl. Acad. Sci. (2000) 97:6640-6645, GenBank No. AY048746)을 함유하는 야생형 대장균 K12의 컴피턴트 세포 (competent cell)에 일렉트로포레이션 (electroporation)하였다. 이후 카나마이신 (kanamycine) 내성을 보이는 세포주를 대상으로 PCR 반응을 수행하여, mak 유전자의 결실여부를 확인하고 pCP20 (Proc. Natl. Acad. Sci. (2000) 97:6640-6645) 플라스미드를 도입하여 항생제 내성 표식 유전자를 제거하였다.

서열번호 8: 5' GTGCGTATAGGTATCGATTTAGGCGGCACCAAAACTGAAGTGATTGCACTG TTGCAGCATTACACGTCTTG3'

서열번호 9: 5' TTACTCTTGTGGCCATAACCACGCAGCGCCGCGTACGCCGCTGGAATCACC ACTTAACGGCTGACATGGGA 3'

실시예 4. MG1655 mak 유전자 결손 균주에 pAcscBKAR 도입 및 수크로스 이 용성 확인

수크로스 대사에 주요하게 영향을 줄 것으로 예상되는 유전자가 각각 결실된 변이 대장균 K12를 실시예 3의 방법으로 제작한 후, pAcscBKAR 플라스미드를 형질전환 하였다. pAcscBKAR 플라스미드가 도입된 형질전환체를 33℃ 배양기에서 LB 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 수크로즈가 함유된 표 1의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 36 시간 배양하였으며, 이의 결과를 표 2에 나타내었다.　

표 2에서 보는 바와 같이 mak가 결손된 균주는 36시간 동안 수크로스를 24.9 g/L 이용하고, mak가 결손되지 않는 야생형 균주는 33.1 g/L의 수크로스를 이용함에 따라 mak가 결손된 균주가 mak가 결손되지 않는 균주에 비해 수크로스 이용속도가 약 1.3배 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 mak가 수크로스 대사에 있어서 중요한 유전자임을 예상할 수 있었으며, 이러한 사실을 바탕으로 효율적인 수크로스를 이용성 균주를 개발하기 위한 연구를 지속적으로 수행하였다.

실시예 5. pAcscBAR-mak 제작

pAcscBAR-mak는 다음과 같은 방법으로 제작되었다. 우선pAcscBAR을 제작한 후 pAcscBAR에 mak유전자를 클로닝하는 방법을 이용하였다. pAcscBAR의 제작은, 서열번호 10과 11의 프라이머를 이용하여 cscK 부위가 제거된 cscB부위의 폴리뉴클레오티드로 증폭하였다.

서열번호 10: 5' CGCGATATCTAGCATATGCCGGGTACCGCACTAGTTGAGAGTAAACGGC GAAGT 3'

서열번호 11: 5' ATTCGGCCGGAGCCCTGCAGGTGCACGAGTACATTTGAGCGACTGT 3'

PCR법의 조건은 94℃에서 3분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 30초 중합을 25회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 1521 bp의 폴리뉴클레오티드를 획득할 수 있었다. 얻어진 폴리뉴클레오티드와 pAcscBKAR를 각각 EcoRV와 EagI으로 제한 효소 처리를 한 후 클로닝하여 대장균 DH5α에 형질전환 하였다. LB 배지에서 성장한 콜로니를 이용한 PCR법을 통하여 pAcscBAR이 포함된 콜로니를 선별하였으며, 통상에 알려진 플라스미드 미니프렙법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 획득된 pAcscBAR 플라스미드의 XbaI과 EagI자리에 연결된 cscBAR의 염기서열 (서열번호 12) 분석을 통하여 변이가 없는 것을 확인하였다.

pAcscBAR-mak의 제작은, 서열번호 13과 14의 프라이머와 대장균 W3110의 염색체를 주형으로 하여 mak가 포함된 폴리뉴클레오티드로 증폭한 후 pAcscBAR의 PstI과 EagI 의 제한 효소 자리에 클로닝하였다.

서열번호 13: 5' CACTGCAGTGGGGTAAATGCCATCG 3'

서열번호 14: 5' AACGGCCGTCTCGGTGCTCATTACT 3'

PCR법의 조건은 94 ℃에서 3분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 30초 중합을 25회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 1388 bp의 폴리뉴클레오티드 (서열번호 15)를 획득할 수 있었다. 얻어진 폴리뉴클레오티드와 pAcscBAR를 각각 PstI과 EagI으로 제한 효소 처리를 한 후 클로닝하여 대장균 DH5α에 형질전환 하였다. LB 배지에서 성장한 콜로니를 이용한 PCR법을 통하여 pAcscBAR-mak가 포함된 콜로니를 선별하였으며, 통상에 알려진 플라스미드 미니프렙법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 획득된 pAcscBAR-mak 플라스미드의 XbaI과 EagI자리에 연결된 cscBAR-mak의 염기서열 (서열번호 16) 분석을 통하여 변이가 없는 것을 확인하였다.

실시예 6. 쓰레오닌 생산주에 pAcscBAR-mak 도입

pAcscBAR-mak를 쓰레오닌을 생산하는 대장균에 도입하였을 때, 수크로스를 이용하여 성장할 뿐만 아니라, 실제 효율적인 쓰레오닌 생산이 가능한지 확인하기 위하여 통상의 형질전환 방법을 통하여 쓰레오닌 생산주, ABA5G에 도입하였다. 획득된 콜로니에 대하여 PCR 클로닝 법을 통해 수크로스 이용 관련 유전자가 포함된 플라스미드를 갖고있는 콜로니를 획득하였다. 획득한 콜로니를 33℃ 배양기 (incubator)에서 LB 고체 배지 중에 밤새 배양한 후, 표 1의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 30시간 배양하였으며, 이의 결과를 표 3에 나타내었다.

표 3에서 나타난 바와 같이pAcscBKAR 를 포함한 ABA5G균주는 30 시간 배양하였을 경우 18.7 g/L의 수크로스를 이용하고, 6.0 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였으나, pAcscBAR-mak를 포함한 ABA5G 균주는 27.7 g/L의 수크로스를 이용하고 9.7 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였다. 따라서 pAcscBAR-mak가 포함된 ABA5G는 pAcscBKAR을 포함한 ABA5G 균주에 비해 수크로스 이용 속도가 약 1.5 배가량 증가하였으며, 쓰레오닌 생산성도 3.7 g/L 상승하였다.

실시예 7. cscBAR-mak 도입을 통한 Mak 활성 강화 확인

모균주 ABA5G와 비교하여 pAcscBAR-mak가 포함된 ABA5G 균주에서 만노키나아제의 활성의 증대 또는 강화를 확인하기 위한 하나의 방법으로 프락토카이네이즈 활성 측정(Plant Physiol. (1978) 62:291-294)을 수행하였다. 이 효소 활성 측정법은 프락토오즈를 최초 기질로 하여, 만노키나아제와 포스포글루코스 아이소머라제 (phosphoglucose isomerase) 및 글루코스-6-소프페이트 디하이드라제 (glucose-6-phosphate dehydrogenase)를 이용한 커플링 반응(coupling reaction)을 통하여 만노키나아제의 프락토카이네이즈 활성을 측정할 수 있는 방법이다. 효소액은 LB에서 24시간 배양한 pAcscBAR과 pAcscBAR-mak가 각각 포함된 ABA5G 균주를 소니케이터(sonicator)를 이용하여 파쇄한 후 원심 분리한 상등액을 효소액으로 이용하였으며, 단백질 농도 측정은 브래드포드 분석법 (Bradford assay) (Anal. Biochem. (1976) 72:248-254)을 이용하였다. 효소 반응은 30분간 유지하면서 OD 340 nm에서 흡광도의 변화량을 측정하였고, 이를 통해 커플링 반응에 의해 생성된 NADPH의 양을 측정하였으며, NADPH의 흡광계수 6.22 cm^-1 mM^-1를 사용하여 활성을 계산하였다. 만노키나아제의 1 unit은 상기의 효소 활성 측정법에 의하여 1 분당 전체 단백질 1 mg에 의해 1 nM의 NADPH를 생성시키는 효소량으로 정의하며, 이의 결과는 표 4에 나타내었다.

표 4에 나타난 바와 같이 pAcscBAR-mak가 포함된 ABA5G의 만노키나아제의 활성은 pAcscBAR만 포함된 ABA5G에 비해 효소 활성이 약 12배 증가 또는 강화 된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 8. cscBAR-mak 의 mutation 도입

수크로스 이용성을 향상시킬 뿐만 아니라 쓰레오닌 생산성을 향상시키기 위하여 하이드록실아민 (Hydroxylamine)을 처리하여 변이된 수크로스 이용성 유전자를 얻는 화학적 무작위 변이법 (chemical random mutagenesis)을 수행하였다 (Methods Enzymol. (1991) 194:302-318). 우선 1 M 하이드록실아민, 2 mM EDTA, 100 mM 소디움 클로라이드 (sodium chloride), 50 mM 소디움 파이로포스페이트 (sodium pyrophosphate) 를 첨가하여 변이유발액 (mutagenesis solution)을 제조한 후, 1 ml 변이유발액에 목적 DNA를 0.2 mg/ml 농도로 25 μl넣었다. pAcscBAR-mak 플라스미드로부터 EagI과 XbaI의 제한 효소를 이용하여, 5887 bp의 cscBAR-mak가 포함된 DNA 조각을 목적 DNA로 이용하였다. 변이유발액을 첨가한 DNA 조각을 75℃에서 30분, 1시간, 2시간, 4시간 마다 500 μl씩 정제컬럼 (purification column)을 이용하여 정제하였다. 하이드록실아민이 처리된 DNA와 EagI과 XbaI의 제한 효소가 처리된 pACYC184 벡터를 T4 DNA 라이게이즈 (ligase)를 이용하여 연결한 후 쓰레오닌 생산주 ABA5G에 형질전환하였다. 형질전환된 균주를 0.1 %의 저농도 수크로스가 포함된 맥콘키 고체 배제에 도말하여 37℃에서 하루 배양 후 진한 자주색을 띠는 콜로니를 선별하였다.

선별된 콜로니들을 표 1의 역가 배지에서 쓰레오닌 생산성과 수크로스 이용속도를 평가하여 최종적으로 쓰레오닌 생산성과 수크로스 이용성이 가장 우수한 한 균주를 선별하였다. 선별된 균주로부터 통상의 플라스미드 미니 프렙법을 이용하여 플라스미드를 얻은 후 염기서열 분석을 수행하였다. 결과적으로 cscR의 388 번째 염기가 C에서 T로 치환되었으며, 그에 따라 130번째 아미노산이 히스티딘에서 타이로신으로 변이가 일어났으며, 이 변이를 가진 수크로스 전사 조절자는 서열번호 17의 염기서열에 의해 암호화된다.

실시예 9. pAcscBAR'-mak도입을 통한 L-쓰레오닌 생산성 향상

cscR 변이 (서열번호 17)가 포함된 pAcscBAR'-mak (서열번호 18) 플라스미드를 ABA5G에 새로 형질전환 하여 플라스크 역가 평가를 수행하였다. 33℃ 배양기에서 LB 고체 배지 중에 밤새 배양한 균주를 표 1의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 30시간 배양하였으며, 이의 결과를 표 5에 나타내었다.

표 5에서 나타난 바와 같이 pAcscBKAR 를 포함한 ABA5G균주는 30 시간 배양하였을 경우 18.7 g/L의 수크로스를 이용하고, 6.0 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였으나, pAcscBAR'-mak를 포함한 ABA5G 균주는 33.4 g/L의 수크로스를 이용하고 12.4 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였다. 즉, pAcscBAR'-mak가 포함된 ABA5G는 pAcscBKAR을 포함한 ABA5G 균주에 비해 수크로스 이용 속도가 약 1.8 배, 쓰레오닌 생산성이 6.4 g/L 상승하였으며, pAcscBAR-mak가 포함된ABA5G에 비해서도 수크로스 이용 속도가 약 1.2 배, 쓰레오닌 생산성이 2.7 g/L 가량 증가하였다. 따라서 cscBAR'-mak을 포함한 재조합 균주의 경우, 수크로스 이용성 및 L-쓰레오닌의 생산성이 향상됨을 확인할 수 있었으며, 상기 형질전환된 미생물을 CA03-0308로 명명하였고, 이를 2008년 12월 23일자로 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제 1동 361-221 번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM10978P로 기탁하였다.

실시예 10. pAcscBAR'-mak도입을 통한 O-석시닐-호모세린 생산성 향상

상기의 실시예 8에서 제작된 pAcscBAR'-mak를 미국공개특허 제2009/0253187호에 기재된 O-숙시닐-호모세린(O-Succinyl-homoserine) 생산균주인 CJM-11A(KCCM-10922P)에 형질전환하여 0.1 %의 저농도 수크로스가 포함된 맥콘키 고체배지에 도말하여 37℃에서 하루 배양 후 진한 자주색을 띠는 콜로니를 선별하였다

선별된 형질전환체를 33℃ 배양기에서 LB 고체 배지 중에 밤새 배양한 균주를 슈크로즈가 함유된 표 1의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 배양하였으며, 이의 결과를 표 6에 나타내었다.

표 6에서 나타낸 바와 같이, 모 균주인 pAcscBKAR을 포함한 CJM-11A 균주는 48시간 배양하였을 경우 30.2 g/L의 수크로스를 이용하고, 12.3 g/L의 O-석시닐-호모세린을 생산하였으나, pAcscBAR'-mak를 포함한 CJM-11A 균주는 50.4 g/L의 수크로스를 이용하고, 20.5 g/L의 O-석시닐-호모세린을 생산하여 pAcscBKAR을 포함한 CJM-11A 에 비해 수크로스 이용 속도가 1.7배 증가하였고, 8.2 g/L의 향상된 O-석시닐-호모세린 생산성을 나타내었다. 따라서 cscBAR'-mak을 포함한 재조합 균주의 경우, 수크로스 이용성 및 O-석시닐-호모세린의 생산성이 향상됨을 확인할 수 있었다.

실시예 11. pAcscBAR'-mak 도입을 통한 O-아세틸-호모세린 생산성 향상

상기의 실시예 8에서 제작된 pAcscBAR'-mak를 미국공개특허 제2009/0253186호에 기재된 O-아세틸-호모세린(O-Acetyl-homoserine) 생산균주인 CJM-X(KCCM-10921P)에 형질전환하여 0.1 %의 저농도 수크로스가 포함된 맥콘키 고체배지에 도말하여 37℃에서 하루 배양 후 진한 자주색을 띠는 콜로니를 선별하였다

선별된 형질전환체를 33℃ 배양기에서 LB 고체 배지 중에 밤새 배양한 균주를 슈크로즈가 함유된 표 1의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 배양하였으며, 이의 결과를 표 7에 나타내었다.

표 7에서 나타낸 바와 같이, 모 균주인 pAcscBKAR을 포함한 CJM-X 균주는 48시간 배양하였을 경우 29.9 g/L의 수크로스를 이용하고, 10.7 g/L의 O-Acetyl-homoserine을 생산하였으나, pAcscBAR'-mak를 포함한 CJM-X 균주는 53.5 g/L의 수크로스를 이용하고, 15.4 g/L의 O-Acetyl-homoserine을 생산하여 pAcscBKAR을 포함한 CJM-X 에 비해 수크로스 이용 속도가 1.8배 증가하였고, 8.8 g/L의 향상된 O-Acetyl-homoserine 생산성을 나타내었다. 따라서 cscBAR'-mak을 포함한 재조합 균주의 경우, 수크로스 이용성 및 O-Acetyl-homoserine의 생산성이 향상됨을 확인할 수 있었다.

실시예 12. pAcscBAR'-mak도입을 통한 L-트립토판 생산성 향상

상기의 실시예 8에서 제작된 pAcscBAR'-mak를 L-트립토판 생산균주인 CJ285에 형질전환하여 0.1 %의 저농도 수크로스가 포함된 맥콘키 고체배지에 도말하여 37℃에서 배양 후 하루 배양 후 진한 자주색을 띠는 콜로니를 선별하였다.

선별된 형질전환체를 37℃ 배양기에서 LB 고체 배지 중에 밤새 배양한 균주를 슈크로즈가 함유된 표 8의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 37℃, 200 rpm의 배양기에서 배양하였으며, 이의 결과를 표 9에 나타내었다.

표 9에서 나타낸 바와 같이, 모 균주인 pAcscBKAR을 포함한 CJ285 균주를 60시간 배양하였을 경우, 24.7 g/L의 수크로스를 이용하고, 4.9 g/L의 L-트립토판을 생산하였으나, pAcscBAR'-mak를 포함한 CJ285균주는 37.1 g/L의 수크로스를 이용하고, 8.9 g/L의 L-트립토판을 생산하여 pAcscBKAR을 포함한 CJ285에 비해 수크로스 이용 속도가 1.5배 증가하였고, 4.0 g/L의 향상된 L-트립토판 생산성을 나타내었다. 따라서 cscBAR'-mak을 포함한 재조합 균주의 경우, 수크로스 이용성 및 L-트립토판의 생산성이 향상됨을 확인할 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당 업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

도 1은 scr 레귤론의 개요를 나타낸 도면이다 (J. biotechnol. (2001) 92:133-158). p는 프로모터 (promoters), Ko1 및 Yo2o3는 작동자 (operators), 및 t는 종결자 (terminators)를 의미한다.

도 2는 cscBAR'-mak을 포함하는 재조합 플라스미드 pAcscBAR'-mak의 작제도이다.

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> MICROORGANISMS FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS AND PROCESS FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS USING THEM <130> PA080579/KR <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> gene <222> (1)..(30) <223> primer for amplification of cscBKAR <400> 1 cttacggccg gagtacattt gagcgactgt 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> gene <222> (1)..(30) <223> primer for amplification of cscBKAR <400> 2 cgactctaga ctcgttggcg agaacagagg 30 <210> 3 <211> 5179 <212> DNA <213> Escherichia coli (ATCC9637) <220> <221> gene <222> (1)..(5179) <223> polynucleotide containing cscBKAR regulon <400> 3 gagtacattt gagcgactgt accagaacat gaatgaggcg tttggattag gcgattatta 60 gcagggctaa gcattttact attattattt tccggttgag ggatatagag ctatcgacaa 120 caaccggaaa aagtttacgt ctatattgct gaaggtacag gcgtttccat aactatttgc 180 tcgcgttttt tactcaagaa gaaaatgcca aatagcaaca tcaggcagac aatacccgaa 240 attgcgaaga aaactgtctg gtagcctgcg 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ccaccagcga cgatatgatc 2820 cactggcagc atgagcctat tgcgctagcg ccaggagacg ataatgacaa agacgggtgt 2880 ttttcaggta gtgctgtcga tgacaatggt gtcctctcac ttatctacac cggacacgtc 2940 tggctcgatg gtgcaggtaa tgacgatgca attcgcgaag tacaatgtct ggctaccagt 3000 cgggatggta ttcatctcga gaaacagggt gtgatcctca ctccaccaga aggaatcatg 3060 cacttccgcg atcctaaagt gtggcgtgaa gccgacacat ggtggatggt agtcggggcg 3120 aaagatccag gcaacacggg gcagatcctg ctttatcgcg gcagttcgtt gcgtgaatgg 3180 accttcgatc gcgtactggc ccacgctgat gcgggtgaaa gctatatgtg ggaatgtccg 3240 gactttttca gccttggcga tcagcattat ctgatgtttt ccccgcaggg aatgaatgcc 3300 gagggataca gttaccgaaa tcgctttcaa agtggcgtaa tacccggaat gtggtcgcca 3360 ggacgacttt ttgcacaatc cgggcatttt actgaacttg ataacgggca tgacttttat 3420 gcaccacaaa gctttttagc gaaggatggt cggcgtattg ttatcggctg gatggatatg 3480 tgggaatcgt caatgccctc aaaacgtgaa ggatgggcag gctgcatgac gctggcgcgc 3540 gagctatcag agagcaatgg caaacttcta caacgcccgg tacacgaagc tgagtcgtta 3600 cgccagcagc atcaatctgt ctctccccgc acaatcagca 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240 ataggtatcg atttaggcgg caccaaaact gaagtgattg cactgggcga tgcaggggag 300 cagttgtacc gccatcgtct gcccacgccg cgtgatgatt accggcagac tattgaaacg 360 atcgccacgt tggttgatat ggcggagcag gcgacggggc agcgcggaac ggtaggtatg 420 ggcattcctg gctcaatttc gccttacacc ggtgtggtga agaatgccaa ttcaacctgg 480 ctcaacggtc agccattcga taaagactta agcgcgaggt tgcagcggga agtgcggctg 540 gcaaatgacg ctaactgtct ggcggtttca gaagcagtag atggcgcggc agcgggagcg 600 cagacggtat ttgccgtgat tatcggcacg ggatgcggcg cgggcgtggc attcaatggg 660 cgggcgcata tcggcggcaa tggcacggca ggtgagtggg gacacaatcc gctaccgtgg 720 atggacgaag acgaactgcg ttatcgcgag gaagtccctt gttattgcgg taaacaaggt 780 tgtattgaaa cctttatttc gggcacggga ttcgcgatgg attatcgtcg tttgagcgga 840 catgcgctga aaggcagtga aattatccgc ctggttgaag aaagcgatcc ggtagcggaa 900 ctggcattgc gtcgctacga gctgcggctg gcaaaatcgc tggcacatgt cgtgaatatt 960 ctcgatccgg atgtgattgt cctggggggc gggatgagca atgtagaccg tttatatcaa 1020 acggttgggc agttgattaa acaatttgtc ttcggcggcg aatgtgaaac gccggtgcgt 1080 aaggcgaagc 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ccggatcgag 420 aatattcacg acatgtgcca gcgattttgc cagccgcagc tcgtagcgac gcaatgccag 480 ttccgctacc ggatcgcttt cttcaaccag gcggataatt tcactgcctt tcagcgcatg 540 tccgctcaaa cgacgataat ccatcgcgaa tcccgtgccc gaaataaagg tttcaataca 600 accttgttta ccgcaataac aagggacttc ctcgcgataa cgcagttcgt cttcgtccat 660 ccacggtagc ggattgtgtc cccactcacc tgccgtgcca ttgccgccga tatgcgcccg 720 cccattgaat gccacgcccg cgccgcatcc cgtgccgata atcacggcaa ataccgtctg 780 cgctcccgct gccgcgccat ctactgcttc tgaaaccgcc agacagttag cgtcatttgc 840 cagccgcact tcccgctgca acctcgcgct taagtcttta tcgaatggct gaccgttgag 900 ccaggttgaa ttggcattct tcaccacacc ggtgtaaggc gaaattgagc caggaatgcc 960 catacctacc gttccgcgct gccccgtcgc ctgctccgcc atatcaacca acgtggcgat 1020 cgtttcaata gtctgccggt aatcatcacg cggcgtgggc agacgatggc ggtacaactg 1080 ctcccctgca tcgcccagtg caatcacttc agttttggtg ccgcctaaat cgatacctat 1140 acgcacggta ctctccttat ttttttcaat atcaatagcg tagagacgga caaccggatt 1200 ggcaatgcaa ggccgccgac aattcgttat catgcccgct aaatttaacg acaaggccgt 1260 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agctggtgat atgggatagt gttcaccctt gttacaccgt 60 tttccatgag caaactgaaa cgttttcatc gctctggagt gaataccacg acgatttccg 120 gcagtttcta cacatatatt cgcaagatgt ggcgtgttac ggtgaaaacc tggcctattt 180 ccctaaaggg tttattgaga atatgttttt cgtctcagcc aatccctggg tgagtttcac 240 cagttttgat ttaaacgtgg ccaatatgga caacttcttc gcccccgttt tcaccatggg 300 caaatattat acgcaaggcg acaaggtgct gatgccgctg gcgattcagg ttcatcatgc 360 cgtctgtgat ggcttccatg tcggcagaat gcttaatgaa ttacaacagt actgcgatga 420 gtggcagggc ggggcgtaat ttttttaagg cagttattgg tgcccttaaa cgcctggtgc 480 tacgcctgaa taagtgataa taagcggatg aatggcagaa attcgaaagc aaattcgacc 540 cggtcgtcgg ttcagggcag ggtcgttaaa tagccgctta tgtctattgc tggtttaccg 600 gtttattgac taccggaagc agtgtgaccg tgtgcttctc aaatgcctga ggccagtttg 660 ctcaggctct ccccgtggag gtaataattg acgatatgat catttattct gcctcccaga 720 gcctgataaa aacggttagc gcttcgttaa tacagatgta ggtgttccac agggtagcca 780 gcagcatcct gcgatgcaga tccggaacat aatggtgcag ggcgcttgtt tcggcgtggg 840 tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact gttgggcgct 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tgccgccgga agcgagaaga 1740 atcataatgg ggaaggccat ccagcctcgc gtcgcgaacg ccagcaagac gtagcccagc 1800 gcgtcggccg tctcggtgct cattacttat tgccggatgc ggcgtgaacg ccttatccgc 1860 cctacgcggt tctggcacat tttgcaggcc tgataagacg cggcaagcgt cgcatcaggc 1920 atcggagcac ttattgccgg atgcggcgtg aacgccttat ccggcctacg gttctggcac 1980 cttttgtagg cctgataaga cgcggcaagc gtcgcatcag gcatgatgcg ccaattgcct 2040 acgtttttta ctcttgtggc cataaccacg cagcgccgcg tacgccgctg gaatcaccgt 2100 gcttcgcctt acgcaccggc gtttcacatt cgccgccgaa gacaaattgt ttaatcaact 2160 gcccaaccgt ttgatataaa cggtctacat tgctcatccc gccccccagg acaatcacat 2220 ccggatcgag aatattcacg acatgtgcca gcgattttgc cagccgcagc tcgtagcgac 2280 gcaatgccag ttccgctacc ggatcgcttt cttcaaccag gcggataatt tcactgcctt 2340 tcagcgcatg tccgctcaaa cgacgataat ccatcgcgaa tcccgtgccc gaaataaagg 2400 tttcaataca accttgttta ccgcaataac aagggacttc ctcgcgataa cgcagttcgt 2460 cttcgtccat ccacggtagc ggattgtgtc cccactcacc tgccgtgcca ttgccgccga 2520 tatgcgcccg cccattgaat gccacgcccg cgccgcatcc cgtgccgata atcacggcaa 2580 ataccgtctg cgctcccgct gccgcgccat ctactgcttc tgaaaccgcc agacagttag 2640 cgtcatttgc cagccgcact tcccgctgca acctcgcgct taagtcttta tcgaatggct 2700 gaccgttgag ccaggttgaa ttggcattct tcaccacacc ggtgtaaggc gaaattgagc 2760 caggaatgcc catacctacc gttccgcgct gccccgtcgc ctgctccgcc atatcaacca 2820 acgtggcgat cgtttcaata gtctgccggt aatcatcacg cggcgtgggc agacgatggc 2880 ggtacaactg ctcccctgca tcgcccagtg caatcacttc agttttggtg ccgcctaaat 2940 cgatacctat acgcacggta ctctccttat ttttttcaat atcaatagcg tagagacgga 3000 caaccggatt ggcaatgcaa ggccgccgac aattcgttat catgcccgct aaatttaacg 3060 acaaggccgt ggaaattatc atgctgtggt tcaaaaattt aatggtttac cgtcttagcc 3120 gcgagatttc gctgcgtgca gaagagatgg aaaaacagct agcctcgatg gcatttaccc 3180 cactgcaggt gcacgagtac atttgagcga ctgtaccaga acatgaatga ggcgtttgga 3240 ttaggcgatt attagcaggg ctaagcattt tactattatt attttccggt tgagggatat 3300 agagctatcg acaacaaccg gaaaaagttt acgtctatat tgctgaaggt acaggcgttt 3360 ccataactat ttgctcgcgt tttttactca agaagaaaat 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aacgggcatg acttttatgc 5940 accacaaagc tttttagcga aggatggtcg gcgtattgtt atcggctgga tggatatgtg 6000 ggaatcgtca atgccctcaa aacgtgaagg atgggcaggc tgcatgacgc tggcgcgcga 6060 gctatcagag agcaatggca aacttctaca acgcccggta cacgaagctg agtcgttacg 6120 ccagcagcat caatctgtct ctccccgcac aatcagcaat aaatatgttt tgcaggaaaa 6180 cgcgcaagca gttgagattc agttgcagtg ggcgctgaag aacagtgatg ccgaacatta 6240 cggattacag ctcggcactg gaatgcggct gtatattgat aaccaatctg agcgacttgt 6300 tttgtggcgg tattacccac acgagaattt agacggctac cgtagtattc ccctcccgca 6360 gcgtgacacg ctcgccctaa ggatatttat cgatacatca tccgtggaag tatttattaa 6420 cgacggggaa gcggtgatga gtagtcgaat ctatccgcag ccagaagaac gggaactgtc 6480 gctttatgcc tcccacggag tggctgtgct gcaacatgga gcactctggc tactgggtta 6540 acataatatc aggtggaaca acggatcaac agcgggcaag ggatccgcgt cactcttccc 6600 ccttcacgac cttcaataat atgcaatgca gcttcccgcc cgataatgtc atgtggaagc 6660 tgaattgtgg tcagcggcgg taaaaacaga tgcccgacgc caaccagatt atcaaagccc 6720 attacggcga catcctgcgg gattcgtacc cccttcgcca 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gatccaacgc cctatcacct 7620 gacacagcaa tacaataaaa aataacaata attcccggac aattgtcccc agttccgcct 7680 ctgttctcgc caacgagtct agaaatattt tatctgatta ataagatgat cttcttgaga 7740 tcgttttggt ctgcgcgtaa tctcttgctc tgaaaacgaa aaaaccgcct tgcagggcgg 7800 tttttcgaag gttctctgag ctaccaactc tttgaaccga ggtaactggc ttggaggagc 7860 gcagtcacca aaacttgtcc tttcagttta gccttaaccg gcgcatgact tcaagactaa 7920 ctcctctaaa tcaattacca gtggctgctg ccagtggtgc ttttgcatgt ctttccgggt 7980 tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc ggactgaacg gggggttcgt 8040 gcatacagtc cagcttggag cgaactgcct acccggaact gagtgtcagg cgtggaatga 8100 gacaaacgcg gccataacag cggaatgaca ccggtaaacc gaaaggcagg aacaggagag 8160 cgcacgaggg agccgccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc 8220 caccactgat ttgagcgtca gatttcgtga tgcttgtcag gggggcggag cctatggaaa 8280 aacggctttg ccgcggccct ctcacttccc tgttaagtat cttcctggca tcttccagga 8340 aatctccgcc ccgttcgtaa gccatttccg ctcgccgcag tcgaacgacc gagcgtagcg 8400 agtcagtgag cgaggaagcg gaatatatcc tgtatcacat 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Claims (16)

1. 수크로스 비자화성 미생물에 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제 및 수크로스 전사 조절자의 활성을 부여하고, 만노키나아제의 활성을 강화시킨 것을 특징으로 하는 증가된 L-아미노산 생산능 및 수크로스 자화능을 갖는 대장균.
2. 제1항에 있어서, 만노키나아제의 활성 강화는 만노키나아제 유전자의 카피수 증가, 프로모터 교체, 프로모터 변이 및 유전자 변이로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 방법에 의한 것을 특징으로 하는 증가된 L-아미노산 생산능 및 수크로스 자화능을 갖는 대장균.
3. 제2항에 있어서, 만노키나아제 유전자의 카피수 증가는 염색체 삽입 및 벡터 도입에 의한 것을 특징으로 하는 증가된 L-아미노산 생산능 및 수크로스 자화능을 갖는 대장균.
4. 제3항에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 15의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 증가된 L-아미노산 생산능 및 수크로스 자화능을 갖는 대장균.
5. 제1항에 있어서, 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제 및 수크로스 전사 조절자의 활성 부여가 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제 및 수크로스 전사 조절자를 암호화하는 염기서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 증가된 L-아미노산 생산능 및 수크로스 자화능을 갖는 대장균.
6. 제5항에 있어서, 상기 염기서열은 각각 서열번호 4, 6 및 7의 염기서열인 것을 특징으로 하는 증가된 L-아미노산 생산능 및 수크로스 자화능을 갖는 대장균.
7. 제6항에 있어서, 수크로스 전사 조절자의 130번째 아미노산이 타이로신으로 치환된 것을 특징으로 하는 증가된 L-아미노산 생산능 및 수크로스 자화능을 갖는 대장균.
8. 제7항에 있어서, 수크로스 전사 조절자가 서열번호 17의 염기서열로 암호화된 것을 특징으로 하는 증가된 L-아미노산 생산능 및 수크로스 자화능을 갖는 대장균.
9. 제1항에 있어서, 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제, 수크로스 전사 조절자 및 만노키나아제를 암호화하는 염기서열을 모두 포함하는 벡터로 형질전환한 것을 특징으로 하는 증가된 L-아미노산 생산능 및 수크로스 자화능을 갖는 대장균.
10. 제9항에 있어서, 상기 벡터가 서열번호 18의 염기서열로 암호화된 것을 특징으로 하는 증가된 L-아미노산 생산능 및 수크로스 자화능을 갖는 대장균.
11. 삭제
12. 제1항에 있어서, 대장균이 대장균 CA03-0308 (수탁번호 KCCM10978P)인 것을 특징으로 하는 증가된 L-아미노산 생산능 및 수크로스 자화능을 갖는 대장균.
13. 제1항에 있어서, L-아미노산이 L-쓰레오닌, O-석시닐-호모세린, O-아세틸-호모세린, L-메티오닌, L-라이신, L-호모세린, L-이소루신, L-발린 및 L-트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 증가된 L-아미노산 생산능 및 수크로스 자화능을 갖는 대장균.
14. 제13항에 있어서, L-아미노산이 L-쓰레오닌, O-석시닐-호모세린, O-아세틸-호모세린 및 L-트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 증가된 L-아미노산 생산능 및 수크로스 자화능을 갖는 대장균.
15. 탄소원으로서 수크로스가 전체 또는 일부 포함된 배양 배지에 제1항 내지 제10항 및 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 증가된 L-아미노산 생산능 및 수크로스 자화능을 갖는 대장균을 접종하여 배양하는 단계; 및

    상기 단계에서 수득되는 배양물로부터 L-아미노산을 분리하는 단계를 포함하는 L-아미노산의 생산 방법.
16. 제15항에 있어서, L-아미노산이 L-쓰레오닌, O-석시닐-호모세린, O-아세틸-호모세린, L-메티오닌, L-라이신, L-호모세린, L-이소루신, L-발린 및 L-트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 L-아미노산의 생산 방법.

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