JP2002512802A

JP2002512802A - 芳香族代謝／ｉｉｉ物質の微生物による製造

Info

Publication number: JP2002512802A
Application number: JP2000546021A
Authority: JP
Inventors: クレーマー，マルコ; カルツ，マルティン; スプレンガー，ゲオルグ; サーム，ヘルマン
Original assignee: ディーエスエムビオテックゲーエムベーハー
Priority date: 1998-04-24
Filing date: 1999-04-22
Publication date: 2002-05-08
Also published as: CN1298448A; KR20010042974A; WO1999055877A1; DE19818541A1; DE19818541C2; CA2328598A1; KR100567120B1; CN1289675C; EP1090126A1; AU3445699A

Abstract

(57)【要約】本発明は、芳香族代謝物質、特に芳香族アミノ酸を微生物学的に製造する方法に関する。加えて、本発明は、遺伝子構造及び形質転換された細胞に関する。本発明に従い、物質、特に芳香族アミノ酸の生産の増加がグルコースデヒドロゲナーゼの活性を導入し又は増加させることによって観察される。グルコース酸化酵素の活性の増加は、グルコース含有物質からのグルコノラクトン及びグルコン酸の細胞内形成を導くものである。好ましい態様においては、グルコースデヒドロゲナーゼはＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍから誘導される。本発明に従う方法は、より広範囲な種類の物質の提供に使用可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、請求項１乃至19項及び請求項２９記載の芳香族代謝物質の微生物学
的製造方法、請求項２０乃至２２記載の遺伝子構造物、及び請求項23乃至２8記
載の形質転換された細胞に関する。

【０００２】微生物学的に製造された芳香族代謝物質、例えば、特に芳香族アミノ酸は、ア
ミノ酸の需要が増大し続けていて多大な経済的関心の対象となっている。

【０００３】すなわち、例えば、Ｌ−フェニルアラニンは、薬剤の製造に用いられ、又、特
に、甘味剤アスパルテーム（α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメ
チルエステル）の製造に使用される。Ｌ−トリプトファンは、薬剤として、又
、飼料添加剤として必要とされる；同様に、Ｌ−チロシンが薬剤として、又、薬
品工業において原料として必要とされる。天然物からの分離の他に、バイオテク
ノロジーを使用した製造は、経済的に適性な条件下で、所望の光学活性型のアミ
ノ酸を得るのに非常に重要な方法である。バイオテクノロジー的製造は、酵素的
に又は微生物を使用してのいずれかで遂行される。

【０００４】後者、すなわち微生物学的製造は、単純なそして廉価な原料を採用することが
できる利点を持つ。しかし、アミノ酸の生合成は非常に多種の様式により細胞中
で制御されるので、生産性を増大させる多くの試みがなされている。例えば、ア
ミノ酸同族体が生合成の制御をスイッチオフするのに使用される。例えば、フェ
ニルアラニン同族体に対する抵抗を選択することにより、Ｌ−フェニルアラニン
の生産を増加させるのを可能にするＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉの突然
変異体を得ることができる（ＧＢ−２、０５３、９０６）。また、同様のやり
方でＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＪＰ−１９０３７/１９７６及びＪＰ−
３９５１７/１９７８）及びＢａｃｉｌｌｕｓ（ＥＰ−０、１３８、５２６）の
過剰生産菌株が得られた。

【０００５】加えて、組換えＤＮＡ技術により構築された微生物が知られており、もはやフ
ィードバック阻害されないキー酵素をコードする遺伝子のクローニング及び発現
により生合成の制御が同様に消滅している。ひとつのモデルとして、ＥＰ−０、
０７７、１９６は芳香族アミノ酸を産生する製法を開示し、そのなかで、もはや
フィードバック阻害を起こさない３‐デオキシ‐Ｄ‐アラビノヘプツローソネー
ト‐７‐フォスフェートシンターゼ（ＤＡＨＰシンターゼ）がＥ．ｃｏｌｉ
中で過剰発現されることを開示しいる. ＥＰ‐０、１４５、１５６は、Ｌ−フ
ェニルアラニンを産生するためにコリスメートムターゼ/プリフェネートデヒ
ドラターゼが追加的に過剰発現されるＥ．ｃｏｌｉ菌株を記載している。

【０００６】ここで述べた戦略は、生産性を改善するための介入は芳香族アミノ酸に特異的
な生合成経路に限定されるという共通の特徴を共有する。しかしながら、産生を
更に増加させるためには、アミノ酸を産生するに必要な第一次代謝産物である、
ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）及びエリトロース‐４‐フォスフェイト（
Ｅｒｙ４Ｐ）の供給を改善することに努力することが肝要である。

【０００７】ＰＥＰは、解糖からの産物、ピルベート（ピルビン酸）の活性化前駆体である
；Ｅｒｙ４Ｐは、ペントースフォスフェート経路の中間体である。

【０００８】生産性を増加させるこれらの多くのさまざまな試みは、すべてアミノ酸の細胞
質合成に対する制限を克服することに向けられている。芳香族アミノ酸の製造
において、第一次代謝産物、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）及びＥｒｙ４
Ｐが３‐デオキシ‐Ｄ‐アラビノヘプツローソネート‐７-フォスフェイト（Ｄ
ＡＨＰ）を形成する縮合反応に必要とされる。

【０００９】ある文献は、Ｅｒｙ４Ｐの入手性の増大させる幾つかの戦略、例えば、Ｅｒｙ
４Ｐの供給を増加させること、そして結果として、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チ
ロシン又はＬ−フェニルアラニン産生物の形成が増大することがトランスケトラ
ーゼの過剰発現によって可能になったと報じている（ＥＰ特許出願番号０、６０
０、４６３；Ｆｒｏｓｔ＆Ｄｒａｔｈｓ、Ａｎｎ、Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．４９（１９９５）５５７−５７９）。最近、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉのＰＴＳ−ネガティブ突然変異体の自発的グルコース‐ポジティ
ブ復帰突然変異体は、ＧａｌＰシステムにより細胞中にグルコースを集中させ、
グルコースでの成長が可能であったことが明らかにされた（Ｆｌｏｒｅｓｅｔ
ａｌ．，ｎａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４（１９９６）６２
０−６２３）。トランスケトラーゼ遺伝子ｔｋｔＡの追加的発現は、中間体Ｄ
ＡＨＰの形成の増大が観察されることを結果した。（Ｆｌｏｒｅｓｅｔａｌ
．，ｎａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４（１９９６）６２０−６
２３）。

【００１０】未公開である二つのドイツ特許出願、引用番号ＤＥ１９６４４５６６
．３及びＤＥ１９６４４５６７．１において、出願人は、Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａｃｏｌｉ中のトランスアルドラーゼ又はトランスアルドラーゼ及び
トランスケトラーゼの酵素活性を増加させることにより、又はＥｓｃｈｅｒｉｃ
ｉａｃｏｌｉ中のグルコキナーゼ又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ中の
グルコキナーゼ及び糖のためのＰＥＰ非依存性輸送システムの活性を増加させる
ことにより又は上記酵素と輸送システムを組合せることにより、増大した量のフ
ェニルアラニンを製造することが可能になったことを証明した。

【００１１】本発明の目的は、芳香族代謝物質の改良された微生物学的合成が達成される方
法を利用可能にすることである。

【００１２】また、芳香族代謝物質の形成が増加された微生物が構築される。

【００１３】驚くべきことに、グルコース酸化酵素活性を単純に増加させることにより、芳
香族代謝物質を産生する微生物中で、グルコース又はグルコース含有基質が変化
されることによりその目的が達成される。このようにして、既存のものに変わる
代謝経路が提供される。この経路は、遊離のグルコースをグルコノラクトン/グ
ルコネートへの酸化及び６−ホスホグルコネートを形成するグルコネートのホス
ホリル化を含む。

【００１４】この結果は、単純にグルコース酸化酵素活性を増加させることが芳香族代謝物
質を産生することにおいて重要な役割を演ずるということが決して自明でないか
ら特に驚くべきことである。

【００１５】本発明の意味において、芳香族代謝物質は、Ｅｒｙ４Ｐ、又はＥｒｙ４Ｐ及び
ＰＥＰの供給の増加が生化学的合成に有利である全ての化合物であると理解され
る。例えば、芳香族アミノ酸、インジゴ、インドール酢酸、アジピン酸、メラニ
ン、シキミ酸、コリスミ酸、キノン、安息香酸そして又それらの潜在的誘導体及
び第二次産物である。

【００１６】これに関連して、本発明による介入に加えて、本物質を産生する微生物への更
なる遺伝子的変更が、インジゴ、アジピン酸及び他の非自然的第二次産物の製造
に必要とされることが注目される（Ｆｒｏｓｔ＆Ｄｒａｔｈｓ、Ａｎｎ、Ｒ
ｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９（１９９５）５５７−５７９）。

【００１７】微生物産生芳香族代謝物質は、グルコース又はグルコース含有基質、すなわち
、グルコース含有二糖類又はオリゴ糖を種々の過程で代謝することができる：従
って、グルコースは、ＡＴＰ依存性キナーゼ（ヘキソキナーゼ及びグルコキナー
ゼ）によってホスホリル化され、それによって解糖系に集中されることが知られてい
る。更に、多くの細菌は、グルコースを取込み、それをホスホリル化するための
ＰＥＰ依存性システムを利用する。

【００１８】グルコースは、種々の溶解性又は膜結合された酵素によっても酸化されうる（
グルコノラクトンを経由してグルコン酸に変わる）。これらの酵素は、グルコー
スオキシダーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼを包含する。グルコースオキシ
ダーゼは、分子状酸素の還元を伴い、グルコースを酸化してグルコノラクトンに
する。グルコースデヒドロゲナーゼも、グルコースを酸化してグルコノラクトン
にするが、ピローロキノリンキノン（ＰＱＱ）のような他の電子受容体又はニコ
チンアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）もしくはＮＡＤＰのような他の補助因子
を使用する。膜に結合したグルコースデヒドロゲナーゼは、膜の外側で起きる
反応により補助因子ピローロキノリンキノン（ＰＱＱ）を使用してグルコースを
酸化することが知られている。産生物（グルコノラクトン又はグルコン酸）をそ
の細胞の中へ取り込むために、ｖａｎＳｃｈｉｅｅｔａｌ．，Ｊｏｕｎａ
ｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１６３（１９８５）４９３−４９９；
Ｉｓｔｕｒｉｚｅｔａｌ．，ＪｏｕｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＭｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１３２（１９８６）３２０９−３２１９；Ｉｚｕ
ｅｔａｌ．，ＪｏｕｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ
２６７（１９９７）７７８−７９３により記載されたように特殊の輸送シス
テムを必要とするが、Ｉｚｕ等によってＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌ
ａｒＢｉｏｌｏｇｙ２６７（１９９７）７７８−７９３において及びＣｏｗ
ａｙ．によりＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ１０３
（１９９２）１−２７において記載されたように、その形質発現は、通常（例え
ば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉの中で）グルコースの存在により抑制さ
れる。

【００１９】補助因子ＮＡＤ又はＮＡＤＰを使用するグルコースデヒドロゲナーゼは、細胞
内に見出される可溶性酵素である。知られているプロデューサーは、バチルス菌
株を包含し、その中の幾つかはグルコースデヒドロゲナーゼのイソ酵素を有する
（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍの場合のグルコースデヒド
ロゲナーゼＩ‐ＩＶ；Ｍｉｔａｍｕｒａｅｔａｌ．，１９９０，Ｊｏ
ｕｒｎａｌｏｆＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅ
ｒｉｎｇ７０，３６３−３６９）。グルコースデヒドロゲナーゼの発現は、厳
密に制御されており、例えば、バチルス種による内生胞子の形成過程の胞子前状
態においてのみ生じることが知られている；グルコース上の成長に関連してグ
ルコースデヒドロゲナーゼの生理学的役割は、Ｌａｍｐｅｌ等によりＪｏｕｒｎ
ａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１６６（１９８６）２３８−２４３，
および最近では、Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ又はＦｏｒｔｎａｇｅｌ（“バチルスズ
ブチリス及び他のグラム陽性細菌”（Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ、Ｈｏｃｈａｎ
ｄＬｏｓｉｃｋ，編），Ｍ．Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚｐｐ．１５７−１７０及
びＰ．Ｆｏｒｔｎａｇｅｌｐｐ．１７１−１８０；ＩＳＢＮ１−５５５８
１−０５３−５；ＡＳＭＰｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１
９９３）で報告されたように、明らかでない。

【００２０】これまで、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ、又は特にＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａにおいてはＮＡＤ（Ｐ）依存性グル
コースデヒドロゲナーゼは報告がなかった。バチルス菌株により誘導されたグル
コースデヒドロゲナーゼのための遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
中にクローン化されこの細菌中で発現された（Ｈｉｌｔｅｔａｌ．，Ｂｉｏ
ｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ１０７６（１９９１
）２９８−３０４）。その目的は、特に、組換えグルコースデヒドロゲナーゼを
得るためで、それはグルコース又は補助因子再生のための検出用システムとして
採用されたものである（Ｈｉｌｔｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ
ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ１０７６（１９９１）２９８−３０４；ド
イツ国特許出願３７１１８８１）。対照的にこれらの遺伝子は、たとえば
芳香族代謝物質を得るための基質として、グルコースを活用するためにはこれま
で記載されていない。

【００２１】本発明に従い、グルコースデヒドロゲナーゼを導入し、またはその活性を増加
させることが驚くべきことに物質の形成へと導くということが見出された。グル
コース酸化酵素の活性の増加が、グルコース含有基質からグルコノラクトン及び
グルコン酸の細胞内形成へ導く。好ましい態様では、Ｍｉｔａｍｕｒａ等により
、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄＢｉｏｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ７０（１９９０）３６３−３６９において及びＮａｇａｏ
等により、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１５（１９９
２）５０１３−５０２０において述べられたようにグルコースデヒドロゲナーゼ
は、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ，特にＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇ
ａｔｅｒｉｕｍグルコースデヒドロゲナーゼＩＶに由来する。

【００２２】グルコン酸は、その活性をグルコン酸ホスホリル化酵素に依存する。そのよう
な酵素は、例えば、グルコン酸特異性を有するホスホエノールピルベート依存性
酵素ＩＩでもよいし又はグルコン酸特異性を有するＡＴＰ依存性キナーゼでもよ
いことが知られている。ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＡＴＰ依存性グル
コネートキナーゼＧｎｔｋは、例えば、Ｉｚｕ等によって、ＦＥＢＳＬｅｔ
ｔｅｒｓ３９４（１９９６）１４−１６において；Ｉｚｕ等によって、Ｊ
ｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ２６７（１９９７
）７７８−７９３及びＴｏｎｇ等によって、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ１７８（１９９６）３２６０−３２６９において述べられてい
るように、知られている。

【００２３】Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉにおいて、産生物６−ホスホグルコネート
は、ペントースフォスフェート経路及びエントナードウデロフ（Ｅｎｔｎｅｒ−
Ｄｏｕｄｅｒｏｆｆ）経路双方の酸化枝分れの中間体であり、このことは、Ｆｒ
ａｅｎｋｅｌｎにより、“ＥｓｃｈｅｒｉａｃｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ” 米国、ワシントン、ＡＳＭ出版、第二版（Ｎｅｉｄｈａｒｔｅｔ
ａｌ．，Ｅｄｓ）、ＩＳＢＮ−１−５５５８１−０８４−５、１９９６、１８
９−１９８頁において述べらている。

【００２４】物質の産生は、追加的にグルコン酸（グルコネート）−ホスホリル化酵素の活
性を増加させることにより改良できる。グルコン酸ホスホリル化酵素が使用され
るとき、例えば、多くの種類の微生物からのグルコン酸ホスホリル化酵素が好ま
しい、但し、それらが芳香族代謝物質を産生する微生物中で機能的に発現され得
ることが条件となる。ＡＴＰ依存性グルコネートキナーゼ、好ましくはＥｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉグルコネートキナーゼ、特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉＫ−１２からのグルコネートキナーゼ（Ｇｎｔｋ）の使用が特
に望ましい。グルコン酸ホスホリル化酵素用の他の遺伝子であっても、遺伝子産
生物がグルコン酸をホスホリル化するものであれば、本発明に基づく製法に適し
ているといえる。他の腸内細菌、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓ，Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ，及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌ
ｕｔａｍｉｃｕｍからの遺伝子が例として挙げられる。

【００２５】グルコキナーゼの効果は、グルコン酸／グルコネートの活性化に限定され、そ
れはしかし例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ又は他の細菌によりグルコ
ースの存在下で代謝されない。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ中で
生物がグルコン酸上で成長するときに、グルコネートキナーゼＧｎｔｋが重要
なだけで、グルコースの代謝には寄与しない。Ｉｚｕ等によって、Ｊｏｕｒｎａ
ｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ２６７（１９９７）７７８−
７９３及びＴｏｎｇ等によって、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ１７８（１９９６）３２６０−３２６９において述べられているように、事実、その形成は、グルコースの存在下で実際に抑制され、グルコースの存在
下では起きない。

【００２６】それゆえ、この特定の態様においては、グルコン酸ホスホリル化酵素、特にグ
ルコネートキナーゼ、なかんずくＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉグルコネ
ートキナーゼ、そして特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ−１２から
のグルコネートキナーゼＧｎｔｋの追加の活性増加が、グルコン酸ホスホリ
ル化酵素を細胞外グルコネートの不存在下又はグルコースの存在下で微生物中で
利用できるようにする酵素を提供する。その利点は、本発明に基づく代謝経路に
よる増加した物質の流れである。このことが、グルコン酸の６‐ホスホグルコネ
ートへ変換の増加をグルコースの存在下であっても可能にするのである。これは
、存在する６‐ホスホグルコネートの細胞内における比率を増加させ、それは既
知の代謝順序により当該物質への転化されうる。

【００２７】グルコノラクトンは、グルコース酸化酵素の反応生成物である。グルコノラク
トンが、自動的にグルコン酸に転化可能であり、酵素がこの転化を触媒的に促進
することが述べられている（例えば、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓグ
ルコノラクトナーゼ、ＫａｎａｇａｓｕｎｄａｒａｍａｎｄＳｃｏｐｅｓ
，ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ１１７１
（１９９２）１９８−２００）。それゆえ、別の態様において、グルコノラクト
ンからグルコン酸（又は各々６-Ｐ-グルコネート）への転化を促進するために、
グルコース酸化酵素に加えて又はグルコース酸化酵素及びグルコン酸ホスホリル
化酵素に加えてグルコノラクトナーゼ（例えば、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉ
ｌｉｓからの）のための遺伝子が発現される。

【００２８】グルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコネートキナーゼの遺伝子は、ある種の
バチルス種においては、自然に生じうる；しかしながら、Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ又
はＦｏｒｔｎａｇｅｌ（“バチルスズブチリス及び他のグラム陽性細菌”（
Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ、ＨｏｃｈａｎｄＬｏｓｉｃｋ，ｅｄｓ），Ｓｔｅｉ
ｎｍｅｔｚｐｐ．１５７−１７０及びＰ．Ｆｏｒｔｎａｇｅｌｐｐ．１７
１−１８０；ＩＳＢＮ１−５５５８１−０５３−５；ＡＳＭＰｒｅｓｓ
，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９３）において述べられているように
、その酵素のための遺伝子は異なったオペロン内に配列されそしてグルコースを
代謝するためには一緒には明らかには用いられない。更に、胞子形成条件下でグ
ルコースデヒドロゲナーゼの特異的誘導の故に、その二つの酵素が一緒になって
物質の形成に寄与するとは期待できない。

【００２９】従って、本発明の文脈内で記載されている、芳香族代謝物質の生成のための、
グルコース又はグルコース含有基質上での成長と関連して、グルコース酸化酵素
又はグルコース酸化酵素及びグルコン酸ホスホリル化酵素各々の酵素活性の増加
の効果は、全く予測されないのである。

【００３０】本発明の他の好ましい態様において、ＰＥＰ非依存性の糖摂取のための輸送タ
ンパク質の活性は、グルコース酸化酵素又はグルコース酸化酵素及びグルコン酸
ホスホリル化酵素の増加に加えて、増大する。

【００３１】又、この態様は、ＰＥＰ依存性輸送システムにより糖を摂取することができる
芳香族代謝物質を産生する微生物中でグルコース又はグルコース含有基質のＰＥ
Ｐ非依存性摂取のための輸送タンパク質の活性の増加を含む。追加のＰＥＰ非依
存性輸送システムを組み入れることは、当該物質を産生する微生物中での糖の提
供の増加を可能にする。本発明に従えば、この糖は、細胞内グルコース酸化酵素
によりグルコノラクトンへ及び引き続きグルコン酸に転化されうる。次にグルコ
ン酸は、グルコン酸ホスホリル化酵素の基質となる。一般的に、ＰＥＰは、これ
らの反応のエネルギードナーとして必要とされないので、解糖系及びペントース
ホスフェート経路における物質の一定の流れに基づいて、芳香族化合物のための
共通の生合成経路の第一次代謝物、すなわち３-デオキシ‐Ｄ-アラビノ‐ヘプツ
ローソネート‐７−フォスフェイト（ＤＡＨＰ）を形成するＥｒｙ４Ｐとの縮合
反応のためおよびその後の芳香族代謝物質を生成するためにより多量に利用可能
である。

【００３２】輸送タンパク質の場合は、活性はタンパク質媒介摂取速度(protein-mediated
uptake rate)として理解される。

【００３３】グルコース又はグルコース含有基質のＰＥＰ非依存性摂取のための輸送たんぱ
く質に関して、特にタンパク質媒介の促進された拡散(facilitated diffusion)
の原理に基づき行動する輸送たんぱく質、特に促進剤（facilitator）の使用が
望まれる。Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓからのグルコース促進剤タン
パク質（Ｇｌｆ）の使用が特に好ましい。後者が使用されるとき、そのタンパク
質をコードする遺伝子、すなわち、ｇｌｆは、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ、特にＰａｒ
ｋｅｒ等によって、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１５（１
９９５）７９５−８０２において又Ｗｅｉｓｓｅｒ等によって、Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７７（１９９５）３３５１−３３５４に
おいて記載されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓＡＴＣＣ３１８２１から分離された促
進剤遺伝子に由来する。しかしながら、他の細菌由来の糖輸送遺伝子であって、
その遺伝子産生物が糖を輸送し、その際いかなるＰＥＰも使用しない遺伝子、た
とえば、ＥｓｃｈｅｒｉａｃｈｉａｃｏｌｉＧａｌＰ系の遺伝子が本発明
の製法にとくに適している。更にＨＸＴ１〜ＨＸＴ７のような、Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｐｉｃｈｉａｓｔｉｐｉｔｉｓ又
はＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓのような真核細胞微生物から由来
する遺伝子又は極めて一般に他の微生物由来であって、微生物中で機能的に発現
されかつ同時にその遺伝子産生物がＰＥＰなしでグルコースをホスホリル化し及
び/又は輸送するために働きうる遺伝子を使用できる。糖輸送遺伝子は、アミノ
酸プロデューサー中で発現され得ることが特に望ましい。

【００３４】本発明の意味内において、活性を増加させる手段とは、グルコース酸化酵素の
活性、又はグルコース酸化酵素の活性及び加えて、グルコン酸ホスホリル化酵素
、グルコノラクトナーゼ及びＰＥＰ非依存性糖摂取のための輸送タンパク質の中
の少なくとも一つの活性を増加するに適したあらゆる手段であると理解される。
次のものは、この目的にとって特に好ましいものである。 ‐例えば、ベクター又は鋳型ファージを使用する遺伝子の導入； ‐遺伝子コピー数の増大、例えば、本発明に従い遺伝子を増大したコピー数で、
わずか（例えば、２〜５倍）から大きく増大したコピー数（例えば、１５〜50倍
）までのコピー数で、生物に導入する目的でプラスミドを使用すること； ‐遺伝子発現の増大、例えば、転写速度を増大させること、たとえばＰｔａｃ、
Ｐｔｅｔ又は他の調節ヌクレオチド配列のようなプロモーター因子を使用するこ
と及び／又は翻訳速度を増大させること、例えば、コンセンサスリボソーム結合
部位を使用することにより； ‐存在する酵素の内在活性を高めること、例えば、古典的な手法に従って間接的
な方法で発生される突然変異により、例えば、UV照射又は変異原化合物により、
あるいは除去、挿入、及び／又はヌクレオチド交換等の組替えDNA法により特異
的に作られる突然変異によって； ‐酵素の構造を変えることにより酵素活性を増加させること、例えば、物理的、
化学的、分子生物学的又は他の微生物学的方法を使用しての突然変異誘発による
； ‐脱調節された酵素、例えば、もはやフィードバック阻害されていない酵素を使
用すること； ‐脱調節された酵素をコードする相当する遺伝子を導入すること。

【００３５】更に、記載した方法及び活性を増加させる他類似の方法の組み合わせも採用す
ることが可能である。輸送タンパク質の場合には、内在的活性は増加されること
ができ、例えば、上記方法を使用して遺伝子をクローン化することにより、たと
えば物質の輸送の増加を発揮する突然変異体を選択することにより行う。

【００３６】好ましくは、一つの遺伝子構造あるいは幾つかの遺伝子構造物中に入れられた
単一遺伝子又は複数の遺伝子によって、活性の増加が達成される。遺伝子は、一
つのあるいは複数の遺伝子として、単一コピーとして又は増加したコピー数にお
ける遺伝子構造物中に導入される。

【００３７】本発明の意味内で、遺伝子構造物は、遺伝子又は本発明に従った遺伝子を有す
る何らかのヌクレオチド配列と理解される。適当なヌクレオチド配列はたとえば
、プラスミド、ベクター、染色体、ファージ又は環状に閉じていない他のヌクレ
オチド配列であり得る。

【００３８】芳香族アミノ酸代謝の最初の中間体を産生するＰＥＰの利用可能性は、Ｅｒｙ
４Ｐに向かう物質の流れが増大されている微生物に制限される。そのような場合
には、代謝におけるＰＥＰ消費性反応を、もし存在すればであるが、減少させ又
はスイッチオフ（switch off）するのが有益でありうる。その反応とは、ＰＥＰ
反応：ＰＥＰ依存性糖摂取を触媒する糖ホスホトランスフェラーゼシステム（Ｐ
ＴＳ）である。

【００３９】本発明によれば、ＰＴＳ活性の自然のレベルを示す有機体の使用がなされる；
しかし、その方法をさらに改善する目的で、ＰＴＳ活性が減少されたところのＰ
ＴＳ突然変異体の使用もまた可能である。この性質の減少は、酵素レベルにおい
てまたは遺伝子的手法によるいずれかで達成され、後者は例えば、ｐｔｓ遺伝子
を発現する代替の、強力な抑制可能なプロモーターの使用により、又は、ｇｌｆ
遺伝子を染色体の中に、特にそのｐｔｓ遺伝子の遺伝子座の中に挿入することに
よりなされ、これは同時にその染色体中の組換えＤＮＡの安定化（分離安定性）
及びその結果としてのベクターを使用して処理する能力に関係する。更に、調節
可能なプロモターと一緒になってＰＴＳ活性は、培養期間中の関連するプロモー
ターの誘起物質又は阻害物質を加えることにより影響を受ける。

【００４０】芳香族代謝物質を製造する本発明の方法において、微生物の中でこれらの物質
の合成に追加的に関与する1以上の酵素が脱制御され及び/又はそれらの活性を増
加させた微生物を採用することが好ましい。

【００４１】これらの酵素は、特に、芳香族アミノ酸代謝の酵素、特にＤＡＨＰシンター
ゼ、シキミ酸キナーゼ、コリスメートムターゼ/プリフェネートデヒドラターゼ
及び芳香族代謝物質の合成に関与している他のすべての酵素、特にトランスアル
ドラーゼ、トランスケトラーゼ及びグルコキナーゼ等である。

【００４２】本発明の酵素とは別に、アジピン酸、胆汁酸及びキノン化合物及びその誘導体
等の物質の製造に重要なのは特にＤＡＨＰシンターゼの脱制御及び過剰発現であ
る。加えて、シキメートキナーゼは、例えば、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシ
ン、インディゴ、及びヒドロキシ‐及びアミノ安息香酸、及び、ナフト‐及びア
ントラキノン、及びそれらの第二次産生物の過剰合成を達成するために、脱制御
されそしてその活性を増加されるべきである。脱制御され、過剰発現されたコリ
スメートムターゼ／プリフェネートデヒドラターゼは、フェニルアラニン及びフ
ェニルピルビン酸及びそれらの誘導体の効率的製造に特に重要である。しかしな
がら、Ｅｒｙ４Ｐ又はＥｒｙ４Ｐ及びＰＥＰの供給によってその産生が促進され
る物質の生化学的合成にその活性が寄与するあらゆる他の酵素をも包含すること
も意図されている。

【００４３】本発明に基づく介入とは別に、微生物に対する更なる遺伝子的変更が、インデ
ィゴ、アジピン酸及び他の非自然第二次産生物の製造には要求される。これらの
手段は、当業者には知られている（Ｆｒｏｓｔ＆Ｄｒａｔｈｓ，Ａｎｎ．Ｒ
ｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．４９（１９９５）５５７−５７９）。

【００４４】本発明に基づく方法は、芳香族アミノ酸、特にＬ−フェニルアラニンを製造す
るのに適している。Ｌ−フェニルアラニンの場合には、脱制御されたＤＡＨＰシ
ンターゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＡｒｏｆ又はＡｒｏＨにおける）及び/又は
同様に脱制御されたクリスメートムターゼ／プリフェネートデヒドラターゼ（Ｐ
ｈｅＡ）の遺伝子発現及び/又は酵素活性を同時に増加させることが好ましい。

【００４５】好ましい産生有機体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種であり又Ｓｅｒｒａｔｉ
ａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、またはＢｒｅｖｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ属の微生物又は古典的アミノ酸法によって知られているたの菌
株である。Ｎｏｒｃａｒｄｉｃｅａｅ及びＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓファ
ミリーの細菌も同様である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉが特に好まし
い。

【００４６】本発明は又、本方法を特別に成功裏に実施することを可能にする好ましい遺伝
子及びこれらの遺伝子を運ぶ形質転換された細胞の提供に関する。

【００４７】本発明の趣旨の範囲内で、新たな遺伝子構造物が利用可能となり、それらの遺
伝子構造物は組み換え体の形で、ａ）グルコン酸ホスホリル化酵素をコードする
遺伝子と共に又はｂ）ＰＥＰ非依存性糖摂取のための輸送タンパク質をコードす
る遺伝子と共に又はｃ）グルコン酸ホスホリル化酵素、グルコノラクトナーゼ、
糖のＰＥＰ非依存性摂取のための輸送タンパク質をコードする３つの遺伝子の内
のすくなくとも２つと共に、グルコース酸化酵素をコードする遺伝子を含む。

【００４８】特に、グルコース酸化酵素のための遺伝子はグルコースデヒドロゲナーゼをコ
ードし、グルコン酸ホスホリル化酵素用の遺伝子は、グルコネートキナーゼをコ
ードする。

【００４９】グルコースデヒドロゲナーゼのための遺伝子は、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍから誘導され、グルコネートキナーゼのための遺伝子は、
好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉから誘導され、グルコノラクトナ
ーゼ及び輸送タンパク質のための遺伝子は、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉ
ｓから誘導される。グルコースデヒドロゲナーゼのための遺伝子がＢａｃｉｌｌ
ｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍからのグルコースデヒドロゲナーゼＩＶ（ｇｄｈIV
）であり、グルコネートキナーゼのための遺伝子ｇｎｔｋが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉからのＧｎｔｋであり、輸送タンパク質及びグルコノラクトナ
ーゼのための遺伝子が、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓからのｇｌｆ及び
ｇｎｌ遺伝子であるところの遺伝子構造物がとくに有利である。関連する遺伝子
の分離及び細胞の形質転換は、従来の方法で遂行される：Ｅ．ｃｏｌｉグルコネ
ートキナーゼ遺伝子ｇｎｔＫ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍグルコ
ースデヒドロゲナーゼＩＶ（ｇｄｈＩＶ）遺伝子又はＺｙｍｏｍｏｎａｓ
ｍｏｂｉｌｉｓグルコノラクトナーゼ（ｇｎｌ）遺伝子又は輸送遺伝子ｇｌｆを
クローン化する場合には、遺伝子の特異的に増殖するポリメラーゼチェーン反応
（ＰＣＲ）法が好ましく、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ−１２（ｇｎ
ｔＫ），Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（ｇｄｈＩＶ）、Ｚｙｍｏ
ｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓ菌株ＡＴＣＣ２９１９１又はＡＴＣＣ３１
８２１（ｇｎｌ，ｇｌｆ）を各々使用する。

【００５０】公知のベクター（ｐＧＥＭ７、ｐＵＣＢＭ２０、ｐＵＣ１９又はその他）でDN
Aを増幅し、試験管内でそれを組換えた後で、宿主細胞は化学的方法、エレクト
ロポレーション、形質導入又は接合の手段により形質転換される。

【００５１】３つのドナー有機体からのｇｎｔＫ，ｇｄｈＩＶ，ｇｎｌ及びｇｌｆ遺伝子の
完全ヌクレオチド配列は、知られており、一般的にアクセス可能な入手先より入
手可能であり、例えば、ハイデルバーグにあるＥＭＢＬ／ＨＵＳＡＲのようなデ
タベースにおいてからアクセス番号、Ｄ８４３６２（ｇｎｔＫ），Ｄ１０６
２６（ｇｄｈＩＶ），X ６７１８９（ｇｎｌ）及びＭ６０６１５（ｇｌｆ
）で寄託されている。ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ−１２菌株からの
染色体ＤＮＡを用いた遺伝子及びＩｚｕ等によって、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ２６７（１９９７）７７８−７９３及びＴ
ｏｎｇ等によって、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７８
（１９９６）３２６０−３２６９において述べられている遺伝子配列を用いた遺
伝子を特異的に増幅させるＰＣＲは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｇｎ
ｔＫ遺伝子をクロ−ン化するのに好ましい。Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒ
ｉｕｍからの染色体ＤＮＡはたとえば、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕ
ｍｇｄｈＩＶ遺伝子（Ｎａｇａｏｅｔａｌ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７４（１９９２）５０１３−５０２０）をクローン化
するのに好ましい。

【００５２】分離されたグルコースデヒドロゲナーゼＩＶ遺伝子は、本発明の趣旨の範囲内
で述べられた１以上の遺伝子と共に、いかなる組み合わせでも組み込まれて、単
一の遺伝子構造物あるいは幾つかの遺伝子構造物とされることができる。これは
、遺伝子構造への正確な配置を考慮することなく、ｇｄｈＩＶ＋ｇｎｔＫ，ｇｄ
ｈＩＶ＋ｇｌｆ，ｇｄｈＩＶ＋ｇｎｔＫ＋ｇｌｆ；ｇｄｈＩＶ＋ｇｎｔＫ＋ｇｎ
ｌ；ｇｄｈＩＶ＋ｇｎｌ＋ｇｌｆ；ｇｄｈＩＶ＋ｇｎｔＫ＋ｇｎｌ＋ｇｌｆのよ
うな組み合わせに導く。上記遺伝子構造物に加えて、トランスケトラーゼ、トラ
ンスアルドラーゼ、グルコキナーゼ、ＤＡＨＰシンターゼ、コリスメートムター
ゼ/プリフェネートデヒドラターゼ、コリスメートムターゼ/プリフェネートデヒ
ドラゲナーゼ又は芳香族代謝物質の合成にポジティブに影響をあたえる他の酵素
をコードする1以上の遺伝子を追加的に含むいかなる遺伝子構造物をも意味する
。

【００５３】遺伝子を配置するとき、ｇｌｆは、一つの遺伝子構造又は複数の遺伝子構造中
に、膜タンパク質の過剰発現から生じる在りうる負の結果を避けるために、好ま
しくは低いコピー数ｘ（ｘ＝１-１０）で導入される。

【００５４】遺伝子の一つに与えられた少なくとも一つの調節遺伝子配列を含む遺伝子構造
が、有利である。

【００５５】従って、調節要素は、特に転写シグナルを強化することにより転写レベルにお
いて好ましく強化されうる。これはたとえば、構造遺伝子の上流に位置するプロ
モーター配列を変化させことにより又はより活性なプロモーターで完全にそのプ
ロモーターを置き換えることにより、プロモーターの活性を増加して達成される
。転写は、又、遺伝子に割り振られた調節遺伝子に適切に影響を及ぼすことによ
り強化されうる；しかし加えて、たとえばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の
安定性を改善することにより翻訳を強化することもできる。

【００５６】更に、本発明の趣旨の範囲内で、複製可能な形で本発明の遺伝子構造物を宿す
形質転換された細胞もまた利用可能である。本発明の目的の範囲内で、形質転換
された細胞とは、芳香族代謝物質の細胞中で形成の増加をもたらす本発明の遺伝
子構造物を運ぶ任意の微生物を意味するものと理解される。宿主細胞は、化学的
方法で（ＨａｎａｈａｎＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６（１９８３）５５７−
５８０）またエレクトロポレイション、接合又は形質導入によっても形質転換さ
れる。

【００５７】形質転換のために、物質の合成に追加的に関与する1以上の酵素が、脱制御さ
れ及び/又はその活性を増加されている宿主細胞を採用することが有利となる。
微生物菌株、特に本発明に基づき芳香族アミノ酸または他の芳香族代謝物質を産
生するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉは、関連する遺伝子を含む遺伝子構造
物により形質転換される。

【００５８】遺伝子構造物による形質転換のために、更に、ＰＥＰ依存性糖摂取系が存在す
れば、その活性が減少又はスイッチオフされている宿主細胞を採用することが好
都合である。

【００５９】特に、形質転換された細胞は、芳香族アミノ酸好ましくはＬ−フェニルアラニ
ンを産生できる形質転換細胞が利用可能にされる。

【００６０】芳香族代謝物質を微生物学的に製造する方法であって、上記したように、遺伝
子構造物を宿す形質転換された細胞を使用する方法が従って利用できるようにな
る。

【００６１】本発明に基づく方法の特に好ましい態様においては、Ｅｒｙ４Ｐとは別に、中
枢代謝の他の代謝物をも含む形質転換細胞が、より利用可能性が増した状態で使
用される。これらの代謝物の例は、細胞内合成過程から生じるα‐オキソグルタ
レート又はオキサロアセテート、又は、対応する化合物中で供給することによっ
て成長する細胞が利用できるその他のもの、又は、クエン酸回路の代謝物として
のフマール酸又はマレイン酸エステルのようなそれらの前駆体である。

【００６２】Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ菌株ＡＴ２４７１／ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫｇｄｈＩＶは、ＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ
ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍａｎｄＣｅｌｌ
Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に1998年4月15日にブタペスト条約の条件下で寄託番号
ＤＳＭ 12118の下に寄託された。

【００６３】採用された有機体、即ちＡＴ２４７１は、ＴａｙｌｏｒとＴｒｏｔｔｅｒ（Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．１３（１９６７）３３２−５３）によって番号
４５１０でＣＧＳＣに寄託され、無償で入手できる。

【００６４】採用された物質及び方法が下記に示されそして本発明が実験による実施例及び
比較例により支持される。

【００６５】一般的方法遺伝子研究の目的の範囲内で、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株は、特に断りの無い限り、デ
ィフコバクトトリプトン（１０ｇ／ｌ），ディフコ酵母エキス（５ｇ／ｌ）
及び食塩（１０ｇ／ｌ）からなるＬＢ培地で培養した。採用された菌株の耐性に
より、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）及びクロラムフェニコール（１７−３４
ｍｇ／ｌ）が、必要に応じ培地に加えられた。これに関連して、アンピシリンは
、あらかじめ水に溶解させ、クロラムフェニコールはあらかじめエタノールに溶
解させ、そして濾過により滅菌した後に既にオートクレーブにかけた培地に加え
られた。ディフコバクトアガー（１．５％）が、寒天プレートを作成するため
ＬＢ培地に加えられた。

【００６６】Ｅ．ｃｏｌｉからのプラスミドＤＮＡは、商業的に入手可能なシステム（Ｑｉ
ａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）を用いてアルカリ溶解法により分離された。染色体Ｄ
ＮＡは、チェン（Ｃｈｅｎ）及びクオ（Ｋｕｏ）法（Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅ
ｓ．２１（１９９３）２２６０）を使用してＥ．ｃｏｌｉ及びＢａｃｉｌｌｕ
ｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＤＳＭ３１９から分離された。制限酵素である、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、アルカリ性フォスファタ
ーゼ、ＲＮａｓｅ及びＴ４ＤＮＡリガーゼが製造者指示（ベーリンガー、マン
ハイム、ドイツ又はプロメガ社、ドイツ、ハイデルバーグ）に基づいて用いられ
た。制限分析については、ＤＮＡ断片が、アガロースゲル（０．８％）中で分画
され、そして商業的に入手可能なシステム（ＱｕｉａＥｘＩＩ，ドイツ、ヒルデ
ン）を使用して抽出によりアガロースから分離された。

【００６７】形質転換前に、細胞は、３７℃で２．５−３時間、２００ｒｐｍの回転でＬＢ
培地中（５ｍｌ管）でインキュベートした。約０．４の吸光度（６２０ｎｍ）に
おいて、細胞を遠心分離で落とし、ＴＳＳ（１０％(w/v)ＰＥＧ８０００，５
％（v/v）ＤＭＳＯ及び５０ｍＭＭｇＣｌ₂を含むＬＢ培地）の１０分の１体積
の量で採取した。４℃で３０分間０．１〜１００ｎｇのＤＮＡと共にインキュベ
ートし、引き続き、３７℃で１時間インキュベートした後で、細胞は、適当な抗
生物質を含むＬＢ培地上にプレートされた。

【００６８】

【実施例１】本発明に基づくプラスミドをベースとした遺伝子構造のモデルとしてのｐＧＥＭ７ｇｎｔＫｇｄｈＩＶの調製グルコースデヒドロゲナーゼＩＶをコードするＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔ
ｅｒｉｕｍＤＳＭ３１９ｇｄｈＩＶ遺伝子が、Ｎａｇａｏ等著、Ｊｏｕ
ｒｎａｌＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第１５巻（１９９２）、第５０１３〜５
０２０頁に記載された既知の遺伝子のＤＮＡ配列に基づいて、ポリメラーゼチェ
ーン反応法（ＰＣＲ）によってＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＤＳ
Ｍ３１９の染色体ＤＮＡの特異的増幅に従いクローン化された。ＰＣＲオリゴ
ヌクレオチドプライマーは、制限酵素ＢａｍＨＩ（５´末端）及びＳａｃＩ（３
´末端）についての開裂部位が備えられた。プライマー１（ＢａｍＨＩ）は、５
´ＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＡＡＣＡＣＴＡＧＧＡＧＧＡＴ
ＴＴＴ 3´からなる。プライマー２（ＳａｃＩ）は、５´ ＧＣＣＡＧＡ
ＧＣＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＣＡＴＣＧＡＴＴＡＡＡＡＡＣ
ＴＡＴ３´からなり，ｇｄｈＩＶ遺伝子の３´末端に対し相補的であった
。結果として生じるＤＮＡ増幅産生物は、約８００の塩基対を持ちＢａｍＨＩ及
びＳａｃＩによって制限され、次いで同じように処理された（表１参照）ベクタ
ーｐＧＥＭ７内に連結された。形質転換は、菌株ＪＭ１０９ＤＥ３の中でＸ−Ｇ
ａＬ及びアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で選別して達成された。成功裡
のクローン化が、クローン化されたｇｄｈＩＶ遺伝子のＤＮＡ配列を決定するこ
とにより検出された。このベクター（ｐＧＥＭ７ｇｄｈＩＶ）は、Ｔ７ポリメラ
ーゼ系（菌株ＪＭ１０９ＤＥ３）の存在なしでもグルコースデヒドロゲナーゼＩ
Ｖ活性の発現を可能にした（表２参照）。染色体テンプレートとしてのＥ．ｃｏ
ｌｉＫ−１２Ｗ３１１０菌株を使用して，特異性ＤＮＡ増幅法によってＥｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ−１２グルコネートキナーゼのｇｎｔＫ遺
伝子がクローン化された。ｇｎｔＫ遺伝子の配列は、Ｔｏｎｇ等によって、Ｊｏ
ｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第１７８巻（１９６６）、第３
２６０〜３２６９頁において記載されている。ＰＣＲによる増幅法については、
ＥｃｏＲＩ（５´）及びＢａｍＨＩ（３´）に関する制限開裂部位を追加的に備
えたオリゴヌクレオチドプライマーが選択された。プライマー１は、５´ ＣＣ
ＧＡＡＴＴＣＴＴＧＴＡＴＴＧＴＧＧＧＧＧＣＡＣ３´から
なり及びｇｎｔＫ遺伝子の５´上流に結合する；プライマー２は、５´ ＣＣＧ
ＧＡＴＣＣＧＴＴＡＡＴＧＴＡＧＴＣＡＣＴＡＣＴＴＡ３
´からなり、ｇｎｔＫ遺伝子の３´末端に対し相補性である。約６００の塩基対
を持つ増幅産生物は精製され、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩによって制限され、開
環されているベクターｐＧＥＭ７に連結された。形質転換は、菌株ＪＭ１０９Ｄ
Ｅ３の中でＸ−ＧａＬ及びアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上を選択して達
成された。成功裡のクローン化が、クローン化されたｇｎｔｋ遺伝子のＤＮＡ配
列を決定することにより検出された。このベクター（ｐＧＥＭ７ｇｎｔｋ）は、
Ｔ７ポリメラーゼ系（菌株ＪＭ１０９ＤＥ３）の存在なしでもグルコネートキナ
ーゼ活性の発現を可能にした（表２参照）。ｇｎｔＫ及びｇｄｈＩＶ遺伝子は、ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩによる二重制限に
付してベクターｐＧＥＭ７ｇｄｈＩＶを開くことにより結合される。８００の塩
基対断片は、ベクターｐＧＥＭ７ｇｄｈＩＶを制限した後に得られ、ｇｄｈＩＶ
遺伝子を含んでいるが、このようにして開かれたこのベクター内に連結される。
再び、形質転換がアンピシリンについて選別して遂行される。新しい遺伝子構造
ｐＧＥＭ７ｇｎｔｋｇｄｈＩＶが、本発明に従い、グルコースデヒドロゲナーゼ
ＩＶに関して又グルコネートキナーゼＧｎｔＫに関して酵素活性のＴ７ポリメラ
ーゼ非依存性発現を媒介する（表２参照）。得られた形質転換細胞は、−８０℃においてグリセリン培養物の形でＬＢ培地
上で保管される。必要なときに、グリセリン培養物は使用直前に解凍される。

【００６９】

【実施例２】グルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコースキナーゼの酵素活性の測定バクテリア粗抽出物における酵素活性を測定するために、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞及
びプラスミド寄生突然変異体の細胞が、鉱物性培地で培養された。この培地は、
クエン酸・３Ｈ₂Ｏ（１．０ｇ／ｌ）、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（０．３ｇ／ｌ）、
ＫＨ₂ＰＯ₄（３．０ｇ／ｌ），ＫＨ₂ＰＯ₄（１２．０ｇ／ｌ），ＮａＣｌ（０．
１ｇ／ｌ），（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄（５．０ｇ／ｌ），ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ（１５．
０ｍｇ／ｌ），ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（０．０７５ｇ／ｌ）及びＬ−チロシン（０
．０４ｇ／ｌ）からなる。更に、鉱物が痕跡量の元素溶液（１ｍｌ／ｌ）の形で
加えられた。その溶液は、Ａｌ₂（ＳＯ₄）₃・１８Ｈ₂Ｏ（２．０ｇ／ｌ）、Ｃｏ
ＳＯ₄・６Ｈ₂Ｏ（０．７ｇ／ｌ）、ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ（２．５ｇ／ｌ）、Ｈ₃
ＢＯ₃（０．５ｍｇ／ｌ）、ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ（２０．０ｇ／ｌ）、Ｎａ₂Ｍ
ｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ（３．０ｇ／ｌ）、ＮｉＳＯ₄・３Ｈ₂Ｏ（２．０ｇ／ｌ）及びＺ
ｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（１５．０ｇ／ｌ）からなった。ビタミンＢ１（５．０ｍｇ／
ｌ）が、水に溶解され、ろ過により滅菌された後、オートクレーブで処理された
培地に加えられた。必要に応じアンピシリン、及び／又はアンピシリンとクロラ
ンフエニコールが同様に加えられた。グルコース（３０ｇ／ｌ）は、別途同じよ
うにオートクレーブで処理され、あらかじめオートクレーブで処理された培地に
加えられた。採取された細胞は、１００ｍｌのトリス/ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄
した。沈殿物の細胞は、超音波（マイクロチップ装着ブランソンソニフィアー
２５０）で、２５％の超音波処理サイクルで、４０ワットの強さで、細胞縣濁液
１ｍｌにつき４分の時間で破壊した。１８、０００ｇ、及び４℃で３０分間遠心
分離の後、上澄み（粗抽出液）が、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はグル
コネートキナーゼの活性の測定のために使用された。グルコースデヒドロキナーゼの活性は、Ｈａｒｗｏｏｄ＆Ｃｕｔｔｉｎｇ、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＢａｃｉ
ｌｌｕｓ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ｓｏｎｓに記載の方法で測定された。グ
ルコースデヒドロゲナーゼは、グルコースからグルコノラクトンへの酸化を触媒
する。酵素の活性は光度計により、還元された補助因子ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺の濃度の
増加を３４０ｎｍの波長で測定することにより決定された。１ｍｌの全容量を有
する石英キュヴェット中で測定した。反応混合液は、トリスＨＣｌ（最終濃度
２５０ｍＭ、ｐＨ８．０）、２．５ｍＭＥＤＴＡナトリウム、１００ｍＭＫ
Ｃｌ及び２ｍＭＮＡＤからなった。粗抽出液は、２５℃で５分間緩衝液中で予
めインキュベイトした。グルコース（最終濃度、１００ｍＭ）が検出反応を開始
するために加えられた。吸光度の増加は、３４０ｎｍでモニターした。各場合に
おいてグルコースなしの混合液を対照として供した。特異的グルコースデヒドロ
ゲナーゼ活性は、１分当たり及びタンパク質１ｍｇ当たり１μモルのグルコース
ヘの変換と同等であるよう設定された、１分当たり及びタンパク質ｍｇ当たり１
μモルのＮＡＤＨ形成として定義されるＵ／ｍｇ単位で与えられる。グルコネートキナーゼは、Ｉｚｕ等によって，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ、第
３９４巻（１９９６）第１４〜１６頁に記載されたようにして粗抽出液中で測定
された。グルコネートキナーゼは、グルコネートから６−ホスホグルコネートへのＡＴ
Ｐ依存性ホスホリル化反応を触媒する。酵素試験においては、形成される６−ホ
スホグルコネートが、ＮＡＤＰ依存性補助酵素６−ホスホグルコネートデヒドロ
ゲナーゼ（ベーリンガーマンハイム、Ｎｏ．１０８４０５）を使用したときのＮ
ＡＤＰＨ濃度の増加により３４０ｎｍの波長で光度計で測定される。これに関連
して、１μモルのＮＡＤＰＨの形成は、１μモルのグルコネートのホスホリル化
に相当する。酵素的検出は、１ｍｌの全容量を有する石英キュヴェット中で２５
℃において遂行された。反応混合液は、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、１
００ｍＭＡＴＰ、０．２５ｍＭＮＡＤＰ、１．２単位の補助酵素６−ホスホ
グルコネートデヒドロゲナーゼ及び変動量の粗抽出液を含んだ。混合液は、２５
℃で５分間、予めインキュベイトされ、次いで反応はグルコン酸（ｐＨ６．８；
混合液での最終濃度、１０ｍＭ）を加えて開始された。グルコン酸を加えない混
合液は、対照として利用に供された。粗抽出液中のタンパク質濃度は、商業的に入手可能な色素試薬を使用してＢｒ
ａｄｆｏｒｄＭ．Ｍ．（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第７２巻（１９７６）
第２４８〜２５４頁）に従って測定された。仔牛血清アルブミンがスタンダード
として用いられた。表２は、宿主菌株Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０及びプラスミドｐＧＥＭ７ｇｄｈ
ＩＶ、ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫ又はｐＧＥＭ７ｇｎｔＫｇｄｈＩＶを寄生させる突然
変異体を使用したときの酵素測定結果を表す。既に述べられ、及び本発明に従う
遺伝子構造が用いられた場合には、本発明に従い、細胞中で機能的な方法で酵素
を発現させることが可能であることが判明した。

【００７０】

【実施例３】増加されたグルコースデヒドロゲナーゼ活性を示す菌株を使用した、物質の産生ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＡＴ２４７１及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉＡＴ２４７１／ｐＧＥＭ７ＫｇｈｄＩＶの合成効率が、実施例２
で述べた鉱物性培地中で測定された。このために、振とうフラスコ（１００ｍｌ
の培地を含む１０００ｍｌ容器）に２ｍｌのグリセリン培養物を接種し、旋回振
とう器で３７℃、１５０ｒｐｍで７２時間インキュベイトした。培養物のｐＨを
約１２時間間隔で測定し、必要に応じてＫＯＨ（４５％）を加えて開始値７．２
に回復させた。更に、試料（２ｍｌ）が、吸光度及びグルコースとＬ−フェニル
アラニンの濃度を測定するために、２４時間及び４８時間後に採取された。フェニルアラニンの濃度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ヒュー
レットパッカード社、ドイツ、ミュンヘン市）により蛍光法検出（３３５ｎｍで
の励起、５７０ｎｍでの発光）と組み合わせて確認され、ヌクレオシル‐１２０
−８Ｃ１８カラム（２５０・４．６ｍｍ）が固相として使用された；溶出はグラ
ディエントを用いて行われた（溶出剤Ａ：９０％５０ｍＭリン酸、１０％メ
タノール、ｐＨ２．５；溶出剤Ｂ：２０％５０ｍＭリン酸、８０％メタノ
ール、ｐＨ２．５；グラディエント；０−８分、１００％Ａ、８−１３分、０
％Ａ、１３−１９分、１００％Ａ）。溶出速度は、１．０ｍｌ／ｍｉｎ及び
カラム温度は４０℃に設定した。ポストカラム誘導体化は、ｏ−フタルジアルデ
ヒドを使用して反応キャピラリー（１４ｍ・０．３５ｍｍ）内で室温にて行われ
た。既述した条件のもとで、Ｌ−フェニルアラニンは６．７分の保持時間を有するこ
とがわかった。酵素試験紙（ディアバー、ドイツ、ベーリンガーマンハイム社）を使用して、
グルコース濃度を測定し、その結果とは独立に、引き続き２ｍｌの濃縮されたグ
ルコース溶液（５００ｇ／ｌ）を計量しながら入れることにより，実験混合溶液
中でグルコースが制限的にならないよう注意を払った。単にプラスミドｐＧＥＭ７ｇｄｈＩＶを導入すことにより、Ｅ．ｃｏｌｉＡ
Ｔ２４７１宿主菌株の指標値（フェニルアラニン）の１００と比較して、４８時
間のインキュベーション時間の後で、フェニルアラニン濃度を記載する指標値と
して１４５が結果的に達成された。この結果は、本発明に従い物質産生性の微生
物中でのグルコースデヒドラゲナーゼの酵素活性の増加の芳香族化合物の合成増
加効果を証明している。

【００７１】

【実施例４】グルコースデヒドラゲナーゼの酵素活性の増加に加えてＰＥＰ非依存性糖摂取系が発現される菌株を使用しての物質の製造Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓｇｌｆ遺伝子は、プラスミドｐＺＹ
６００（Ｗｅｉｓｓｅｒ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ１７７（１９９５）
３３５１−３３４５）を使用してテンプレートとして増幅された。同時に、プラ
イマーの選択は、ＢａｍＨＩ開裂部位及びＫｐｎＩ開裂部位の導入が結果として
もたらされた。これらの特有の開裂部位を用いてベクターｐＵＣＢＭ２０（ベー
リンガーマンハイム）に遺伝子が挿入され、これらは同様にＢａｍＨＩ及びＫｐ
ｎＩにより開かれた。大きさが１．５ｋｂのＤＮＡ断片は、ＢａｍＨＩ及びＨｉ
ｎｄＩＩＩで制限することによりこのベクター（ｐＢＭ２０ｇｌｆ）より分離さ
れ、ベクタープラスミドｐＺＹ５０７（Ｗｅｉｓｓｅｒ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ１７７（１９９５）３３５１−３３４５）に連結され、制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで同様に開かれた。組換えプラスミドｐＺＹ５０７ｇ
ｌｆは、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換し形質転換細胞をクローン化した後に得られた
。このベクターはクロランフェニコール耐性を与え、ｌａｃＩ^q−ｔａｃプロ
モーターシステムを含み、低いコピー数を有している。ベクターｐＺＹ５０７ｇｌｆは、実施例１の記載に従って得られた本発明の遺
伝子構造と共に宿主菌株ＡＴ２４７１に形質転換された。実施例３で述べられた実験条件に従って、突然変異体Ｅ．ｃｏｌｉＡＴ２
４７１ｇｌｆ、Ｅ．ｃｏｌｉＡＴ２４７１ｇｌｆ／ｐＧＥＭ７、Ｅ．ｃｏｌ
ｉＡＴ２４７１ｇｌｆ／ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫ及びＥ．ｃｏｌｉＡＴ２４７１
ｇｌｆ／ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫｇｄｈＩＶはそれぞれ２つの並列する混合液で培養
された。４８時間後、培地中のＬ−フェニルアラニン濃度が測定された。指標値１００に相当するＬ−フェニルアラニン濃度を達成する開始菌株Ｅ．ｃ
ｏｌｉＡＴ２４７１ｇｌｆとの比較において、ベクターｐＧＥＭ７の存在は指標値９６をもたらし、結果的に、実質的には同一の濃度が達成される。対照的
に、Ｅ．ｃｏｌｉＡＴ２４７ｇｌｆ／ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫの使用は、既述した
菌株と比較すれば指標値１７９に相当するＬ−フェニルアラニン濃度を結果とし
てもたらす。Ｅ．ｃｏｌｉＡＴ２４７１ｇｌｆ／ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫｇｄｈＩ
Ｖ中の代替の代謝遺伝子、即ちグルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコネートキ
ナーゼ双方の発現は、指標値１９５を表すフェニルアラニン濃度のさらなる増加
を達成した。この結果は、グルコースデヒドロゲナーゼの酵素活性を導入し、グルコネート
キナーゼの酵素活性を増大させることによる代替の代謝経路の発現が、同時にＰ
ＥＰ非依存性糖摂取システムが形質転換されそして発現されたこれらの微生物中
で特異的にＬ−フェニルアラニン合成に対するポジティブな影響力を有している
ことを証明している。

【００７２】

【実施例５】その内部でグルコースデヒドロゲナーゼ酵素活性が増加されることに加えてＰＥＰ−非依存性糖摂取システムが発現されるＰＴＳ−突然変異を使用した物質の製造Ｅ．ｃｏｌｉＰＴＳ系の成分をコードする遺伝子中にｇｌｆ遺伝子を取込む
ために、プラスミドｐＰＴＳ１は、ＢｇｌＩＩで消化され、クレノウ（Ｋｌｅｎ
ｏｗ）断片で処理される。その独特の開裂部位はｐｔｓＩ遺伝子に存在する。そ
のｇｌｆ遺伝子は、ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ断片としてプラスミドｐＢＭ２０ｇｌ
ｆｇｌｋから分離され、クレノウ断片で同じように処理される。ｐｔｓＨＩとし
ての同じ配位におけるｇｌｆ遺伝子を運搬するクローンは、平滑末端によって得
られた。ｐｔｓＨ遺伝子及び取込まれたｇｌｆおよびｃｒｒを有するｐｔｓＩの
３´領域を運ぶ４．６ｋｂのＰｓｔＩ断片は、結果として生ずるプラスミドｐＰ
ＴＳｇｌｆから得られた。この断片は、ベクターｐＧＰ７０４のＥｃｏＲＶ開裂
部位に連結された。このベクターは、λｐｉｒ菌株においてのみ複製されること
ができるので、このファージを宿さない形質転換細胞は、もしそれらがカルベニ
シリン上で成長可能であるならば、染色体の中にそのベクターを取込むことがで
きる。取込みは、サザン分析法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｍｉ
ｌｌｅｒＶ．Ｌ．等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０（１９８８）２５７５
−８３）によってチェックされた。ｇｌｆ遺伝子に加えて、得られた形質転換細
胞は、完全なＰＴＳ遺伝子も含んでいた。ベクターの部分はカルベニシリン耐性の欠損へと導く第２の相同的交差の状態
に組替えが行われ得る。この場合ｐｔｓ遺伝子の挿入は、ｇｌｆ遺伝子によって
妨げられるので、ＰＴＳはこれらの突然変異体中で機能的に発現されない。望ましいＰＴＳ^-突然変異体は、次ぎのように選別される：静止したＰＴＳ⁺形質
転換細胞を抗生物質なしでＬＢ培地上で繰り返しサブイノキュレート（サブ接種
）した後、細胞縣濁液の一部は１００μｇ／ｌのホスホマイシンを含むＬＢプレ
ート上に置き培養された。ＰＴＳ^-突然変異体は、これらのプレート上で成長可
能である。成長するクローンは、ホスホマイシン又は２０μｇ／ｌのカルベニシ
リンのいずれかを含むＬＢプレート上で画線培養された。染色体ＤＮＡは、ホス
ホマイシンプレート上で新たな成長を示すがカルベニシリンプレート上では成長
はしないクローンから分離された。ｇｌｆ遺伝子のＰＴＳ系をコードする遺伝子
への組み込みは、サザン分析により確認された。相当する突然変異体は、表現型
上ＰＴＳ欠損として同定された。一つのクローンは、宿主有機体がＥ．ｃｏｌｉＡＴ２４７１ｇｌｆｉｎｔＰ
ＴＳ^-として選別され、プラスミドｐＧＥＭ７ｇｎｔＫｇｄｈＩＶで形質転換の
ため使用された（上記参照）。実施例３及び４で記載された実験的条件に従い、ＰＴＳ陰性突然変異体Ｅ．
ｃｏｌｉＡＴ２４７１ｇｌｆｉｎｔＰＴＳ^-／ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫｇｄｈＩＶ
及び相当する宿主菌株ＡＴ２４７１ｇｌｆｉｎｔＰＴＳ^-は、それぞれの場合
、２つの並列の混合液で培養された。４８時間培養後全体のバイオマス特異的生
産性が、その結果より計算された。宿主菌株Ｅ．ｃｏｌｉＡＴ２４７１ｇｌｆｉｎｔＰＴＳ^-と比較されるよ
うに、その全体バイオマス特異的生産性は指標値１００として表されるが、突然
変異体ＡＴ２４７１ｇｌｆｉｎｔＰＴＳ^-／ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫｇｄｈＩＶ
は、指標値１３３を有する全体バイオマス特異的生産性を達成した。この結果は、グルコースデヒドロゲナーゼの酵素活性を導入し、グルコネート
キナーゼの酵素活性を増大させることが、同時にＰＥＰ非依存性糖摂取システム
が取込まれそしてその酵素活性が減少されるか完全にスイッチオフされたＰＴＳ
系によって特徴づけられるこれらの微生物中で特異的にフェニルアラニン合成の
生産性に対しポジティブな影響力を有していることを証明している。

【００７３】

【表１】

【００７４】

【表２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 13/22 (Ｃ１２Ｎ 1/21 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ (72)発明者スプレンガー，ゲオルグドイツ国，52428 ジューリッヒ，シュロスストラーセ４ (72)発明者サーム，ヘルマンドイツ国，52428 ジューリッヒ，ヴェンデリヌスストラーセ 71 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA05 BA71 BA75 CA04 DA06 EA04 GA11 4B050 CC03 DD02 LL01 LL02 4B064 AE29 AE30 AE34 CA02 CA19 CC24 DA01 DA10 4B065 AA17Y AA26X AB01 BA02 CA17 CA41 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】微生物学的に芳香族代謝物質を製造する方法において、当該物質
を産生する微生物中で、グルコース含有基質がグルコース酸化酵素の活性を増加
させる結果として変化されることを特徴とする方法。
【請求項２】グルコースデヒドロゲナーゼの活性を該微生物中に導入し及び /
又はその中で増加させることを特徴とする請求項１に記載した方法。
【請求項３】Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍグルコースデヒドロゲ
ナーゼの活性を微生物中に導入し及び / 又はその中で増加させることを特徴と
する請求項２記載の方法。
【請求項４】Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍグルコースデヒドロゲ
ナーゼIVの活性を微生物中に導入し及び / 又はその中で増加させることを特徴
とする請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】グルコン酸ホスホリル化酵素を追加的に増加させることを特徴と
する請求項１乃至４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】グルコネートキナーゼの活性を増加させることを特徴とする請求
項５記載の方法。
【請求項７】Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉグルコネートキナーゼの活性
を増加させることを特徴とする請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】グルコノラクトナーゼ、特にＺｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉ
ｓグルコノラクトナーゼの活性を追加的に増加させることを特徴とする請求項２
乃至７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】 PEP非依存性糖摂取のための輸送タンパク質の活性を追加的に増
加させる請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】輸送タンパク質が促進剤である請求項９記載の方法。
【請求項１１】促進剤がＺｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓグルコース促進剤
タンパク（Ｇｌｆ）であることを特徴とする請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】 a ) 遺伝子を導入することにより、 b ）及び / 又は遺伝子コピー数を増加させることにより、 c ）及び / 又は遺伝子発現を増加させることにより、 d ）及び / 又は該酵素の内在的活性を増加させることにより、 e ）及び / 又は酵素の構造を変更することにより、 f ）及び / 又は脱制御された酵素を使用することにより、 g ）及び / 又は脱制御された酵素をコードする遺伝子を導入することにより、グルコース酸化酵素活性又はグルコース酸化酵素活性とさらにグルコン酸ホスホ
リル化酵素、グルコノラクトナーゼ及びPEP非依存性糖摂取用輸送タンパク質の
内の少なくとも１つの活性を増加させることを特徴とする請求項２乃至１１の１
つに記載の方法。
【請求項１３】活性の増加が、単一の遺伝子構造または複数の遺伝子構造に組み
込まれた遺伝子によって達成され、ここで該遺伝子は、単一コピーとして又は増
加されたコピー数の遺伝子構造中に導入されていることを特徴とする請求項１２
に記載の方法。
【請求項１４】もし存在すれば、PEP依存性糖摂取系の活性を追加的に減少させ
又はスイッチオフすることを特徴とする請求項９乃至１３の１つに記載の方法。
【請求項１５】微生物中で、当該物質の合成に追加的に関与する１以上の酵素を
脱制御し、その活性を増加させた微生物を使用したことを特徴とする請求項１乃
至１４の１つに記載された方法。
【請求項１６】当該調製された物質が芳香族アミノ酸であることを特徴とする請
求項１乃至１５の１つに記載の方法。
【請求項１７】芳香族アミノ酸がL-フェニルアラニンであることを特徴とする請
求項１６に記載の方法。
【請求項１８】採用される微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉ
ａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ又はＢｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ属に属することを特徴とする請求項１乃至１７の１つに記載の方法
。
【請求項１９】微生物がEscherichia coliであることを特徴とする請求項１８に
記載の方法。
【請求項２０】グルコン酸ホスホリル化酵素をコードする遺伝子と共に、グルコ
ース酸化酵素をコードする遺伝子、又はPEP非依存性糖摂取用輸送タンパク質を
コードする遺伝子と共に、グルコース酸化酵素をコードする遺伝子、又はつぎの
３つの遺伝子、グルコン酸ホスホリル化酵素をコードする遺伝子、グルコノラク
トナーゼをコードする遺伝子及びPEP非依存性糖摂取用輸送タンパク質をコード
する遺伝子の内の少なくとも２つの遺伝子と共に、グルコース酸化酵素をコード
する遺伝子の内のいずれかを組換え型遺伝子内に含む遺伝子構造物。
【請求項２１】グルコース酸化酵素のための遺伝子がグルコースデヒドロゲナー
ゼをコードしかつグルコン酸ホスホリル化酵素のための遺伝子がグルコネートキ
ナーゼをコードすることを特徴とする請求項２０に記載の遺伝子構造物。
【請求項２２】グルコースデヒドロゲナーゼのための遺伝子がＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍから誘導され、グルコネートキナーゼのための遺伝子が
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉから誘導され、グルコノラクトナーゼ及び輸
送タンパク質のための遺伝子がＺｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓから誘導さ
れることを特徴とする請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】請求項２０乃至２２のいずれか１つに記載の遺伝子構造を複製で
きる形で有する形質転換細胞。
【請求項２４】細胞中で、当該物質の合成に追加的に関与する１以上の酵素を脱
制御し及び / 又はその / それらの活性が増加されたものであることを特徴とす
る請求項２３に記載の形質転換細胞。
【請求項２５】該細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細胞である請求項２
３又は２４に記載の形質転換細胞。
【請求項２６】もしPEP依存性糖摂取系が存在するならば、それは減少され又は
スイッチオフされた活性を有していたことを特徴とする請求項２３乃至２５の１
つに記載した形質転換細胞。
【請求項２７】芳香族アミノ酸を産生することができる請求項２３乃至２６の１
つに記載の形質転換細胞。
【請求項２８】芳香族アミノ酸がL-フェニルアラニンであることを特徴とする請
求項２７に記載の方法。
【請求項２９】請求項２０乃至２１の１つに記載の遺伝子構造物をその内部に有
する請求項２３乃至２８の１つに記載の形質転換細胞を使用することを特徴とす
る請求項１乃至１９の１つに記載の、物質を微生物的に製造する方法。