JP5254353B2 - ２−デオキシ−シロ−イノソース（ｄｏｉ）生産細菌及びこれを用いた２−デオキシ−シロ−イノソース（ｄｏｉ）生産方法 - Google Patents

Description

本発明は、スクロースから２−デオキシ−シロ−イノソース（ＤＯＩ）を生産する細菌とそれを用いたＤＯＩ生産方法に関する。

２−デオキシ−シロ−イノソース（以下、ＤＯＩともいう）は、医薬原料や化学工業資源として用いられる有用な物質である。例えば、特開２０００−２３６８８１号公報によれば、２−デオキシ−シロ−イソノースは、大腸菌を用いて得られた組換えＤＯＩ合成酵素を使用して、グルコース−６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ）から短工程で生産できることが明らかとなっている。さらに、例えば、国際公開２００６／１０９４７９号パンフレットによれば、ＤＯＩ合成酵素を発現させた大腸菌を用いて、グルコースから一段階でＤＯＩを生産する方法も開発されている。これにより、植物由来資源より得られるグルコースからＤＯＩを生産することが可能になった。

しかしながら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２９，ｐｐ．５０２−５０９（２００７）によれば、国際公開２００６／１０９４７９号パンフレットに記載のＤＯＩ生産方法では、原料としてグルコースを使用すると共に、菌体の増殖／生育のために、希少で且つ高価な糖であるマンニトールを別途必要とすることが明らかになっている。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２９，ｐｐ．５０２−５０９（２００７）によると、野生型の大腸菌にＤＯＩ合成酵素を発現させただけではＤＯＩの生産性は僅か１．５ｇ／Ｌであり、高い生産性（２９．５ｇ／Ｌ）を達成するためには、大腸菌が保有する３つの酵素遺伝子、ホスホグルコースイソメラーゼ（ｐｇｉ）及びグルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）及びホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）を同時に破壊することが必要であることが示されている。このようにグルコースが解糖系へ入る代謝経路が全て遮断されるため、別途解糖系に利用可能な糖（例えばマンニトール）が菌体の増殖／生育のために必要であると結論づけられている。また、同様な高いＤＯＩ生産性を得るためには、ｐｇｉ遺伝子とｚｗｆ遺伝子の２つを同時に破壊するだけでもよいが、この場合もグルコースを唯一の炭素源とすると菌体が増殖できなくなるため、菌体の増殖／生育用にマンニトールが必要であることが示されている。

一方、グルコースよりも安価な糖原料としてスクロースが知られている。スクロースは廃糖蜜の主成分であり、スクロースを資化してＤＯＩを生産する大腸菌は工業利用可能な安価なＤＯＩを生産する上で有用となることが期待されていた。しかしながら、スクロースを資化してＤＯＩを生産する細菌はこれまで全く存在しなかった。

例えば、特開２００１−３４６５７８号公報によれば、微生物がスクロースを資化するメカニズムは、スクロースＰＴＳ（Phosphoenolpyruvate: Carbohydrate Phosphotransferase System）とスクロース非ＰＴＳの２つに大別される。スクロース非ＰＴＳを経由する場合、微生物はスクロースをそのままの形で取り込み、その後にグルコースとフルクトースに分解する。一方スクロースＰＴＳを経由する場合では、微生物はスクロースを取り込む際にスクロースをリン酸化し、スクロース−６−リン酸へと変換する。そして微生物内部でグルコース−６−リン酸とフルクトースに分解する。

即ちいずれのメカニズムを経由した場合でも、スクロース由来のフルクトースは、まずはリン酸化されない形で微生物内部に出現することとなる。そしてこのリン酸化されていないフルクトース（以下、非リン酸化フルクトースと呼ぶ）が解糖系へ取り込まれるためには、フルクトースがグルコースに異性化されるか、又はリン酸化される必要がある。しかし、ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．１０５５−１０６２（２００５）、ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９８（２６），ｐｐ．１５２５７−１５２５９（２００１）、及びＪ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８４（１９），ｐｐ．５３０７−５３１６（２００２）によれば、該微生物が大腸菌の場合、非リン酸化フルクトースをグルコースへ異性化する活性、フルクトースをリン酸化する活性はいずれも非常に低いことが示唆されている。このため、仮に大腸菌内部で非リン酸化フルクトースを出現させることに成功したとしても、別段の手段を講じない限り、当該大腸菌が非リン酸化フルクトースを資化することは期待できなかった。

Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．４５，ｐｐ．１８−４２２（１９９９）は、大腸菌にスクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）のみを導入することでスクロースを原料にして大腸菌が増殖できるようになったことを開示している。一方、スクロースを原料とした大腸菌によるＤＯＩ生産において重要なことの一つは、スクロース由来のフルクトースを利用した菌体の増殖／生育の実現である。しかるに上記文献では、一貫してスクロースとグルコースが菌体内に取り込まれるようになることについて情報を開示するのみであり、スクロース由来のフルクトースがどの程度資化されているかについては全くデータを開示していない。

このように、従来より知られていたＤＯＩ生産大腸菌は、ＤＯＩの生産のためにグルコースを、また菌体の増殖のために高価な糖であるマンニトール等が必要であるため、ＤＯＩを工業的に生産する上で問題があった。
従って本発明は、安価な糖であるスクロースから効率よくＤＯＩを生産することができるＤＯＩ生産大腸菌及びこれを用いたＤＯＩ生産方法を提供することを目的とする。

問題を解決するための手段

本発明は上記状況を鑑みてなされたものであり、本発明のＤＯＩ生産大腸菌及びＤＯＩ生産方法は、以下のとおりである。

［１］ スクロース非ＰＴＳ遺伝子群（リプレッサー蛋白質（ＣｓｃＲ）をコードする遺伝子、スクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子、フルクトキナーゼ（ＣｓｃＫ）をコードする遺伝子、及びスクロース透過酵素（ＣｓｃＢ）をコードする遺伝子で構成される遺伝子群）のうちスクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子のみを有すると共に、２−デオキシ−シロ−イノソース（ＤＯＩ）生産系が付与又は強化されたＤＯＩ生産大腸菌。
［２］ 前記ＤＯＩ生産大腸菌が、糖取り込み能力強化系を有する［１］に記載のＤＯＩ生産大腸菌。
［３］ 前記ＤＯＩ生産大腸菌が、該大腸菌が本来有しているホスホグルコースイソメラーゼ（Ｐｇｉ）、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）、ホスホグルコムターゼ（Ｐｇｍ）及び定常期における蛋白質合成の修飾を担うリボソーム修飾因子（Ｒｍｆ）からなる群より選択された少なくとも１つの活性が、不活化又は低減化されている［１］又は［２］に記載のＤＯＩ生産大腸菌。
［４］ 前記ＤＯＩ生産大腸菌が、該大腸菌が本来有しているホスホグルコースイソメラーゼ（Ｐｇｉ）及びグルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）の活性が不活化又は低減化されている［１］又は［２］に記載のＤＯＩ生産大腸菌。
［５］ ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）をコードする遺伝子が導入されたことにより前記ＤＯＩ生産系が付与又は強化された［１］〜［４］のいずれか一つに記載のＤＯＩ生産大腸菌。
［６］ グルコース輸送促進蛋白質（Ｇｌｆ）をコードする遺伝子が導入されたことにより前記糖取り込み能力強化系を有する［２］〜［５］のいずれか一つに記載のＤＯＩ生産大腸菌。
［７］ 前記スクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子が、大腸菌に由来する［１］〜［６］のいずれか一つに記載のＤＯＩ生産大腸菌。
［８］ 前記スクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子が、エシェリヒア・コリＯ−１５７に由来する［１］〜［６］のいずれか一つに記載のＤＯＩ生産大腸菌。
［９］ 前記グルコース輸送促進蛋白質（Ｇｌｆ）をコードする遺伝子がザイモモナス属細菌に由来する［６］〜［８］のいずれか一つに記載のＤＯＩ生産大腸菌。
［１０］ 前記グルコース輸送促進蛋白質（Ｇｌｆ）をコードする遺伝子がザイモモナス・モビリスに由来する［６］〜［８］のいずれか一つに記載のＤＯＩ生産大腸菌。
［１１］ 前記ＤＯＩ生産大腸菌が、本来スクロース資化能を持たない種類の大腸菌から作られた菌である［１］〜［１０］のいずれか一つに記載のＤＯＩ生産大腸菌。
［１２］ 前記ＤＯＩ生産大腸菌が、Ｂ株若しくはその由来株又はＫ−１２株若しくはその由来株の大腸菌から作られた菌である［１］〜［１０］のいずれか一つに記載のＤＯＩ生産大腸菌。
［１３］ ［１］〜［１２］のいずれか一つに記載のＤＯＩ生産大腸菌を用いて、スクロースを含む植物由来原料からＤＯＩを生産することを含むＤＯＩの生産方法。
［１４］ ［１］〜［１２］のいずれか一つに記載のＤＯＩ生産大腸菌をｐＨ６．５以下の培地で培養することを含む［１３］に記載のＤＯＩの生産方法。

本発明によれば、スクロースを唯一の炭素源としてＤＯＩを効率よく生産するＤＯＩ生産大腸菌及びこれを用いたＤＯＩ生産方法を提供することができる。

本発明の実施例１１で得られた細菌株のＤＯＩ生産性を示す図である。 本発明の実施例１２で得られた細菌株のＤＯＩ生産性を示す図である。

本発明のＤＯＩ生産大腸菌は、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群の中で、少なくともスクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子を有すると共に、２−デオキシ−シロ−イノソース（ＤＯＩ）生産系が付与又は強化されたＤＯＩ生産大腸菌である。

本発明は、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群の中で、少なくともスクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子を有すると共に、２−デオキシ−シロ−イノソース（ＤＯＩ）生産系が付与又は強化されたＤＯＩ生産大腸菌によって、スクロース由来のフルクトースを資化し、スクロースを唯一の炭素源として極めて高い生産効率でＤＯＩを生産できることを見出したものである。この結果、植物に由来し、安価で工業的によく利用されるスクロースから、効率よくＤＯＩを得ることができる。
即ち、本発明のＤＯＩ生産大腸菌は、スクロース由来のフルクトースをリン酸化して菌体内に取り込むことができると共に、このフルクトースを、解糖系を用いて菌体の増殖／生育用のエネルギーへ変換することができる。このように、スクロース由来のフルクトースを菌体増殖の栄養源として利用しながら大腸菌でＤＯＩを生産させた報告例はない。

これを更に説明すれば、スクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）は、大腸菌の細胞膜上にはほとんど存在しない酵素として認識されているものであり（Can.J.Microbiol.,Vol.45,pp.18-422(1999)参照）、一方、ＤＯＩ生産大腸菌は、非リン酸化フルクトースを解糖系に取り込むことができず、リン酸化フルクトースしか生育に利用できないものとして構築されている（ＷＯ２００６／１０９４７９号パンフレット参照）。このようなＤＯＩ生産大腸菌に、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群の中で、少なくともスクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子を導入し、ＣｓｃＡ活性を付与した結果、予想に大きく反して、フルクトースを栄養源として利用可能なＤＯＩ生産大腸菌を得ることができたものである。この結果得られた本発明のＤＯＩ生産大腸菌は、大腸菌にとって最も利用しやすい糖であるグルコースの存在下にもかかわらず、スクロースやその分解産物であるフルクトースを効率良く資化して、ＤＯＩを生産することができるので、グルコースの減少又は枯渇を待たずにＤＯＩを生産することができ、より効率的である。スクロースが分解されるとグルコースとフルクトースが等量生成されるが、一般に、大腸菌では通常グルコースの取り込みがフルクトースよりも優先され、グルコースの存在下ではフルクトースは充分に代謝されないことが知られている。このため、例えば、菌体の培養時のｐＨを調整することで、グルコースによる代謝抑制（カタボライトリプレッション）の影響を受けずに、フルクトースを効率よく大腸菌の生育に利用できたことは驚くべきことである。

以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。

本発明において「スクロースの資化」とは、スクロースを、そのまま、低分子化または高分子化して、好ましくは低分子化して、生体内に取り入れる能力、あるいは代謝的に別物質に変換する能力をいう。また、本発明において、資化とはスクロースをより低分子化する分解を含む。詳しくは、スクロースをＤ−グルコースとＤ−フルクトースに分解することを含む。

本発明における「スクロース非ＰＴＳ遺伝子群」とは、微生物のスクロース資化経路のうち非ＰＴＳ系に関与する遺伝子群のことをいう。詳しくは、リプレッサー蛋白質（ＣｓｃＲ）をコードする遺伝子（ｃｓｃＲ）、スクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子（ｃｓｃＡ）、フルクトキナーゼ（ＣｓｃＫ）をコードする遺伝子（ｃｓｃＫ）、スクロース透過酵素（ＣｓｃＢ）をコードする遺伝子（ｃｓｃＢ）で構成される遺伝子群である。本発明では、このうちｃｓｃＡを少なくとも含んでいればよく、例えば、ｃｓｃＡのみ、ｃｓｃＡ及びｃｓｃＫの組み合わせ、ｃｓｃＡ及びｃｓｃＢの組み合わせ、ｃｓｃＡ及びｃｓｃＲの組み合わせ、ｃｓｃＡとｃｓｃＢとｃｓｃＲの組み合わせ、ｃｓｃＡとｃｓｃＫとｃｓｃＲの組み合わせ、ｃｓｃＡとｃｓｃＫとｃｓｃＢの組み合わせ、ｃｓｃＡとｃｓｃＫとｃｓｃＢとｃｓｃＲの組み合わせが挙げられる。
なかでも、ＤＯＩを更に効率よく生産するという観点から、ｃｓｃＡのみを有し、その他の遺伝子を含まないことが好ましい。

本発明における「スクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）」とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号３．２．１．２６に分類され、スクロースからＤ−グルコースとＤ−フルクトースを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。なお、この酵素は、Ｋ−１２株及びＢ株等の大腸菌には本来保有されていない。

本発明においては、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群の中で少なくともｃｓｃＡを大腸菌に導入することでＣｓｃＡ活性を付与することにより、特には、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群の中でｃｓｃＡのみを大腸菌に導入することでＣｓｃＡ活性のみを付与することにより、菌体外に存在するスクロースを細胞膜上でグルコースとフルクトースに分解して細胞外へ放出し、これらを大腸菌が本来保有するグルコースＰＴＳ及びフルクトースＰＴＳを介してリン酸化しながら細胞質内へ取り込む。その結果、細胞外に存在したフルクトースはフルクトース−１−リン酸として菌体内に出現し、その後、菌体内に存在するフルクトース−１−リン酸キナーゼ（ＦｒｕＫ）によってフルクトース−１，６−リン酸に変換されて、解糖系へ入る。

本発明の宿主細菌に導入されるスクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）の遺伝子（ｃｓｃＡ）としては、この酵素を保有する生物から得られるスクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus）、ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ−１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ−１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。またｃｓｃＡには、ＣｓｃＡを菌体のペリプラズムへ移行させるためのシグナル配列が付加されていることが好ましい。

本発明の宿主細菌に導入されうるリプレッサー蛋白質（ＣｓｃＲ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるリプレッサー蛋白質（ＣｓｃＲ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus）、ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ−１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ−１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。

本発明の宿主細菌に導入されうるフルクトキナーゼ（ＣｓｃＫ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるフルクトキナーゼ（ＣｓｃＫ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus）、ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ−１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ−１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。

本発明の宿主細菌に導入されうるスクロース透過酵素（ＣｓｃＢ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られる、スクロース透過酵素（ＣｓｃＢ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus）、ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ−１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ−１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。

なお、本発明において「宿主細菌」とは、ひとつ以上の遺伝子の菌体外からの導入を受けた結果、本発明のＤＯＩ生産大腸菌となる当該大腸菌を意味する。

本発明における「ＤＯＩ生産系」とは、遺伝子組換えにより導入又は改変されたＤＯＩ生産能力を付与するための構造をいう。このようなＤＯＩ生産系は、対象となる大腸菌におけるＤＯＩ生産量を増加させるものであればいずれのものであってもよい。
好ましくは、ＤＯＩ生産に関与する酵素活性の付与若しくは強化又はこれらの組み合わせを挙げることができる。これにより、上記のＣｓｃＡ活性と組み合わせて、本来はスクロース資化能を有しない大腸菌であっても、スクロースからＤＯＩを効果的に生産することができる。

本発明における「付与」又は「強化」とは、酵素をコードする遺伝子を宿主細菌の菌体外から菌体内に導入することの他に、宿主細菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化すること又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させたものを含む。

本発明における「遺伝子組換えにより」との文言は、生来の遺伝子の塩基配列に対する別のＤＮＡの挿入、あるいは遺伝子のある部分の置換、欠失又はこれらの組み合わせによって塩基配列上の変更が生じているものであれば全て包含し、例えば、突然変異が生じた結果得られたものであってもよい。

本発明におけるＤＯＩ生産系は、ＤＯＩの生産効率の観点から、好ましくは、ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）活性に由来するものであり、このようなＤＯＩ合成酵素は、ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）を導入することにより、大腸菌に付与することができる。

ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）は、グルコース−６−リン酸から２−デオキシ−シロ−イソノース（ＤＯＩ）を生成する反応を触媒する酵素であり、４２ｋＤａと２３ｋＤａの二量体ペプチドであって、コバルトイオンの存在下で酵素活性が促進され、亜鉛、銅イオンの存在下において酵素活性が抑制され、ＮＡＤ^＋を補酵素として反応を行うものと知られている（例えば、特開２０００−２３６８８１号、ＷＯ２００６／１０９４７９号、参照）。ｂｔｒＣ遺伝子は、この遺伝子を有する生物に由来するものであればいずれのものを使用することもでき、例えば、バチルス属細菌に由来するものを挙げることができる。ｂｔｒＣ遺伝子としては中でも、ＤＯＩ生産効率の観点から、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来の４２ｋＤａサブユニットをコードする遺伝子を好ましく用いることができる（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０６６２７６）。

本発明におけるＤＯＩ生産大腸菌は、好ましくは、糖取り込み能力強化系を有するものである。
本発明における糖取り込み能力とは、生体膜を介する糖輸送能力を意味し、生体膜の外側から内側への糖輸送又は生体膜の内側から外側への糖輸送のどちらに対する作用でもこの能力に含むことができる。糖輸送における糖としては５単糖又は６単糖を含む。具体的には、グルコース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース等が挙げられ、好ましくはグルコースを挙げることができる。

本発明における「糖取り込み能力強化系を有する」とは、上記糖の菌体外から菌体内への糖の取り込みが増加している状態を指す。本発明において「糖取り込み能力強化系」とは、好ましくはグルコースの取り込み能力を向上させるための構造を意味する。更に好ましくは、該糖取り込み能力強化系がＰＴＳ系又は非ＰＴＳ系とは異なり、例えば菌体外のグルコースをそのままの形で菌体内へ取り込む系である。取り込まれたグルコースは、その後、菌体が保有するグルコキナーゼ（Ｇｌｋ）等のリン酸化酵素によってリン酸化されて、物質生産の基質として利用できるようになる。これにより、大腸菌は本来保有するＰＴＳ系又は非ＰＴＳ系の糖取り込み系のほかに、新たな糖取り込み系を保有することになる。

本発明における糖取り込み能力強化系は、ＤＯＩの生産性の観点から、好ましくは、グルコース輸送促進蛋白質（Ｇｌｆ）活性の強化系である。
本発明におけるグルコース輸送促進蛋白質（Ｇｌｆ）とは、Ｄ−グルコースやＤ−フルクトース等を生体膜の外側から内側へ輸送する作用をもつ蛋白質の総称を指す。ｇｌｆ遺伝子を導入した大腸菌においてマンニトールの生産性が向上した技術（例えば、特表２００６−５０３５５９号参照）や、Ｌ−フェニルアラニンやシキミ酸の生産性が向上（特表２００２−５１２８０２号公報、Applied Microbiology and Biotechnology(2004),64,333-339）することは知られているが、グルコース輸送促進蛋白質遺伝子（ｇｌｆ）の導入が、ＤＯＩ生産大腸菌においても生産性向上の効果を示すかどうかは全く分かっていなかった。なお、後述するようにｇｌｆ遺伝子の導入は、乳酸の生産性を向上させるためには効果はない。このため、ｇｌｆ遺伝子の導入は糖を原料とした物質生産に有効な共通する技術ではなく、本発明においてｇｌｆ遺伝子を導入することによりＤＯＩが効率よく生産できたことは意外なことである。

本発明の宿主細菌に導入されるグルコース輸送促進蛋白質の遺伝子（ｇｌｆ）としては、この蛋白質を保有する生物由来のグルコース輸送促進蛋白質（Ｇｌｆ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好ましくは、酵母やザイモモナス属細菌に由来するものを挙げることができ、より好ましくはザイモモナス属細菌に由来するものとすることができ、例えばザイモモナス・モビリス由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、ザイモモナス・モビリス由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。

本発明のより好ましい態様のＤＯＩ生産大腸菌としては、スクロースの分解能力の観点から、スクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）活性がエシェリヒア属細菌由来であり、ＤＯＩの生産性向上の観点から、グルコース輸送促進蛋白質（Ｇｌｆ）活性がザイモモナス属細菌由来の各蛋白質をコードする遺伝子の導入により得られたものとすることができる。より好ましくは、前記スクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）がエシェリヒア・コリＯ−１５７細菌由来であり、グルコース輸送促進蛋白質（Ｇｌｆ）がザイモモナス・モビリス細菌由来の各蛋白質をコードする遺伝子の導入により得られたものとすることができる。これらの細菌由来の遺伝子とすることにより、これらの遺伝子の機能を確実に発現させることができる。

本発明において各種遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、上記いずれかの遺伝子の発現を制御可能なものであればよいが、恒常的に微生物内で機能する強力なプロモーターで、かつグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモーターであることが好ましく、具体的にはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーターやセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのプロモーターが例示できる。

本発明において各活性を付与した大腸菌とは、菌体外から菌体内へ何らかの方法によって酵素又は蛋白質に基づく活性が与えられた大腸菌を指す。これらの大腸菌は、例えば該酵素及び蛋白質をコードする遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて菌体外から菌体内に導入する等の方法を用いて作出することができる。菌体外から菌体内へ遺伝子を導入する際に必要なゲノムＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， ｅｔ．ａｌ．， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ”, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）などに記載されている。

本発明の好ましい態様では、ＤＯＩを可能な限り高収率で生産するために、宿主細菌が保有するグルコース−６−リン酸の代謝に関わる以下の酵素、すなわち、ホスホグルコースイソメラーゼ（Ｐｇｉ）、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）及びホスホグルコムターゼ（Ｐｇｍ）と、定常期における蛋白合成の制御に関わるリボソーム修飾因子（Ｒｍｆ）とからなる群より選択された少なくとも１つの活性が、不活化または低減化されている。このような態様は、上記のそれぞれをコードする遺伝子（それぞれ、ｐｇｉ遺伝子、ｚｗｆ遺伝子及びｐｇｍ遺伝子）がそれぞれ単独で遺伝子破壊されているか、または２つが同時に遺伝子破壊されているか（ｐｇｉ遺伝子とｚｗｆ遺伝子、ｐｇｉ遺伝子とｐｇｍ遺伝子）、もしくは３つが同時に遺伝子破壊されるか、さらに、定常期における蛋白合成の制御に関わるＲＭＦ蛋白質をコードする遺伝子（ｒｍｆ遺伝子）が単独で遺伝子破壊されているか、または上記のグルコース−６−リン酸の代謝に関わる酵素をコードする遺伝子が破壊されている各種遺伝子破壊株に対してｒｍｆ遺伝子が破壊されている。
これによって、ＤＯＩ生産のための直接の基質となるグルコース−６−リン酸の菌による分解代謝が抑制され、また定常期における蛋白質合成によりＤＯＩ生産能を高めることができる。このようなＤＯＩ生産細菌は、例えば、国際公開２００６／１０９４７９号パンフレットに記載されている。

本発明におけるＤＯＩ生産大腸菌としては、更に好ましくは、ホスホグルコースイソメラーゼ（Ｐｇｉ）及びグルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）の活性が同時に不活化あるいは低減化された大腸菌である。最も好ましくは、ホスホグルコースイソメラーゼ（Ｐｇｉ）及びグルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）及びホスホグルコムターゼ（Ｐｇｍ）の活性が同時に不活化あるいは低減化された大腸菌である。

各種酵素を不活化させるための手段としては、この目的で通常用いられる手段であれば特に制限されずに用いることができ、例えば、酵素をコードする遺伝子の相同組換え等による遺伝子破壊を挙げることができる。このような遺伝子の破壊は、染色体上の遺伝子であってもプラスミド遺伝子であってもよい。
また本発明における大腸菌は、ＤＯＩの合成を考慮して、種々の染色体／プラスミド遺伝子を破壊した株を用いてもよい。

本発明における「不活化」とは、既存の測定系によって測定された当該酵素の活性が検出限界以下である状態を指す。
本発明における「低減化」とは、当該酵素をコードする遺伝子の遺伝子組換えにより、それらの処理を行う前の状態よりも有意に当該酵素の活性が低下している状態を指す。
本発明における酵素の活性は、既存の測定系のいずれによって測定された活性であってもよい。

本発明における「遺伝子破壊」とは、ある遺伝子の機能が発揮できないようにするために、その遺伝子の塩基配列に変異を入れる、別のＤＮＡを挿入する、あるいは、遺伝子のある部分を欠失させることを示している。遺伝子破壊の結果、その遺伝子がｍＲＮＡへ転写できなくなり、構造遺伝子が翻訳されない、あるいは、転写されたｍＲＮＡが不完全なため、翻訳された構造蛋白質のアミノ酸配列に変異又は欠失が生じ、本来の機能の発揮が不可能になる。

遺伝子破壊株の作製は、当該酵素又は蛋白質が発現しない破壊株が得られればいかなる方法も用いることが可能である。遺伝子破壊の方法は種々の方法（自然育種、変異剤添加、紫外線照射、放射線照射、ランダム突然変異、トランスポゾン、部位特異的遺伝子破壊）が報告されているが、ある特定の遺伝子のみ破壊できるという点で、相同的組換えによる遺伝子破壊が好ましい。相同組換えによる手法はＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６１，１２１９−１２２１（１９８５）やＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７，１５１１−１５１９（１９９５）やＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９７，６６４０−６６４５（２０００）に記載されており、これらの方法及びその応用によって同業技術者であれば容易に実施可能である。

本発明に用いられる大腸菌は、上記の各遺伝子の導入及び変更が可能であればいずれの大腸菌であってもよい。より好ましくは、本来スクロース資化能を備えていない種類の大腸菌であり、このような大腸菌としては、エシェリヒア属（Escherichia）細菌等が例示され、特に利便性が高く、工業的な使用の実績が豊富なエシェリヒア・コリ（Escherichia coli：大腸菌）が好適に使用される。例えば、Ｋ−１２株、Ｂ株、Ｃ株及びその由来株等を挙げることができる。これにより、本来はスクロース資化能を持たない種類の大腸菌の用途を拡大させることができる。

本発明のＤＯＩ生産大腸菌は、本来スクロース資化能を備えていない種類の大腸菌の中でも、Ｂ株及びその由来株が好適に使用される。Ｂ株及びその由来株を用いて本発明のＤＯＩ生産大腸菌を構築することにより、汎用工業培地であるコーンスティープリカーを用いて高いＤＯＩ生産性を得ることができる。大腸菌は一般的にＫ−１２株、Ｂ株、Ｃ株に分類される。工業的物質生産の宿主としてはＫ−１２由来株とＢ由来株が広く用いられており、どちらも遺伝子組換えによる異種蛋白質の発現が可能であるが、Ｂ株がＤＯＩの生産において好ましい宿主であるという知見はこれまでに一切知られていない。従って、ＤＯＩの生産においてＢ由来株がＫ−１２由来株に比して著しく高い生産性を示すことは、予期できない特異的な現象である。

本発明のＤＯＩの生産方法は、上記ＤＯＩ生産大腸菌を用いて、スクロースを含む植物由来原料から２−デオキシ−シロ−イノソースを生産することを含むものであり、即ち、上記ＤＯＩ生産大腸菌とスクロースを含む植物由来原料とを接触させる工程と、接触により得られたＤＯＩを回収する回収工程とを含むものである。
なお、本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されればよく、本用語に含まれる。

上記ＤＯＩ生産方法に用いられる植物由来原料とは、植物から得られる炭素源であり、大腸菌が代謝し、ＤＯＩに変換しうるものであれば特に制限されない。本発明においては、根、茎、幹、枝、葉、花、種子等の器官、それらを含む植物体、それら植物器官の分解産物を指し、更に植物体、植物器官、またはそれらの分解産物から得られる炭素源のうち、微生物が培養において炭素源として利用し得るものも、植物由来原料に包含される。

このような植物由来原料に包含される炭素源としては、スクロースの他に、一般的なものとしてデンプン、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース等の糖類、またはこれら成分を多く含む草木質分解産物やセルロース加水分解物などが例示できる。更には植物油由来のグリセリンや脂肪酸も、本発明における炭素源に該当する。

本発明における植物由来原料としては、穀物等の農作物、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿等、又はこれらの組み合わせを好ましく挙げることができ、その原料としての使用形態は、未加工品、絞り汁、粉砕物等、特に限定されない。また、上記の炭素源のみの形態であってもよい。

接触工程におけるＤＯＩ生産大腸菌と植物由来原料との接触は、一般に、植物由来原料を含む培地でＤＯＩ生産大腸菌を培養することにより行われる。

植物由来原料とＤＯＩ生産大腸菌との接触密度は、ＤＯＩ生産大腸菌の活性によって異なるが、一般に、培地中の植物由来原料の濃度として、グルコース換算で初発の糖濃度を混合物の全質量に対して２０質量％以下とすることができ、大腸菌の耐糖性の観点から好ましくは、初発の糖濃度を１５質量％以下とすることができる。この他の各成分は、微生物の培地に通常添加される量で添加されればよく、特に制限されない。

また培地中のＤＯＩ生産大腸菌の含有量としては、大腸菌の種類及び活性によって異なるが一般に、初発の菌濃度を培養液に対して０．１質量％から３０質量％、培養条件制御の観点から好ましくは１質量％〜１０質量％とすることができる。

本発明におけるＤＯＩの生産方法は、ＤＯＩ生産大腸菌と植物由来原料とを含む混合物中でＤＯＩ生産大腸菌を培養することにより植物由来原料を資化し、一定時間後に培養液中に分泌されたＤＯＩを蒸留、膜分離、抽出等の公知技術を用いて精製する方法を包含する。ＤＯＩの生産方法における混合物は、細菌類の培養に一般的に用いられる基本培地を主体とするものであればよく、ＤＯＩ生産大腸菌の種類に応じて通常用いられる培地であればいずれも使用することができる。このような基本培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の微量成分を含有する培地であれば特に制限は無い。

炭素源としては、上記スクロースのみでも充分であるが、ＤＯＩの生産効率の観点から、更にグルコース、フルクトース、糖蜜などの糖類、フマル酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、その他を適宜追加的に使用してもよい。窒素源としては、有機アンモニウム塩、無機アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水等の無機体窒素源、及び蛋白質加水分解物等の有機体窒素源、その他が適宜使用される。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、その他が必要に応じて適宜使用される。

有機微量成分としては、ビタミン、アミノ酸等及びこれらを含有する酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、その他が適宜使用される。
なお、本発明に使用される培地としては、工業的生産に供する点を考慮すれば液体培地が好ましい。

培養条件としては作成された菌体、培養装置により変動するが、一般に、培養温度は２０℃から４０℃、ＤＯＩの生産効率の観点から、より好ましくは２５℃から３５℃で培養することが好ましい。またｐＨは、ｐＨ４からｐＨ９、好ましくはｐＨ５．０からｐＨ７．５、より好ましくはｐＨ６．０からｐＨ７．０とすることができ、ＮａＯＨ、ＮＨ_３等で調整すればよい。培養時間は特に限定されないが、菌体が十分に増殖し、且つＤＯＩが生成するに必要な時間である。

培養に際しては通常は温度、ｐＨ、通気条件、攪拌速度を制御し得る培養槽を用いるのが一般的であるが、本発明の培養に際しては培養槽を使用することに限定されない。培養槽を用いて培養する場合には、必要により、予め前培養として種培養を行い、これを必要量予め調製しておいた培養槽内の培地に接種してもよい。

本発明で得られた微生物を培養してＤＯＩを生産させる際には、通気を全く行わなくともよいが、より好ましい結果を得るためには通気を行った方がよい。ここで言う通気条件下とは必ずしも培養液中を空気が通過する必要はなく、培養槽の形状によっては適度に培養液を撹拌しながら培養液上の空気層が換気されるような上面通気も含み、培養槽の内部に酸素を含む気体を流入させることを意味する。

液中に通気する場合は内圧、撹拌羽根位置、撹拌羽根形状、撹拌速度の組み合わせにより溶存酸素濃度が変化するためにＤＯＩの生産性およびＤＯＩ以外の有機酸量などを指標に次のように最適条件を求めることができる。例えばＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１等の比較的小型の培養槽で培養する場合は、５００ｇの培養液を使用した際、空気を常圧で０．００５Ｌ／分〜２Ｌ／分、撹拌速度５０ｒｐｍ〜２０００ｒｐｍ、より好ましくは、常圧で０．０５Ｌ／分〜１Ｌ／分、撹拌速度１００ｒｐｍ〜１０００ｒｐｍで達成し得る通気条件で好ましい結果を得ることができる。
上述した通気条件は培養初期から終了まで一貫して行う必要はなく、培養工程の一部で行うことでも好ましい結果を得ることができる。

回収工程では、この接触によって得られたＤＯＩを回収するものであり、一般に、上記培養により得られた培養物からＤＯＩを回収することにより行われる。
本発明における培養物とは、上述した方法により生産された菌体、培養液、及びそれらの処理物を指す。

培養物からＤＯＩを回収する方法は、例えば培養液からならば通常知られた方法が利用できる。例えば、菌体を遠心分離などで除去した後、培養上清をイオン交換樹脂に添加し蒸留水で溶出を行う。屈折率、ｐＨ、伝導率を測定しながら不純物を含まないフラクションを分取して、その水溶液を取り除いてＤＯＩを回収することができる。また、本発明の方法により生産された菌体は、ＤＯＩの生産に適した酵素群を生産していることから、これを利用してさらにＤＯＩを生産し、回収することも培養物からＤＯＩを回収する方法の一部とみなされる。

本発明により、安価な植物由来の糖を原料としてＤＯＩを極めて高いレベルで生産することができる。本発明は、カーボンニュートラルなＤＯＩの普及に極めて有用である。

以下に、本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。また、特に断らない限り、実施例中の「％」は質量基準である。

［実施例１］
＜エシェリヒア・コリｐｇｉ遺伝子の近傍領域のクローニング＞
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのホスホグルコースイソメラーゼ（以下ｐｇｉと呼ぶことがある）をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている。ｐｇｉをコードする遺伝子（１，６５０ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ＣＡＧＧＡＡＴＴＣＧ ＣＴＡＴＡＴＣＴＧＧ ＣＴＣＴＧＣＡＣＧ（配列番号１）、ＣＡＧＴＣＴＡＧＡＧ ＣＡＡＴＡＣＴＣＴＴ ＣＴＧＡＴＴＴＴＧＡ Ｇ（配列番号２）、ＣＡＧＴＣＴＡＧＡＴ ＣＡＴＣＧＴＣＧＡＴ ＡＴＧＴＡＧＧＣＣ（配列番号３）及びＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡ ＴＣＡＴＣＣＧＴＣＡ ＧＣＴＧＴＡＣＧＣ（配列番号４）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号１のプライマーは５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位を、配列番号２及び３のプライマーは５’末端側にＸｂａＩ認識部位を、配列番号４のプライマーは５’末端側にＰｓｔＩ認識部位をそれぞれ有している。

エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）記載の方法により調製し、得られたゲノムＤＮＡ １μｇと、配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２の塩基配列を有するプライマー、配列番号３の塩基配列を有するプライマーと配列番号４の塩基配列を有するプライマーの組み合わせで、上記プライマーＤＮＡ各々１００ｐｍｏｌとを用いて、通常の条件でＰＣＲを行うことによりそれぞれ約１．０ｋｂ（以下ｐｇｉ−Ｌ断片およびｐｇｉ−Ｒ断片と呼ぶことがある）のＤＮＡ断片を増幅した。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｐｇｉ−Ｌ断片をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで、ｐｇｉ−Ｒ断片をＸｂａＩ及びＰｓｔＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）のＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ消化物とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に形質転換して、ｐｇｉをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の２つの断片を含むプラスミドを得、ｐＴＨΔｐｇｉと命名した。

［実施例２］
＜エシェリヒア・コリＭＧ１６５５Δｐｇｉ株の作製＞
実施例１で得たプラスミドｐＴＨΔｐｇｉをエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株に形質転換し、細胞が温度感受性プラスミドを保持できる３０℃でクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレート上で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をＬＢ培地３０℃で３時間から一晩培養後、ＬＢ液体培地または生理食塩水で希釈して、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレート上に塗布した。このＬＢ寒天プレートを、温度感受性プラスミドを保持できない４２℃で培養し、生育した形質転換体をゲノム外−ゲノム間相同組換えによりプラスミド全長がエシェリヒア・コリゲノムに組み込まれた株として得た。

この株からゲノムＤＮＡを取得し、これを鋳型としたＰＣＲを実施して、ｐＴＨ１８ｃｓ１が有するクロラムフェニコール耐性遺伝子がゲノム上に存在すること、およびｐｇｉをコードする遺伝子の５’側近傍領域、及び３’側近傍領域のそれぞれと相同な領域がゲノム上に存在することをもってプラスミド全長がエシェリヒア・コリゲノムに組み込まれた株であることを確認した。

プラスミド全長がエシェリヒア・コリゲノムに組み込まれた株を、クロラムフェニコールを含まないＬＢ液体培地２０ｍｌを入れた１００ｍｌのバッフル付きフラスコに植え、これを３０℃で４時間振とう培養した。この培養液を、クロラムフェニコールを含まないＬＢ液体培地で希釈し、クロラムフェニコールを含まないＬＢ寒天培地上に塗布した。これを４２℃で培養して生育したコロニーを無作為に９６個選抜し、それぞれを、クロラムフェニコールを含まないＬＢ寒天培地上と、クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に生育させ、クロラムフェニコール感受性の株を選抜した。
さらに選抜された株からゲノムＤＮＡを取得し、これを鋳型としたＰＣＲを実施してｐｇｉをコードする遺伝子が欠損した株を選抜し、これをＭＧ１６５５Δｐｇｉ株と命名した。

［実施例３］
＜エシェリヒア・コリｚｗｆ遺伝子の近傍領域のクローニング＞
エシェリヒア・コリのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ｚｗｆと呼ぶことがある）をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている。ｚｗｆをコードする遺伝子（１，４７６ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ＣＡＧＧＡＡＴＴＣＡ ＴＧＣＧＴＴＧＣＡＧ ＣＡＣＧＡＴＡＴＣ（配列番号５）、ＣＡＧＴＣＴＡＧＡＴ ＡＡＣＣＣＧＧＴＡＣ ＴＴＡＡＧＣＣＡＧ（配列番号６）、ＣＡＧＴＣＴＡＧＡＣ ＴＧＣＧＣＴＴＡＴＣ ＣＴＴＴＡＴＧＧＴ（配列番号７）及びＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴ ＴＡＣＣＧＧＴＣＡＴ ＧＣＧＴＧＴＡＡＣ（配列番号８）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号５のプライマーは５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位を、配列番号６及び７のプライマーは５’末端側にＸｂａＩ認識部位を、配列番号８のプライマーは５’末端側にＰｓｔＩ認識部位をそれぞれ有している。

エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡ １μｇと、配列番号５の塩基配列を有するプライマーと配列番号６の塩基配列を有するプライマー、配列番号７の塩基配列を有するプライマーと配列番号８の塩基配列を有するプライマーの組み合わせで、上記プライマーＤＮＡ各々１００ｐｍｏｌとを用いて、通常の条件でＰＣＲを行うことによりそれぞれ約０．８５ｋｂ（以下ｚｗｆ−Ｌ断片と呼ぶことがある）のＤＮＡ断片と約１．０ｋｂ（以下ｚｗｆ−Ｒ断片と呼ぶことがある）のＤＮＡ断片を増幅した。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｚｗｆ−Ｌ断片をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで、ｚｗｆ−Ｒ断片をＸｂａＩ及びＰｓｔＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１のＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ消化物とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に形質転換して、ｚｗｆをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の２つの断片を含むプラスミドを得、ｐＴＨΔｚｗｆと命名した。

［実施例４］
＜エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株の作製＞
実施例３で得たプラスミドｐＴＨΔｚｗｆを、実施例２で得たエシェリヒア・コリＭＧ１６５５Δｐｇｉ株に形質転換し、細胞が温度感受性プラスミドを保持できる３０℃で、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレート上で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をＬＢ培地３０℃で３時間から一晩培養後、ＬＢ液体培地または生理食塩水で希釈して、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレート上に塗布した。このＬＢ寒天プレートを、温度感受性プラスミドを保持できない４２℃で培養し、生育した形質転換体をゲノム外−ゲノム間相同組換えによりプラスミド全長がエシェリヒア・コリゲノムに組み込まれた株として得た。

この株からゲノムＤＮＡを取得し、これを鋳型としたＰＣＲを実施して、ｐＴＨ１８ｃｓ１が有するクロラムフェニコール耐性遺伝子がゲノム上に存在すること、およびｚｗｆをコードする遺伝子の５’側近傍領域、及び３’側近傍領域のそれぞれと相同な領域がゲノム上に存在することをもってプラスミド全長がエシェリヒア・コリゲノムに組み込まれた株であることを確認した。

プラスミド全長がエシェリヒア・コリゲノムに組み込まれた株を、クロラムフェニコールを含まないＬＢ液体培地２０ｍｌを入れた１００ｍｌのバッフル付きフラスコに植え、これを３０℃で４時間振とう培養した。この培養液をクロラムフェニコールを含まないＬＢ液体培地で希釈し、クロラムフェニコールを含まないＬＢ寒天培地上に塗布した。これを４２℃で培養して生育したコロニーを無作為に９６個選抜し、それぞれを、クロラムフェニコールを含まないＬＢ寒天培地上と、クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に生育させ、クロラムフェニコール感受性の株を選抜した。
さらに選抜された株からゲノムＤＮＡを取得し、これを鋳型としたＰＣＲを実施してｚｗｆをコードする遺伝子が欠損した株を選抜し、これをＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株と命名した。

［実施例５］
＜ＧＡＰＤＨプロモーター制御下、ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）発現ベクターの構築＞
エシェリヒア・コリのＧＡＰＤＨ遺伝子の塩基配列はすでに報告されている。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＡ）プロモーターを取得するため、ＣＧＡＧＣＴＡＣＡＴ ＡＴＧＣＡＡＴＧＡＴ ＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴ ＣＣＧ（配列番号９）、及びＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴ ＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣ ＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣ ＴＣＡＧＣＴＡＴＴＴ ＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴ ＡＡＡＡＧＧ（配列番号１０）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ合成した。配列番号９のプライマーはその５’末端側にＮｄｅＩ認識部位を、配列番号１０のプライマーはその５’末端側から順にＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ認識部位をそれぞれ有している。

上記２種のプライマーとともに、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートを用い、通常条件でＰＣＲ法を行い、ＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターをコードするフラグメントを得た。次に上記のＤＮＡフラグメントと、ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した大腸菌用クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｊ０１７４９）を混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３０℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをｐＧＡＰと命名した。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ（ＡＴＣＣ ４５１３）が有するＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０６６２７６）。ｂｔｒＣ遺伝子を取得するために、ＣＡＣＴＧＧＡＧＣＴ ＣＧＣＴＧＧＴＧＧＡ ＡＴＡＴＡＴＧＡＣＧ ＡＣＴＡＡＡＣＡＡＡ ＴＴＴＧ（配列番号１１）、及びＣＡＧＧＡＴＣＣＴＴ ＡＣＡＧＣＣＣＴＴＣ ＣＣＧＧＡＴＣ（配列番号１２）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ合成した。配列番号１１のプライマーはその５’末端側から順にＳａｃＩ認識部位と１３塩基のＧＡＰＤＨ遺伝子のリボソーム結合配列を有している。配列番号１２のプライマーはその５’末端側にＢａｍＨＩ認識部位を有している。

上記２種のプライマーとともに、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓのゲノムＤＮＡをテンプレートとして通常条件でＰＣＲ法を行い、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化することで約１．１ｋｂｐのＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）フラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＧＡＰを制限酵素ＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３０℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ｂｔｒＣを回収して、ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）発現ベクターを構築した。

［実施例６］
＜ＧＡＰＤＨプロモーター制御下、ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）及びスクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）発現ベクターの構築＞
エシェリヒア・コリＯ−１５７株が有するスクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）の塩基配列はすでに報告されている。すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＥ００５１７４に記載のエシェリヒア・コリＯ−１５７株ゲノム配列の３２７４３８３−３２７５８１６に記載されている。ｃｓｃＡ遺伝子を取得するために、ＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣ ＴＧＧＴＧＧＡＡＴＡ ＴＡＴＧＡＣＧＣＡＡ ＴＣＴＣＧＡＴＴＧＣ（配列番号１３）、及びＧＡＣＧＣＧＴＣＧＡ ＣＴＴＡＡＣＣＣＡＧ ＴＴＧＣＣＡＧＡＧＴ ＧＣ（配列番号１４）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ合成した。配列番号１３のプライマーはその５’末端側から順にＢａｍＨＩ認識部位と１３塩基のＧＡＰＤＨ遺伝子のリボソーム結合配列を有している。配列番号１４のプライマーはその５’末端側にＳａｌＩ認識部位を有している。

上記２種のプライマーとともに、エシェリヒア・コリＯ−１５７株のゲノムＤＮＡ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ：ＩＲＭＭ４４９）をテンプレートとして通常条件でＰＣＲ法を行い、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化することで約１．４ｋｂｐのスクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）フラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＧＡＰ−ｂｔｒＣを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３０℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡを回収して、ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）及びスクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）発現ベクターを構築した。

［実施例７］
＜ＧＡＰＤＨプロモーター制御下、ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）、スクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）及びグルコース輸送促進蛋白質遺伝子（ｇｌｆ）発現ベクターの構築＞
Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ ２９１９１）が有するグルコース輸送促進蛋白質遺伝子（ｇｌｆ）の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ６０６１５）。ｇｌｆ遺伝子を取得するために、ＣＣＴＧＴＣＧＡＣＧ ＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴ ＡＴＡＴＧＡＧＴＴＣ ＴＧＡＡＡＧＴＡＧＴ ＣＡＧＧ（配列番号１５）、及びＣＴＡＣＴＧＣＡＧＣ ＴＡＣＴＴＣＴＧＧＧ ＡＧＣＧＣＣＡＣＡ（配列番号１６）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ合成した。配列番号１５のプライマーはその５’末端側から順にＳａｌＩ認識部位と１３塩基のＧＡＰＤＨ遺伝子のリボソーム結合配列を有している。配列番号１６のプライマーはその５’末端側にＰｓｔＩ認識部位を有している。

上記２種のプライマーとともに、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓのゲノムＤＮＡをテンプレートとして通常条件でＰＣＲ法を行い、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳａｌＩ及びＰｓｔＩで消化することで約１．４ｋｂｐのグルコース輸送促進蛋白質遺伝子（ｇｌｆ）フラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡを制限酵素ＳａｌＩ及びＰｓｔＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３０℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを回収して、ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）、スクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）及びグルコース輸送促進蛋白質遺伝子（ｇｌｆ）発現ベクターを構築した。

［実施例８］
＜ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ及びｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆのＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株への導入＞
上記のプラスミドｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡおよびｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆをそれぞれＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで３７℃一晩培養することによりＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ株およびＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株を得た。

［実施例９］
＜ＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ株を用いたＤＯＩの生産性と培養ｐＨによるＤＯＩの生産性の違い＞
前培養として三角フラスコに入れたＬＢ Ｂｒｏｔｈ， Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）２５ｍｌにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ株を植菌し、一晩１２０ｒｐｍで撹拌培養を行った後、下記組成の培地４７５ｇを入れた１Ｌ容培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）に全量植菌した。培養は大気圧下、通気量１．０ｖｖｍ、撹拌速度８００ｒｐｍ、培養温度３０℃で行った。培養槽は全部で４台用い、ｐＨを１２．５％アンモニア水と２Ｎ塩酸を用いてｐＨ７．０、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０に調整した。また、６６０ｎｍの吸光度を測定することにより、菌体濃度を測定した。培養開始時の菌体濃度は全て０．２９であった。培養６２時間後、得られた培養液中のＤＯＩ、スクロース、グルコース、フルクトースの量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。また、６６０ｎｍの吸光度を測定することにより、菌体濃度を測定した。培養に使用する培地の組成を下記表１に記載する。結果を表２に示す。

本実施例により、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ株を用いてスクロースからＤＯＩが生産できることが確認された。
また、本実施例で用いた菌はｐｇｉ遺伝子とｚｗｆ遺伝子が同時に破壊されていることからグルコースを異化代謝できないはずであるが、スクロースを唯一の炭素源とした培地で６２時間培養した結果、全ての試験区において菌は１００倍以上に増えた。このことにより、本発明の大腸菌が、菌体の増殖／生育用に高価なマンニトール等を必要とせず、スクロースを分解して得られるフルクトースを菌体の増殖／生育用に利用していることが確認された。

ｐＨを、ｐＨ７．０、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０と変化させたところ、ＤＯＩの蓄積量は３１ｇ／Ｌ、３６ｇ／Ｌ、３３ｇ／Ｌとなり、ｐＨ６．５のとき最も多くなった。培養６２時間後で、投入されたスクロースは全てのｐＨ条件下で完全に分解され、培地中のフルクトースは、ｐＨ６．５以下のとき最も少なくなった。このことより、ｐＨ６．５以下のときにスクロースの分解により得られたフルクトースが最も効率良く菌体内に取り込まれることが分かった。ｐＨ６．５以下では、まだ培地中にグルコースが残存しているにもかかわらずｐＨ７．０のときと比べてフルクトースの取り込みが早くなっており、ＤＯＩ生産大腸菌が効率良くグルコースとフルクトースを取り込んでいることが分かる。

［実施例１０］
＜ＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ株及びＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株によるＤＯＩの生産＞
前培養として三角フラスコに入れたＬＢ Ｂｒｏｔｈ， Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）２５ｍｌにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ株とＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株をそれぞれ植菌し、一晩１２０ｒｐｍで撹拌培養を行った後、下記組成の培地４７５ｇを入れた１Ｌ容培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）にそれぞれ全量を植菌した。培養は大気圧下、通気量１．０ｖｖｍ、撹拌速度８００ｒｐｍ、培養温度３０℃、ｐＨ６．５（１２．５％アンモニア水で調整）で行った。培養４８時間後、得られた培養液中のＤＯＩとスクロース、グルコースの量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。培養に使用する培地の組成を下記表３に記載する。結果を表４に示す。

培養４８時間後で、ＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ株では３１ｇ／Ｌ、ＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株では４４ｇ／ＬのＤＯＩの蓄積が確認された。本実施例の結果により、ｇｌｆ遺伝子を導入することによってＤＯＩの生産性が向上することが明らかとなった。本実施例の結果において、全ての株で培養開始時に投入されたスクロースは完全になくなっていた。また、ｇｌｆ遺伝子を導入した株では、ｇｌｆ遺伝子を導入していない株と比べてグルコースの消費が明らかに早くなっており、Ｇｌｆ活性の付与によってグルコースが効率良くＤＯＩに変換されていることが示唆された。

［実施例１１］
＜ＢΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株及びＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株による、工業用培地を用いたときのスクロースからのＤＯＩの生産＞
一般に工業生産では、培養培地成分として高価な酵母エキス等の代替としてコーンスティープリカーを使用する。コーンスティープリカー培地を用いた場合のＤＯＩの生産性をエシェリヒア・コリの亜種であるＭＧ１６５５株とＢ株で比較した。
エシェリヒア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）に対しても実施例１〜４に記載の方法でｐｇｉ遺伝子およびｚｗｆ遺伝子の破壊を行い、得られた株をＢΔｐｇｉΔｚｗｆ株と命名した。この株に対して、実施例８に記載の方法で発現ベクターｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを導入し、得られた菌をＢΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株と命名した。

前培養として三角フラスコに入れたＬＢ Ｂｒｏｔｈ， Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）２５ｍｌにＢΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株とＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株をそれぞれ植菌し、一晩１２０ｒｐｍで撹拌培養を行った後、下記組成の培地４７５ｇを入れた１Ｌ容培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）にそれぞれ全量を植菌した。培養は大気圧下、通気量１．５ｖｖｍ、撹拌速度８００ｒｐｍ、培養温度３０℃、ｐＨ６．２（１２．５％アンモニア水で調整）で行った。発酵原料として５０％スクロース水溶液を４ｇ／時の速度で加えながら培養を行った。得られた培養液中のＤＯＩの量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。培養に使用する培地の組成を下記表５に記載する。結果を表６及び図１に示す。表６において、「−」は測定値なしを表す。図１において、黒丸はＢΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株を表し、白四角はＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株を表す。

培養４８時間後で、ＢΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株では３８．５ｇ／Ｌ、ＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株では９．８ｇ／ＬのＤＯＩの蓄積が確認された。本実施例の結果により、エシェリヒア・コリＢ株を用いることでＤＯＩの生産性がＭＧ１６５５株と比較して大きく向上することが明らかとなった。

［実施例１２］
＜ＢΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ株、ＢΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株及びＢΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｐｃｋ株による廃糖蜜からのＤＯＩの生産＞
ｇｌｆ以外のグルコース輸送促進蛋白質遺伝子として、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Ｐｃｋ）を選定した。ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Ｐｃｋ）は、オキサロ酢酸を基質としてホスホエノールピルビン酸を産生する蛋白質である。エシェリヒア・コリが本来もっているグルコースの取り込み系（ＰＴＳ）はホスホエノールピルビン酸を必要とすることから、この蛋白質を高発現することによりホスホエノールピルビン酸の供給量が増加し、結果的にＰＴＳを強化することができると予想される。

エシェリヒア・コリが有するホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Ｐｃｋ）の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ５９８２３）。ｐｃｋ遺伝子を取得するために、ＴＡＣＴＧＣＡＧＡＧ ＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴ ＡＴＡＴＧＣＧＣＧＴ ＴＡＡＣＡＡＴＧＧＴ ＴＴＧ（配列番号１７）、及びＴＡＣＴＧＣＡＧＴＴ ＡＣＡＧＴＴＴＣＧＧ ＡＣＣＡＧＣＣＧ（配列番号１８）の塩基配列を有するプライマーをそれぞれ作製した。配列番号１７のプライマーはその５’末端側から順にＰｓｔＩ認識部位と１３塩基のＧＡＰＤＨ遺伝子のリボソーム結合配列を有している。配列番号１８のプライマーはその５’末端側にＰｓｔＩ認識部位を有している。上記２種のプライマーとともに、エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして通常条件でＰＣＲ法を行い、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＰｓｔＩで消化することで約１．６ｋｂｐのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子（ｐｃｋ）フラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡを制限酵素ＰｓｔＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３０℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｐｃｋを回収して、ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）、スクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子（ｐｃｋ）発現ベクターを構築した。

実施例８に記載の方法でＢΔｐｇｉΔｚｗｆ株に発現ベクターｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｐｃｋを導入し、ＢΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｐｃｋと命名した。

前培養として三角フラスコに入れたＬＢ Ｂｒｏｔｈ， Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）２５ｍｌにＢΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ株、ＢΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株及びＢΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｐｃｋ株をそれぞれ植菌し、一晩１２０ｒｐｍで撹拌培養を行った後、下記組成の培地４７５ｇを入れた１Ｌ容培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）にそれぞれ全量を植菌した。培養は大気圧下、通気量２．０ｖｖｍ、撹拌速度１０００ｒｐｍ、培養温度３２℃、ｐＨ６．２（１２．５％アンモニア水で調整）で行った。発酵原料として９０％廃糖蜜水溶液を６ｇ／時の速度で加えながら培養を行った。得られた培養液中のＤＯＩの量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。培養に使用する培地の組成を下記表７に記載する。結果を表８及び図２に示す。図２において、白菱形はＢΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ株を表し、黒丸はＢΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株を表し、白三角はＢΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｐｃｋ株を表す。

培養３０時間後で、ＢΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ株では３４．８ｇ／Ｌ、ＢΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株では５１．９ｇ／Ｌ、ＢΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｐｃｋ株では３２．８ｇ／ＬのＤＯＩの蓄積が確認された。本実施例の結果により、ｐｃｋを導入した場合の生産性はｐｃｋを導入しない場合と同程度で、ＰｃｋはＤＯＩ生産性を増強させないことが分かった。ＤＯＩの生産性向上のためには、エシェリヒア・コリが本来持つグルコース取り込み系（ＰＴＳ）を強化するよりも、ｇｌｆを導入してＧｌｆ活性を付与するほうがはるかに効果的であることが分かった。

［比較例１］
ｇｌｆ遺伝子の導入がＤＯＩ以外の物質生産にどのような影響を与えるか確認するために、Ｄ−乳酸生産細菌であるＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株にｃｓｃＡ遺伝子とｇｌｆ遺伝子を導入し、乳酸の生成量を調べた。
なお、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株とは、大腸菌ＭＧ１６５５が本来保有するピルベートホルメートリアーゼ（Ｐｆｌ）、ＦＡＤ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｄｌｄ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｍｄｈ）、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ（Ａｓｐ）の各遺伝子が破壊されていて、ＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬｄｈＡ）の遺伝子が導入されていている株のことであり、ＷＯ２００５／０３３３２４号において、１２０ｇのグルコースから９８ｇ／ＬのＤ−乳酸を生産することが確認されている。

＜エシェリヒア・コリＯ−１５７由来スクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）発現ベクター、エシェリヒア・コリＯ−１５７由来スクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）及びザイモモナス・モビリス由来グルコース輸送促進蛋白質遺伝子（ｇｌｆ）発現ベクター、並びにこれらの発現ベクター形質転換体の構築＞
エシェリヒア・コリのＧＡＰＤＨ遺伝子の塩基配列はすでに報告されている。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターを取得するため、配列番号９及び配列番号１０の塩基配列を有するプライマーを合成した。配列番号９のプライマーはその５’末端側にＮｄｅＩ認識部位を、配列番号１０のプライマーはその５’末端側から順にＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ認識部位を有している。
上記２種のプライマーとともに、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用い、通常条件でＰＣＲ法を行い、ＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターをコードするフラグメントを得た。次に上記のＤＮＡフラグメントと、ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した大腸菌用クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｊ０１７４９）を混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをｐＧＡＰと命名した。

エシェリヒア・コリＯ−１５７株が有するスクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）の塩基配列はすでに報告されている。すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＥ００５１７４に記載のエシェリヒア・コリＯ−１５７株ゲノム配列の３２７４３８３−３２７５８１６に記載されている。ｃｓｃＡ遺伝子を取得するために、配列番号１３及び１４の塩基配列を有するプライマーをそれぞれ合成した。配列番号１３のプライマーはその５’末端側から順にＢａｍＨＩ認識部位と１３塩基のＧＡＰＤＨ遺伝子のリボソーム結合配列を有している。配列番号１４のプライマーはその５’末端側にＳａｌＩ認識部位を有している。
上記２種のプライマーとともに、エシェリヒア・コリＯ−１５７株のゲノムＤＮＡ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ：ＩＲＭＭ４４９）をテンプレートとして通常条件でＰＣＲ法を行い、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化することで約１．４ｋｂｐのスクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）フラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＧＡＰを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ｃｓｃＡを回収して、スクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）発現ベクターを構築した。

Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ ２９１９１）が有するグルコース輸送促進蛋白質遺伝子（ｇｌｆ）の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ６０６１５）。ｇｌｆ遺伝子を取得するために、配列番号１５及び１６の塩基配列を有するプライマーをそれぞれ作製した。配列番号１５のプライマーはその５’末端側から順にＳａｌＩ認識部位と１３塩基のＧＡＰＤＨ遺伝子のリボソーム結合配列を有している。配列番号１６のプライマーはその５’末端側にＰｓｔＩ認識部位を有している。
上記２種のプライマーとともに、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓのゲノムＤＮＡをテンプレートとして通常条件でＰＣＲ法を行い、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳａｌＩ及びＰｓｔＩで消化することで約１．４ｋｂｐのグルコース輸送促進蛋白質遺伝子（ｇｌｆ）フラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＧＡＰ−ｃｓｃＡを制限酵素ＳａｌＩ及びＰｓｔＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを回収して、スクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）及びグルコース輸送促進蛋白質遺伝子（ｇｌｆ）発現ベクターを構築した。

上記プラスミドｐＧＡＰ−ｃｓｃＡとｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを特許文献ＷＯ２００５／０３３３２４号に記載されているＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃一晩培養することにより、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株とＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株を得た。

＜ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株及びＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株によるＤ−乳酸の生産＞
前培養として、三角フラスコに５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ Ｂｒｏｔｈ， Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）２０ｍｌを入れ、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株及びＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株をそれぞれ植菌し、９時間、３０℃、２００ｒｐｍで撹拌培養を行った。前培養液０．２ｍＬを下記組成の培地２０ｍＬを入れた１００ｍＬ容量のフラスコにｎ＝４で植菌し、撹拌速度９０ｒｐｍ、培養温度３５℃で培養を行った。培養に使用する培地の組成を下記表９に記載する。なお、スクロースはフィルター滅菌して用いた。得られた培養液中のＤ−乳酸とスクロースの定量はＨＰＬＣで定法に従って測定した。結果を表１０に記載する。

表１０に示されるように、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株によるＤ−乳酸の生産性は、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡの生産性に比べて低かった。Ｄ−乳酸生産大腸菌では、ｇｌｆ遺伝子の導入による生産性向上の効果は全くみられず、むしろ負の効果を示した。このことは、ｇｌｆ遺伝子の導入が発酵による物質の生産過程において生産量を必ずしも高めるものでないことを示している。

２００８年１１月５日に出願の日本国出願番号第２００８−２８４６３９号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (14)

1. スクロース非ＰＴＳ遺伝子群（リプレッサー蛋白質（ＣｓｃＲ）をコードする遺伝子、スクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子、フルクトキナーゼ（ＣｓｃＫ）をコードする遺伝子、及びスクロース透過酵素（ＣｓｃＢ）をコードする遺伝子で構成される遺伝子群）のうちスクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子のみを有すると共に、２−デオキシ−シロ−イノソース（ＤＯＩ）生産系が付与又は強化されたＤＯＩ生産大腸菌。
2. 前記ＤＯＩ生産大腸菌が、糖取り込み能力強化系を有する請求項１に記載のＤＯＩ生産大腸菌。
3. 前記ＤＯＩ生産大腸菌が、該大腸菌が本来有しているホスホグルコースイソメラーゼ（Ｐｇｉ）、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）、ホスホグルコムターゼ（Ｐｇｍ）及び定常期における蛋白質合成の修飾を担うリボソーム修飾因子（Ｒｍｆ）からなる群より選択された少なくとも１つの活性が、不活化又は低減化されている請求項１又は請求項２に記載のＤＯＩ生産大腸菌。
4. 前記ＤＯＩ生産大腸菌が、該大腸菌が本来有しているホスホグルコースイソメラーゼ（Ｐｇｉ）及びグルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）の活性が不活化又は低減化されている請求項１又は請求項２に記載のＤＯＩ生産大腸菌。
5. ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）をコードする遺伝子が導入されたことにより前記ＤＯＩ生産系が付与又は強化された請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のＤＯＩ生産大腸菌。
6. グルコース輸送促進蛋白質（Ｇｌｆ）をコードする遺伝子が導入されたことにより前記糖取り込み能力強化系を有する請求項２〜請求項５のいずれか１項に記載のＤＯＩ生産大腸菌。
7. 前記スクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子が、大腸菌に由来する請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載のＤＯＩ生産大腸菌。
8. 前記スクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子が、エシェリヒア・コリＯ−１５７に由来する請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載のＤＯＩ生産大腸菌。
9. 前記グルコース輸送促進蛋白質（Ｇｌｆ）をコードする遺伝子が、ザイモモナス属細菌に由来する請求項６〜請求項８のいずれか１項に記載のＤＯＩ生産大腸菌。
10. 前記グルコース輸送促進蛋白質（Ｇｌｆ）をコードする遺伝子が、ザイモモナス・モビリスに由来する請求項６〜請求項８のいずれか１項に記載のＤＯＩ生産大腸菌。
11. 前記ＤＯＩ生産大腸菌が、本来スクロース資化能を持たない種類の大腸菌から作られた菌である請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載のＤＯＩ生産大腸菌。
12. 前記ＤＯＩ生産大腸菌が、Ｂ株若しくはその由来株又はＫ−１２株若しくはその由来株の大腸菌から作られた菌である請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載のＤＯＩ生産大腸菌。
13. 請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載のＤＯＩ生産大腸菌を用いて、スクロースを含む植物由来原料からＤＯＩを生産することを含むＤＯＩの生産方法。
14. 請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載のＤＯＩ生産大腸菌をｐＨ６．５以下の培地で培養することを含む請求項１３に記載のＤＯＩの生産方法。