KR20240066510A - 호기 조건에서 카복시도써머스 하이드로게노포먼스 유래 가용성 일산화탄소 탈수소효소 대량생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 호기 조건에서 카복시도써머스 하이드로게노포먼스 (Carboxydothermus hydrogenoformans) 유래 가용성 일산화탄소 탈수소효소 대량생산 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 일산화탄소 탈수소효소 생산용 조성물 및 일산화탄소 탈수소효소 생산 방법은 기존의 절대 혐기 조건이 아닌 호기 조건 또는 미세 호기 조건 속에서 일산화탄소 탈수소효소, 호기 조건에서 작용 가능한 Suf 단백질 복합체 및 샤페론 단백질을 동시 발현함에 따라 가용성 일산화탄소 탈수소효소의 활성 및 생산량을 증대시킬 수 있다.
Description
본 발명은 호기 조건에서 카복시도써머스 하이드로게노포먼스 (Carboxydothermus hydrogenoformans) 유래 가용성 일산화탄소 탈수소효소 대량생산 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 카복시도써머스 하이드로게노포먼스 유래 재조합 일산화탄소 탈수소효소와 샤페론 단백질 또는 철-황 클러스터 단백질 복합체를 동시 발현함에 따라 혐기 조건이 아닌 호기 조건에서도 일산화탄소 탈수소효소 가용성 단백질 발현의 증가 및 발현된 단백질의 활성을 증대하는 방법에 관한 것이다.
일산화탄소는 무색, 무취의 유독성 가스로서 탄소성분이 불완전 연소 시 발생하고, 제철소 등 산업현장에서 대량으로 발생한다. 두통, 의식불명을 일으키는 등 인체에 유해한 기체로서 그 농도가 해마다 증가하고 있으며 특히 중국 일대에서 많은 양이 배출되고 있어 일산화탄소의 전환이 환경적인 관점에서 많은 관심을 모으고 있다.
현재 철강산업 FOG/LDG에서는 일산화탄소 (68%) 및 고농도 이산화탄소 (46.3%)를 포함하고 있으나 정제기술 부족에 따른 회수비용 과다로 저부가가치의 발전용으로 주로 사용되고 있으므로, 철강 부생가스내의 일산화탄소를 이용한 고부가가치화 연구가 필요하다.
기존의 일산화탄소 산화용 촉매는 고온의 반응온도를 필요로 하기 때문에 온도를 높이기 위한 전기설비 등의 복잡한 부대설비가 필요한 단점이 있다. 그러나 산소분자에 안정성을 가지고 있는 일산화탄소 탈수소효소를 이용하여 일산화탄소를 산화할 경우 저농도의 일산화탄소를 제거할 수 있으며, 별도의 부대장치 없이 간단하게 일산화탄소를 제거할 수 있다.
다만, 기존 연구 중 카복시도써머스 하이드로게노포먼스 (Carboxydothermus hydrogenoformans) 유래 재조합 일산화탄소 탈수소효소를 이용하여 일산화탄소를 제거하는 방법의 경우, 대장균 내에서 전체 단백질 발현량은 높으나 거의 대부분의 단백질이 봉입체를 형성해서 가용성 단백질의 발현량이 현저히 낮은 문제점이 존재하였다.
따라서, 일산화탄소를 이산화탄소로 산화시키는 카복시도써머스 하이드로게노포먼스 유래 재조합 단백질의 가용성 단백질의 생산량 및 활성을 증대시키기 위한 새로운 방법에 대한 요구가 증가되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 호기 조건에서 동시 발현되는 카복시도써머스 하이드로게노포먼스 (Carboxydothermus hydrogenoformans) 유래 재조합 일산화탄소 탈수소효소 및 샤페론 단백질 또는 철-황 클러스터 단백질 복합체 제조하였으며, 일산화탄소 탈수소효소가 기존의 혐기 조건이 아닌 호기 조건에서도 활성이 우수한 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 일산화탄소 탈수소효소 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 일산화탄소 탈수소효소 생산용 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 일산화탄소 탈수소효소 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 호기 조건에서 카복시도써머스 하이드로게노포먼스 (Carboxydothermus hydrogenoformans) 유래 가용성 일산화탄소 탈수소효소 대량생산 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 방법은 혐기 조건뿐만 아니라 호기 조건에서도 높은 발현량과 활성을 가진 일산화탄소 탈수소효소를 생산하는 것이 가능하다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 일산화탄소 탈수소효소 (carbon monoxide dehydrogenase)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1재조합 벡터; 및 샤페론 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2재조합 벡터; 를 포함하는, 일산화탄소 탈수소효소 생산용 조성물이다.
본 명세서 상의 용어“핵산”은 DNA 또는 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체도 포함할 수 있다.
본 명세서상의 용어 "벡터 (vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함할 수 있다.
재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 사용되는 벡터면 제한 없이 사용될 수 있다. 구체적으로, 벡터는 pAWP89, pBAD, pCES208, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등의 플라스미드, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등의 파지 또는 SV40 등의 바이러스 벡터를 이용하여 제작될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 일산화탄소 탈수소효소를 코딩하는 핵산 서열은 카복시도써머스 하이드로게노포먼스 (Carboxydothermus hydrogenoformans) 유래인 것일 수 있다. 본 발명에 있어서 일산화탄소 탈수소효소를 코딩하는 핵산 서열은 카복시도써머스 하이드로게노포먼스에서 유래한 일산화탄소 탈수소효소 유전자의 일부 또는 전체일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 일산화탄소 탈수소효소를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 서열번호 1으로 표시되는 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1의 염기서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "실질적인 동일성"은 각각의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 뉴클레오타이드 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 그 서열을 분석하여, 임의의 다른 뉴클레오타이드 서열이 각각의 뉴클레오타이드 서열과 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 90％ 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 샤페론 단백질은 tig 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 샤페론은 목적 단백질의 접힘에 관여하는 한 미생물 유래 및 구체적인 서열에 제한이 없으나, 구체적으로 원핵생물 (박테리아 등), 진핵생물 또는 고세균 (archaea) 유래 단백질일 수 있으며, 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank 등에서 그 서열을 얻을 수 있다. 구체적으로, 샤페론 단백질은 tig, DnaJ, Dnak, GroEL, GroES, HtpG, ClpA, ClpX, 또는 ClpP이나 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 샤페론은 Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, Hsp100 또는 Hsp104일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 샤페론 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 서열번호 7으로 표시되는 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 7의 염기서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 조성물은 철-황 클러스터 단백질 복합체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제 3재조합 벡터를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 조성물은 Suf 단백질 복합체인 철-황 클러스터 단백질 복합체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3재조합 벡터를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 철-황 클러스터 단백질 복합체로서 호기 조건에서 작용할 수 있는 Suf 단백질 복합체를 이용함에 따라, 숙주세포를 호기 조건에서 배양하여 일산화탄소 탈수소효소를 높은 활성도로 대량 생산하는 것이 가능하다. 구체적으로, 본 발명의 일 구현예에서, 조성물은 일산화탄소 탈수소효소를 코딩하는 핵산 서열, Suf 단백질 복합체를 코딩하는 핵산 서열 및 샤페론 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 각각 포함된 벡터를 통해 절대 혐기 조건에서 성장이 거의 이루어지지 않은 대장균 숙주세포 내에서 일산화탄소 탈수소효소를 샤페론 단백질 및 Suf 단백질 복합체를 동시 발현함에 따라 호기 조건 속에서 일산화탄소 탈수소효소를 높은 활성도로 대량 생산하는 것이 가능하다 (표 18 참조).
본 발명의 일 구현예에서, 철-황 클러스터 단백질 복합체를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 6의 염기서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 제3재조합 벡터는 T7 프로모터를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는, 일산화탄소 탈수소효소 (carbon monoxide dehydrogenase)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1재조합 벡터; 및 샤페론 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2재조합 벡터;가 도입된, 일산화탄소 탈수소효소 생산용 재조합 미생물이다.
본 명세서 상의 용어 "미생물"은 야생형 미생물이나, 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 약화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물을 모두 포함하는 개념이다. 본 출원에서 미생물은 일산화탄소 탈수소효소를 코딩하는 핵산 서열 및 샤페론 단백질을 코딩하는 핵산 서열서열이 도입되거나 포함되는 미생물이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 미생물은 숙주 세포를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 목적 단백질 유전자가 삽입된 발현벡터를 숙주 세포에 삽입함으로써 일산화탄소 탈수소효소의 생산능력 및 이의 활성이 향상된 형질전환체를 만들 수 있으며, 형질전환체는 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함하며, 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태 또는 이를 포함하는 벡터의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다.
본 발명에 있어서 일산화탄소 탈수소효소, 샤페론 단백질 및/또는 철-황 클러스터 단백질 복합체를 코딩하는 핵산 서열 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 미생물 (숙주 세포) 내로의 운반 (도입)은 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
형질전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 미생물은 대장균 BL21 균주인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 미생물은 철-황 클러스터 단백질 복합체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3재조합 벡터가 더 도입된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 철-황 클러스터 단백질 복합체는 Suf 단백질 복합체인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 미생물은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 및 서열번호 7로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 미생물은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드, 및 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 구체적으로 미생물은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 및/또는 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 및/또는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 포함할 수 있으며, 더욱 구체적으로 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 형질전환에 의해 미생물에 도입될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태는, 다음 단계를 포함하는 일산화탄소 탈수소효소 생산 방법이다:
일산화탄소 탈수소효소 (carbon monoxide dehydrogenase)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1재조합 벡터, 및 샤페론 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물을 배양하는 배양 단계;
배양된 재조합 미생물을 수확하여 일산화탄소 탈수소효소를 정제하는 정제 단계.
본 명세서 상의 용어 "배양"은 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 미생물은 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 또는 혐기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 배양 단계는 배지에 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 투여하는 투여 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 딜 구현예에서, 배양 단계는 재조합 미생물을 1 내지 20, 3 내지 17, 5 내지 15, 7 내지 13 또는 9 시간 동안 배양하는 것일 수 있고, 예를 들어, 9시간 배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 배양 단계는 상기 재조합 미생물을 호기 조건에서 배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 배양 단계는 상기 재조합 미생물을 미세 호기 조건에서 배양하는 것일 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "미세 호기 조건"은 산소가 제한적으로 공급되는 조건을 의미하는 것이며, 배지 중의 용존산소 (dissolved oxygen: DO) 농도가 액체 배지 중의 용존 산소에 대한 포화 (saturation)의 0% 보다 크고 약 10%이하로 유지되는 것을 의미한다. 미세호기 조건은 또한, 1% 미만의 산소를 가진 대기 (atmosphere)로 유지된 봉인된 챔버 (sealed chamber) 내에 액체 배지 중 또는 고체 아가 플레이트 상에서 세포를 성장시키거나 유지시키는 (resting) 것을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 배양 단계는 재조합 미생물을 헤드 스페이스 (빈공간)와 배양액의 비율이 2:8, 3:7, 4:6 또는 5:5, 예를 들어, 4:6이 되도록 배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 배양 단계는 1 mM, 1.3 mM, 1.5 mM, 1.7 mM, 1.9 mM 또는 2 mM 이상의 철 농도를 가진 배지에서 재조합 미생물을 배양하는 것일 수 있다.
본 발명은 호기 조건에서 카복시도써머스 하이드로게노포먼스 (Carboxydothermus hydrogenoformans) 유래 가용성 일산화탄소 탈수소효소 대량생산 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 일산화탄소 탈수소효소 생산용 조성물 및 일산화탄소 탈수소효소 생산 방법은 기존의 절대 혐기 조건이 아닌 호기 조건 또는 미세 호기 조건 속에서 일산화탄소 탈수소효소, 호기 조건에서 작용 가능한 Suf 단백질 복합체 및 샤페론 단백질을 동시 발현함에 따라 가용성 일산화탄소 탈수소효소의 활성 및 생산량을 증대시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 일산화탄소 탈수소효소 유전자를 포함하는 pET22b-chCODH II A559W 벡터의 벡터맵을 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 수득한 철-황 클러스터 복합체 (suf 복합체) 오페론의 PCR 결과를 전기영동을 통해 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 철-황 클러스터 복합체 유전자를 포함하는 pAWP89-T7-Suf 벡터의 벡터맵을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 호기 조건에서 배양한 균주의 활성을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 미세 호기 조건에서 배양한 균주의 활성을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 헤드 스페이스와 배양액의 비율에 따른 재조합 균주의 활성을 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 배양 시간에 따른 재조합 균주의 활성을 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 Suf 단백질 복합체 및 샤페론 단백질 공동발현에 따른 일산화탄소 탈수소효소의 활성을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 균주를 배양후 chCODH 내에 있는 철과 니켈의 양을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 배양 시 철 농도에 따른 일산화탄소 탈수소효소의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 수득한 철-황 클러스터 복합체 (suf 복합체) 오페론의 PCR 결과를 전기영동을 통해 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 철-황 클러스터 복합체 유전자를 포함하는 pAWP89-T7-Suf 벡터의 벡터맵을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 호기 조건에서 배양한 균주의 활성을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 미세 호기 조건에서 배양한 균주의 활성을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 헤드 스페이스와 배양액의 비율에 따른 재조합 균주의 활성을 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 배양 시간에 따른 재조합 균주의 활성을 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 Suf 단백질 복합체 및 샤페론 단백질 공동발현에 따른 일산화탄소 탈수소효소의 활성을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 균주를 배양후 chCODH 내에 있는 철과 니켈의 양을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 배양 시 철 농도에 따른 일산화탄소 탈수소효소의 활성을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 배양 방법 및 일산화탄소 탈수소효소 (chCODH) 활성 측정 방법
1-1. 배양 조건
재조합 대장균을 위한 배양 배지로는 하기 표 1의 조성을 갖춘 변형레틴 액체배지 (modified letheen broth; modified LB)를 사용하였다. 초기 배양온도는 37℃였으며, IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) 투여후에는 30℃로 배양하였다. 교반속도 (Agitation speed)는 초기 배양시 230 rpm, IPTG 투여후, 150 rpm이었다.
| Modified LB medium (1L) | |
| Yeast extract | 5g |
| Trypton | 10g |
| NaCl | 10g |
| Glucose | 18.7g |
| K2HPO4 | 12.3g |
| KH2PO4 | 2.2g |
| L-Cysteine | 0.61g |
| FeSO4 | 15.2mg |
| NiCl2 | 2.59mg |
1-2. 배양 방법
재조합 대장균 콜로니 (colony)는 LB (Km 50 ug/ml, Amp 100 ug/ml)에 접종 후 37℃, 230 rpm에서 밤새 배양되었다. 이후, 재조합 대장균은 400 ml modified LB + Km 50 ug/ml, Amp 100 ug/ml 배지에서 37℃, 230 rpm에서 OD600nm 0.5가 될때까지 배양되었다. 배양 후, NiCl 0.5 mM, FeSO4 1 mM, IPTG 0.025 mM 첨가하여 30 ℃, 150 rpm에서 18 시간 동안 배양하고, 세포를 수확하였다.
1-3. chCODH 단백질 정제 및 활성 측정
배양 후, 수확한 세포는 초음파 분산기를 이용해 파쇄되었으며, 효소 정제 과정을 거쳐 효소 활성을 확인하였다. 효소 활성 확인과정에서 Lysis 완충 용액, wash 완충 용액, Elution 완충용액 및 이미다졸 (Imidazole) 용액을 사용하였으며, 사용한 버퍼의 조성은 하기 표 2 내지 5에 나타내었다.
| Lysis 완충 용액 조성 | |
| 성분 | 농도 |
| KH2PO4 | 50 mM/L |
| NaCl | 300 mM/L |
| Imidazole | 10 mM/L |
| DTE | 2 mM/L |
| Resazurin | 2 uM/L |
| pH 8.0 | |
| Wash 완충 용액 조성 | |
| 성분 | 농도 |
| NaH2PO4 | 50 mM/L |
| NaCl | 300 mM/L |
| Imidazole | 20 mM/L |
| DTE | 2 mM/L |
| Resazurin | 2 uM/L |
| pH 8.0 | |
| Elution 완충 용액 조성 | |
| 성분 | 농도 |
| NaH2PO4 | 50 mM/L |
| NaCl | 300 mM/L |
| Imidazole | 250 mM/L |
| DTE | 2 mM/L |
| Resazurin | 2 uM/L |
| pH 8.0 | |
| 이미다졸 용액 조성 | |
| 성분 | 농도 |
| Imidazole | 200 mM/L |
| DTE | 2 mM/L |
| Resazurin | 2 uM/L |
| pH 8.0 | |
각 완충 용액들은 표 2 내지 5와 같은 조성으로 제작되었으며, 아르곤 가스를 최소 15분 이상 퍼징하여 멸균하였다. 멸균이 끝난 뒤, 액체가 투명한 색이 되었는지 확인한 후에 혐기 챔버에 넣어 사용하였다.
이어서, 배양하여 수확한 세포의 중량에 따라 Lysis 완충 용액 (세포 1 g당 20 mL)를 넣어 현탁 한 후, 초음파 분산기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄를 위한 초음파 분산기의 설정은 다음과 같다:
설정 시간: 15 분; 작동 시간: 2.0 초; 중지 시간: 2.0 초; 진폭: 20 %; 총 2회 반복함.
냉장 보관 중인 Ni-NTA agarose beads를 현탁하여 잘 섞어준 뒤, 컬럼에 2 mL 넣고, 혐기 챔버에 넣어주었으며, 이후 과정은 혐기 챔버에서 진행하였다. 200 mM의 이미다졸 (Imidazole) 20 mL를 컬럼에 부어 흘려준 후, 약 5 mL정도 남은 상태에서 1시간 이상 그대로 두어 beads 속 산소를 제거하였다. 남은 이미다졸 (Imidazole)을 흘려보낸 뒤, Wash 완충 용액 20 mL를 흘려 남아있는 이미다졸을 제거하였다. 컬럼 속 비드를 50 mL conical tube에 옮겨 담은 후, 파쇄하여 원심분리한 세포의 상층액과 함께 1시간동안 현탁하여 반응시켰다. 현탁액을 컬럼에 넣어 흘려준 뒤, Wash 완충 용액 20 mL를 흘려주었고, Elution 완충 용액 5 mL을 흘려 내려오는 효소를 새 코니칼 튜브 (conical tube)에 받아 혐기 챔버 안에 보관하였다. 이 때 Elution 완충 용액은 일산화탄소 가스를 850 cc/min의 유량으로 1시간 동안 가스 치환하여 사용하였다.
새로 정제한 효소는 Bradford assay를 통해 단백질의 농도를 측정하였다. 측정 방법은 다음과 같다. EP tube에 정제한 효소 또는 표준 단백질 10 ul와 BSA 용액 990 ul를 넣어 현탁한 후, 실온에서 10분 이상 반응시키고 흡광도 기기를 이용하여 OD595nm에서 표준 단백질과 정제한 효소의 수치를 측정하였으며, 이때 기울기 값을 구하여 총 단백질의 농도를 구하였다.
정제한 효소 chCODH는 산소에 노출되면 쉽게 활성을 잃는 특징이 있어, 활성 측정 또한 혐기 챔버에서 실시하였다. 큐벳에 20 mM의 EV (Ethyl Viologen Dibromide)와 50 mM HEPES 완충 용액 (2 mM DTE, pH 8.0)을 넣고 현탁하여 영점을 잡아주었다. 이 때, 50 mM HEPES 완충 용액은 일산화탄소 가스를 850 cc/min의 유량으로 2시간 동안 가스 치환하여 사용하였다. EV 또한 가스 치환된 50 mM HEPES 완충 용액으로 용해하여 사용하였다. 각 큐벳에 20 mM의 EV와 50 mM HEPES 완충 용액을 현탁하고, 정제한 chCODH 효소 0.2 ug을 넣어 현탁하면서 OD578nm에서 1분간 변화하는 값을 측정하여, 정제한 효소의 활성을 측정하였다.
실시예 2: chCODH 유전자 발현을 위한 벡터 클로닝
chCODH 유전자는 카복시도써머스 하이드로게노포먼스 (Carboxydothermus hydrogenoformans)의 일산화탄소 탈수소효소 (accession Number: WP_011343033)의 유전자 서열을 바탕으로 효소 활성 및 기질에 대한 특이성이 증가한 유전자 서열을 합성하였다. 합성한 chCODH 유전자 서열은 하기 표 6에 나타내었다.
| 서열번호 | 명칭 | 서열 (5'->3') | 비고 |
| 1 | chCODH_gene | ATGGCGAAACAAAATCTGAAGAGCACCGACCGTGCGGTTCAACAAATGCTGGATAAAGCGAAGCGTGAGGGTATTCAAACCGTGTGGGATCGTTACGAGGCGATGAAGCCGCAGTGCGGTTTCGGCGAAACCGGTCTGTGCTGCCGTCACTGCCTGCAAGGTCCGTGCCGTATTAACCCGTTTGGCGATGAGCCGAAAGTGGGCATTTGCGGTGCGACCGCGGAAGTGATCGTTGCGCGTGGTCTGGACCGTAGCATTGCGGCGGGTGCGGCGGGTCATAGCGGTCATGCGAAGCACCTGGCGCACACCCTGAAGAAAGCGGTGCAGGGCAAAGCGGCGAGCTATATGATTAAGGACCGTACCAAACTGCACAGCATCGCGAAGCGTCTGGGTATTCCGACCGAAGGCCAAAAAGACGAGGATATTGCGCTGGAAGTTGCGAAAGCGGCGCTGGCGGACTTCCATGAGAAAGATACCCCGGTTCTGTGGGTGACCACCGTTCTGCCGCCGAGCCGTGTGAAGGTTCTGAGCGCGCATGGTCTGATCCCGGCGGGTATTGATCACGAAATCGCGGAGATTATGCACCGTACCAGCATGGGTTGCGACGCGGATGCGCAGAACCTGCTGCTGGGTGGCCTGCGTTGCAGCCTGGCGGACCTGGCGGGTTGCTACATGGGCACCGACCTGGCGGATATCCTGTTTGGTACCCCGGCGCCGGTGGTTACCGAAAGCAACCTGGGCGTGCTGAAGGCGGATGCGGTGAACGTTGCGGTGCACGGTCACAACCCGGTTCTGAGCGACATCATTGTTAGCGTGAGCAAAGAGATGGAAAACGAGGCGCGTGCGGCGGGTGCGACCGGTATCAACGTGGTTGGTATTTGCTGCACCGGCAACGAGGTGCTGATGCGTCACGGTATTCCGGCGTGCACCCACAGCGTTAGCCAGGAAATGGCGATGATCACCGGCGCGCTGGACGCGATGATCCTGGATTATCAGTGCATTCAACCGAGCGTGGCGACCATTGCGGAGTGCACCGGTACCACCGTTATTACCACCATGGAAATGAGCAAAATCACCGGTGCGACCCATGTGAACTTTGCGGAGGAAGCGGCGGTTGAGAACGCGAAGCAAATCCTGCGTCTGGCGATTGATACCTTTAAACGTCGTAAGGGTAAACCGGTGGAGATCCCGAACATTAAGACCAAAGTGGTTGCGGGCTTCAGCACCGAAGCGATCATTAACGCGCTGAGCAAGCTGAACGCGAACGATCCGCTGAAACCGCTGATTGACAACGTGGTTAACGGTAACATCCGTGGCGTGTGCCTGTTCGCGGGTTGCAACAACGTTAAGGTGCCGCAGGACCAAAACTTTACCACCATTGCGCGTAAGCTGCTGAAACAGAACGTTCTGGTGGTTGCGACCGGTTGCGGTGCGGGTGCGCTGATGCGTCACGGTTTTATGGACCCGGCGAACGTGGATGAGCTGTGCGGCGACGGTCTGAAAGCGGTTCTGACCGCGATCGGTGAAGCGAACGGTCTGGGTGGCCCGCTGCCGCCGGTGCTGCACATGGGTAGCTGCGTTGACAACAGCCGTGCGGTGGCGCTGGTTGCGGCGCTGGCGAACCGTCTGGGCGTTGACCTGGATCGTCTGCCGGTGGTTGCGAGCGCGGCGGAATGGATGCATGAGAAGGCGGTGGCGATTGGTACCTGGGCGGTTACCATCGGTCTGCCGACCCACATTGGTGTGCTGCCGCCGATCACCGGCAGCCTGCCGGTGACCCAAATCCTGACCAGCAGCGTTAAAGATATTACCGGTGGCTACTTCATCGTTGAACTGGACCCGGAGACCGCGGCGGACAAACTGCTGGCGGCGATCAATGAGCGTCGTGCGGGTCTGGGTCTGCCGTGGTGA |
대장균에서 해당 단백질 발현을 위하여 pET22b 벡터에 클로닝을 진행하였다. chCODH 유전자를 pET22b에 클로닝하기 위하여 합성된 chCODH를 주형으로 PCR을 진행하였다. chCODH 수득을 위한 프라이머 서열은 하기 표 7에 나타내었다. PCR을 통해 수득한 chCODH를 제한효소 (NdeI, BamHI) 처리하여 chCODH에 삽입하였고, 클로닝된 벡터는 시퀀싱을 통해 확인하였다.
| 서열번호 | 명칭 | 서열 (5'->3') | 비고 |
| 2 | chCODH F | TACATATGGCGAAACAAAATCTGAAGAGCA | |
| 3 | chCODH R | TTCGGATCCCACCACGGCAGACCCAGACCC |
실시예 3: Suf 복합체 동시발현에 따른 chCODH 발현률 및 효소활성
3-1. 철-황 클러스터 공급을 위한 Suf 복합체 벡터 클로닝
Suf (Iron-sulfur cluster) 시스템을 복제 개수가 높은 플라스미드 구축하여, chCODH의 생산성과 활성을 증가시키고자, 유전자 재조합 실험을 시행하였다. Suf는 E.coli K12 균주에 하나의 오페론으로 존재하며, sufA-sufB-sufC-sufD-sufS-sufE로 구성된다. 이에, 오페론을 수득하기 위해 E.coli K12 균주로부터 PCR를 통해 오페론을 수득하였다. Suf 오페론 수득을 위한 프라이머 서열은 하기 표 8에 나타내었다. PCR을 통해 수득한 Suf 오페론은 전기영동을 통해 확인하였고, 전기영동 결과를 도 2에 나타내었다.
| 서열번호 | 명칭 | 서열 (5'->3') | 비고 |
| 4 | Suf operon F | GAGAGACAGCGAATTCATGGACATGCATTCAGGAACC | |
| 5 | Suf operon R | AGCTCCGGAAGCTTCTGCAGTTAGCTAAGTGCAGCGGC |
PCR을 통해 수득한 Suf 오페론은 복제 개수가 비교적 높은 pAWP89 vector에 유전자 삽입을 진행하였다. 유전자 삽입 시, 오페론의 발현율을 높이고자 T7 프로모터를 이용하여 형질 전환하였다. 이때, PCR을 통해 획득한 Suf 복합체의 유전자 서열은 하기 표 9에 나타내었고, 사용한 벡터맵은 도 3에 나타내었다.
형질 전환의 여부를 확인하고자, 각 균주에서 플라스미드를 재추출하여 벡터와 오페론 모두에 해당되는 제한효소를 이용하여 확인하였다.
3-2. Suf system 동시 발현에 따른 chCODH 발현량과 효소활성 비교
Suf 단백질 복합체 발현에 따른 chCODH 발현량과 효소활성을 Suf 단백질이 삽입되지 않은 대조군 및 Suf 단백질 복합체로 형질전환된 균주와 아무 변인통제 없이 순수하게 호기조건에서 배양하여 비교하였다. 효소 정제, 활성 측정은 상기 실시예와 동일하게 수행하였으며 그 결과를 표 10 및 도 4에 나타내었다.
| 균주 | BL21(pET22b-ChCODH II A559W) | BL21 (pET22b-ChCODH II A559W, pAWP89-T7-ISC) | BL21 (pET22b-ChCODH II A559W, pAWP89-T7-Suf) |
| OD600nm | 8.39 | 9.89 | 10.01 |
| 획득한 chCODH 농도(mg/L) | 4.38 | 10.38 | 9.38 |
| 고유 활성도(unit/mg chCODH) | 1.8 | 23.2 | 56.1 |
| 총활성 (unit/L) |
7.88 | 240.7 | 526.2 |
실험결과, 호기 조건에서 실험을 한 결과, 철-황 클러스터를 합성하는 유전자인 ISC 혹은 Suf를 공동발현했을 때, chCODH만 단독 발현했을 때보다 chCODH의 고유활성 및 가용성 chCODH의 농도가 증가하였고, 특히 Suf system을 동시발현 시켰을 때에 고유활성도가 가장 높음을 알 수 있었다.
3-3. 미세 호기조건에서 chCODH 생산 조건 최적화
3.3.1. 미세 호기조건에서 chCODH 생산 및 활성
균주는 대장균 BL21 (pET21-chCODH, pAWP89), BL21 (pET21-chCODH, pAWP89-T7-Suf)를 사용하였다. 절대호기 조건에서는 Suf 시스템을 공동 발현 시 chCODH의 단백질은 생산되지만 활성이 낮아 졌으므로, 이를 보완하기 위하여 대장균의 성장과 해당 효소의 활성을 높게 유지할 수 있는 미세호기조건에서 배양을 진행하였다. 미세호기조건을 뚜껑이 있는 1 L 플라스크에 배양액 400 mL를 첨가하여 균주를 접종 후 뚜껑을 완전히 밀폐하여 배양액 및 플라스크 내에 존재하는 산소만을 사용하여 성장할 수 있도록 배양을 진행하였다. 실험 및 효소 정제, 활성 측정 방법은 상기 실시예 1과 동일하며, 실험 결과는 하기 표 11 및 도 5에 나타내었다.
| 균주 | BL21(pET22b-ChCODH II A559W) | BL21 (pET22b-ChCODH II A559W, pAWP89-T7-Suf) |
| OD600nm | 9.49 | 8.87 |
| 획득한 chCODH 농도(mg/L) | 10.95 | 19.05 |
| 고유 활성도(unit/mg chCODH) | 155 | 1532 |
| 총 활성 (unit/L) |
1697 | 29185 |
실험결과, 표 11및 도 5에서 확인할 수 있듯이, 미세 호기조건에서는 절대 호기조건에과 비교하여 chCODH 단독 발현과 Suf 시스템 동시발현 모두에서 chCODH 농도가 2배 이상 증가하였고, 고유 활성도 또한 증가하였다. 특히 Suf 시스템을 동시발현 시 대조군 (chCODH 단독발현)보다 10배 높은 고유활성도를 얻었고 (155 vs. 1532 U/ mg chCODH), chCODH의 농도도 2배 이상 높았다. 따라서 최종적으로 총 활성이 대조군 대비 17.2배 증가하는 결과를 얻었다 (1697 vs. 29185 U/L). 이러한 결과는 미세 호기조건에서 Suf 시스템을 동시 발현하면 chCODH의 농도뿐 아니라 고유 활성도도 증가한다는 것을 나타낸다.
3.3.2. 헤드 스페이스 (headspace)와 배양액의 비율에 따른 chCODH 생산 및 활성
대장균 BL21 (pET21-chCODH, pAWP89-T7-Suf)을 이용하여, 배양액과 헤드 스페이스 (headspace, 배양액이 없는 공간) 비율에 따른 chCODH의 활성을 비교하였다. 최초 headspace와 배양액의 비율 6 : 4에서 실험을 진행하였고, 추후 실험의 조건으로 4 : 6 / 6 : 4 / 8 : 2 / 9 : 1로 설정하여 배양 실험을 진행하였다. 실험 및 효소 정제, 활성 측정 방법은 상기 실시예 1과 동일하며, 실험 결과는 하기 표 12 및 도 6에 나타내었다.
| headspace : 배양액 | 4 : 6 | 6 : 4 | 8 : 2 | 9 : 1 |
| OD600nm | 8.68 | 8.12 | 15.64 | 19.52 |
| 획득한 chCODH 농도(mg/L) | 17.4 | 16.9 | 22.0 | 41.0 |
| 고유 활성도(unit/mg chCODH) | 3192 | 1457 | 1184 | 0 |
| 총 활성 (unit/L) |
55434 | 24618 | 26048 | 0 |
실험 결과, 표 12 및 도 6에 나타낸 것과 같이, 헤드 스페이스 비율이 증가할수록 세포의 성장과 chCODH의 생산량이 증가하지만 chCODH의 고유 활성도는 감소하는 경향성을 확인하였다. 특히, 헤드 스페이스: 배양액의 비율이 4 : 6 일 때 기존 실험 조건과 chCODH의 생산량이 유사함에도 불구하고 고유 활성도가 2.19배 증가하여 총 활성이 2.25배 높음을 확인하였다. 따라서 이후 실험에서는 헤드 스페이스: 배양액 비율을 4 : 6으로 조정한 미세 호기조건에서 실험을 진행하였다.
3.3.3. 배양 시간에 따른 chCODH 생산 및 활성
대장균 BL21 (pET21-chCODH, pAWP89-T7-Suf)을 이용하여, 시간에 따른 chCODH 생산량과 고유 활성도를 측정하여 최적화된 배양 조건을 탐색하였다. 실험 및 효소 정제, 활성 측정 방법은 상기 실험 방법과 동일하며, 세포 수확 시간은 IPTG 인덕션 후 3 / 6 / 9 / 12 / 18시간으로 설정하여 배양 실험을 진행하였고, 상기 실시예 1과 동일한 실험을 진행하여 그 결과를 표 13 및 도 7에 나타내었다.
|
배양 시간
(IPTG 인덕션 후) |
3 | 6 | 9 | 12 | 18 |
| OD600nm | 2.36 | 4.06 | 4.95 | 5.62 | 5.13 |
| 획득한 chCODH 농도(mg/L) | 7.1 | 15.1 | 17.9 | 13.7 | 15.7 |
| 고유 활성도(unit/mg chCODH) | 1055 | 1721 | 2173 | 1557 | 1575 |
| 총 활성 (unit/L) |
7491 | 25992 | 38819 | 21283 | 24785 |
실험 결과, 표 13 및 도 8에 나타낸 것과 같이, 배양 시간에 따른 chCODH의 생산량과 활성을 비교해본 결과, chCODH의 생산량과 고유 활성도가 IPTG 인덕션 후 9시간까지 증가하다가 그 이후 감소하는 경향을 보여, 총 활성도 IPTG 인덕션 후 9시간에서 가장 높게 나타났다. 따라서 이후 실험에서는 IPTG 인덕션 후 9시간 동안 세포를 배양 후 세포를 수확하는 것으로 배양 조건을 최적화하였다.
실시예 4: 샤페론 단백질 동시발현에 따른 chCODH 발현률 및 효소활성
4-1. 샤페론 단백질 동시 발현을 위한 균주 구축 및 chCODH 생산 및 활성 비교
chCODH 발현에 효과적인 샤페론 단백질을 찾고자, Takara Bio.로부터 구입한 Chaperone Plasmid Set의 모든 plasmid를 Heat-shock transformation 방법으로 균주 내 동시 발현하였다. 사용한 Chaperone Plasmid Set는 하기 표 14에, pTf16의 서열은 하기 표 15에 나타내었다.
| 플라스미드 | 샤페론 |
| pGro7 | groES-groEL |
| pTf16 | tig |
| pG-KJE8 | dnaK-dnaJ-grpE groES-groEL |
| 서열번호 | 명칭 | 서열 (5'->3') | 비고 |
| 7 | Chaperone_pTf16 gene | ATGCAAGTTTCAGTTGAAACCACTCAAGGCCTTGGCCGCCGTGTAACGATTACTATCGCTGCTGACAGCATCGAGACCGCTGTTAAAAGCGAGCTGGTCAACGTTGCGAAAAAAGTACGTATTGACGGCTTCCGCAAAGGCAAAGTGCCAATGAATATCGTTGCTCAGCGTTATGGCGCGTCTGTACGCCAGGACGTTCTGGGTGACCTGATGAGCCGTAACTTCATTGACGCCATCATTAAAGAAAAAATCAATCCGGCTGGCGCACCGACTTATGTTCCGGGCGAATACAAGCTGGGTGAAGACTTCACTTACTCTGTAGAGTTTGAAGTTTATCCGGAAGTTGAACTGCAGGGTCTGGAAGCGATCGAAGTTGAAAAACCGATCGTTGAAGTGACCGACGCTGACGTTGACGGCATGCTGGATACTCTGCGTAAACAGCAGGCGACCTGGAAAGAAAAAGACGGCGCTGTTGAAGCAGAAGACCGCGTAACCATCGACTTCACCGGTTCTGTAGACGGCGAAGAGTTCGAAGGCGGTAAAGCGTCTGATTTCGTACTGGCGATGGGCCAGGGTCGTATGATCCCGGGCTTTGAAGACGGTATCAAAGGCCACAAAGCTGGCGAAGAGTTCACCATCGACGTGACCTTCCCGGAAGAATACCACGCAGAAAACCTGAAAGGTAAAGCAGCGAAATTCGCTATCAACCTGAAGAAAGTTGAAGAGCGTGAACTGCCGGAACTGACTGCAGAATTCATCAAACGTTTCGGCGTTGAAGATGGTTCCGTAGAAGGTCTGCGCGCTGAAGTGCGTAAAAACATGGAGCGCGAGCTGAAGAGCGCCATCCGTAACCGCGTTAAGTCTCAGGCGATCGAAGGTCTGGTAAAAGCTAACGACATCGACGTACCGGCTGCGCTGATCGACAGCGAAATCGACGTTCTGCGTCGCCAGGCTGCACAGCGTTTCGGTGGCAACGAAAAACAAGCTCTGGAACTGCCGCGCGAACTGTTCGAAGAACAGGCTAAACGCCGCGTAGTTGTTGGCCTGCTGCTGGGCGAAGTTATCCGCACCAACGAGCTGAAAGCTGACGAAGAGCGCGTGAAAGGCCTGATCGAAGAGATGGCTTCTGCGTACGAAGATCCGAAAGAAGTTATCGAGTTCTACAGCAAAAACAAAGAACTGATGGACAACATGCGCAATGTTGCTCTGGAAGAACAGGCTGTTGAAGCTGTACTGGCGAAAGCGAAAGTGACTGAAAAAGAAACCACTTTCAACGAGCTGATGAACCAGCAGGCGTA |
샤페론 단백질 발현을 위해 L-arabinose를 4 mg/ml 투입하여 샤페론 단백질을 발현을 유도하였으며, 전체적인 효소 정제 및 활성 측정 방법은 상기 실시예와 동일하게 진행하였다. 또한, 균주로는 대장균 BL21 (pET21-chCODH, pAWP89-T7-Suf), BL21 (pET21-chCODH, pAWP89-T7-Suf, pGro7), BL21 (pET21-chCODH, pAWP89-T7-Suf, pTf16), BL21 (pET21-chCODH, pAWP89-T7-Suf, pG-KJE8)를 이용하였으며, 그 결과를 표 16 및 도 8에 나타내었다.
| 균주 | BL21 (pET22b-ChCODH II A559W, pAWP89-T7-Suf) | BL21 (pET22b-ChCODH II A559W, pAWP89-T7-Suf, pGro7) | BL21 (pET22b-ChCODH II A559W, pAWP89-T7-Suf, pTf16) | BL21 (pET22b-ChCODH II A559W, pAWP89-T7-Suf, pG-KJE8) |
| OD600nm | 5.9 | 3.7 | 5.4 | 4.5 |
| 획득한 chCODH 농도(mg/L) | 13.8 | 29.8 | 29.4 | 29.5 |
| 고유 활성도(unit/mg chCODH) | 2808 | 1351 | 2300 | 1063 |
| 총 활성(unit/L) | 38657 | 40215 | 67620 | 31415 |
실험결과, 샤페론 단백질을 공동 발현했을 때, 샤페론 단백질 종류에 상관없이 모든 실험군에서 chCODH의 생산량이 대조군 대비 2배 이상 증가하였으나, chCODH의 고유 활성도가 감소하는 경향을 보였다. 샤페론 단백질을 공동 발현한 균주 중, pTf16을 동시 발현한 균주는 대조군 대비 chCODH 생산량은 2.1배 증가하고, 고유 활성도는 0.8배 감소하여 총 활성이 대조군 대비 1.7배 증가하는 결과를 얻었다. 따라서 총 활성이 가장 높은 BL21 (pET21-chCODH, pAWP89-T7-Suf, pTf16) 균주를 이용하여 이후 실험을 진행하였다.
4-2. 철 농도에 따른 chCODH의 발현량 비교
대장균 BL21 (pET21-chCODH, pAWP89-T7-Suf), BL21 (pET21-chCODH, pAWP89-T7-Suf, pTf16)를 이용하여 하기 실험을 진행하였다. 샤페론 단백질을 공동발현했을 때, 대조군보다 고유 활성도가 낮아지는 경향을 보였는데, 이는 샤페론 단백질 공동 발현 시 chCODH의 생산량이 폭발적으로 증가하여 chCODH 내에서 보조인자 역할을 하는 철과 니켈의 양이 부족하지 않을까 추측하였다. 따라서 유도결합플라스마질량분석법을 통해 각각의 균주를 배양 후 chCODH 내에 있는 철과 니켈의 양을 측정해보았고, 이를 도 9에 나타내었다.
실험 결과, 도 9를 참조하면, 샤페론 단백질이 공동 발현되었을 때 대조군 대비 chCODH 내의 니켈의 수는 크게 차이가 없었으나, 철의 양은 감소한 것을 확인하였다. 따라서 샤페론 단백질을 공동 발현했을 때 chCODH의 활성이 감소한 것은 chCODH 내 철이 부족하기 때문이라는 것을 알 수 있었다. 따라서 BL21 (pET21-chCODH, pAWP89-T7-Suf, pTf16) 균주를 이용하여 철의 첨가량에 따른 chCODH 생산과 활성을 비교하였다. 균주의 배양은 현재까지 선정된 최적의 조건에서 진행 후 효소 정제, 활성 측정을 실시하였고, 그 결과를 표 17 및 도 10에 나타내었다.
| 균주 | BL21 (pET22b-ChCODH II A559W, pAWP89-T7-Suf) | BL21 (pET22b-ChCODH II A559W, pAWP89-T7-Suf, pTf16) | ||
| FeSO 4 | 1 mM | 1 mM | 2 mM | 3 mM |
| OD600nm | 7.75 | 4.71 | 5.16 | 5.51 |
| 획득한 chCODH 농도(mg/L) | 11.8 | 31.6 | 38.9 | 31.9 |
| 고유 활성도(unit/mg chCODH) | 2819 | 2221 | 2515 | 2857 |
| 총 활성(unit/L) | 33264 | 70248 | 97761 | 91129 |
실험 결과, 표 16 및 도 10에 나타난 것과 같이, 샤페론 단백질을 동시 발현 시 철을 기존 첨가량보다 2배 증가시켰을 때 chCODH의 생산량은 약 1.2배 증가하였고, 고유 활성도는 1.1배 증가하여 총 활성이 대조군 대비 2.9배 증가한 97761 U/L를 달성하였다.
실시예 5: 소결
상기 실시예에 따른 실험 조건을 종합한 결과, 표 18에 나타낸 것과 같이 미세 호기조건에서 Suf 단백질 복합체를 chCODH와 함께 발현한 경우 chCODH 단독 발현 시 보다 chCODH의 생산량은 약 1.7배 증가하였고, 고유 활성도는 약 9.9배 증가하여 총 활성은 약 17.2배 증가하였다. 그리고 배양조건을 최적화하여 기존배양 조건에서보다 총 활성이 1.3배 증가하였다. 여기서 더 나아가 샤페론 단백질을 동시 발현시키고 철을 기존 첨가량보다 2배 증가시켜 chCODH의 생산량은 약 2.2배 증가하였고, 고유 활성도는 1.2배 증가하여 총 활성은 2.5배 증가한 97761 U/L를 달성하였다.
| 균주 | BL21(pET22b-ChCODH II A559W) | BL21 (pET22b-ChCODH II A559W, pAWP89-T7-Suf) | BL21 (pET22b-ChCODH II A559W, pAWP89-T7-Suf, pTf16) | |
| 배양조건 |
미세 호기조건
|
미세 호기조건
|
미세 호기조건
배양조건 최적화 |
미세 호기조건 배양조건 최적화 (FeSO 4 2 mM) |
| OD600nm | 9.49 | 8.87 | 4.95 | 5.16 |
| 획득한 chCODH 농도 (mg/L) | 11.0 | 19.1 | 17.9 | 38.9 |
| 고유 활성도(unit/mg chCODH) | 155 | 1532 | 2173 | 2515 |
| 총 활성(unit/L) | 1697 | 29185 | 38819 | 97761 |
따라서, 본 발명은 chCODH의 한계점인 절대혐기 조건에서 배양 시에만 활성을 띄는 문제를 극복하였으며 미세 호기조건에서 chCODH의 가용성 단백질 발현 증가를 위하여 Suf 단백질 복합체 과발현이 필요하며 샤페론 단백질 공동발현을 추가하면 chCODH의 생산량이 폭발적으로 증가하는 결과를 얻었다.
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Claims (16)
- 일산화탄소 탈수소효소 (carbon monoxide dehydrogenase)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1재조합 벡터; 및
샤페론 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2재조합 벡터;
를 포함하는, 일산화탄소 탈수소효소 생산용 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 일산화탄소 탈수소효소를 코딩하는 핵산 서열은 카복시도써머스 하이드로게노포먼스 (Carboxydothermus hydrogenoformans) 유래인 것인, 일산화탄소 탈수소효소 생산용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 일산화탄소 탈수소효소를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 일산화탄소 탈수소효소 생산용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 샤페론 단백질은 tig 서열을 포함하는 것인, 일산화탄소 탈수소효소 생산용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 샤페론 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 일산화탄소 탈수소효소 생산용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 철-황 클러스터 단백질 복합체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3재조합 벡터를 더 포함하는 것인, 일산화탄소 탈수소효소 생산용 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 철-황 클러스터 단백질 복합체를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 일산화탄소 탈수소효소 생산용 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 제3재조합 벡터는 T7 프로모터를 포함하는 것인, 탈수소효소 생산용 조성물.
- 일산화탄소 탈수소효소 (carbon monoxide dehydrogenase)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1재조합 벡터; 및
샤페론 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2재조합 벡터;
가 도입된, 일산화탄소 탈수소효소 생산용 재조합 미생물. - 제9항에 있어서, 상기 미생물은 대장균 BL21 균주인 것인, 일산화탄소 탈수소효소 생산용 재조합 미생물.
- 제9항에 있어서, 상기 미생물은 철-황 클러스터 단백질 복합체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3재조합 벡터가 더 도입된 것인, 일산화탄소 탈수소효소 생산용 재조합 미생물.
- 다음 단계를 포함하는 일산화탄소 탈수소효소 생산 방법:
일산화탄소 탈수소효소 (carbon monoxide dehydrogenase)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1재조합 벡터, 및 샤페론 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물을 배양하는 배양 단계;
배양된 재조합 미생물을 수확하여 일산화탄소 탈수소효소를 정제하는 정제 단계. - 제12항에 있어서, 상기 배양 단계는 상기 재조합 미생물을 미세 호기 조건에서 배양하는 것인, 일산화탄소 탈수소효소 생산 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 배양 단계는 2 mM 이상의 철 농도를 가진 배지에서 상기 재조합 미생물을 배양하는 것인, 일산화탄소 탈수소효소 생산 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 배양 단계는 상기 재조합 미생물을 헤드 스페이스와 배양액의 비율이 4:6이 되도록 배양하는 것인, 일산화탄소 탈수소효소 생산 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 배양 단계는 배지에 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 투여하는 투여 단계를 포함하고,
상기 배양 단계는 상기 재조합 미생물을 9시간 동안 배양하는 것인, 일산화탄소 탈수소효소 생산 방법.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240066510A true KR20240066510A (ko) | 2024-05-16 |
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