KR101201687B1

KR101201687B1 - Ｌ-아미노산을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101201687B1
Application number: KR1020067019815A
Authority: KR
Inventors: 다닐라 바디모비치 지멘코브; 안드레이 유리에비치 굴레비치; 알렉산드라 유리에브나 스코로코도바; 요안나 요시포브나 카타쉬키나; 알렉산드르 드미트리에비치 키베로; 이리나 블라디미로브나 비르유코바; 베라 게오르기에브나 도로쉔코; 세르게이 블라디미로비치 마시코
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 2004-02-25
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2012-11-15
Also published as: JP4670811B2; EP1718731B2; WO2005080583A2; EP1718731A2; JP2007523625A; WO2005080583A3; EP1718731B1; KR20070006799A; BRPI0507978A

Abstract

본 발명은 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae) 과의 세균을 사용하여, L-트립토판, L-페닐알라닌 및 L-타이로신과 같은 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 세균의 L-아미노산 생산능은 pgl 유전자(ybhE ORF)에 의해 암호화된 6-포스포글루코노락토나제의 활성을 증진시킴에 의해 증가된다.

엔테로박테리아세애, pgl 유전자, ybhE ORF, 6-포스포글루코노락토나제, L-트립토판, L-페닐알라닌

Description

Ｌ-아미노산을 생산하는 방법{Method for producing L-amino acids}

본 발명은 미생물을 사용하여 발효시킴에 의해 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 L-트립토판, L-페닐알라닌 및 L-타이로신과 같은 방향족 아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

펜토스 포스페이트 경로(PPP)는 대다수 미생물의 중추적 대사에 중요한 부분이다. PPP의 산화 과정에서 NADPH가 합성되고 PPP의 비산화 과정의 인산화된 탄수화물은 뉴클레오타이드 생합성을 위한 전구체(리보스-5-포스페이트), 방향족 아미노산 및 비타민에 대한 전구체(에리트로스-5-포스페이트)이다. 에리트로스 4-포스페이트(E4p)는 방향족 L-아미노산의 공통 생합성 경로의 필수 전구체이다. 포스포에놀피루베이트(PEP) 및 E4p 생합성에 대한 특정 경로를 최적화함으로써 방향족 L-아미노산의 생산을 개선시킬 수 있다.

PPP의 산화 과정은 3개의 반응을 포함한다. 제1 및 제3 반응은 널리 공지된 효소인 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제(EC 1.1.1.49) 및 글루코네이트-6-포스페이트 데하이드로게나제(EC 1.1.1.44)에 의해 촉매되고 이들은 각각 zwf 및 gnd에 의해 암호화되어 있다. 제2 반응은 6-포스포글루코노락톤을 6-포스포글루코네이트로 가수분해시키는 것이다[문헌참조: Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief : F. C. Neidhardt, ASM Press, Washington D. C. , 1996]. 당해 반응을 촉매하는 효소는 예를 들어, 사람(문헌참조: Collard, F. , et al, FEBS Lett. , 459: 2,223-6 (1999)), 트립파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei)(문헌참조: Duffieux, F. , et al, J. Biol. Chem. , 275: 36, 27559-65 (2000)), 플라스모듐 베르헤이(Plasmodium berghei)(문헌참조: Clarke, J. L., et al, Eur. J. Biochem., 268: 7,2013-9 (2001)), 슈도모나스 아에로기노사(Pseudomonas aeroginosa)(문헌참조: Hager P. W. et al, J. Bacteriol., 182: 14,3934-41 (2000)), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)(문헌참조: Petruschka, L. , et al, FEMS Microbiol. Lett. , 215: 1,89-95 (2002))를 포함하는 몇몇 유기체에서 검출되었지만 또한 당해 반응은 자발적으로 진행될 수 있는 것으로 공지되어 있다.

글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제에 의해 촉매되는 반응 생성물중 하나인 δ-6-포스포글루코노락톤은 분자내 재배열 과정에서 γ-6-포스포글루코노락톤으로 이성체화할 수 있다. δ-6-포스포글루코노락톤만이 자발적으로 6-포스포글루코네이트로 가수분해될 수 있고 정확하게는 당해 반응은 공지된 6-포스포글루코노락토나제(EC 3.1.1.31)에 의해 촉매된다[문헌참조: Miclet E. et al. , J Biol Chem. , 276: 37,34840-46 (2001)]. 6-포스포글루코노락토나제를 암호화하는 것으로 추측되는 이. 콜리 기원의 pgl 유전자는 이. 콜리 염색체상에서 att-λ와 chlD 유전자(현재 데이타베이스에서-modC 유전자)사이에 있는 것으로 맵핑되었다. 이. 콜리의 돌연변이체(pgl ^-)는 "말토스-블루" 표현형을 나타내고(문헌참조: Kupor, S. R. and Fraenkel, D. G. , J. Bacteriol. , 100: 3,1296-1301 (1969)) 이는 말토덱스트린을 축적하는 균주의 명백한 특징이다[문헌참조: Adhya S. and Schwartz M., J Bacteriol, 108: 2,621-626 (1971)].

그러나, 현재, 이. 콜리 염색체상에서 pgl 유전자의 서열 또는 정확한 위치는 공지되어 있지 않다. 이. 콜리 기원의 6-포스포글루코노락토나제 활성을 갖는 효소는 분리되지 않았고 L-아미노산 생산 세균 세포에서 6-포스포글루코노락토나제 활성의 증진이 L-아미노산 생산의 증가와 연관이 있다는 보고는 없다.

본 발명의 목적은 이. 콜리 기원의 6-포스포글루코노락토나제를 제공하여 L-아미노산 생산 균주의 생산성을 증진시키고 당해 균주를 사용한 L-아미노산 생산 방법을 제공하는 것이다.

이러한 목적은 이. 콜리 균주 K-12의 ybhE 개방 판독 프레임(ORF)이 6-포스포글루코노락토나제를 암호화하고 있고 ybhE ORF(pgl 유전자)의 증진된 발현이 각각의 L-아미노산 생산 균주에 의한 L-아미노산 생산을 증진시킬 수 있다는 사실을 확인하여 성취되었다. 따라서, 본 발명이 완성되었다.

본 발명의 목적은 6-포스포글루코노락토나제의 활성이 증진되도록 변형된 L-아미노산 생산 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae)과에 속하고 에스케리치아(Escherichia), 에르위니아(Erwinia), 프로비덴시아(Providencia) 및 세라티아(Serratia)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 상기된 바와 같은 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 세균의 염색체상에서 6-포스포글루코노락토나제 유전자의 발현 조절 서열을 변형시켜 유전자의 발현이 증진됨으로써 6-포스포글루코노락토나제의 활성이 증진된 상기된 바와 같은 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 해당 유전자의 고유 프로모터가 보다 강력한 프로모터로 대체된, 상기된 바와 같은 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 6-포스포글루코노락토나제 유전자가 에스케리치아 속에 속하는 세균 기원인 상기된 바와 같은 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 6-포스포글루코노락토나제 유전자가,

(a) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1번 내지 993번의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 및

(b) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1번 내지 993번의 뉴클레오타이드 서열 또는 엄중 조건하에 당해 뉴클레오타이드 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 하이브리드화할 수 있고 6-포스포글루코노락토나제의 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA

로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기된 바와 같은 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 엄중 조건이 1 x SSC 및 0.1% SDS에 상응하는 염농도에서 60℃에서 15분동안의 세척을 포함하는, 상기된 바와 같은 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 추가로 변형되어 ybhE 개방 판독 프레임의 발현이 증진된, 상기된 바와 같은 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 L-아미노산이 L-트립토판, L-페닐알라닌 및 L-타이로신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방향족 L-아미노산인, 상기된 바와 같은 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 상기된 바와 같은 세균을 배양 배지에서 배양하는 단계 및 당해 배양 배지로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는 방향족 L-아미노산의 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 L-아미노산이 L-트립토판, L-페닐알라닌 및 L-타이로신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방향족 아미노산인, 상기된 바와 같은 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 세균이 방향족 아미노산 생합성을 위한 유전자의 증진된 발현을 갖는, 상기된 바와 같은 방법을 제공하는 것이다.

L-아미노산을 생산하는 방법은 본 발명의 단백질의 활성이 증진된, L-트립토판 생산 세균을 사용한 L-트립토판의 생산을 포함한다. 또한 L-아미노산을 생산하는 방법은 본 발명의 단백질의 활성이 증진된, L-페닐알라닌 생산 세균을 사용한 L-페닐알라닌의 생산을 포함한다. L-아미노산을 생산하는 방법은 본 발명의 단백질의 활성이 증진된 L-타이로신 생산 세균을 사용한 L-타이로신의 생산을 추가로 포함한다.

도 1은 ybhE ORF 주변의 세균 고유의 DNA 영역에 대한 구조를 나타낸다.

도 2는 ybhE ORF가 결실된 세균 DNA 영역에 대한 구조를 나타낸다.

도 3은 ybhA ORF가 결실된 세균 DNA 영역에 대한 구조를 나타낸다.

도 4는 ybhD ORF가 결실된 세균 DNA 영역에 대한 구조를 나타낸다.

도 5는 pgi 유전자가 결실된 세균 DNA 영역에 대한 구조를 나타낸다.

도 6은 zwf-edd-eda 오페론이 결실된 세균 DNA 영역에 대한 구조를 나타낸다.

도 7은 pgl 유전자(ybhE ORF)의 업스트림에 인공 프로모터 영역(P_tac*)을 갖는 세균 DNA 영역에 대한 구조를 나타낸다.

도 8은 (His)6-YbhE 단백질의 겔 분리 및 정제(사진)를 나타낸다. A. BL21(DE3)[pET-HTybhE] 균주의 조 추출물. 라인 1, 2, 9- 단백질 분자량 마커; 라인 3,4- IPTG 유도의 존재 및 부재하에 균주의 총 세포 단백질; 라인 5,6- IPTG 유도의 존재 및 부재하에 균주의 가용성 분획; 라인 7,8- IPTG 유도의 존재 및 부재하에 균주의 불용성 분획. B. 라인 1- BL21(DE3)(pET-HTybhE]의 총 세포 단백질; 라인 2, 3, 4, 6 - 정제된 (His)6-YbhE의 증가하는 농도; 라인 5- 단백질 분자량 마커.

바람직한 양태의 기재

본 발명에 따라 변형되어 6-포스포글루코노락토나제의 활성이 증진된, L-아미노산 생산 세균이 기재된다. 용어 "6-포스포글루코노락토나제의 활성"은 6-포스포글루코노락톤의 6-포스포글루코네이트로의 가수분해 반응을 촉매하는 활성을 의미한다. 6-포스포글루코노락토나제의 활성은 예를 들어, 문헌[참조: Kupor, S. R. and Fraenkel, D. G. (J. Bacteriol. , 100: 3,1296-1301 (1969)]에 기재된 방법에 의해 측정된다. 6-포스포글루코노락토나제를 암호화하는 유전자는 에스케리치아 콜리의 ybhE 유전자 또는 이의 동족체일 수 있다.

에스케리치아 콜리의 6-포스포글루코노락토나제(EC 번호 3.1.1.31)를 암호화하는 유전자로서 ybhE ORF를 포함하는 pgl 유전자(GenBank 승인번호 NC_000913.1, gi:16128735의 서열에서 뉴클레오타이드 번호 797809 내지 798804)가 언급된다. ybhE ORF는 이. 콜리 균주 K12의 염색체상에서 ybhA 및 ybhD ORF 사이에 위치한다. 따라서, pgl 유전자는 당해 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 기초로 하여 제조된 프라이머[문헌참조: White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)]를 사용한 PCR에 의해 수득될 수 있다.

에스케리치아 콜리 기원의 pgl 유전자는 하기의 DNA (a) 또는 (b)를 포함하는 DNA로서 예시된다:

(a) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1번 내지 993번의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 또는

(b) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1번 내지 993번의 뉴클레오타이드 서열 또는 당해 뉴클레오타이드 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄중 조건하에서 하이브리드화할 수 있고 6-포스포글루코노락토나제의 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.

본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA는 이들이 단백질의 활성을 상실하지 않는 이상, 하나 또는 여러개의 아미노산이 단백질 (A)상의 하나 이상의 위치에서 결실, 치환, 삽입 또는 첨가된 단백질을 암호화하는 DNA를 포함한다. "여러개"의 아미노산 수가 단백질의 3차원 구조에서 위치 또는 아미노산 잔기 유형에 따라 상이하지만 이는 단백질 (A)에 대해 2 내지 30개, 바람직하게는 2 내지 20개 및 보다 바람직하게는 2 내지 10개일 수 있다.

하나 또는 여러개의 아미노산이 상기된 바와 같이 결실, 치환, 삽입 또는 첨가된 본 발명의 단백질은 서열번호 2의 단백질과 70% 이상 상동성이다. 단백질의 상동성 %는 전체 길이의 서열에 대해 변이체 서열과 서열번호 2의 서열을 비교하고 유사 잔기 수를 결정함에 의해 측정된다. 본 발명의 단백질은 서열번호 2의 단백질과 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 및 가장 바람직하게는 95% 이상 상동성이다. 단백질 또는 DNA의 상동성 %는 또한 BLAST 검색, FASTA 검색 및 CrustalW와 같은 공지된 계산 방법에 의해 평가될 수 있다. BLAST(기본 국소 배열 검색 도구)는 프로그램 blastp, blastn, blastx, megablast, tblastn 및 tblastx에 의해 사용되는 발견 검색 알고리듬이다. 이들 프로그램의 중요성은 이들이 카를린, 사무엘 및 스티븐 에프. 알츠슐의 통계학적 방법(문헌참 조: ""Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990,87 : 2264-68;"Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 5873-7), 문헌[참조: W. R. Pearson ("Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 1990 183: 63- 98)]에 기재된 FASTA 검색 방법 및 문헌[참조:Thompson J. D. , Higgins D. G. and Gibson T. J. ("CLUSTAL W : improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res. 1994, 22: 4673-4680)]에 기재된 ClustalW 방법을 사용하여 검색하기 때문이다.

상기된 것들과 같은 (A)로 정의된 단백질의 변화는 전형적으로 보존적 변화로서 단백질의 활성을 유지하고 있다. 치환 변화는 아미노산 서열중에 하나 이상의 잔기가 제거되고 이의 위치에 상이한 잔기가 삽입되는 것을 포함한다. 상기 단백질에서 본래의 아미노산을 치환할 수 있고 보존적 치환으로서 간주되는 아미노산의 예는 다음을 포함한다: ser 또는 thr로 치환되는 Ala; gln, his 또는 lys로 치환되는 arg; glu, gln, lys, his 또는 asp로 치환되는 asn; asn, glu 또는 gln으로 치환되는 asp ; ser 또는 ala로 치환되는 cys; asn, glu, lys, his, asp 또는 arg로 치환되는 gln; asn, gln, lys 또는 asp로 치환되는 glu; pro로 치환되는 gly; asn, lys, gln, arg 또는 tyr로 치환되는 his; leu, met, val 또는 phe로 치환되는 ile; ile, met, val 또는 phe로 치환되는 leu; asn, glu, gln, his 또는 arg로 치;환되는 lys; ile, leu, val 또는 phe로 치환되는 met; trp, tyr, met, ile 또는 leu로 치환되는 phe; thr 또는 ala로 치환되는 ser; ser 또는 ala로 치환되는 thr; phe 또는 tyr로 치환되는 trp; his, phe 또는 trp로 치환되는 tyr; 및 met, ile 또는 leu로 치환되는 val.

(A)로 정의된 단백질과 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는 예를 들어, 부위 지시된 돌연변이유발법을 사용하여 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실되거나 치환되거나 삽입되거나 첨가되도록 (A)로 정의되는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 변형시킴에 의해 수득될 수 있다. 당해 변형된 DNA는 돌연변이 생성 시약 및 조건을 사용한 처리법과 같은 통상적인 방법에 의해 수득될 수 있다. 당해 처리법은 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA를 하이드록실아민으로 처리하거나 DNA를 함유하는 세균을 UV 조사 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 또는 질산과 같은 시약으로 처리함을 포함한다.

본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA는 천연의 다양성에 따라 에스케리치아 속에 속하는 상이한 균주 및 세균의 변이체에서 발견될 수 있는 변이체를 포함한다. 당해 변이체를 암호화하는 DNA는 엄중 조건하에서 pgl 유전자 또는 유전자의 일부와 하이브리드화하고 6-포스포글루코노락토나제의 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 분리함에 의해 수득될 수 있다. 본원에서 언급되는 용어 "엄중 조건"은 소위 특이적 하이브리드가 형성되지만 비특이적 하이브리드는 형성되지 않는 조건이다. 예를 들어, 엄중 조건은 높은 상동성을 갖는 DNA, 예를 들어, 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA가 서로 하이브리드화되는 조건을 포함한다. 또한, 엄중 조건은 써던 하이브리드화에서 통상적인 세척 조건, 예를 들어, 60℃, 대략 1 x SSC, 0.1% x SSC, 바람직하게는, 0.1 x SSC, 0.1% SDS를 포함하는 조건으로 예시된다. 세척 지속 시간은 블롯팅에 사용되는 막 유형에 따라 상이하고 통상적으로 제조업자에 의해 추천된다. 예를 들어, 엄중 조건하에 Hybond^TM N + 나일론 막(Amersham)에 대해 추천된 세척 지속 시간은 15분이다. 바람직하게, 세척은 2 또는 3회 수행될 수 있다.

변이체를 암호화하고 pgl 유전자와 하이브리드화하는 DNA에 대한 프로브로서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 부분 서열이 또한 사용될 수 있다. 당해 프로브는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 기초로하는 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하고 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 단편을 주형으로서 사용하는 PCR에 의해 제조될 수 있다. 약 300bp 길이의 DNA 단편이 프로브로서 사용되는 경우, 하이브리드화를 위한 세척 조건은 예를 들어, 50℃, 2 x SSC 및 0.1% SDS로 이루어진다.

단백질을 암호화하는 DNA를 사용한 세균의 형질전환은 예를 들어, 본 발명의 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키고 세균 세포에서 단백질의 활성을 증진시키는 통상적 방법에 의해 DNA를 세균 세포로 도입함을 의미한다.

본 발명의 세균은 표적 L-아미노산의 생산성을 증진시키는 증진된 활성의 단백질을 갖는 엔테로박테리아세애 과에 속하는 L-아미노산 생산 세균이다. 바람직하게, 본 발명의 세균은 특히, 본 발명의 단백질의 활성이 증진된 에스케리치아 속에 속하는 방향족 L-아미노산 생산 세균이다. 보다 바람직하게, 본 발명의 세균은 특히, 변형되어 6-포스포글루코노락토나제의 활성이 증진된 에스케리치아 속에 속하는 L-트립토판 생산 세균과 같은 방향족 L-아미노산 생산 세균이다. 보다 바람직하게, 본 발명의 세균은 세균의 염색체상에 변형된 발현 조절 서열과 함께 pgl 유전자(ybhE ORF)를 포함하는 DNA를 함유하여 L-트립토판 생산능이 증진되었다.

"L-아미노산 생산 세균"은 본 발명의 세균이 배지에서 배양되는 경우 배지에 L-아미노산을 축적시키는 능력을 갖는 세균을 의미한다. L-아미노산 생산능은 육종에 의해 부여되거나 증진될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "L-아미노산 생산 세균"은 또한 배양 배지에서 L-아미노산을 야생형 또는 모균주보다 대량으로 생산하고 축적시킬 수 있는 세균을 의미하고 바람직하게는 미생물이 배지에 표적 L-아미노산 0.5g/L 이상, 보다 바람직하게는 1.0g/L 이상의 양으로 생산하고 축적시킬 수 있음을 의미한다. L-아미노산은 L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-글루탐산, L-글루타민, L-글라이신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-타이로신 및 L-발린을 포함하고 바람직하게는 L-트립토판, L-페닐알라닌 및 L-타이로신과 같은 방향족 L-아미노산을 포함한다.

엔테로박테리아세애 과는 에스케리치아, 엔테로박터, 에르위니아, 클렙시엘라(Klebsiella), 판토에아(Pantoea), 프로비덴시아(Providencia), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 쉬겔라(Shigella) 속에 속하는 세균을 포함 한다. 특히, NCBI(National Center for Biotechnology Information) 데이타베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode = Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock)에 사용되는 분류법에 따라 엔테로박테리아세애로 분류되는 것들이 사용될 수 있다. 에스케리치아 속이 바람직하다.

문구 "에스케리치아 속에 속하는 세균"은 세균이 미생물학 분야의 기술자에게 공지된 분류에 따라 에스케리치아 속으로 분류됨을 의미한다. 본 발명에 사용되는 에스케리치아 속에 속하는 미생물의 예는 에스케리치아 콜리(이. 콜리)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 사용될 수 있는 에스케이치아 속에 속하는 세균은 특별히 제한되지않고 예를 들어, 문헌[참조: Neidhardt, F. C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C. , 1208, Table 1]에 기재된 세균은 본 발명에 포함된다. 에스케리치아 콜리의 야생형 균주의 예는 K12 균주 및 이의 변이체인 에스케리치아 콜리 MG1655 균주(ATCC 번호 47076) 및 W3110 균주(ATCC 번호 27325)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, 주소: 12301 Parklawn Drive, Rockville Maryland 20 852, United States of America)으로부터 구입할 수 있다.

용어 "판토에아(Pantoea) 속에 속하는 세균"은 세균이 미생물학 분야의 기술자에게 공지된 분류에 따라 판토에아 속으로서 분류됨을 의미한다. 엔테로박터 애글로메란스(Enterobacter agglomerans)의 몇몇 종은 최근에 16S rRNA 등의 뉴클레오타이드 서열 분석에 기초하여 판토에아 애글로메란스(Pantoea agglomerans), 판 토에아 아나나티스(Pantoea ananatis), 판토에아 스튜아르티(Pantoea stewartii)로 재분류되었다.

용어 "6-포스포글루코노락토나제의 활성이 증진되도록 변형된"은 세포당 활성이 비변형된 균주, 예를 들어, 야생형 균주 보다 높음을 의미한다. 6-포스포글루코노락토나제의 활성은 콜라드(Collard)의 방법(문헌참조: FEBS Letters 459 (1999) 223-226)을 사용하여 측정될 수 있다. 한 예는 세포 당 6-포스포글루코노락토나제 분자 수가 증가하는 경우, 6-포스포글루코노락토나제 분자당 비활성(specific activity)이 증가하는 경우이다. 추가로, 비교 대상체로서 제공된 야생형 균주로서 에스케리치아 콜리 K-12가 포함된다. 6-포스포글루코노락토나제의 세포내 활성이 증진됨으로써 배지내 축적되는 L-트립토판과 같은 L-아미노산의 양은 증가된다.

세균 세포에서 6-포스포글루코노락토나제 활성의 증진은 6-포스포글루코노락토나제를 암호화하는 유전자(pgl 유전자)의 발현을 증가시켜 달성된다. 6-포스포글루코노락토나제 유전자로서, 엔테로박테리아세애 세균 기원의 유전자가 포함된다. pgl 유전자의 발현은 예를 들어, 유전자 재조합 기술을 사용하여 세포에서 pgl 유전자의 카피수를 증가시켜 증진될 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA는 pgl 유전자를 함유하는 유전자 단편을, 숙주 미생물 세포에서 작동할 수 있는 벡터, 바람직하게는 다중 카피 벡터에 연결시키고 수득한 벡터를 숙주 미생물 세포에 도입하여 제조될 수 있다.

에스케리치아 콜리의 pgl 유전자가 사용되는 경우, pgl 유전자(ybhE)는 예를 들어, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 기초로 디자인된 프라이머 및 에스케리치아 콜리의 염색체 DNA를 주형으로서 사용하는 PCR 방법[문헌참조: polymerase chain reaction, White, T. J. et al. , Trends Genet. , 5,185 (1989)]에 의해 수득될 수 있다. 기타 미생물 기원의 pgl 유전자가 또한 사용될 수 있고 pgl 유전자의 서열 또는 상이한 미생물 종 기원의 pgl 유전자 또는 6-포스포글루코노락토나제 단백질의 상동성 서열을 기초로 하여 디자인된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용한 PCR에 의해 또는 당해 서열 정보를 기초로 제조된 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용한 하이브리드화에 의해 염색체 DNA 또는 염색체 DNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 염색체 DNA는 예를 들어, 사이토 및 미우라의 방법[문헌참조: H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72,619 (1963), Text for Bioengineering Experiments, Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, pp. 97-98, Baifukan, 1992]에 의해 DNA 공여체로서 작용하는 미생물로부터 제조될 수 있다.

이어서, pgl 유전자는 숙주 미생물 세포에서 작동할 수 있는 벡터 DNA에 연결되어 재조합 DNA가 제조된다. 바람직하게, 숙주 미생물 세포에서 자발적으로 복제할 수 있는 벡터가 사용된다.

에스케리치아 콜리에서 자발적으로 복제할 수 있는 벡터의 예는 pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, (pHSG 및 pACYC는 제조원(Takara Bio)에서 구입할 수 있다), RSF1010, pBR322 및 pMW219 (pMW는 제조원(Nippon Gene)에서 구입할 수 있다)등을 포함한다.

pgl 유전자 및 상기된 벡터중 임의의 하나를 연결시킴으로써 재조합 DNA를 제조하기 위해, 벡터 및 pgl 유전자를 함유하는 단편을 제한 효소로 분해하고 통상적으로 T4 DNA 리가제와 같은 리가제를 사용하여 서로 연결시킨다.

상기된 바와 같이 제조된 재조합 DNA를 미생물에 도입하기 위해, 지금까지 보고된 임의의 공지된 형질전환 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 에스케리치아 콜리에 대해 보고된, DNA 침투성을 증가시키기 위해 수용체 세포를 염화 칼슘으로 처리하는 방법[문헌참조: Mandel, M. and Higa, A. , J. Mol. Biol., 53,159 (1970)] 및 바실러스 서브티리스(Bacillus subtilis)에 대해 보고된, 성장 세포로부터 제조된 컴피턴트 세포를 사용하여 DNA를 도입하는 방법[문헌참조: Duncan, C. H. , Wilson, G. A. and Young, F. E. , Gene, 1, 153 (1977)]이 사용될 수 있다. 이들 방법 외에, 바실러스 서브틸리스, 액티노마이세테스 및 효모에 적용될 수 있는 것으로 보고된, 원형질 또는 부분 원형질형 수용체 세포로 재조합 DNA를 도입하는 방법[문헌참조: Chang, S. and Choen, S. N. , Molec. Gen. Genet. , 168,111 (1979); Bibb, M. J. , Ward, J. M. and Hopwood, O. A. , Nature, 274,398 (1978); Hinnen, A. , Hicks, J. B. and Fink, G. R. , Proc. Natl. Sci. , USA, 75,1929 (1978)]이 사용될 수 있다.

pgl 유전자의 카피수는 또한 다중 카피의 pgl 유전자를 미생물의 DNA 염색체상에 통합시킴에 의해 증가될 수 있다. 다중 카피의 pgl 유전자를 미생물의 염색체 DNA상에 통합시키기 위해, 염색체 DNA상에 다중 카피의 서열을 표적화함에 의해 상동성 재조합이 수행될 수 있다. 염색체 DNA상에 다중 카피로 존재하는 서열로 서, 반복 DNA 및 트랜스포존 양 말단에 존재하는 역위 반복체를 다중 카피가 염색체 DNA상에 존재하는 서열로 사용할 수 있다. 또한, JP2-109985A에 기재된 바와 같이, pgl 유전자를 트랜스포존에 혼입시킬 수 있고 이것이 전달되어 유전자의 다중 카피가 염색체 DNA로 통합되도록 할 수 있다. pgl 유전자의 염색체로의 통합은 pgl 유전자의 부분 서열을 갖는 프로브를 사용한 써던 하이브리드화에 의해 확인될 수 있다.

본 발명의 세균은 본 발명의 단백질의 활성이 세균 염색체상에서 (A) 또는 (B)로 정의되는 바와 같은 단백질을 암호화하는 DNA의 발현 조절 서열을 변화시켜 증진된 세균을 포함한다[문헌참조: WO00/18935]. 유전자 발현은 본 발명의 DNA를 본래의 프로모터 대신 보다 강력한 프로모터하에 위치하도록 하여 증진될 수 있다. 예를 들어, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터 및 PR 프로모터등은 강력한 프로모터로서 공지되어 있다. 용어 "본래의 프로모터"는 유전자의 개방 판독 프레임(ORF)의 업스트림에 위치한, 야생형 유기체에 존재하여 유전자의 전사를 촉진하는 기능을 갖는 DNA 영역을 의미한다. 프로모터의 강도는 RNA 합성 개시 수행 빈도수에 의해 정의된다. 프로모터의 강도를 평가하는 방법은 예를 들어, 문헌[참조: Deuschle U. , Kammerer W. , Gentz R., Bujard H. (Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J. 1986,5, 2987-2994)]에 기재되어 있다. 프로모터의 효능을 평가하는 방법 및 강력한 프로모터의 예는 문헌[참조: Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev. , 1995,1, 105-128)]에 기재되어 있다.

해독은 본래의 RBS 서열 대신에 보다 효율적인 리보솜 결합 부위(RBS)를 본 발명의 DNA에 도입하여 증진될 수 있다. RBS 서열은 mRNA의 개시 코돈의 업스트림 영역이고 리보솜의 16S RNA와 상호작용한다[문헌참조: Shine J. and Dalgarno L. , Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1974,71, 4, 1342-6]. 용어 "본래의 RBS 서열"은 야생형 유기체에 제공된 RBS 서열을 의미한다. 파아지 T7 기원의 유전자 10의 RBS 서열은 효율적인 RBS 서열로서 예시될 수 있다[문헌참조: Olins P. O. et al, Gene, 1988,73, 227-235].

본 발명의 세균은 본래 L-아미노산을 생산하는 능력을 갖는 세균으로 상기 언급된 DNA를 도입하여 수득될 수 있다. 또한, 본 발명의 세균은 이미 DNA를 함유하는 세균으로 L-아미노산 생산능을 부가하여 수득될 수 있다.

본 발명의 단백질의 활성이 증진된 모균주로서, 에스케리치아 속에 속하는 L-트립토판 생산 세균인, 돌연변이 trpS 유전자에 의해 암호화된 트립토파닐-tRNA 신테타제가 결핍된 이. 콜리 균주 JP4735/pMU3028(DSM10122) 및 JP6015/pMU91(DSM10123)[문헌참조: 미국 특허 제5,756,345호]; 세린에 의한 피드백 억제를 받지 않는 serA 대립형질을 갖는 이. 콜리 균주 SV164(pGH5)[문헌참조: 미국 특허 제6,180,373호]; 효소 트립토파나제가 결핍된 이. 콜리 균주 AGX17(pGX44)(NRRL B-12263) 및 AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)[문헌참조: 미국 특허 제4,371,614]; 포스포에놀피루베이트 생산 능력이 증진된 이. 콜리 균주 AGX17/pGX50, pACKG4-pps(문헌참조: WO9708333, 미국 특허 제6,319,696)등이 사용 될 수 있다. 본 발명의 발명자는 yddG 유전자의 야생형 대립형질이 미생물내 다중 카피 벡터상에서 증폭되는 경우, 임의의 L-아미노산의 생합성 경로에 관여하지 않는 막 단백질을 암호화하는 yddG 유전자가 L-페닐알라닌 및 여러 아미노산 유사체에 대한 미생물 내성을 부여함을 미리 확인하였다. 추가로, yddG 유전자는 추가의 카피가 각각의 생산 균주 세포로 도입되는 경우 L-페닐알라닌 또는 L-트립토판의 생산을 증진시킬 수 있다[문헌참조: 러시아 특허원 제2002121670호, WO03044192]. 따라서, L-트립토판 생산 세균이 추가로 변형되어 yddG 개방 판독 프레임의 발현이 증진되는 것이 바람직하다.

L-트립토판 생합성에 효과적인 유전자는 trpEDCBA 오페론의 유전자들, 예를 들어, aroF, aroG, aroH, aroB, aroD, aroE, aroK, aroL, aroA 및 aroC 유전자와 같은, 방향족 아미노산에 대한 공통 경로의 유전자들 및 serA, serB 및 serC 유전자와 같은 L-세린 생합성의 유전자들 등을 포함한다.

본 발명의 단백질의 활성이 증진된 모균주로서, 에스케리치아 속에 속하는 페닐알라닌 생산 세균인, 이. 콜리 균주 AJ12739(tyrA::Tn10, tyrR); pheA34 유전자를 함유하는 균주 HW1089(ATCC 승인 번호 제55371호)(미국 특허 제5,354,672호); 돌연변이 MWEC101-b 균주(KR8903681); 균주 NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 및 NRRL B-12147(미국 특허 제4,407,952호)등이 사용될 수 있다. 에스케리치아 속에 속하는 페닐알라닌 생산 세균은 이. 콜리 균주 K-12[W3110(tyrA)/pPHAB], 이. 콜리 균주 K-12[W3110(tyrA)pPHAD], 이. 콜리 K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm] 및 AJ12604로 호칭되는 이. 콜리 균주 K- 12[W3110(tyrA)pBR-aroG4,pACMAB]등을 포함한다[문헌참조: 유럽 특허 EP488424B1].

본 발명의 단백질 활성이 증진된 모균주로서, 에스케리치아 속에 속하는 L-타이로신 생산 세균인, 포스포에놀피루베이트 생산능 또는 공통된 방향족 경로의 효소가 증진된 이. 콜리 균주등이 또한 사용될 수 있다(문헌참조: EP0877090A).

본 발명의 방법은, 본 발명의 세균을 배양 배지에서 배양하여 L-아미노산을 생산하고 배지에 축적시키는 단계 및 배양 배지로부터 L-아미노산을 수거하는 단계를 포함하는, L-아미노산 생산 방법을 포함한다. 또한, 본 발명의 방법은 본 발명의 세균을 배양 배지에서 배양하여 L-트립토판을 생산하고 배양 배지에서 축적시키는 단계 및 배양 배지로부터 L-트립토판을 수거하는 단계를 포함하는 L-트립토판 생산 방법을 포함한다. 본 발명의 방법은 배양 배지에서 본 발명의 세균을 배양하여 L-페닐알라닌을 생산하고 배양 배지에 축적시키는 단계 및 배양 배지로부터 L-페닐알라닌을 수거하는 단계를 포함하는 L-페닐알라닌 생산 방법을 포함한다. 본 발명의 방법은 추가로, 배양 배지에서 본 발명의 세균을 배양하여 L-타이로신을 생산하고 배양 배지에 축적시키는 단계 및 배양 배지로부터 L-타이로신을 수거하는 단계를 포함하는 L-타이로신 생산 방법을 포함한다.

본 발명에서, L-아미노산, 바람직하게는 L-트립토판, L-페닐알라닌 및 L-타이로신과 같은 방향족 아미노산의 배지로부터의 생산, 수거 및 정제는 미생물을 상요하여 아미노산을 생산하는 통상적인 발효 방법과 유사한 방식으로 수행될 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 배지가 탄소원 및 질소원 및 무기물 및 경우에 따 라, 미생물 성장에 요구되는 적당량의 영양물을 포함하는 한 합성 또는 천연 배지일 수 있다.

탄소원은 글루코스 및 슈크로스 및 다양한 유기산과 같은 다양한 탄수화물을 포함한다. 선택된 미생물의 동화작용 방식에 따라 에탄올 및 글리세롤을 포함하는 알콜이 사용될 수 있다.

질소원으로서, 암모니아 및 황산암모늄과 같은 다양한 암모늄 염, 아민과 같은 기타 질소 화합물, 펩톤, 대두 가수분해물 및 분해된 발효 미생물과 같은 천연 질소원이 사용될 수 있다.

무기물로서, 1인산칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황화철, 황산마그네슘 및 염화칼슘등이 사용될 수 있다.

경우에 따라, 추가의 영양물이 첨가될 수 있다. 예를 들어, 미생물이 성장을 위해 타이로신을 필요로 하는 경우(타이로신 영양요구성), 충분한 양의 타이로신이 배양용 배지에 첨가될 수 있다.

배양은 진탕 배양 및 통기 교반 배양과 같은 호기 조건하에 20 내지 42℃의 온도에서, 바람직하게는 37 내지 40℃에서 수행될 수 있다. 배양 pH는 일반적으로 5 내지 9이고, 바람직하게는 6.5 내지 7.2이다. 배양 pH는 암모니아, 탄산칼슘, 다양한 산, 다양한 염기 및 완충액으로 조정될 수 있다. 일반적으로 1 내지 5일 배양은 액체 배지에 표적 L-아미노산을 축적시킨다.

배양 후, 세포와 같은 고형물은 원심분리 또는 막 여과에 의해 액체 배지로부터 제거될 수 있고 이어서 표적 L-아미노산은 수거되고 이온 교환, 농축 및 결정 화 방법에 의해 정제될 수 있다.

본 발명은 하기의 비제한적인 실시예를 참조로 보다 구체적으로 설명될 것이다.

실시예 1. 이. 콜리 기원의 pgl 유전자의 동정 및 뉴클레오타이드 서열 비교.

쿠포르(Kupor) 및 프라엔켈(Fraenkel)은 이. 콜리 염색체상에서 chlD(현재 modC로서 공지되어 있음)과 bioA 유전자 사이에 pgl 돌연변이를 맵핑하였다[문헌참조: Kupor, S. R. and Fraenkel, D. G. , J. Bacteriol. , 100: 3, 1296-1301 (1969)]. 이것은 이. 콜리 유전자 맵에서 17.18 및 17.40분에 상응한다. 이러한 영역에서, 기능이 공지되지 않은 단백질을 암호화하는 8개의 개방 판독 프레임이 있다. 추가로, 이. 콜리 스톡 센터 데이타베이스는 pgl 돌연변이를 17.20과 17.22분 사이에 위치시켰다. 이들 배위는 거의 정확하게 ybhA와 ybhD ORF 사이에 위치한 ybhE 개방 판독 프레임(ORF)의 배위와 일치한다(도 1).

ybhE에 의해 암호화된 YbhE 단백질을 사용하여 수행되는 BLAST 검색은 쉬겔라 플렉스메리(Shigella flexmeri)(98.8% 유사성), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi)(92.8% 유사성), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)(68.4% 유사성)와 같은 상이한 유기체에서 기능이 공지되지 않은 많은 동족체가 있고 바이러스 안트라시스(Bacillus anthracis)(28% 동일성) 기원의 시토크롬 D1 헴 도메인, 자동화된 컴퓨터 분석에 의해 예상되는 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens)(28% 동일성) 기원의 3-카복시뮤코네이트 사이클라제, 트리코스포론 베이겔리(26% 동일성) 기원의 뮤코네이트 사이클로이소머라제 및 승인번호 NP_833107하에 데이타뱅크에서 6-포스포글루코노락토나제로서 언급된 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 기원의 효소와 같은 기능이 공지된 여러 동족체가 있음을 보여주었지만 공개된 실험 작업은 언급되지 않았다.

또한, 3개의 중첩 보존된 단백질 도메인은 NCBI 보존된 도메인 검색을 사용하여 밝혀졌다. 이들중 2개는 기능이 규명되지 않은 보존된 단백질 계열에 속하고 하나는 3-카복시뮤코네이트 사이클라제 계열에 속한다.

이. 콜리 프로테옴(Proteome) 내에서 BLAST 검색은 예를 들어, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 기원의 기재된 6-포스포글루코노락토나제의 동족체를 밝히지 못했다.

이. 콜리 염색체에서 ybhE로서 표시된 ORF가 6-포스포글루코노락토나제를 암호화하는 pgl 유전자인지를 확인하기 위해, ybhA, ybhE 및 ybhD ORF를 연속해서 파괴시켰고 수득된 돌연변이가 "말토스 블루" 표현형임을 확인하였다(하기 참조).

실시예 2. ybhE ORF의 파괴. 클로람페니콜 내성 유전자(Cm^R)를 함유하는 DNA 단편에 의한 ybhE ORF의 치환.

ybhE ORF를 파괴하기 위해, cat 유전자에 의해 암호화된 클로람페니콜 내성 마커(Cm^R)를 함유하는 DNA 단편을 문헌[참조: Datsenko K. A. and Wanner B. L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,97, 6640-6645)]에 의해 기재된 방법에 의해 본래의 ybhE ORF 대신 이. 콜리 균주 BW25113[pKD46]의 염색체로 통합시켰고 이것은 소위 "레드-매개 통합" 및/또는 "레드-구동 통합"으로 불리운다. ybhE ORF의 치환된 고유 영역의 뉴클레오타이드 서열 및 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열은 서열 목록에 각각 서열번호 1 및 2로 제시되어 있다. 재조합 플라스미드 pKD46을 함유하는 에스케리치아 콜리 균주 BW25113은 기관[E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, USA]으로부터 수득할 수 있고 이의 승인번호는 CGSC7630이다.

Cm^R 마커를 함유하는 DNA 단편은 주형 및 프라이머 P1(서열번호 3) 및 P2(서열번호 4)로서 시판되는 플라스미드 pACYC184(GenBank/EMBL 승인 번호 X06403, "Fermentas", Lithuania)를 사용하는 PCR에 의해 수득되었다. 프라이머 P1은 ybhE ORF의 5' 말단과 상동성인 36개의 뉴클레오타이드를 함유하고 프라이머 P2는 ybhE ORF의 3'-말단과 상동성인 36개의 뉴클레오타이드를 함유한다. ybhE 유전자의 이들 서열은 세균 염색체로 추가로 통합시키기 위해 프라이머 P1 및 P2로 도입하였다.

"ThermoHybaid PCR 익스프레스" 증폭기를 사용하는 PCR이 제공되었다. 반응 혼합물(총 용적- 50㎕)은 15mM의 MgCl₂("Fermentas", Lithuania), 각각 200μM의 dNTP, 각각 25pmol의 사용되는 프라이머 및 1U의 Taq-폴리머라제("Fermentas", Lithuania)와 함께 5㎕의 10 x PCR-완충액으로 이루어졌다. 약 5ng의 플라스미드 DNA가 PCR 증폭용 주형 DNA로서 반응 혼합물에 첨가되었다. 온도 프로필은 다음과 같다: 처음 5분동안 95℃에서 DNA 변성에 이어서 30초동안 95℃에서 25회 변성, 30초동안 55℃에서 어넬링, 30초동안 72℃에서 신장 및 72℃에서 7분동안 최종 신장.

이어서, 증폭된 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제하고 "GenElute 스핀 칼럼"("시그마", USA)을 사용하여 추출하고 에탄올로 침전시켰다. 작제된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5로 제공된다.

상기된 바와 같이 정제된 수득된 DNA 단편은 전기천공 및 이. 콜리 균주 BW25113[pKD46]의 세균 염색체로의 레드-매개 통합을 위해 사용하였다. 열 민감성 레플리콘과 함께 재조합 플라스미드 pKD46(문헌참조: Datsenko, K. A., Wanner, B. L. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,97, 6640-6645)은 레드 매개 재조합 시스템에서 작용하는 파아지 λ-유래된 유전자의 공여체로서 사용하였다.

BW25113[pKD46] 세포는 앰피실린(100㎍/ml)이 첨가되고 이어서 앰피실린(100㎍/ml) 및 L-아라비노스(10mM)(이것은 레드 시스템의 플라스미드에 삽입된 유전자를 유도하기 위해 사용된다)이 첨가된 SOB 배지(효모 추출물, 5g/l; NaCl, 0.5 g/l; 트립톤, 20g/l; KCl, 2.5mM; MgCl₂, 10mM)에 의해 1:100으로 희석된 액체 LB-배지에서 세균 배양물의 광학 밀도 OD₆₀₀이 0.4 내지 0.7에 도달하도록 30℃에서 밤새 배양시켰다. 세균 배양 10ml로부터 증식된 세포를 냉각 탈이온수로 3회 세척함에 이어서 100㎕의 물에 현탁시켰다. 탈이온수에 용해된 DNA 단편(100ng) 10㎕를 세포 현탁액에 첨가하였다. 제조업자의 지침에 따라 "바이오-래드" 전기 천공기(USA)(번호. 165-2098, 버젼 2-89)로 전기천공하였다. 쇼크 세포를 1ml의 SOC 배지에 첨가하고(문헌참조: Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) 2시간동안 37℃에서 배양함에 이어서 L-한천 함유 25㎍/ml의 클로람페니콜상에 도말하였다. 프라이머 P3(서열번호 6) 및 P4(서열번호 7)를 사용한 PCR에 의해 본래의 ybhE ORF 대신에 Cm^R 마커가 존재하는지의 여부에 대해 24시간 이내에 증식한 콜로니를 시험하였다. 이러한 목적을 위해, 새롭게 분리된 콜로니를 20㎕의 물에 현탁시킴에 이어서 수득된 현탁액 1㎕를 PCR을 위해 사용하였다. 온도 프로필은 다음과 같다: 처음 10분동안 95℃에서 DNA 변성에 이어서 30초동안 95℃에서 30회 변성, 30초동안 55℃에서 어넬링, 1분동안 72℃에서 신장 및 72℃에서 7분동안 최종 신장. 시험된 몇개의 Cm^R 콜로니가 목적하는 1279bp DNA 단편을 함유하였고 이는 본래의 ybhE ORF 대신에 Cm^R 마커 DNA가 존재함을 확인시켜준다. 수득된 균주의 하나는 37℃에서 배양함에 의해 열 민감성 플라스미드 pKD46때문에 소실되었고 수득한 균주를 이. 콜리 균주 BW25113-△ybhE로 명명하였다.

ybhE ORF가 파괴된 세균 DNA 영역의 구조는 도 2에 나타낸다.

실시예 3. ybhA 및 ybhD ORF의 파괴. 클로람페니콜 내성 유전자(Cm^R)를 함 유한 DNA 단편에 의한 ybhA 및 ybhD ORF의 치환.

ybhA 및 ybhD ORF를 파괴하기 위해, cat 유전자에 의해 암호화된 클로람페니콜 내성 마커(Cm^R)를 함유한 DNA 단편을 실시예 2에 기재된 방법에 의해 본래의 ybhA 및 ybhD ORF 대신에 이. 콜리 균주 BW25113[pKD46]의 염색체에 별도로 통합시켰다.

전기천공을 위한 단편을 수득하고 ybhA 및 ybhD ORF를 파괴하기 위해, 2쌍의 프라이머 P5(서열번호 8)와 P6(서열번호 9) 및 P7(서열번호 10)과 P8(서열번호 11)을 각각 합성하고 PCR에 사용하였다. 프라이머 P5는 3' 말단 ybhA ORF에 상동성인 36개의 뉴클레오타이드를 함유한다. 프라이머 P6는 ybhA ORF의 5' 말단에 상동성인 36개의 뉴클레오타이드를 함유한다. 프라이머 P7은 ybhD ORF의 3' 말단에 상동성인 36개의 뉴클레오타이드를 함유하고 프라이머 P8은 ybhD ORF의 5' 말단에 상동성인 36개의 뉴클레오타이드를 함유한다. 이들 서열들은 세균 염색체에 추가로 통합하기 위해 프라이머 P5, P6, P7 및 P8에 도입하였다.

작제된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열번호 12 및 서열번호 13으로 나타낸다. ybhA 및 ybhD ORF의 치환된 본래의 영역의 뉴클레오타이드 서열(각각, 뉴클레오타이드 번호 796836 내지 797654 및 798845 내지 799777, gi:16128734 및 gi:33347481)은 승인번호 NC_000913.1하에 GenBank에 제공되어 있다. ybhA 및 ybhD ORF가 파괴된 세균 DNA 영역의 구조는 각각 도 3 및 도 4에 나타낸다.

전기천공 후, ybhA ORF 파괴용 프라이머 P9(서열번호 14)과 P10(서열번호 15) 및 ybhD ORF 파괴용 프라이머 P11(서열번호 16)과 P12(서열번호 17)를 사용한 PCR에 의해 Cm^R 마커가 존재하는지에 대해 상응하는 콜로니를 시험하였다.

제1 경우에, 시험된 몇개의 Cm^R 콜로니는 목적하는 1424 bp DNA 단편을 함유하였고 이것은 본래의 ybhA ORF 대신 Cm^R 유전자가 존재함을 확인시켜준다. 제2 경우에, 시험된 몇개의 Cm^R 콜로니는 목적하는 1386 bp DNA 단편을 함유하였고 이것은 본래의 ybhD ORF 대신에 Cm^R 유전자가 존재함을 확인시켜준다. 각각의 경우에, 수득된 균주중 하나는 37℃에서 배양함에 의해 열 민감성 플라스미드 pKD46때문에 소실되었고 수득된 균주는 각각 이. 콜리 균주 BW25113-△ybhA 및 BW25113-△ybhD로 명명되었다.

실시예 4. "말토스 블루" 표현형에 대한 ybhE^-, ybhA^- 및 ybhD^- 돌연변이체의 조사

3개의 수득된 돌연변이 균주 각각은 문헌[참조: Kupor, S. R. and Fraenkel, D. G. (J. Bacteriol. , 100: 3,1296-1301 (1969)]에 기재된 방법에 의해 "말토스 블루" 표현형에 대해 시험하였다. 배양물을, 0.8%의 말토스를 함유하는 M9 최소 배지를 갖는 플레이트상에 패취(patch)시켰다. 6시간 후, 배양 플레이트에 0.01M I₂ 및 0.03M KI를 함유하는 용액 5ml을 충분히 붓고 패취 색을 육안으로 "블루" 또 는 "블루가 아님"으로 스코어하였다.

수득된 균주 BW25113-△ybhE는 "블루"로서 스코어된 반면 균주(대조군 균주로서) BW25113-△ybhA, BW25113-△ybhD 및 BW25113는 "블루가 아님"이었다.

실시예 5. pgi 및 ybhE 또는 ybhD가 결실된 이중 돌연변이 균주의 작제

상이한 탄소원상에서 당해 균주의 증식 비교

포스포글루코스 이소머라제가 결핍된 돌연변이 균주(pgi^-)는 글루코스상에서 펜토스 포스페이트 경로의 산화 과정만을 사용함으로 서서히 증식하였다. 당해 과정의 2차 단계를 촉매하는 포스포글루코노락토나제(pgl)이 결핍된 또 다른 돌연변이는 또한 6-포스포글루코노락톤이 글루코네이트-6-포스페이트로만 자발적으로 가수분해됨으로 보다 서서히 증식한다. 따라서, ybhE ORF가 실제로 pgl 유전자라면, pgi 및 ybhE의 이중 돌연변이는 야생형 균주 및 pgi 돌연변이 보다 서서히 증식할 것이다. 이러한 제안을 뒷받침하기 위해, pgi 및 ybhE의 이중 돌연변이를 작제하였다.

pgi 유전자내 돌연변이는 이. 콜리 균주 BW25113[pKD46]에서 본래의 세균 염색체를 실시예 2에 기재된 방법으로 가나마이신 내성 유전자(Km^R)를 함유하는 DNA 단편으로 치환하여 수행하였다. pgi 유전자의 치환된 본래의 영역의 뉴클레오타이드 서열은 승인번호 NC_000913.1(뉴클레오타이드 번호 4231337 내지 4232986; gi:16131851)로서 GenBank에 제공되어 있다.

Km^R 유전자를 함유하는 DNA 단편은 주형으로서 시판되는 플라스미드 pUC4KAN(GenBank/EMBL 승인 번호 X06404, "Fermentas", Lithuania) 및 프라이머 P13(서열번호 18) 및 P14(서열번호 19)를 사용하는 PCR로 수득하였다. 프라이머 P13은 pgi 유전자의 3'-말단과 상동성인 36개의 뉴클레오타이드를 함유하고 프라이머 P14는 pgi 유전자의 5'-말단과 상동성인 36개의 뉴클레오타이드를 함유한다. pgi 유전자 기원의 당해 서열은 세균 염색체로 추가로 통합하기 위해 프라이머 P13 및 P14에 도입하였다.

PCR은 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다.

이어서, 증폭된 DNA 단편은 아가로스-겔 전기영동으로 농축시키고 "GenElute 스핀 칼럼"("Sigma", USA)을 통한 원심분리로 겔로부터 추출하고 에탄올로 침전시켰다. 작제된 DNA 영역의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 20으로 나타낸다.

상기된 바와 같이 정제된 수득된 DNA 단편은, 전기천공 후 50㎍/ml의 가나마이신을 함유하는 L-한천상에 세포를 도말하는 것을 제외하고는 실시예 2에 기재된 바와 같은 전기천공 및 이. 콜리 균주 BW25113[pKD46]의 세균 염색체로의 레드-매개된 통합을 위해 사용하였다.

24시간 이내에 증식한 콜로니는 프라이머 P15(서열번호 21) 및 P16(서열번호 22)를 사용하는 PCR에 의해 pgi 유전자 대신 Km^R 마커의 존재 여부에 대해 시험하였다. 이러한 목적을 위해, 새롭게 분리된 콜로니를 20㎕의 물에 현탁시킴에 이어서 1㎕의 수득된 현탁액을 PCR을 위해 사용하였다. PCR 조건은 실시예 2에 기재된 바 와 같다. 시험된 몇개의 Km^R 콜로니는 목적하는 1286 bp DNA 단편을 함유하였고 이는 pgi 유전자 대신 Km^R 유전자가 존재함을 확인시켜준다. 수득된 균주중 하나는 37℃에서 배양함에 의해 열 민감성 플라스미드 pKD46때문에 소실되었고 수득된 균주는 이. 콜리 균주 BW25113-△pgi로 명명하였다.

pgi 유전자가 결실된 세균성 DNA 영역의 구조는 도 5에 나타낸다.

pgi 결실은 문헌[참조: Fraenkel (J. Bacteriol. 93 (1967), 1582-1587)]의 방법으로 이. 콜리 MG1655 균주로 형질도입함에 이어서 가나마이신을 함유하는 플레이트상에서 선별하였다. 수득된 균주는 MG-△pgi로 명명하였다. 이어서, ybhE 및 ybhD ORF에서의 돌연변이는 실시예 2 및 3에 기재된 균주 BW25113-△ybhE 및 BW25113-△ybhD로부터, 당해 수득된 균주로 형질도입함에 이어서 클로람페니콜을 함유하는 플레이트상에서 선별하였다. 수득된 균주는 각각 MG-△pgi-△ybhE 및 MG-△pgi-△ybhD로 명명하였다.

MG1655 및 MG1655-△pgi와 함께 이들 2개의 균주를 탄소원으로서 글루코스 또는 글루코네이트를 갖는 M9 최소 플레이트상에 패취시켰다. 배양 24시간 후에, 균주의 증식을 육안으로 확인하였다. MG-△pgi-△ybhE의 증식은 글루코스를 함유한 플레이트상에서 모든 다른 균주에 대한 것 보다 불량하였고 글루코네이트를 함유한 플레이트상에서는 별 특성이 없었다.

실시예 6. 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 기원의 pgl 유전자 및 ybhE 돌연변이의 상보체를 함유하는 플라스미드의 작제

몇몇 유기체 기원의 pgl 유전자가 보고되었다. 이들중에는 이. 콜리와 밀접하게 관련된 유기체인 슈도모나스 푸티다 기원의 6-포스포글루코노락토나제가 있다. 몇몇 다른 유전자들을 피. 푸티다로부터 이. 콜리에 콜로닝하였고 이. 콜리에 제공된 상응하는 돌연변이의 상보체는 보고되었다[문헌참조: Ramos-Gonzalez, M. I. and Molin, S. , J. Bacteriol., v180, 13, p. 3421,1998].

피. 푸티다 기원의 pgl 유전자는 프라이머 17(서열번호 23) 및 18(서열번호 24)를 사용하여 클로닝하였다. 프라이머 P17은 피. 푸티다 기원의 pgl 유전자의 1 내지 19bp의 서열과 동일한 서열을 함유한다. 프라이머는 또한 업스트림에 위치한 이. 콜리 기원의 lacZ 유전자의 리보솜 결합 부위(RBS) 및 이의 5' 위치에 도입된 제한 효소 SacI에 대한 인지 부위를 함유한다. 프라이머 P18은 피. 푸티다 기원의 pgl 유전자의 709 내지 729 bp의 서열에 상보적인 서열 및 이의 5' 말단에 도입된 제한효소 EcoRI에 대한 인지 부위를 함유한다.

피. 푸티다 KT2440 균주 TG1의 염색체 DNA[문헌참조: Bagdasarian, M. & Timmis, K. N. In Current Topics of Microbiology and Immunology, eds. Goebel, W. & Hofschneider, P. H. (Springer, Berlin), pp. 47-67 (1981)]는 전형적인 방법으로 작제하였다. PCR은 하기의 조건하에 "퍼킨 엘머 GeneAmp PCR 시스템 2400"으로 수행하였다: 95℃에서 40초, 53℃에서 40초, 72℃에서 40초, Taq 폴리머라제(Fermentas)로 25회. lacZ 유전자의 RBS와 함께 피. 푸티다 기원의 pgl 유전자를 함유하는 수득된 PCR 단편은 SacI 및 EcoRI 레스트릭타제로 처리하고 동일한 레스트릭타제로 처리된 다중카피 벡터 pUC19에 삽입하였다. 따라서, 플라스미드 pUC19-pgl을 수득하였다.

균주 BW25113-△ybhE는 수득된 플라스미드 pUC19-pgl로 형질전환시켰다. 배양물을, 앰피실린 100㎍/ml을 함유하는 최소 말토스 플레이트상에 패취시켰고 상기된 바와 같이 처리하여 "말토스 블루" 표현형인지를 조사하였다. 형질전환체는 대조군 균주 BW25113-△ybhE와는 대조적으로 "말토스 블루" 표현형을 나타내지 않았다.

따라서, 슈도모나스 푸티다 기원의 pgl 유전자의 클로닝된 카피는 이. 콜리에서의 ybhE 돌연변이를 상보시키고 이것은 또 다시 ybhE ORF가 pgl 유전자의 암호화 영역이라는 본 발명자의 가설을 지지한다.

실시예 7. ybhE 돌연변이에서 6-포스포글루코노락토나제 활성의 측정

균주 BW25113 및 BW25113-△ybhE의 하루 배양물을 글루코스를 함유하는 최소 M9 배지로 50배 희석하였다. 배양물 광학 밀도가 OD₅₄₀=1에 도달할때까지 세포를 증식시켰다. 추출물을 3ml의 배양물로부터 제조하였다. 생리학적 용액에 세포를 세척하고 400㎕의 인산칼륨 완충액(pH 7.0)에 현탁시키고 초음파 처리하였다. 이어서, 원심분리 후에 수득된 상등액 분획물을 추가의 희석 없이 분석에 사용하였다.

6-포스포글루코노락토나제 활성을 측정하기 위해, 문헌[참조: Collard, F. et al. (FEBS Letters 459 (1999) 223-226)]에 기재된 방법을 사용하였다. 락톤을 30℃에서 0.2mM NADP, 25mM HEPES(pH 7.1), 2mM MgCl₂ 및 1.75U 효모 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제(Sigma, USA)의 존재하에 50μM의 글루코스-6-포스페이트(Sigma, USA)를 항온처리하여 즉석으로 제조하였다(총 용적 1ml). A₃₄₀에서 반응 혼합물의 광학 밀도가 정체상태에 도달한 경우, 초기에 수득된 상등액 분석 분획물과 함께 0.5U/ml의 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제(Sigma, USA)를 첨가하고 A₃₄₀에서의 광학 밀도를 약 10분동안 추가로 측정하였다. 문헌[참조: Bradford, M. M. (Anal. Biochem. 72,248-254 (1976)]의 방법에 따라 단백질의 양을 측정하였다. 수득된 데이타를 표 1에 나타낸다. 활성은 총 단백질 mg당 상대적 단위로 나타낸다.

표에서 알 수 있는 바와 같이, ybhE 돌연변이에서 6-포스포글루코노락토나제 활성은 "야생형" 균주 보다 적어도 1차수 등급 적었고 자발적인 가수분해 속도에 상당하였다.

실시예 8. zwf-edd-eda 오페론의 결실. 가나마이신 내성 유전자(Km^R)를 함유하는 DNA 단편에 의한 zwf-edd-eda 유전자 영역의 치환

YbhE 발현이 증가된 균주를 수득하기 위해, 본 발명자는 레드-매개 통합을 사용하여 ybhE RBS와 이의 고유 프로모터 사이에 Ptac 기원의 항상성 프로모터를 통합시키고자 하였다(실시예 9 참조).

그러나, 본 발명자는 "야생형" 균주 MG1655의 염색체를 변형시키는데 실패하였다. 본 발명자는 pgl(ybhE)의 발현 증진에 의한 독성 효과를 설명할 수 없지만 본 발명자는 6-포스포글루코노락토나제 활성이 증가되어 펜토스-포스페이트 경로(PPP)가 불균형을 이루어 몇몇 독성 중간체가 축적(또는 세포 생존에 필수적인 것들의 고갈)되는 것과 관련되어 있을 것으로 제안하였다. 따라서, 본 발명자는 당해 경로의 제1 효소를 암호화하는 zwf 유전자를 결실시켜 PPP를 완전히 차단시키기로 결정하였다.

zwf-edd-eda 오페론의 결실은 pgi 유전자에 대해 실시예 5에 기재된 방법으로 수행하였다. zwf-edd-eda 오페론의 치환된 본래의 영역의 뉴클레오타이드 서열은 승인번호 NC_000913.1(zwf, edd 및 eda 유전자에 대해 각각 뉴클레오타이드 번호 1932863 내지 1934338, gi:16129805; 1930817 내지 1932628, gi:16129804 및 1930139 내지 1930780, gi:16129803)하에 GenBank에 제공되어 있다. Km^R 유전자를 함유한 DNA 단편은 프라이머 P19(서열번호 25) 및 P20(서열번호 26)을 사용한 PCR에 의해 수득되었다. 프라이머 P19는 eda 유전자의 3' 말단에 상보적인 36개의 뉴클레오타이드를 함유한다. 프라이머 P20은 zwf 유전자의 5'말단에 상보적인 36개의 뉴클레오타이드를 함유한다. 작제된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 27로 나타낸다.

24시간이내에 증식한 콜로니를 프라이머 P21(서열번호 28) 및 P22(서열번호 29)를 사용한 PCR에 의해 zwf-edd-eda 오페론 대신 Km^R 마커가 존재하는지의 여부에 대해 시험하였다. 시험된 몇개의 Km^R 콜로니는 목적하는 1287bp DNA 단편을 함유하였고 이것은 zwf-edd-eda 오페론 대신 Km^R 유전자가 존재함을 확인시켜준다. 수득된 균주중 하나는 37℃에서 배양함에 의해 열 민감성 플라스미드 pKD46때문에 소실되었고 수득한 균주는 이. 콜리 균주 BW25113-△zwf-edd-eda로서 명명하였다. zwf-edd-eda 오페론이 결실된 세균 DNA 영역의 구조는 도 6에 나타낸다.

실시예 9. 이. 콜리 염색체상에 위치한 ybhE 유전자의 본래의 업스트림 영역의, 합성 P_tac ^*-프로모터를 함유한 신규한 조절 성분으로의 치환

pgl(ybhE) 유전자의 업스트림에 다양한 강도의 인공 P_tac ^* 프로모터를 추가로 통합하기 위해, 이. 콜리 균주 BW25113-△zwf-edd-eda를 pKD46 플라스미드로 다시 형질전환시켰다. 수득된 가나마이신 및 앰피실린 내성 균주는 이. 콜리 균주 BW25113-△zwf-edd-eda[pKD46]로 명명하였다. pKD46 플라스미드는 열 민감성이기때문에 30℃에서 추가로 형질전환체를 선별하였다.

σ⁷⁰과 이. 콜리 RNA 폴리머라제의 복합체에 의해 인지되는 프로모터의 "-35" 영역이 변형된 돌연변이체가 상당히 변화된 전사 개시 효율을 소유하고 있다는 것은 기정사실이다(WO00/18935). 따라서, 초기 랜덤 프로모터형 서열상에 생성된 수득한 프로모터중에서, 강도가 상이한 프로모터가 수득될 수 있다. 따라서, 당해 일반적인 방법은 목적하는 유전자 발현 수위를 잘 조정하여 사용될 수 있다. 본 발명자는 이전에 강도가 상이한 변형된 P_tac 프로모터의 라이브러리를 수득하였다[이후부터, 당해 변형된 P_tac 프로모터는 별표로 표시한다]. 이들 프로모터는 "-35" 영역의 4개의 중심 뉴클레오타이드가 상이하다. 본 연구에서, 강도가 상이한 2개의 P_tac* 프로모터를 사용하였다. 상응하는 프로모터의 조절하에 발현된 β-갈락토시다제 활성 값을 기준으로, 이들은 P_tac-10000(통상적으로 P_tac) 및 P_tac-3900(본래의 TGAC 대신 TTGC 중심 뉴클레오타이드를 가짐)로서 명명되었다.

이어서, 이들 인공 P_tac* 프로모터 각각은 pgl 유전자의 암호화 영역의 업스트림에서 상기된 방법(실시예 2 참조)에 의해 이. 콜리 균주 BW25113-△zwf-edd-eda[pKD46]의 염색체로 통합시켰다. 추가로, 프로모터 영역 업스트림에 클로람페니콜 내성 유전자(Cm^R)를 갖는 인공 DNA 단편을 통합시켰다(도 7 참조).

세균 염색체의 상응하는 영역으로 통합된 상기 언급된 인공 DNA 단편의 작제는 여러 단계로 완성되었다. 제1 단계를 위해, 업스트림 영역에 BglII 제한 부위 및 상응하는 P_tac* 프로모터를 함유한 DNA 단편을 PCR로 수득하였다.

염색체로 통합된 인공 P_tac-3900 프로모터 및 P_tac-10000 프로모터를 갖는 이. 콜리 MG1655 균주 기원의 염색체 DNA는 PCR을 위한 주형으로서 사용하였다. P_tac-3900 또는 P_tac-10000 의 경우에 각각 프라이머 P23(서열번호 30) 및 P24(서열번호 31)를 사용하고 양 경우에 프라이머 P25(서열번호 32)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 프라이머 P23 및 P24는 이의 5' 말단에 도입된 BglII-제한 부위를 함유한다. 프라이머 P25는 pgl 유전자의 업스트림에 11개의 뉴클레오타이드(RBS를 포함) 및 pgl 암호화 영역의 처음 25개 뉴클레오타이드를 함유한다. 상기 언급된 서열은 세균 염색체로 추가로 통합하기 위해 프라이머 P25에 도입하였다.

증폭용 "TermoHybaid PCR 익스프레스 PCR 시스템"을 사용하여 PCR을 수행하였다. 반응 혼합물(총 용적 50㎕)은 15mM MgCl₂("Fermentas", Lithuania), dNTP 각각 200μM, 사용되는 프라이머 각각 25pmol 및 1μTaq-폴리머라제("Fermentas", Lithuania)와 함께 10x PCR 완충액 5㎕로 이루어진다. 염색체 DNA 0.5㎍을 추가의 PCR 구동 증폭을 위해 주형 DNA로서 반응 혼합물에 첨가하였다. 온도 PCR 조건은 다음과 같다: 처음에 95℃에서 5분동안 DNA 변성에 이어서 95℃에서 30초동안 25회 변성, 30초동안 53℃에서 어넬링, 72℃에서 30초동안 신장 및 최종적으로 72℃에서 7분동안 중합.

목적하는 DNA 단편 작제를 위한 제2 단계를 수행하였다. Cm^R 유전자는 주형으로서 시판되는 플라스미드 pACYC184(GenBank/EMBL 승인번호 X06403, "Fermentas", Lithuania) 및 프라이머 P26(서열번호 33) 및 P27(서열번호 34)를 사용하는 PCR로 증폭시켰다. 프라이머 P26은 P_tac* 프로모터를 함유하는 처음에 수득된 DNA 단편과 추가로 연결하기 위해 사용된 BglII- 제한 부위를 함유한다. 프라이머 P27은 이. 콜리 기원의 pgl(ybhE) 유전자 개시 코돈의 업스트립에 위치한 뉴클레오타이드 58 내지 12에 상보적인 46개의 뉴클레오타이드를 함유하고 당해 단편을 세균 염색체에 추가로 통합시키기 위해 필요하다.

이어서, 증폭된 DNA 단편은 아가로스 겔-전기영동으로 농축시켰고 "GenElute 스핀 칼럼"("Sigma", USA)를 통한 원심분리에 의해 겔로부터 추출하고 에탄올로 침전시켰다. 이어서, 2개의 수득된 DNA 단편을 BglII 제한 엔도뉴클레아제로 처리하고 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시켰다[문헌참조: Maniatis T. , Fritsch E. F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989].

연결된 생성물을 프라이머 P25 및 P27을 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 5㎕의 10x AccuTaq LA 완충액("Sigma", USA), 각각의 dNTP 200μM, 사용되는 프라이머 각각 25pmol 및 1μAccuTaq LA 폴리머라제("Sigma", USA)로 이루어진 반응 혼합물(총 용적 - 50㎕)로 PCR을 수행하였다. 연결된 DNA 생성물 약 50ng을 주형으로서 반응 혼합물에 첨가하였다. PCR 온도 주기는 다음과 같다: 처음에 95℃에서 5분동안 DNA 변성에 이어서 95℃에서 30초동안 25회 변성, 30초동안 55℃에서 어넬링, 72℃에서 4분동안 신장 및 72℃에서 7분동안 최종 중합.

작제된 DNA 영역의 뉴클레오타이드 서열은 각각 P_tac-3900 및 P_tac-10000 프로모터에 대해 서열번호 35 및 36으로 나타낸다.

상기된 바와 같이 정제된 수득된 DNA 단편은 전기천공 및 실시예 2에 기재된 바와 같은 이. 콜리 균주 BW25113△zwf-edd-eda[pKD46]의 세균 염색체로의 레드 매개된 통합을 위해 사용하였다.

클로람페니콜을 갖는 배지에서 24시간이내에 증식한 콜로니는, 프라이머 P27(서열번호 34) 및 P10(서열번호 15)을 사용한 PCR에 의해 pgl 유전자 업스트림에 Cm^R 마커가 존재하는지의 여부에 대해 시험하였다. 동일한 콜로니를 또한 각각 P_tac-3900 및 P_tac-10000에 대한 프라이머 P23(서열번호 30) 및 P24(서열번호 31), 및 프라이머 P10(서열번호 15)을 사용한 PCR에 의해 pgl 유전자 업스트림에 P_tac* 프로모터 영역이 존재하는지의 여부에 대해 시험하였다. 이러한 목적을 위해, 새롭게 분리된 콜로니를 20㎕의 물에 현탁시킴에 이어서 현탁액 1㎕를 PCR을 위해 사용하였다. PCR 조건은 다음과 같다: 처음에 95℃에서 10분동안 DNA 변성에 이어서 95℃에서 30초동안 30회 변성, 30초동안 54℃에서 어넬링, 72℃에서 1분동안 신장 및 최종적으로 72℃에서 7분동안 중합. 시험된 몇개의 Cm^R 콜로니는 목적하는 1193bp 및 124bp DNA 단편을 함유하고 이것은 이. 콜리 염색체에 각각, pgl 유전자의 업스트림에 온전히 작제된 DNA 영역 및 P_tac* 프로모터를 함유하는 하이브리드 조절 성분이 존재함을 확인시켜준다. 양 경우에, 수득된 균주중 하나는 37℃에서 배양함에 의해 열 민감성 플라스미드 pKD46때문에 소실되었고 수득한 균주는 각각 이. 콜리 균주 BW25113-P_tac-3900-ybhE 및 BW25113-P_tac-10000-ybhE로 명명하였다. pgl 유전자의 업스트림에 존재하는 작제된 DNA 영역의 구조는 도 7에 나타낸다.

실시예 10. pgl 유전자의 발현이 증진된 균주에서 6-포스포글루코노락토나제 활성의 측정

균주 BW25113-P_tac-3900-ybhE 및 BW25113-P_tac-10000-ybhE로부터 6-포스포글루코노락토나제의 활성은 실시예 7에 기재된 바와 같이 측정하였다. 수득된 데이타는 표 2에 나타내었다. 자발적인 가수분해 수준은 공제되었다.

따라서, pgl 유전자의 발현 증진은 6-포스포글루코노락토나제 활성을 증가시킨다.

실시예 11. 트립토판 생산에 대한 pgl 유전자의 발현 증진 효과

트립토판 생산 이. 콜리 균주 SV164[pMW-P_tacUV5-serA5-fruR, pYDDG2]를 트립토판 생산에 대한 pgl 유전자 발현 증진 효과를 평가하기 위해 모균주로서 사용하였다. 균주 SV164는 미국 특허 제6,180,373호에 상세히 기재되어 있다. 균주 SV164[pMW-P_tacUV5-serA5-fruR, pYDDG2]는 균주 SV164의 변이체이고 추가로 플라스미드 pMW-P_tacUV5-serA5-fruR, pYDDG2를 함유한다. 플라스미드 pMW-P_tacUV5-serA5-fruR은 세린에 의한 피드백 억제를 받지 않는 단백질을 암호화하는 돌연변이 serA5 유전자를 함유한다[문헌참조: WO2004090125 A2]. serA5 유전자의 증폭은 L-트립토판의 전구체인 세린의 양을 증가시키는데 필요하다[미국 특허 제6,180,373호]. 플라스미드 pYDDG2는 pAYCTER3 벡터(WO03/044192)를 토대로 작제하고 L-트립토판 생산에 유용한 막관통 단백질(추정 수송체)을 암호화하는 yddG 유전자를 함유한다. pAYCTER3 벡터는 플라스미드 RSF1010을 토대로 작제된 매우 안정한 벡터이고 카피수가 적절한 pAYC32의 유도체이고 스트렙토마이신 내성을 위한 마커를 함유한다[문헌참조: Christoserdov A. Y., Tsygankov Y. D, Broad-host range vectors derived from a RSF 1010 Tnl plasmid, Plasmid, 1986, v. 16, pp. 161-167]. pAYCTER3 벡터는 이의 프로모터 대신 pUC19 플라스미드 기원의 폴리링커 및 강한 터미네이터 rrnB를 pAYC32 플라스미드에 도입하여 수득하였다.

트립토판 생산에 대한 P_tac* 프로모터 조절하에 있는 pgl 유전자의 발현 증진 효과를 시험하기 위해, 상기 언급된 이. 콜리 균주 BW25113-P_tac-3900-ybhE 및 BW25113-P_tac-10000-ybhE의 염색체 기원 DNA 단편을 P1 형질도입에 의해 트립토판 생산 이. 콜리 균주 SV164[pMW-P_tacUV5-serA5-fruR]로 이전하였다[문헌참조: Miller, J. H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY]. 이어서, 플라스미드 pYDDG2를 SV164[pMW-P_tacUV5-serA5-fruR] 균주 및 수득한 형질도입체 둘다에 도입하였다.

SV164[pMW-P_tacUV5-serA5-fruR, pYDDG2], SV164-P_tac-3900-ybhE[pMW-P_tacUV5-serA5-fruR, pYDDG2] 및 SV164-P_tac-10000-ybhE[pMW-P_tacUV5-serA5-fruR, pYDDG2] 균주는 100㎍/ml의 앰피실린 및 50㎍/ml의 스트렙토마이신이 보충된 영양 액체 배지 3ml중에서 37℃에서 교반시키면서 밤새 배양하였다. 0.3ml의 수득된 배양물을 20 x 200mm 시험 튜브중에 당해 항생제를 함유하는 발효 배지 3ml에 접종하고 250rpm의 회전 진탕기를 사용하여 40시간동안 37℃에서 배양하였다.

발효 배지의 조성은 표 3에 나타낸다.

섹션 A는 NH₄OH로 조정된 pH 7.1이다. 각각의 섹션은 별도로 멸균하였다.

배양 후, 배지에 축적된 L-트립토판의 양은 TLC로 측정하였다. 형광 지시제 없이 0.11nm의 Sorbfil 실리카 겔 층으로 피복된 10 x 15cm TLC 플레이트(제조원: Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Russia)를 사용하였다. Sorbfil 플레이트를 다음과 같은 이동상으로 전개하였다: 프로판-2-올: 에틸아세테이트: 25% 수성 암모니아:물 = 16:16:3:9(v/v). 아세톤중의 닌하이드린 용액(2%)을 가시화 시약으로서 사용하였다. 수득된 데이타는 표 4에 나타낸다.

표 4로부터 알 수 있는 바와 같이, pgl 유전자 발현의 증진은 SV164[pMW-P_tacUV5-serA5-fruR, pYDDG2] 균주의 트립토판 생산성을 개선시켰다.

실시예 12. His-태그된 YbhE 단백질의 정제 및 이의 6-PGL(6-포스포글루코노락토나제) 활성의 측정.

이전에 실시예 1 내지 7에 기재된 모든 결과는 ybhE ORF가, 이. 콜리에서 기능적으로 활성인 6-PGL을 암호화하는 pgl 유전자임을 간접적으로 시사한다. 한편, ybhE ORF는 예를 들어, 6-PGL을 암호화하는 또 다른 미지의 유전자의 발현에 대한 양성 조절인자를 암호화할 가능성이 있다. 따라서, ybhE ORF의 성질에 관한 최종 결론은 단지 단백질 생성물의 생물학적 활성을 직접 측정함으로써 내릴 수 있다.

이러한 목적을 위해, 염색체내 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 함유하는 수용체 균주로서 이.콜리 BL21(DE3) 및 T7 유전자 10의 T7 후기 프로모터 및 효율적인 RBS를 갖는 pET-22b(+) 벡터 플라스미드를 포함하는 T7 발현 시스템을 사용하여 과발현시켰다. 하기의 단백질 정제를 간편하게 하기 위해, 6개의 His 코돈을 정확하게 ATG 개시 코돈 뒤에 ybhE ORF의 5' 말단에 삽입하였다.

T7 발현 시스템에서 His-Tag 서열로 ybhE ORF를 클로닝하기 위해, 주형으로서 이.콜리 균주 MG1655의 염색체 DNA를 사용하여 프라이머 P28(서열번호 37) 및 P29(서열번호 38)과 함께 PCR을 수행하였다. 프라이머 P28은 ybhE ORF의 제2 코돈 앞에 6개의 추가의 히스티딘 코돈에 연결된 ATG 코돈 및 NdeI 제한 부위를 함유한다. 프라이머 P29는 추가의 클로닝을 위해 BamHI 제한 부위를 함유한다. 증폭된 DNA 단편을 분리하고 NdeI 및 BamHI 레스트릭타제로 처리하고 동일한 레스트릭타제로 처리된 pET-22b(+) 플라스미드에 연결하였다. 수득된 pET-HT-ybhE 플라스미드의 작제는 서열분석하여 입증하였다.

이어서, 염색체내 락토스 프로모터 조절하에 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 함유하는 BL21(DE3) 세포를 pET-HT-ybhE 플라스미드로 형질전환시켰다. 단일 콜로니로부터 기원하는 하루 배양물을 LB로 50배 희석하고 OD₆₀₀이 약 1.0이 되도록 증식시킴에 이어서 IPTG(1mM)를 첨가하여 재조합 플라스미드에서 ybhE ORF의 T7 RNA 폴리머라제 구동 발현을 유도하였다. 2시간 배양한 후, 세포를 20ml로부터 수거하였다. 세포 추출물을 20mM의 트리스-HCl, pH 8.0 및 2mM PMSF를 함유하는 완충액으로 초음파 처리하여 제조하였다. 이어서, 프로브를 16,000 x g 및 4℃에서 20분동안 원심분리함에 이어서 제조자에 의해 추천된 바와 같이 HiTrap 킬레이팅 HP 칼럼(Amersham Bioscience)를 사용하여 상등액으로부터 His-태그된 단백질을 정제하였다.

대수증식기의 배양물에서 T7 발현 시스템을 유도한지 2시간 후, His-태그된 YbhE(분자량이 37Kda 초과인 단백질)에 상응하는 전기영동 이동도를 갖는 단백질이 축적됨을 관찰하였다. 단백질의 양은 총 세포 폴리펩타이드중 약 15%였다. 당해 단백질 대부분은 가용성 상에서 관찰되었다(도 8A 참조).

수득된 His₆-YbhE 단백질은 Ni-NTA 칼럼을 사용하여 정제하였다. 재조합 단백질 합성 수준의 측정 및 정제 공정의 조절은 문헌[참조: Laemmli U. K. (Nature, 227,680-685 (1970)]에 기재된 방법에 따른 SDS-PAGE 전기영동으로 수행하였다. 도 8B에서 알 수 있는 바와 같이, 수득된 단백질의 순도는 90% 초과이고 이것은 표준 락토나제 시험에서 6-PGL 활성을 나타내었다[문헌참조: Collard, F. et al, FEBS Letters, 459,223-226 (1999)].

따라서, 미지의 기능을 갖는 이. 콜리 기원의 ybhE ORF는 실질적으로 6-PGL을 암호화하는 pgl 유전자인 것으로 결론지울 수 있다.

실시예 13. 페닐알라닌 생산에 대한 pgl 유전자의 발현 증진 효과

페닐알라닌 생산 이. 콜리 균주 AJ12739를, 트립토판 생산에 대한 pgl 유전자 발현 증진 효과를 평가하기 위해 모 균주로서 사용하였다. 균주 AJ12739는 수탁번호 VKPM B-8197하에 기탁기관(VKPM)[Russia, 113545 Moscow, 15t Dorozhny proozd, 1]에 2001년 11월 6일자로 기탁하였다.

BW25113-P_tac-3900-ybhE 및 BW25113-P_tac-10000-ybhE 균주 기원의 염색체 DNA 단편을 P1 형질도입에 의해 페닐알라닌 생산 균주 AJ12739로 이전시켜 각각 AJ12739 P_tac-3900-ybhE 및 AJ12739 P_tac-10000 균주를 수득하였다. 이들 균주를 25mg/l의 클로람페니콜이 함유된 영양 배양액에서 각각 18시간동안 37℃에서 배양하고 0.3ml의 수득된 배양물을 20 x 200nm 시험 튜브에서 25mg/l의 클로람페니콜을 함유하는 발효 배지 3ml중에 접종하고 회전 진탕기를 사용하여 24시간동안 34℃에서 배양하였다. 배양 후, 배지에 축적된 페닐알라닌의 양은 TLC로 측정하였다. 형광 지시제 없이 0.11nm의 Sorbfil 실리카 겔 층으로 피복된 10 x 15cm TLC 플레이트(제조원: Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Russia)를 사용하였다. Sorbfil 플레이트를 다음과 같은 이동상으로 전개하였다: 프로판-2-올: 에틸아세테이트: 25% 수성 암모니아:물 = 40:40:7:16(v/v). 아세톤중의 닌하이드린 용액(2%)을 가시화 시약으로서 사용하였다.

발효 배지의 조성(g/l):

글루코스 40.0

(NH₄)₂SO₄ 16.0

K₂HPO₄ 0.1

MgSO₄ㆍ7H₂O 1.0

FeSO₄ㆍ5H₂O 0.01

MnSO₄ㆍ5H₂O 0.01

티아민 HCl 0.0002

효모 추출물 2.0

타이로신 0.125

CaCO₃ 20.0

글루코스 및 황산마그네슘을 별도로 멸균시킨다. 2시간동안 180℃에서 CaCO₃ 건조 열로 멸균시켰다. pH는 7.0으로 조정한다. 항생제는 멸균 후 배지로 도입한다. 당해 결과는 표 5에 나타낸다.

pgl 유전자의 발현 증진이 AJ12739 균주의 페닐알라닌 생산을 개선시켰음을 표 5로부터 알 수 있다.

본 발명은 이의 바람직한 양태를 참조로 상세하게 기술되었지만 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 다양하게 변화될 수 있고 이의 등가물이 사용될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본원의 모든 인용 문헌은 본원에 참조로서 본원의 일부로서 인용된다.

본 발명에 따라, L-트립토판, L-페닐알라닌 및 L-타이로신과 같은 L-아미노산의 생산이 증진될 수 있다.

<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS <130> C255OPC4299 <150> RU 2004105179 <151> 2004-02-25 <150> US 60/604,698 <151> 2004-08-27 <150> RU 2005101700 <151> 2005-01-26 <160> 38 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 996 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(996) <400> 1 atg aag caa aca gtt tat atc gcc agc cct gag agc cag caa att cac 48 Met Lys Gln Thr Val Tyr Ile Ala Ser Pro Glu Ser Gln Gln Ile His 1 5 10 15 gtc tgg aat ctg aat cat gaa ggc gca ctg acg ctg aca cag gtt gtc 96 Val Trp Asn Leu Asn His Glu Gly Ala Leu Thr Leu Thr Gln Val Val 20 25 30 gat gtg ccg ggg cag gtg cag ccg atg gtg gtc agc ccg gac aaa cgt 144 Asp Val Pro Gly Gln Val Gln Pro Met Val Val Ser Pro Asp Lys Arg 35 40 45 tat ctc tat gtt ggt gtt cgc cct gag ttt cgc gtc ctg gcg tat cgt 192 Tyr Leu Tyr Val Gly Val Arg Pro Glu Phe Arg Val Leu Ala Tyr Arg 50 55 60 atc gcc ccg gac gat ggc gca ctg acc ttt gcc gca gag tct gcg ctg 240 Ile Ala Pro Asp Asp Gly Ala Leu Thr Phe Ala Ala Glu Ser Ala Leu 65 70 75 80 ccg ggt agt ccg acg cat att tcc acc gat cac cag ggg cag ttt gtc 288 Pro Gly Ser Pro Thr His Ile Ser Thr Asp His Gln Gly Gln Phe Val 85 90 95 ttt gta ggt tct tac aat gcg ggt aac gtg agc gta acg cgt ctg gaa 336 Phe Val Gly Ser Tyr Asn Ala Gly Asn Val Ser Val Thr Arg Leu Glu 100 105 110 gat ggc ctg cca gtg ggc gtc gtc gat gtg gtc gag ggg ctg gac ggt 384 Asp Gly Leu Pro Val Gly Val Val Asp Val Val Glu Gly Leu Asp Gly 115 120 125 tgc cat tcc gcc aat atc tca ccg gac aac cgt acg ctg tgg gtt ccg 432 Cys His Ser Ala Asn Ile Ser Pro Asp Asn Arg Thr Leu Trp Val Pro 130 135 140 gca tta aag cag gat cgc att tgc ctg ttt acg gtc agc gat gat ggt 480 Ala Leu Lys Gln Asp Arg Ile Cys Leu Phe Thr Val Ser Asp Asp Gly 145 150 155 160 cat ctc gtg gcg cag gac cct gcg gaa gtg acc acc gtt gaa ggg gcc 528 His Leu Val Ala Gln Asp Pro Ala Glu Val Thr Thr Val Glu Gly Ala 165 170 175 ggc ccg cgt cat atg gta ttc cat cca aac gaa caa tat gcg tat tgc 576 Gly Pro Arg His Met Val Phe His Pro Asn 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Ser His His Ile Ser Val Tyr Glu Ile 290 295 300 gtt ggc gag cag ggg cta ctg cat gaa aaa ggc cgc tat gcg gtc ggg 960 Val Gly Glu Gln Gly Leu Leu His Glu Lys Gly Arg Tyr Ala Val Gly 305 310 315 320 cag gga cca atg tgg gtg gtg gtt aac gca cac taa 996 Gln Gly Pro Met Trp Val Val Val Asn Ala His 325 330 <210> 2 <211> 331 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Lys Gln Thr Val Tyr Ile Ala Ser Pro Glu Ser Gln Gln Ile His 1 5 10 15 Val Trp Asn Leu Asn His Glu Gly Ala Leu Thr Leu Thr Gln Val Val 20 25 30 Asp Val Pro Gly Gln Val Gln Pro Met Val Val Ser Pro Asp Lys Arg 35 40 45 Tyr Leu Tyr Val Gly Val Arg Pro Glu Phe Arg Val Leu Ala Tyr Arg 50 55 60 Ile Ala Pro Asp Asp Gly Ala Leu Thr Phe Ala Ala Glu Ser Ala Leu 65 70 75 80 Pro Gly Ser Pro Thr His Ile Ser Thr Asp His Gln Gly Gln Phe Val 85 90 95 Phe Val Gly Ser Tyr Asn Ala Gly Asn Val Ser Val Thr Arg Leu Glu 100 105 110 Asp Gly Leu Pro Val Gly Val Val Asp Val Val Glu Gly Leu Asp Gly 115 120 125 Cys His Ser Ala Asn Ile Ser Pro Asp Asn Arg Thr 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Description of Artificial Sequence: primer P1 <400> 3 catgaagcaa acagtttata tcgccagccc tgagagctta cgccccgccc tgccactc 58 <210> 4 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P2 <400> 4 ttagtgtgcg ttaaccacca cccacattgg tccctggctg atgtccggcg gtgcttttg 59 <210> 5 <211> 1096 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 36 nucleotides from 5`-terminus of ybhE gene, Cm-resistance gene, 36 nucleotides from 3`-terminus of ybhE gene <400> 5 catgaagcaa acagtttata tcgccagccc tgagagctta cgccccgccc tgccactcat 60 cgcagtactg ttgtaattca ttaagcattc tgccgacatg gaagccatca cagacggcat 120 gatgaacctg aatcgccagc ggcatcagca ccttgtcgcc ttgcgtataa tatttgccca 180 tggtgaaaac gggggcgaag aagttgtcca tattggccac gtttaaatca aaactggtga 240 aactcaccca gggattggct gagacgaaaa acatattctc aataaaccct ttagggaaat 300 aggccaggtt ttcaccgtaa cacgccacat cttgcgaata tatgtgtaga aactgccgga 360 aatcgtcgtg gtattcactc cagagcgatg aaaacgtttc agtttgctca tggaaaacgg 420 tgtaacaagg gtgaacacta tcccatatca ccagctcacc gtctttcatt gccatacgga 480 attccggatg agcattcatc aggcgggcaa gaatgtgaat aaaggccgga taaaacttgt 540 gcttattttt ctttacggtc tttaaaaagg ccgtaatatc cagctgaacg gtctggttat 600 aggtacattg agcaactgac tgaaatgcct caaaatgttc tttacgatgc cattgggata 660 tatcaacggt ggtatatcca gtgatttttt tctccatttt agcttcctta gctcctgaaa 720 atctcgataa ctcaaaaaat acgcccggta gtgatcttat ttcattatgg tgaaagttgg 780 aacctcttac gtgccgatca acgtctcatt ttcgccaaaa gttggcccag ggcttcccgg 840 tatcaacagg gacaccagga tttatttatt ctgcgaagtg atcttccgtc acaggtattt 900 attcggcgca aagtgcgtcg ggtgatgctg ccaacttact gatttagtgt atgatggtgt 960 ttttgaggtg ctccagtggc ttctgtttct atcagctgtc cctcctgttc agctactgac 1020 ggggtggtgc gtaacggcaa aagcaccgcc ggacatcagc cagggaccaa tgtgggtggt 1080 ggttaacgca cactaa 1096 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P3 <400> 6 tacaccgata ccactatcgg acaaa 25 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P4 <400> 7 gaacgccaga gacacgcgt 19 <210> 8 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P5 <400> 8 ttaaatcagg tggctataaa tgaactgggc aatgctgctg atgtccggcg gtgcttttg 59 <210> 9 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P6 <400> 9 atgaccacac gcgtgattgc tctcgactta gacggcttac gccccgccct gccactc 57 <210> 10 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P7 <400> 10 ttaacctatc tcctgtaacg cgtgtctctg gcgttcgctg atgtccggcg gtgcttttg 59 <210> 11 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P8 <400> 11 atgcagttaa aatttttaac ggccagccac ccaaaattac gccccgccct gccactc 57 <210> 12 <211> 1095 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 36 nucleotides from 3`-terminus of ybhE gene, Cm-resistance gene, 36 nucleotides from 5`-terminus of ybhA gene <400> 12 ttaaatcagg tggctataaa tgaactgggc aatgctgctg atgtccggcg gtgcttttgc 60 cgttacgcac caccccgtca gtagctgaac aggagggaca gctgatagaa acagaagcca 120 ctggagcacc tcaaaaacac catcatacac taaatcagta agttggcagc atcacccgac 180 gcactttgcg ccgaataaat acctgtgacg gaagatcact tcgcagaata aataaatcct 240 ggtgtccctg ttgataccgg gaagccctgg gccaactttt ggcgaaaatg agacgttgat 300 cggcacgtaa gaggttccaa ctttcaccat aatgaaataa gatcactacc gggcgtattt 360 tttgagttat cgagattttc aggagctaag gaagctaaaa tggagaaaaa aatcactgga 420 tataccaccg ttgatatatc ccaatggcat cgtaaagaac attttgaggc atttcagtca 480 gttgctcaat gtacctataa ccagaccgtt cagctggata ttacggcctt tttaaagacc 540 gtaaagaaaa ataagcacaa gttttatccg gcctttattc acattcttgc ccgcctgatg 600 aatgctcatc cggaattccg tatggcaatg aaagacggtg agctggtgat atgggatagt 660 gttcaccctt gttacaccgt tttccatgag caaactgaaa cgttttcatc gctctggagt 720 gaataccacg acgatttccg gcagtttcta cacatatatt cgcaagatgt ggcgtgttac 780 ggtgaaaacc tggcctattt ccctaaaggg tttattgaga atatgttttt cgtctcagcc 840 aatccctggg tgagtttcac cagttttgat ttaaacgtgg ccaatatgga caacttcttc 900 gcccccgttt tcaccatggg caaatattat acgcaaggcg acaaggtgct gatgccgctg 960 gcgattcagg ttcatcatgc cgtctgtgat ggcttccatg tcggcagaat gcttaatgaa 1020 ttacaacagt actgcgatga gtggcagggc ggggcgtaag ccgtctaagt cgagagcaat 1080 cacgcgtgtg gtcat 1095 <210> 13 <211> 1095 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 36 nucleotides from 3`-terminus of ybhE gene, Cm-resistance gene, 36 nucleotides from 5`-terminus of ybhD gene <400> 13 ttaacctatc tcctgtaacg cgtgtctctg gcgttcgctg atgtccggcg gtgcttttgc 60 cgttacgcac caccccgtca gtagctgaac aggagggaca gctgatagaa acagaagcca 120 ctggagcacc tcaaaaacac catcatacac taaatcagta agttggcagc atcacccgac 180 gcactttgcg ccgaataaat acctgtgacg gaagatcact tcgcagaata aataaatcct 240 ggtgtccctg ttgataccgg gaagccctgg gccaactttt ggcgaaaatg agacgttgat 300 cggcacgtaa gaggttccaa ctttcaccat aatgaaataa gatcactacc gggcgtattt 360 tttgagttat cgagattttc aggagctaag gaagctaaaa tggagaaaaa aatcactgga 420 tataccaccg ttgatatatc ccaatggcat cgtaaagaac attttgaggc atttcagtca 480 gttgctcaat gtacctataa ccagaccgtt cagctggata ttacggcctt tttaaagacc 540 gtaaagaaaa ataagcacaa gttttatccg gcctttattc acattcttgc ccgcctgatg 600 aatgctcatc cggaattccg tatggcaatg aaagacggtg agctggtgat atgggatagt 660 gttcaccctt gttacaccgt tttccatgag caaactgaaa cgttttcatc gctctggagt 720 gaataccacg acgatttccg gcagtttcta cacatatatt cgcaagatgt ggcgtgttac 780 ggtgaaaacc tggcctattt ccctaaaggg tttattgaga atatgttttt cgtctcagcc 840 aatccctggg tgagtttcac cagttttgat ttaaacgtgg ccaatatgga caacttcttc 900 gcccccgttt tcaccatggg caaatattat acgcaaggcg acaaggtgct gatgccgctg 960 gcgattcagg ttcatcatgc cgtctgtgat ggcttccatg tcggcagaat gcttaatgaa 1020 ttacaacagt actgcgatga gtggcagggc ggggcgtaat tttgggtggc tggccgttaa 1080 aaattttaac tgcat 1095 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P9 <400> 14 cggccaggtg gaagtgg 17 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P10 <400> 15 ggctctcagg gctggc 16 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P11 <400> 16 cgagcagggg ctactgc 17 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P12 <400> 17 aacgcgcccc tcgagg 16 <210> 18 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P13 <400> 18 ttaaccgcgc cacgctttat agcggttaat cagaccgaaa gccacgttgt gtctcaaaat 60 ctctgatg 68 <210> 19 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P14 <400> 19 aatgaaaaac atcaatccaa cgcagaccgc tgcctggcgc tgaggtctgc ctcgtgaaga 60 aggtg 65 <210> 20 <211> 1286 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 36 nucleotides from 3`-terminus of pgi gene, Km-resistance gene, 36 nucleotides from 5`-terminus of pgi gene <400> 20 ttaaccgcgc cacgctttat agcggttaat cagaccgaaa gccacgttgt gtctcaaaat 60 ctctgatgtt acattgcaca agataaaaat atatcatcat gaacaataaa actgtctgct 120 tacataaaca gtaatacaag gggtgttatg agccatattc aacgggaaac gtcttgctcg 180 aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg ggtataaatg ggctcgcgat 240 aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat cgattgtatg ggaagcccga tgcgccagag 300 ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg ttacagatga gatggtcaga 360 ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca agcattttat ccgtactcct 420 gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc cccgggaaaa cagcattcca ggtattagaa 480 gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg cagtgttcct gcgccggttg 540 cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc gcgtatttcg tctcgctcag 600 gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga cgagcgtaat 660 ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataagc ttttgccatt ctcaccggat 720 tcagtcgtca ctcatggtga tttctcactt gataacctta tttttgacga ggggaaatta 780 ataggttgta ttgatgttgg acgagtcgga atcgcagacc gataccagga tcttgccatc 840 ctatggaact gcctcggtga gttttctcct tcattacaga aacggctttt tcaaaaatat 900 ggtattgata atcctgatat gaataaattg cagtttcatt tgatgctcga tgagtttttc 960 taatcagaat tggttaattg gttgtaacac tggcagagca ttacgctgac ttgacgggac 1020 ggcggctttg ttgaataaat cgaacttttg ctgagttgaa ggatcagatc acgcatcttc 1080 ccgacaacgc agaccgttcc gtggcaaagc aaaagttcaa aatcaccaac tggtccacct 1140 acaacaaagc tctcatcaac cgtggctccc tcactttctg gctggatgat ggggcgattc 1200 aggcctggta tgagtcagca acaccttctt cacgaggcag acctcagcgc caggcagcgg 1260 tctgcgttgg attgatgttt ttcatt 1286 <210> 21 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P15 <400> 21 ttaaccgcgc cacgct 16 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P16 <400> 22 aatgaaaaac atcaatccaa cg 22 <210> 23 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P17 <400> 23 gacaaagagc tccacacagg aaacagctat gggagggcgt ggtatgg 47 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P18 <400> 24 ttagtagaat tctcatgggc accagtagat gtc 33 <210> 25 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P19 <400> 25 ttacagctta gcgccttcta cagcttcacg cgccaggaaa gccacgttgt gtctcaaaat 60 ctctgatg 68 <210> 26 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P20 <400> 26 atggcggtaa cgcaaacagc ccaggcctgt gacctggcgc tgaggtctgc ctcgtgaaga 60 aggtg 65 <210> 27 <211> 1286 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 36 nucleotides from 3`-terminus of eda gene, Km-resistance gene, 36 nucleotides from 5`-terminus of zwf gene <400> 27 ttacagctta gcgccttcta cagcttcacg cgccaggaaa gccacgttgt gtctcaaaat 60 ctctgatgtt acattgcaca agataaaaat atatcatcat gaacaataaa actgtctgct 120 tacataaaca gtaatacaag gggtgttatg agccatattc aacgggaaac gtcttgctcg 180 aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg ggtataaatg ggctcgcgat 240 aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat cgattgtatg ggaagcccga tgcgccagag 300 ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg ttacagatga gatggtcaga 360 ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca agcattttat ccgtactcct 420 gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc cccgggaaaa cagcattcca ggtattagaa 480 gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg cagtgttcct gcgccggttg 540 cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc gcgtatttcg tctcgctcag 600 gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga cgagcgtaat 660 ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataagc ttttgccatt ctcaccggat 720 tcagtcgtca ctcatggtga tttctcactt gataacctta tttttgacga ggggaaatta 780 ataggttgta ttgatgttgg acgagtcgga atcgcagacc gataccagga tcttgccatc 840 ctatggaact gcctcggtga gttttctcct tcattacaga aacggctttt tcaaaaatat 900 ggtattgata atcctgatat gaataaattg cagtttcatt tgatgctcga tgagtttttc 960 taatcagaat tggttaattg gttgtaacac tggcagagca ttacgctgac ttgacgggac 1020 ggcggctttg ttgaataaat cgaacttttg ctgagttgaa ggatcagatc acgcatcttc 1080 ccgacaacgc agaccgttcc gtggcaaagc aaaagttcaa aatcaccaac tggtccacct 1140 acaacaaagc tctcatcaac cgtggctccc tcactttctg gctggatgat ggggcgattc 1200 aggcctggta tgagtcagca acaccttctt cacgaggcag acctcagcgc caggtcacag 1260 gcctgggctg tttgcgttac cgccat 1286 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P21 <400> 28 ttacagctta gcgccttcta cag 23 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P22 <400> 29 catggcggta acgcaaac 18 <210> 30 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P23 <400> 30 ctagtaagat ctccctgttt gcaattaatc atcgg 35 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P24 <400> 31 ctagtaagat ctccctgttg acaattaatc atcgg 35 <210> 32 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P25 <400> 32 tggcgatata aactgtttgc ttcatgaatg ctcctttcct gtgtgaaatt gttatccgc 59 <210> 33 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P26 <400> 33 ctagtaagat ctgctgatgt ccggcggtgc ttttg 35 <210> 34 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P27 <400> 34 gccaaaagcg actaatttta gctgttacag tcagttgcta aatgcattac gccccgccct 60 gccactc 67 <210> 35 <211> 1099 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Cm-resistance gene, Ptac-3900 promoter <400> 35 ttacgccccg ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat tcattaagca ttctgccgac 60 atggaagcca tcacagacgg catgatgaac ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc 120 gccttgcgta taatatttgc ccatggtgaa aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc 180 cacgtttaaa tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg gctgagacga aaaacatatt 240 ctcaataaac cctttaggga aataggccag gttttcaccg taacacgcca catcttgcga 300 atatatgtgt agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt 360 ttcagtttgc tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc 420 accgtctttc attgccatac ggaattccgg atgagcattc atcaggcggg caagaatgtg 480 aataaaggcc ggataaaact tgtgcttatt tttctttacg gtctttaaaa aggccgtaat 540 atccagctga acggtctggt tataggtaca ttgagcaact gactgaaatg cctcaaaatg 600 ttctttacga tgccattggg atatatcaac ggtggtatat ccagtgattt ttttctccat 660 tttagcttcc ttagctcctg aaaatctcga taactcaaaa aatacgcccg gtagtgatct 720 tatttcatta tggtgaaagt tggaacctct tacgtgccga tcaacgtctc attttcgcca 780 aaagttggcc cagggcttcc cggtatcaac agggacacca ggatttattt attctgcgaa 840 gtgatcttcc gtcacaggta tttattcggc gcaaagtgcg tcgggtgatg ctgccaactt 900 actgatttag tgtatgatgg tgtttttgag gtgctccagt ggcttctgtt tctatcagct 960 gtccctcctg ttcagctact gacggggtgg tgcgtaacgg caaaagcacc gccggacatc 1020 agcagatctc cctgtttgca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg 1080 ataacaattt cacacagga 1099 <210> 36 <211> 1099 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Cm-resistance gene, Ptac-10000 promoter <400> 36 ttacgccccg ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat tcattaagca ttctgccgac 60 atggaagcca tcacagacgg catgatgaac ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc 120 gccttgcgta taatatttgc ccatggtgaa aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc 180 cacgtttaaa tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg gctgagacga aaaacatatt 240 ctcaataaac cctttaggga aataggccag gttttcaccg taacacgcca catcttgcga 300 atatatgtgt agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt 360 ttcagtttgc tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc 420 accgtctttc attgccatac ggaattccgg atgagcattc atcaggcggg caagaatgtg 480 aataaaggcc ggataaaact tgtgcttatt tttctttacg gtctttaaaa aggccgtaat 540 atccagctga acggtctggt tataggtaca ttgagcaact gactgaaatg cctcaaaatg 600 ttctttacga tgccattggg atatatcaac ggtggtatat ccagtgattt ttttctccat 660 tttagcttcc ttagctcctg aaaatctcga taactcaaaa aatacgcccg gtagtgatct 720 tatttcatta tggtgaaagt tggaacctct tacgtgccga tcaacgtctc attttcgcca 780 aaagttggcc cagggcttcc cggtatcaac agggacacca ggatttattt attctgcgaa 840 gtgatcttcc gtcacaggta tttattcggc gcaaagtgcg tcgggtgatg ctgccaactt 900 actgatttag tgtatgatgg tgtttttgag gtgctccagt ggcttctgtt tctatcagct 960 gtccctcctg ttcagctact gacggggtgg tgcgtaacgg caaaagcacc gccggacatc 1020 agcagatctc cctgttgaca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg 1080 ataacaattt cacacagga 1099 <210> 37 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P28 <400> 37 gatatacata tgcaccacca ccaccaccac aagcaaacag tttatatcgc cag 53 <210> 38 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P29 <400> 38 agactaggat ccttagtgtg cgttaaccac cac 33

Claims

에스케리치아 콜리(Escherichia coli)를 배양 배지에서 배양하는 단계 및

상기 배양 배지로부터 L-아미노산을 수거하는 단계

를 포함하는, L-아미노산을 생산하는 방법으로서,

상기 에스케리치아 콜리가 비변형된 균주에 비해, 6-포스포글루코노락토나제의 증진된 활성을 갖도록 6-포스포글루코노락토나제 유전자의 발현을 증가시킴에 의해 변형되고, 상기 6-포스포글루코노락토나제 유전자가 에스케리치아 콜리로부터 유래된 것이며, 6-포스포글루코노락토나제 유전자의 발현이 상기 유전자의 카피수를 증가시키거나 상기 유전자의 본래의 프로모터를 보다 강한 프로모터로 대체하거나 상기 유전자의 본래의 SD 서열을 보다 효율적인 SD 서열로 대체함에 의해 증진되고, 상기 6-포스포글루코노락토나제 유전자가,

(A) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 및

(B) 서열번호 2의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기의 보존성 치환을 포함하고 6-포스포글루코노락토나제의 활성을 갖는 단백질

로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 것인, 방법.
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제1항에 있어서, 6-포스포글루코노락토나제 유전자가,

서열번호 1의 뉴클레오타이드 1번 내지 993번의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA인, 방법.
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제1항에 있어서, 에스케리치아 콜리가 yddG 개방 판독 프레임의 발현이 증진되도록 추가로 변형된 것인, 방법.
제1항, 제8항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, L-아미노산이 L-트립토판, L-페닐알라닌 및 L-타이로신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방향족 L-아미노산인 방법.
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