ES2635312T3 - Microorganismo para producir L-aminoácidos y método para producir L-aminoácidos utilizando el mismo - Google Patents

Microorganismo para producir L-aminoácidos y método para producir L-aminoácidos utilizando el mismo Download PDF

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Abstract

Un microorganismo que pertenece al género Escherichia con productividad de L-aminoácidos y capacidad de asimilar sacarosa mejoradas, que tiene las actividades de sacarosa permeasa, sacarosa hidrolasa y regulador transcripcional de sacarosa y tiene una actividad manoquinasa potenciada en comparación con un microorganismo que no asimila sacarosa que pertenece al género Escherichia.

Description

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El polinucleótido obtenido y pAcscBKAR se trataron con las enzimas de restricción EcoRVy EagI, respectivamente y se conectaron entre sí para construir un plásmido pAcscBAR. La cepa DH5 de E. coli se transformó con el vector y entre las colonias que estaban en medio LB, a través de PCR, se seleccionaron las que contenían pAcscBAR, para obtener un plásmido pAcscBAR. Se analizó la secuencia de bases (SEQ ID NO. 12) de cscBAR ligado a los sitios de
5 restricción XbaI y EagI del plásmido pAcscBAR obtenido y no se encontró ninguna mutación.
Posteriormente, para amplificar el polinucleótido que contenía el gen mak, se realizó la PCR utilizando, como molde, el ADN genómico de E. coli W3110 y un par de cebadores de SEQ ID NO. 13 y 14 de la misma manera que la indicada en el Ejemplo 1. Se obtuvo un polinucleótido de 1388 pb y el producto de la PCR se clonó en los sitios de
10 restricción PstI y EagI de pAcscBAR para construir pAcscBAR-mak.
SEQ ID NO. 13: 5’-CACTGCAGTGGGGTAAATGCCATCG-3’
SEQ ID NO. 14: 5’-AACGGCCGTCTCGGTGCTCATTACT-3’
15 La cepa DH5 de E. coli se transformó con pAcscBAR y entre las colonias que estaban en medio LB, a través de PCR, se seleccionaron las que contenían pAcscBAR-mak por PCR, para obtener un plásmido pAcscBAR-mak. Se analizó la secuencia de bases (SEQ ID NO. 16) de pAcscBAR-mak ligado a los sitios de restricción XbaI y EagI del plásmido pAcscBAR-mak obtenido, y no se encontró ninguna mutación.
20 Ejemplo 6. Introducción de pAcscBAR-mak en una cepa productora de treonina
Para confirmar si E. coli productora de treonina crecía en sacarosa y producía de forma eficaz treonina por transformación de pAcscBAR-mak, se transformó una cepa productora de treonina ABA5G (KFCC 10718) con el plásmido. A partir de las colonias obtenidas por PCR, se seleccionaron colonias que tenían el plásmido que contenía
25 el gen relacionado con la asimilación de sacarosa. Las colonias seleccionadas se incubaron en medio LB sólido en una incubadora a 33 ºC durante una noche. En 25 ml de un medio de titulación que contenía sacarosa como se indica en la Tabla 1, se inoculó un asa de la cepa y después se cultivó en una incubadora a 33 ºC a 200 rpm durante 36 horas. Posteriormente, se midió el valor de DO y el consumo de azúcar del medio de cultivo y los resultados se muestran en la Tabla 3.
30 Tabla 3
Cepa parental
DO Consumo de azúcar (g/l) L-treonina (g/l)
pAcscBKAR
9,2 18,7 6,0
pAcscBAR-mak
10,8 27,7 9,7
Como se muestra en la Tabla 3, cuando la cepa ABA5G, que contenía pAcscBKAR, se cultivó durante 30 horas, utilizaba 18,7 g/l de sacarosa y producía 6,0 g/l de L-treonina, pero la cepa ABA5G, que contenía pAcscBAR-mak,
35 utilizaba 27,7 g/l de sacarosa y producía 9,7 g/l de L-treonina. Es decir, la tasa de consumo de sacarosa de la cepa ABA5G que contenía pAcscBAR-mak era aproximadamente 1,5 veces mayor que la de la cepa ABA5G que contenía pAcscBKAR, y la productividad de treonina de la cepa ABA5G que contenía pAcscBAR-mak aumentó a 3,7 g/l más que la de la cepa ABA5G que contenía pAcscBKAR.
40 Ejemplo 7. Aumento de la actividad de Mak por introducción de cscBAR-mak
Para confirmar un aumento o una mejora en la actividad manoquinasa de la cepa ABA5G que contiene pAcscBARmak en comparación con la cepa parental ABA5G, se midió la actividad fructoquinasa (Copeland L et al., Plant Physiol. (1978) 62: 291-294). Esta medición de la actividad fructoquinasa es un método para medir la actividad 45 fructoquinasa de manoquinasa a través de una reacción de acoplamiento utilizando manoquinasa, fosfoglucosa isomerasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y utilizando fructosa como sustrato inicial. El sobrenadante se obtuvo sometiendo a ultrasonido y centrifugación las cepas ABA5G que contenían tanto pAcscBAR como pAcscBAR-mak cultivadas en medio LB durante 24 horas, y se usó como un líquido enzimático. La concentración proteica se determinó mediante el ensayo Bradford. La reacción enzimática se mantuvo durante 30 min y se midió el cambio de
50 absorbancia a una DO 340 nm para medir el NADPH producido por la reacción de acoplamiento. La actividad se calculó utilizando el coeficiente de absorción de NADPH de 6,22 cm-1 mM-1. 1 unidad de manoquinasa se define como una cantidad de enzima que cataliza 1 mg de proteína total por 1 min para producir NADPH 1 nM por la medición de actividad enzimática anterior. El resultado se muestra en la Tabla 4.
55 Tabla 4
Cepa parental ABA5G
Unidades (nM/mg/min)
pAcscBAR
0,3
pAcscBAR-mak
3,7
8
imagen7
Tabla 6
Cepa parental CJM-11A
DO Consumo de azúcar (g/l) O-succinil-homoserina (g/l)
pAcscBKAR
6,8 30,2 12,3
pAcscBAR-mak
6,8 44,8 18,2
pAcscBAR’-mak
7,5 50,4 20,5
Como se muestra en la Tabla 6, cuando las cepas se cultivaron durante 48 horas, la cepa parental CJM-11A que
5 contenía pAcscBKAR utilizaba 30,2 g/l de sacarosa y producía 12,4 g/l de O-succinil-homoserina, pero la cepa CJM11A que contenía pAcscBAR’-mak utilizaba 50,4 g/l de sacarosa y producía 20,5 g/l de O-succinil-homoserina, lo que indicaba que la tasa de utilización de sacarosa y la productividad de O-succinil-homoserina aumentaba aproximadamente 1,7 veces y 8,2 g/l más que las de la cepa CJM-11A que contenía pAcscBKAR, respectivamente. Es decir, se descubrió que la cepa recombinante que contenía cscBAR’-mak mostraba una mejor utilización de
10 sacarosa y mejor productividad de O-succinil-homoserina.
Ejemplo 11. Mejora de la productividad de O-acetil-homoserina por introducción de pAcscBAR’-mak
La cepa productora de O-acetil-homoserina, CJM-X (KCCM 10921P) desvelada en la Patente de Estados Unidos N.º
15 2008/0253186 se transformó con pAcscBAR’-mak construido en el Ejemplo 8 y se expandió en una placa de agar MacConkey que contenía una concentración baja de sacarosa al 0,1 %, seguido de cultivo a 37 ºC durante un día. De las colonias, se seleccionaron las que tenían un color púrpura intenso.
El transformante seleccionado se cultivó en medio sólido LB y en una incubadora a 33 ºC durante una noche. En 25
20 ml de un medio de titulación como se indica en la Tabla 1, se inoculó un asa de la cepa y después se cultivó en una incubadora a 33 ºC a 200 rpm. Los resultados se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7
Cepa parental CJM-X
DO Consumo de azúcar (g/l) O-acetil-homoserina (g/l)
pAcscBKAR
13,5 29,9 10,7
pAcscBAR-mak
12,3 42,9 15,4
pAcscBAR’-mak
13,6 53,5 19,5
25 Como se muestra en la Tabla 7, cuando las cepas se cultivaron durante 48 horas, la cepa parental, CJM-X que contenía pAcscBKAR utilizaba 29,9 g/l de sacarosa y producía 10,7 g/l de O-acetil-homoserina (en lo sucesivo en el presente documento denominada OAH), pero la cepa CJM-X que contenía pAcscBAR’-mak utilizaba 53,5 g/l de sacarosa y producía 15,4 g/l de OAH, lo que indicaba que la tasa de utilización de sacarosa y la productividad de OAH aumentaba aproximadamente 1,8 veces y 8,8 g/l más que las de la cepa CJM-X que contenía pAcscBKAR,
30 respectivamente. Es decir, se descubrió que la cepa recombinante que contenía cscBAR’-mak mostraba una mejor utilización de sacarosa y productividad de OAH.
Ejemplo 12. Mejora de la productividad de L-triptófano por introducción de pAcscBAR’-mak
35 La cepa productora de L-triptófano, CJ285 (KCCM-10534, depositada en el Korean Culture Center of Microorganisms el 28 de noviembre de 2003) se transformó con pAcscBAR’-mak construido en el Ejemplo 8 y se expandió en una placa de agar MacConkey que contenía una concentración baja de sacarosa al 0,1 %, seguido de cultivo a 37 ºC durante un día. De las colonias, se seleccionaron las que tenían un color púrpura intenso.
40 El transformante seleccionado se cultivó en medio LB sólido y en una incubadora a 37 ºC durante una noche. En 25 ml de un medio de titulación que contenía sacarosa como se indica en la Tabla 1, se inoculó un asa de la cepa y después se cultivó en una incubadora a 37 ºC a 200 rpm. Los resultados se muestran en la Tabla 8.
Tabla 8
Composición
Concentración (por litro)
Sacarosa
60 g
KH2PO4
2 g
(NH4)2SO4
20 g
MgSO4 · 7H2O
1 g
Na3C6H5O7 · 2H2O
5 g
NaCl
1 g
Extracto de levadura
2,5 g
10

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