JP5254353B2 - 2−デオキシ−シロ−イノソース(doi)生産細菌及びこれを用いた2−デオキシ−シロ−イノソース(doi)生産方法 - Google Patents
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Description
従って本発明は、安価な糖であるスクロースから効率よくDOIを生産することができるDOI生産大腸菌及びこれを用いたDOI生産方法を提供することを目的とする。
[2] 前記DOI生産大腸菌が、糖取り込み能力強化系を有する[1]に記載のDOI生産大腸菌。
[3] 前記DOI生産大腸菌が、該大腸菌が本来有しているホスホグルコースイソメラーゼ(Pgi)、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(Zwf)、ホスホグルコムターゼ(Pgm)及び定常期における蛋白質合成の修飾を担うリボソーム修飾因子(Rmf)からなる群より選択された少なくとも1つの活性が、不活化又は低減化されている[1]又は[2]に記載のDOI生産大腸菌。
[4] 前記DOI生産大腸菌が、該大腸菌が本来有しているホスホグルコースイソメラーゼ(Pgi)及びグルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(Zwf)の活性が不活化又は低減化されている[1]又は[2]に記載のDOI生産大腸菌。
[5] DOI合成酵素(BtrC)をコードする遺伝子が導入されたことにより前記DOI生産系が付与又は強化された[1]〜[4]のいずれか一つに記載のDOI生産大腸菌。
[6] グルコース輸送促進蛋白質(Glf)をコードする遺伝子が導入されたことにより前記糖取り込み能力強化系を有する[2]〜[5]のいずれか一つに記載のDOI生産大腸菌。
[7] 前記スクロース加水分解酵素(CscA)をコードする遺伝子が、大腸菌に由来する[1]〜[6]のいずれか一つに記載のDOI生産大腸菌。
[8] 前記スクロース加水分解酵素(CscA)をコードする遺伝子が、エシェリヒア・コリO−157に由来する[1]〜[6]のいずれか一つに記載のDOI生産大腸菌。
[9] 前記グルコース輸送促進蛋白質(Glf)をコードする遺伝子がザイモモナス属細菌に由来する[6]〜[8]のいずれか一つに記載のDOI生産大腸菌。
[10] 前記グルコース輸送促進蛋白質(Glf)をコードする遺伝子がザイモモナス・モビリスに由来する[6]〜[8]のいずれか一つに記載のDOI生産大腸菌。
[11] 前記DOI生産大腸菌が、本来スクロース資化能を持たない種類の大腸菌から作られた菌である[1]〜[10]のいずれか一つに記載のDOI生産大腸菌。
[12] 前記DOI生産大腸菌が、B株若しくはその由来株又はK−12株若しくはその由来株の大腸菌から作られた菌である[1]〜[10]のいずれか一つに記載のDOI生産大腸菌。
[13] [1]〜[12]のいずれか一つに記載のDOI生産大腸菌を用いて、スクロースを含む植物由来原料からDOIを生産することを含むDOIの生産方法。
[14] [1]〜[12]のいずれか一つに記載のDOI生産大腸菌をpH6.5以下の培地で培養することを含む[13]に記載のDOIの生産方法。
即ち、本発明のDOI生産大腸菌は、スクロース由来のフルクトースをリン酸化して菌体内に取り込むことができると共に、このフルクトースを、解糖系を用いて菌体の増殖/生育用のエネルギーへ変換することができる。このように、スクロース由来のフルクトースを菌体増殖の栄養源として利用しながら大腸菌でDOIを生産させた報告例はない。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
なかでも、DOIを更に効率よく生産するという観点から、cscAのみを有し、その他の遺伝子を含まないことが好ましい。
好ましくは、DOI生産に関与する酵素活性の付与若しくは強化又はこれらの組み合わせを挙げることができる。これにより、上記のCscA活性と組み合わせて、本来はスクロース資化能を有しない大腸菌であっても、スクロースからDOIを効果的に生産することができる。
本発明における糖取り込み能力とは、生体膜を介する糖輸送能力を意味し、生体膜の外側から内側への糖輸送又は生体膜の内側から外側への糖輸送のどちらに対する作用でもこの能力に含むことができる。糖輸送における糖としては5単糖又は6単糖を含む。具体的には、グルコース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース等が挙げられ、好ましくはグルコースを挙げることができる。
本発明におけるグルコース輸送促進蛋白質(Glf)とは、D−グルコースやD−フルクトース等を生体膜の外側から内側へ輸送する作用をもつ蛋白質の総称を指す。glf遺伝子を導入した大腸菌においてマンニトールの生産性が向上した技術(例えば、特表2006−503559号参照)や、L−フェニルアラニンやシキミ酸の生産性が向上(特表2002−512802号公報、Applied Microbiology and Biotechnology(2004),64,333-339)することは知られているが、グルコース輸送促進蛋白質遺伝子(glf)の導入が、DOI生産大腸菌においても生産性向上の効果を示すかどうかは全く分かっていなかった。なお、後述するようにglf遺伝子の導入は、乳酸の生産性を向上させるためには効果はない。このため、glf遺伝子の導入は糖を原料とした物質生産に有効な共通する技術ではなく、本発明においてglf遺伝子を導入することによりDOIが効率よく生産できたことは意外なことである。
これによって、DOI生産のための直接の基質となるグルコース−6−リン酸の菌による分解代謝が抑制され、また定常期における蛋白質合成によりDOI生産能を高めることができる。このようなDOI生産細菌は、例えば、国際公開2006/109479号パンフレットに記載されている。
また本発明における大腸菌は、DOIの合成を考慮して、種々の染色体/プラスミド遺伝子を破壊した株を用いてもよい。
本発明における「低減化」とは、当該酵素をコードする遺伝子の遺伝子組換えにより、それらの処理を行う前の状態よりも有意に当該酵素の活性が低下している状態を指す。
本発明における酵素の活性は、既存の測定系のいずれによって測定された活性であってもよい。
なお、本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されればよく、本用語に含まれる。
なお、本発明に使用される培地としては、工業的生産に供する点を考慮すれば液体培地が好ましい。
上述した通気条件は培養初期から終了まで一貫して行う必要はなく、培養工程の一部で行うことでも好ましい結果を得ることができる。
本発明における培養物とは、上述した方法により生産された菌体、培養液、及びそれらの処理物を指す。
<エシェリヒア・コリpgi遺伝子の近傍領域のクローニング>
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリのホスホグルコースイソメラーゼ(以下pgiと呼ぶことがある)をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている。pgiをコードする遺伝子(1,650bp)の塩基配列近傍領域をクローニングするため、CAGGAATTCG CTATATCTGG CTCTGCACG(配列番号1)、CAGTCTAGAG CAATACTCTT CTGATTTTGA G(配列番号2)、CAGTCTAGAT CATCGTCGAT ATGTAGGCC(配列番号3)及びGACCTGCAGA TCATCCGTCA GCTGTACGC(配列番号4)の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。配列番号1のプライマーは5’末端側にEcoRI認識部位を、配列番号2及び3のプライマーは5’末端側にXbaI認識部位を、配列番号4のプライマーは5’末端側にPstI認識部位をそれぞれ有している。
<エシェリヒア・コリMG1655Δpgi株の作製>
実施例1で得たプラスミドpTHΔpgiをエシェリヒア・コリMG1655株に形質転換し、細胞が温度感受性プラスミドを保持できる30℃でクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレート上で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をLB培地30℃で3時間から一晩培養後、LB液体培地または生理食塩水で希釈して、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレート上に塗布した。このLB寒天プレートを、温度感受性プラスミドを保持できない42℃で培養し、生育した形質転換体をゲノム外−ゲノム間相同組換えによりプラスミド全長がエシェリヒア・コリゲノムに組み込まれた株として得た。
さらに選抜された株からゲノムDNAを取得し、これを鋳型としたPCRを実施してpgiをコードする遺伝子が欠損した株を選抜し、これをMG1655Δpgi株と命名した。
<エシェリヒア・コリzwf遺伝子の近傍領域のクローニング>
エシェリヒア・コリのグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下zwfと呼ぶことがある)をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている。zwfをコードする遺伝子(1,476bp)の塩基配列近傍領域をクローニングするため、CAGGAATTCA TGCGTTGCAG CACGATATC(配列番号5)、CAGTCTAGAT AACCCGGTAC TTAAGCCAG(配列番号6)、CAGTCTAGAC TGCGCTTATC CTTTATGGT(配列番号7)及びGACCTGCAGT TACCGGTCAT GCGTGTAAC(配列番号8)の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。配列番号5のプライマーは5’末端側にEcoRI認識部位を、配列番号6及び7のプライマーは5’末端側にXbaI認識部位を、配列番号8のプライマーは5’末端側にPstI認識部位をそれぞれ有している。
<エシェリヒア・コリMG1655ΔpgiΔzwf株の作製>
実施例3で得たプラスミドpTHΔzwfを、実施例2で得たエシェリヒア・コリMG1655Δpgi株に形質転換し、細胞が温度感受性プラスミドを保持できる30℃で、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレート上で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をLB培地30℃で3時間から一晩培養後、LB液体培地または生理食塩水で希釈して、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレート上に塗布した。このLB寒天プレートを、温度感受性プラスミドを保持できない42℃で培養し、生育した形質転換体をゲノム外−ゲノム間相同組換えによりプラスミド全長がエシェリヒア・コリゲノムに組み込まれた株として得た。
さらに選抜された株からゲノムDNAを取得し、これを鋳型としたPCRを実施してzwfをコードする遺伝子が欠損した株を選抜し、これをMG1655ΔpgiΔzwf株と命名した。
<GAPDHプロモーター制御下、DOI合成酵素遺伝子(btrC)発現ベクターの構築>
エシェリヒア・コリのGAPDH遺伝子の塩基配列はすでに報告されている。グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPA)プロモーターを取得するため、CGAGCTACAT ATGCAATGAT TGACACGATT CCG(配列番号9)、及びCCAAGCTTCT GCAGGTCGAC GGATCCGAGC TCAGCTATTT GTTAGTGAAT AAAAGG(配列番号10)の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ合成した。配列番号9のプライマーはその5’末端側にNdeI認識部位を、配列番号10のプライマーはその5’末端側から順にHindIII、PstI、SalI、BamHI、SacI認識部位をそれぞれ有している。
<GAPDHプロモーター制御下、DOI合成酵素遺伝子(btrC)及びスクロース加水分解酵素遺伝子(cscA)発現ベクターの構築>
エシェリヒア・コリO−157株が有するスクロース加水分解酵素遺伝子(cscA)の塩基配列はすでに報告されている。すなわち、GenBank accession number AE005174に記載のエシェリヒア・コリO−157株ゲノム配列の3274383−3275816に記載されている。cscA遺伝子を取得するために、GCGGATCCGC TGGTGGAATA TATGACGCAA TCTCGATTGC(配列番号13)、及びGACGCGTCGA CTTAACCCAG TTGCCAGAGT GC(配列番号14)の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ合成した。配列番号13のプライマーはその5’末端側から順にBamHI認識部位と13塩基のGAPDH遺伝子のリボソーム結合配列を有している。配列番号14のプライマーはその5’末端側にSalI認識部位を有している。
<GAPDHプロモーター制御下、DOI合成酵素遺伝子(btrC)、スクロース加水分解酵素遺伝子(cscA)及びグルコース輸送促進蛋白質遺伝子(glf)発現ベクターの構築>
Zymomonas mobilis(ATCC 29191)が有するグルコース輸送促進蛋白質遺伝子(glf)の塩基配列はすでに報告されている(GenBank accession number M60615)。glf遺伝子を取得するために、CCTGTCGACG CTGGTGGAAT ATATGAGTTC TGAAAGTAGT CAGG(配列番号15)、及びCTACTGCAGC TACTTCTGGG AGCGCCACA(配列番号16)の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ合成した。配列番号15のプライマーはその5’末端側から順にSalI認識部位と13塩基のGAPDH遺伝子のリボソーム結合配列を有している。配列番号16のプライマーはその5’末端側にPstI認識部位を有している。
<pGAP−btrC−cscA及びpGAP−btrC−cscA−glfのMG1655ΔpgiΔzwf株への導入>
上記のプラスミドpGAP−btrC−cscAおよびpGAP−btrC−cscA−glfをそれぞれMG1655ΔpgiΔzwf株に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートで37℃一晩培養することによりMG1655ΔpgiΔzwf/pGAP−btrC−cscA株およびMG1655ΔpgiΔzwf/pGAP−btrC−cscA−glf株を得た。
<MG1655ΔpgiΔzwf/pGAP−btrC−cscA株を用いたDOIの生産性と培養pHによるDOIの生産性の違い>
前培養として三角フラスコに入れたLB Broth, Miller培養液(Difco244620)25mlにエシェリヒア・コリMG1655ΔpgiΔzwf/pGAP−btrC−cscA株を植菌し、一晩120rpmで撹拌培養を行った後、下記組成の培地475gを入れた1L容培養槽(ABLE社製培養装置BMJ−01)に全量植菌した。培養は大気圧下、通気量1.0vvm、撹拌速度800rpm、培養温度30℃で行った。培養槽は全部で4台用い、pHを12.5%アンモニア水と2N塩酸を用いてpH7.0、pH6.5、pH6.0に調整した。また、660nmの吸光度を測定することにより、菌体濃度を測定した。培養開始時の菌体濃度は全て0.29であった。培養62時間後、得られた培養液中のDOI、スクロース、グルコース、フルクトースの量をHPLCで定法に従って測定した。また、660nmの吸光度を測定することにより、菌体濃度を測定した。培養に使用する培地の組成を下記表1に記載する。結果を表2に示す。
また、本実施例で用いた菌はpgi遺伝子とzwf遺伝子が同時に破壊されていることからグルコースを異化代謝できないはずであるが、スクロースを唯一の炭素源とした培地で62時間培養した結果、全ての試験区において菌は100倍以上に増えた。このことにより、本発明の大腸菌が、菌体の増殖/生育用に高価なマンニトール等を必要とせず、スクロースを分解して得られるフルクトースを菌体の増殖/生育用に利用していることが確認された。
<MG1655ΔpgiΔzwf/pGAP−btrC−cscA株及びMG1655ΔpgiΔzwf/pGAP−btrC−cscA−glf株によるDOIの生産>
前培養として三角フラスコに入れたLB Broth, Miller培養液(Difco244620)25mlにエシェリヒア・コリMG1655ΔpgiΔzwf/pGAP−btrC−cscA株とMG1655ΔpgiΔzwf/pGAP−btrC−cscA−glf株をそれぞれ植菌し、一晩120rpmで撹拌培養を行った後、下記組成の培地475gを入れた1L容培養槽(ABLE社製培養装置BMJ−01)にそれぞれ全量を植菌した。培養は大気圧下、通気量1.0vvm、撹拌速度800rpm、培養温度30℃、pH6.5(12.5%アンモニア水で調整)で行った。培養48時間後、得られた培養液中のDOIとスクロース、グルコースの量をHPLCで定法に従って測定した。培養に使用する培地の組成を下記表3に記載する。結果を表4に示す。
<BΔpgiΔzwf/pGAP−btrC−cscA−glf株及びMG1655ΔpgiΔzwf/pGAP−btrC−cscA−glf株による、工業用培地を用いたときのスクロースからのDOIの生産>
一般に工業生産では、培養培地成分として高価な酵母エキス等の代替としてコーンスティープリカーを使用する。コーンスティープリカー培地を用いた場合のDOIの生産性をエシェリヒア・コリの亜種であるMG1655株とB株で比較した。
エシェリヒア・コリB株(ATCC11303)に対しても実施例1〜4に記載の方法でpgi遺伝子およびzwf遺伝子の破壊を行い、得られた株をBΔpgiΔzwf株と命名した。この株に対して、実施例8に記載の方法で発現ベクターpGAP−btrC−cscA−glfを導入し、得られた菌をBΔpgiΔzwf/pGAP−btrC−cscA−glf株と命名した。
<BΔpgiΔzwf/pGAP−btrC−cscA株、BΔpgiΔzwf/pGAP−btrC−cscA−glf株及びBΔpgiΔzwf/pGAP−btrC−cscA−pck株による廃糖蜜からのDOIの生産>
glf以外のグルコース輸送促進蛋白質遺伝子として、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(Pck)を選定した。ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(Pck)は、オキサロ酢酸を基質としてホスホエノールピルビン酸を産生する蛋白質である。エシェリヒア・コリが本来もっているグルコースの取り込み系(PTS)はホスホエノールピルビン酸を必要とすることから、この蛋白質を高発現することによりホスホエノールピルビン酸の供給量が増加し、結果的にPTSを強化することができると予想される。
glf遺伝子の導入がDOI以外の物質生産にどのような影響を与えるか確認するために、D−乳酸生産細菌であるMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株にcscA遺伝子とglf遺伝子を導入し、乳酸の生成量を調べた。
なお、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株とは、大腸菌MG1655が本来保有するピルベートホルメートリアーゼ(Pfl)、FAD依存性D−乳酸デヒドロゲナーゼ(Dld)、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(Mdh)、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ(Asp)の各遺伝子が破壊されていて、NADH依存性D−乳酸デヒドロゲナーゼ(LdhA)の遺伝子が導入されていている株のことであり、WO2005/033324号において、120gのグルコースから98g/LのD−乳酸を生産することが確認されている。
エシェリヒア・コリのGAPDH遺伝子の塩基配列はすでに報告されている。グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)プロモーターを取得するため、配列番号9及び配列番号10の塩基配列を有するプライマーを合成した。配列番号9のプライマーはその5’末端側にNdeI認識部位を、配列番号10のプライマーはその5’末端側から順にHindIII、PstI、SalI、BamHI、SacI認識部位を有している。
上記2種のプライマーとともに、エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用い、通常条件でPCR法を行い、DNA断片を増幅した。得られたDNAフラグメントを制限酵素NdeIとHindIIIで消化することで約100bpのGAPDHプロモーターをコードするフラグメントを得た。次に上記のDNAフラグメントと、NdeI、HindIIIで消化した大腸菌用クローニングベクターpBR322(GenBank accession number J01749)を混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセル(タカラバイオ社製)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で30℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをpGAPと命名した。
上記2種のプライマーとともに、エシェリヒア・コリO−157株のゲノムDNA(SIGMA−ALDRICH:IRMM449)をテンプレートとして通常条件でPCR法を行い、得られたDNAフラグメントを制限酵素BamHI及びSalIで消化することで約1.4kbpのスクロース加水分解酵素遺伝子(cscA)フラグメントを得た。このDNAフラグメントとプラスミドpGAPを制限酵素BamHI及びSalIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセル(タカラバイオ社製)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で30℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpGAP−cscAを回収して、スクロース加水分解酵素遺伝子(cscA)発現ベクターを構築した。
上記2種のプライマーとともに、Zymomonas mobilisのゲノムDNAをテンプレートとして通常条件でPCR法を行い、得られたDNAフラグメントを制限酵素SalI及びPstIで消化することで約1.4kbpのグルコース輸送促進蛋白質遺伝子(glf)フラグメントを得た。このDNAフラグメントとプラスミドpGAP−cscAを制限酵素SalI及びPstIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセル(タカラバイオ社製)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で30℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpGAP−cscA−glfを回収して、スクロース加水分解酵素遺伝子(cscA)及びグルコース輸送促進蛋白質遺伝子(glf)発現ベクターを構築した。
前培養として、三角フラスコに50μg/mLのアンピシリンを含むLB Broth, Miller培養液(Difco244620)20mlを入れ、エシェリヒア・コリMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/pGAP−cscA株及びMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/pGAP−cscA−glf株をそれぞれ植菌し、9時間、30℃、200rpmで撹拌培養を行った。前培養液0.2mLを下記組成の培地20mLを入れた100mL容量のフラスコにn=4で植菌し、撹拌速度90rpm、培養温度35℃で培養を行った。培養に使用する培地の組成を下記表9に記載する。なお、スクロースはフィルター滅菌して用いた。得られた培養液中のD−乳酸とスクロースの定量はHPLCで定法に従って測定した。結果を表10に記載する。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
Claims (14)
- スクロース非PTS遺伝子群(リプレッサー蛋白質(CscR)をコードする遺伝子、スクロース加水分解酵素(CscA)をコードする遺伝子、フルクトキナーゼ(CscK)をコードする遺伝子、及びスクロース透過酵素(CscB)をコードする遺伝子で構成される遺伝子群)のうちスクロース加水分解酵素(CscA)をコードする遺伝子のみを有すると共に、2−デオキシ−シロ−イノソース(DOI)生産系が付与又は強化されたDOI生産大腸菌。
- 前記DOI生産大腸菌が、糖取り込み能力強化系を有する請求項1に記載のDOI生産大腸菌。
- 前記DOI生産大腸菌が、該大腸菌が本来有しているホスホグルコースイソメラーゼ(Pgi)、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(Zwf)、ホスホグルコムターゼ(Pgm)及び定常期における蛋白質合成の修飾を担うリボソーム修飾因子(Rmf)からなる群より選択された少なくとも1つの活性が、不活化又は低減化されている請求項1又は請求項2に記載のDOI生産大腸菌。
- 前記DOI生産大腸菌が、該大腸菌が本来有しているホスホグルコースイソメラーゼ(Pgi)及びグルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(Zwf)の活性が不活化又は低減化されている請求項1又は請求項2に記載のDOI生産大腸菌。
- DOI合成酵素(BtrC)をコードする遺伝子が導入されたことにより前記DOI生産系が付与又は強化された請求項1〜請求項4のいずれか1項に記載のDOI生産大腸菌。
- グルコース輸送促進蛋白質(Glf)をコードする遺伝子が導入されたことにより前記糖取り込み能力強化系を有する請求項2〜請求項5のいずれか1項に記載のDOI生産大腸菌。
- 前記スクロース加水分解酵素(CscA)をコードする遺伝子が、大腸菌に由来する請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載のDOI生産大腸菌。
- 前記スクロース加水分解酵素(CscA)をコードする遺伝子が、エシェリヒア・コリO−157に由来する請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載のDOI生産大腸菌。
- 前記グルコース輸送促進蛋白質(Glf)をコードする遺伝子が、ザイモモナス属細菌に由来する請求項6〜請求項8のいずれか1項に記載のDOI生産大腸菌。
- 前記グルコース輸送促進蛋白質(Glf)をコードする遺伝子が、ザイモモナス・モビリスに由来する請求項6〜請求項8のいずれか1項に記載のDOI生産大腸菌。
- 前記DOI生産大腸菌が、本来スクロース資化能を持たない種類の大腸菌から作られた菌である請求項1〜請求項10のいずれか1項に記載のDOI生産大腸菌。
- 前記DOI生産大腸菌が、B株若しくはその由来株又はK−12株若しくはその由来株の大腸菌から作られた菌である請求項1〜請求項10のいずれか1項に記載のDOI生産大腸菌。
- 請求項1〜請求項12のいずれか1項に記載のDOI生産大腸菌を用いて、スクロースを含む植物由来原料からDOIを生産することを含むDOIの生産方法。
- 請求項1〜請求項12のいずれか1項に記載のDOI生産大腸菌をpH6.5以下の培地で培養することを含む請求項13に記載のDOIの生産方法。
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