CN101052707B

CN101052707B - 生产l-氨基酸的方法

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Publication number: CN101052707B
Application number: CN2005800060995A
Authority: CN
Inventors: 丹尼拉·V·齐门科夫; 安德雷·Y·格莱维奇; 亚历克山德拉·Y·斯科罗克霍多瓦; 乔安娜·Y·卡塔什基纳; 亚历山大·D·基弗罗; 艾里纳·V·比尔尤科瓦; 维拉·G·多罗申科; 瑟盖·V·马什科
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2004-02-25
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2025-02-25
Also published as: RU2004105179A; CN101052707A

Abstract

本发明提供一种使用肠杆菌科细菌生产L-氨基酸例如L-色氨酸，L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的方法。通过增强由pgl基因(ybhE ORF)编码的6-磷酸葡糖酸内酯酶的活性来增加所述细菌的L-氨基酸生产能力。

Description

生产L-氨基酸的方法

技术领域

本发明涉及使用微生物通过发酵生产L-氨基酸的方法。具体地，本发明涉及生产芳香族氨基酸例如L-色氨酸，L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的方法。

背景技术

戊糖磷酸途径(PPP)是大部分生物体的中枢代谢(central metabolism)的重要部分。在PPP的氧化分支中发生NADPH的合成，而PPP非氧化分支中的磷酸化的糖类是核苷酸生物合成(核糖-5-磷酸)，芳香族氨基酸和维生素(赤藓糖-5-磷酸)的前体。赤藓糖-4-磷酸(E4p)是芳香族L-氨基酸的常规生物合成的必需前体。因此，优化磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和E4p生物合成的具体途径可以提高芳香族L-氨基酸的产量。

PPP的氧化分支包括3个反应。第一和第三个反应由熟知的6-磷酸葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.49)和6-磷酸葡糖酸脱氢酶(EC.1.1.1.44)所催化，这两个酶分别由zwf和gnd基因所编码。第二个反应是6-磷酸葡糖酸内酯水解成6-磷酸葡糖酸(Escherichia coli and Salmonella，Second Edition，F.C.Neihardt主编，ASM Press，Washington D.C.1996)。已经在若干种生物中发现了催化此反应的酶，这些生物包括，例如，人(Collard等，FEBS Lett.，459：2，223-6(1999))，布氏锥虫(Trypanosoma brucei)(Duffieux F.等，J.Biol.Chem.，275：36，27559-65(2000))，贝氏疟原虫(Plasmodium berghei)(Clarke，J.L.等，Eur.J.Biochem.，268：7，2013-9(2001))，铜绿假单孢菌(Pseudomonasaeroginosa)(Hager P.W.等，J.Bacteriol.，182：14，3934-41(2000))，恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)(Petruschka，L.等，FEMS Microbiol.Lett.，215：1，89-95(2002))，但是还已知该反应可以自发进行。

δ-6-磷酸葡糖酸内酯是由6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化的反应的产物之一，其可以在分子间重排的过程中异构为γ-6-磷酸葡糖酸内酯。只有δ-6-磷酸葡糖酸内酯可以自发地水解为6-磷酸葡糖酸，而此反应正是被已知的6-磷酸葡糖酸内酯酶(EC.3.1.1.31)所催化的(Miclet E.等，J Biol Chem.，276：37，34840-46(2001))。来自大肠杆菌(E.coli)的pgl基因可能编码6-磷酸葡糖酸内酯酶，其被定位于大肠杆菌染色体上att-λ和chlD基因(在最新的数据库中-modC基因)之间。大肠杆菌突变体(pgl-)显示“麦芽糖蓝色”(“maltose-blue”)表型(Kupor，S.R.和Fraenkel，D.G.，J.Bacteriol.，100：3，1926-1301(1969))这是积累麦芽糖糊精的菌株所特有的特征(Adhya S.和Schwartz M.，J.Bacteriol.，108：2，621-626(1971))。

但是目前，pgl基因的序列和它在大肠杆菌染色体上的确切位置都还是未知的。来自大肠杆菌的具有6-磷酸葡糖酸内酯酶活性的酶尚未得到分离，也没有将产L-氨基酸细菌的细胞中6-磷酸葡糖酸内酯酶活性的增强和L-氨基酸产量增加联系起来的报道。

本发明的公开

本发明的一个目的是提供来自大肠杆菌的6-磷酸葡糖酸内酯酶，提高产L-氨基酸菌株的生产能力，并提供使用该菌株生产L-氨基酸的方法。

通过确认下列事实达到了上述目的：大肠杆菌K-12株的ybhE开放阅读框(ORF)编码6-磷酸葡糖酸内酯酶，且ybhE ORF(pgl基因)的表达的增强可以提高各种产L-氨基酸菌株的L-氨基酸生产。因此，本发明得以完成。

本发明的一个目的是提供一种产L-氨基酸细菌，其中该细菌已经受到修饰以增强6-磷酸葡糖酸内酯酶的活性。

本发明还有一个目的是提供如上所述的细菌，其中该细菌属于肠杆菌(Enterobacteriaceae)科，且该细菌选自埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、普罗威登斯菌属(Providencia)和沙雷氏菌属(Serratia)。

本发明还有一个目的是提供如上所述的细菌，其中通过修饰细菌染色体上6-磷酸葡糖酸内酯酶基因的表达调控序列以增强该基因的表达来增强6-磷酸葡糖酸内酯酶的活性。

本发明还有一个目的是提供如上所述的细菌，其中所述基因的天然启动子被更强(potent)的启动子所取代。

本发明还有一个目的是提供如上所述的细菌，其中所述6-磷酸葡糖酸内酯酶基因源自属于埃希氏菌属的细菌。

本发明还有一个目的是提供如上所述的细菌，其中所述6-磷酸葡糖酸内酯酶基因选自：

(a)包括SEQ ID NO：1的核苷酸1至993的核苷酸序列的DNA；和

(b)可以与SEQ ID NO：1的核苷酸1至993的核苷酸序列或者与可从上述序列制备得到的探针在严紧条件下杂交，并且编码具有6-磷酸葡糖酸内酯酶活性的蛋白质的DNA。

本发明还有一个目的是提供如上所述的细菌，其中所述严紧条件包括在60℃、对应于1xSSC和0.1％SDS的盐浓度下，洗涤15分钟。

本发明还有一个目的是提供如上所述的细菌，其中所述细菌受到进一步修饰以具有增强的ybhE开放阅读框的表达。

本发明还有一个目的是提供如上所述的细菌，其中L-氨基酸是芳香族L-氨基酸，其选自L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸。

本发明还有一个目的是提供生产芳香族L-氨基酸的方法，其包括在培养基中培养如上所述的细菌并从培养基中收集所述L-氨基酸。

本发明还有一个目的是提供如上所述的方法，其中L-氨基酸是芳香族氨基酸，其选自L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸。

本发明还有一个目的是提供如上所述的方法，其中所述细菌具有增强的芳香族氨基酸生物合成基因的表达。

所述生产L-氨基酸的方法包括使用产L-色氨酸细菌生产L-色氨酸，该细菌中本发明的蛋白的活性被增强。所述生产L-氨基酸的方法还包括使用产L-苯丙氨酸细菌生产L-苯丙氨酸，该细菌中本发明的蛋白的活性被增强。所述生产L-氨基酸的方法还包括使用产L-酪氨酸细菌生产L-酪氨酸，该细菌中本发明的蛋白的活性被增强。

附图简述

图1显示ybhE ORF周围细菌天然DNA区域的结构。

图2显示ybhE ORF缺失的细菌DNA区域的结构。

图3显示ybhA ORF缺失的细菌DNA区域的结构。

图4显示ybhD ORF缺失的细菌DNA区域的结构。

图5显示pgi基因缺失的细菌DNA区域的结构。

图6显示zwf-edd-eda操纵子缺失的细菌DNA区域的结构。

图7显示在pgl基因(ybhE ORF)上游具有人工启动子区域(

)的细菌DNA区域的结构。

图8显示(His)6-YbhE蛋白的凝胶分离和纯化(照片)。A.BL21(DE3)[pET-HTybhE]菌株的粗提取物。第1，2，9列-蛋白质分子量标记；第3，4列-不使用和使用IPTG诱导的菌株的总细胞蛋白；第5，6列-不使用和使用IPTG诱导的菌株可溶级分；第7，8列-不使用和使用IPTG诱导的菌株不可溶级分。B.第1列-BL21(DE3)[pET-HTybhE]的总细胞蛋白；第2，3，4，6列-递增浓度的纯化后(His)6-YbhE；第5列：蛋白质分子量标记。

优选的实施方案描述

根据本发明，描述了产L-氨基酸的细菌，其中该细菌已受到修饰以增强6-磷酸葡糖酸内酯酶的活性。术语“6-磷酸葡糖酸内酯酶的活性”指催化6-磷酸葡糖酸内酯水解成为6-磷酸葡糖酸的反应的活性。通过由，例如Kupor，S.R.和Fraenkel，D.G.(J.Bacteriol.，100：3，1296-1301(1969))所描述的方法来测量6-磷酸葡糖酸内酯酶的活性。编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的基因可以是大肠杆菌的ybhE基因或其同源物。

作为编码大肠杆菌的6-磷酸葡糖酸内酯酶(EC号3.1.1.31)的基因，已公开了包括ybhE ORF的pgl基因(GenBank登记号NC_000913，gi：16128735的序列中核苷酸号797809至798804)。ybhE ORF位于大肠杆菌菌株K12染色体上的ybhA ORF和ybhD ORF之间。因此pgl基因可以使用基于该基因的核苷酸序列制备的引物通过PCR(聚合酶链式反应，参考White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989))来获得。

来自大肠杆菌的pgl基因可以以包括下列DNA(a)或(b)的DNA为例：

(a)包括SEQ ID NO：1的核苷酸1至993的核苷酸序列的DNA；和

编码本发明的蛋白质的DNA包括编码这样的蛋白质的DNA，该蛋白质在蛋白质(A)的一个或几个位置上包含了一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或添加，只要它们不失去该蛋白质的活性。尽管“几个”氨基酸的数目根据在该蛋白质三维结构中的位置及氨基酸残基的类型而不同，对于蛋白(A)其可以是2至30，优选2至20，更优选2至10。

具有上述一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或添加的本发明的蛋白质与SEQ ID NO：2的蛋白质至少70％同源。蛋白质的百分比同源性是通过将变体序列与SED ID：2中的序列进行全序列长度的比较并确定相似残基的数目来测定的。本发明的蛋白质与SEQ ID NO：2的蛋白质至少70％同源，优选至少80％同源，还更优选至少90％同源，并最优选与SEQ ID NO：2的蛋白质至少95％同源。蛋白质或DNA的百分比同源性还可以用已知的计算方法来评价，例如BLAST搜索，FASTA搜索和CrustalW。BLAST(基本局部比对搜索工具)是blastp，blastn，blastx，megablast，tblastn和tblastx等程序所使用的启发式搜索算法。这些程序把重要性归因于它们使用Karlin，Samuel和Stephen F.Altschul的统计方法的发现(“Method forassessing the statistical significance of molecular sequence features by usinggeneral scoring schemes”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，87：2264-68；“Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecularsequences”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，90：5873-7)。W.R.Pearson描述了FASTA搜索方法(“Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTPand FASTA”，Methods in Enzymology，1990 183：63-98)。Thompson J.D.，Higgins D.G.和Gibson T.J.描述了ClustalW方法(“CLUSTAL W：improvingthe sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequenceweighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice”，NucleicAcids Res.1994，22：4673-4680)。

(A)中定义的蛋白质的改变，如上所述通常是保守性的改变，以维持该蛋白的活性。取代改变包括除去氨基酸序列中至少一个残基并在其位置上插入另一个不同的残基。可在上述蛋白质中取代原始氨基酸并且被认为是保守取代的氨基酸的实例包括，例如，用ser或thr取代ala；用gln、his或lys取代arg；用glu、gln、lys、his、asp取代asn；用asn、glu或gln取代asp；用ser或ala取代cys；用asn、glu、lys、his、asp或arg取代gln；用asn、gln、lys或asp取代glu；用pro取代gly；用asn、lys、gln、arg、tyr取代his；用leu、met、val、phe取代ile；用ile、met、val、phe取代leu；用asn、glu、gln、his、arg取代lys；用ile、leu、val、phe取代met；用trp、tyr、met、ile或leu取代phe；用thr、ala取代ser；用ser或ala取代thr；用phe、tyr所取代trp；用his、phe或trp取代tyr；以及用met、ile、leu取代val。

编码与(A)中定义的蛋白质基本上相同的蛋白质的DNA可以通过例如如下方法获得：使用定点诱变来修饰编码(A)中定义的蛋白质的核苷酸序列，以缺失、取代、插入或添加一个或多个氨基酸残基。所述修饰的DNA可以通过常规的方法，使用产生突变的试剂和条件进行处理而得到。这些处理包括用羟胺处理编码本发明的蛋白质的DNA，或用紫外辐射或诸如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍或亚硝酸的试剂处理含有该DNA的细菌。

由于天然多样性，编码本发明蛋白质的DNA还包括变体，这些变体可能存在于属于埃希氏菌属的细菌的不同菌株和变体中。通过分离在严紧条件下与pgl基因或该基因的部分杂交，且编码具有6-磷酸葡糖酸内酯酶活性的蛋白质的DNA，可以得到编码上述的变体的DNA。术语“严紧条件”在本文中指这样的条件，在该条件下形成所谓的特异性杂合体，而不形成非特异性杂合体。例如，严紧条件包括这样的条件，在该条件下具有高同源性的DNA，例如相互之间具有不少于70％，优选不少于80％，更优选不少于90％，最优选不少于95％的同源性的DNAs，发生杂交。或者，严紧条件通过这样的条件举例说明，该条件包括Southern杂交中常规的洗涤条件，例如60℃，大约1xSSC，0.1％SDS，优选0.1xSSC，0.1％SDS。洗涤的持续时间取决于印迹所用的膜的种类，通常由生产商推荐。例如，Hybond^TMN+尼龙膜(Amersham)在严紧条件下推荐的洗涤持续时间为15分钟。优选地，洗涤可进行2到3次。

SEQ ID NO：1的核苷酸序列的部分序列也可以用作编码变体并与pgl基因杂交的DNA的探针。这种探针可以使用基于SEQ ID NO：1的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA片段作为模板，通过PCR来制备。当使用长度大约300bp的DNA片段作为探针时，杂交的洗涤条件由例如50℃，2xSSC，和0.1％SDS组成。

用编码蛋白质的DNA转化细菌的意思是将该DNA例如通过常规手段导入细菌细胞，以增加编码本发明蛋白质的基因的表达并增强该蛋白质在该细菌细胞中的活性。

本发明的细菌是属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的产L-氨基酸细菌，其具有蛋白质的增强的活性，增强了目标L-氨基酸的生产能力。优选地，本发明的细菌是产芳香族L-氨基酸的细菌，具体地，其属于埃希氏菌属，并具有增强的本发明的蛋白质的活性。更优选地，本发明的细菌是产芳香族L-氨基酸的细菌，例如产L-色氨酸细菌，具体地属于埃希氏菌属，其中该细菌已受到修饰以增强6-磷酸葡糖酸内酯酶的活性。更优选地，本发明的细菌在其染色体上含有DNA，所述DNA包含带有修饰的表达调控序列的pgl基因(ybhE ORF)，并具有增强的产L-色氨酸的能力。

“产L-氨基酸的细菌”指这样的细菌，当在培养基中培养本发明的细菌时，其具有引起L-氨基酸在培养基中积累的能力。可以通过培养来赋予或增强产L-氨基酸的能力。本文中使用的术语“产L-氨基酸的细菌”还指这样的细菌，其能够以比野生型或亲代菌株更大的量产生并在培养基中积累L-氨基酸，优选地，指该微生物能够产生并导致在培养基中积累不少于0.5g/L，更优选不少于1.0g/L的量的目标L-氨基酸。L-氨基酸包括L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，L-甘氨酸，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸，和L-缬氨酸，优选地包括芳香族L-氨基酸，例如L-色氨酸，L-苯丙氨酸和L-酪氨酸。

肠杆菌科细菌包括属于下列属的细菌：埃希氏菌属，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，泛菌属(Pantoea)，普罗威登斯菌属，沙门氏菌属(Salmonella)，沙雷氏菌属(Serratia)，志贺氏菌属(Shigella)，摩根氏菌属(Morganella)。肠杆菌属，欧文氏菌属，埃希氏菌属，克雷伯氏菌属，普罗威登斯菌属，沙门氏菌属，沙雷氏菌属，志贺氏菌属等。具体地，可以使用那些根据NCBI(国家生物技术信息中心)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxomomy/wgetorg？mode＝Tree&id＝1236&1v1＝3&keep＝1&srchmode＝1&unlock))所用的分类法归类于肠杆菌科的细菌。优选埃希氏菌属。

短语“属于埃希氏菌属的细菌”意思是该细菌根据微生物学领域的技术人员已知的分类而被分类于埃希氏菌属。本发明中使用的属于埃希氏菌属的微生物的例子包括，但不限于大肠杆菌(Ecoli)。

可用于本发明的属于埃希氏菌属的细菌无具体的限制，但是例如，由Neidhardt，F.C.等(Escherichia coli and Salmonella typhimurium，AmericanSociety for Microbiology，Washington D.C.，1208，表1)描述的细菌为本发明所涵盖。野生型的大肠杆菌菌株包括但不限于，K12菌株及其衍生菌株，大肠杆菌MG1655菌株(ATCC No.47076)，及W3110菌株(ATCC No.27325)。这些菌株都可从美国典型培养物保藏中心(ATCC，地址：12301Parklawn Drive，Rockville Maryland 20852，美国)得到。

术语“属于泛菌属的细菌”的意思是该细菌根据微生物学领域的技术人员已知的分类而被归类于泛菌属。根据16S rRNA等的核苷酸序列分析，最近已将成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)的某些种重新归类于成团泛菌(Pantoea agglomerans)，Pantoea ananatis，斯氏泛菌(Pantoea stewartii)等等。

术语“经过修饰以增强6-磷酸葡糖酸内酯酶的活性”指每个细胞的活性已高于非修饰的菌株，例如野生型菌株。6-磷酸葡糖酸内酯酶活性可以用Collard’s方法测量(FEBS Letters 459(1999)223-226)。例如，当每个细胞的6-磷酸葡糖酸内酯酶分子数增加时，每个6-磷酸葡糖酸内酯酶分子的比活性增加，等等。另外，作为比较的对象的野生型菌株包括，例如，大肠杆菌K-12。作为6-磷酸葡糖酸内酯酶的细胞内活性增强的结果，L-氨基酸例如在培养基中积累的L-色氨酸的量的增加。

细菌细胞中6-磷酸葡糖酸内酯酶活性的增强是通过增加编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的基因(pgl基因)的表达实现的。6-磷酸葡糖酸内酯酶基因包括来自于肠杆菌科中的细菌的基因。可通过，例如，使用遗传重组技术增加细胞中pgl基因的拷贝数来增强pgl基因的表达。例如，可以通过如下方法得到重组DNA：将含有pgl基因的基因片段连接到载体，优选多拷贝载体中，该载体在宿主微生物的细胞中是可操作的；并将所得载体导入宿主微生物的细胞中。

当使用大肠杆菌的pgl基因时，可以使用基于SEQ ID NO：1的核苷酸序列设计的引物，并用大肠杆菌的染色体DNA作为模板，通过例如PCR(聚合酶链式反应，参考White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989))来获得该pgl基因(ybhE)。也可以使用来自其他微生物的pgl基因，并可以从这些微生物的染色体DNA或者染色体DNA文库中得到，使用以这些微生物的pgl基因，或其pgl基因的同源序列，或来自不同微生物的6-磷酸葡糖酸内酯酶蛋白质的序列为基础设计的寡核苷酸引物，通过PCR获得；或使用基于所述序列信息制备的寡核苷酸探针，通过杂交获得。可以从作为DNA供体的微生物中通过，例如Saito和Miura的方法(参考H.Saito和K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619，(1963)，Text for Bioengineering Experiments，由Society for Bioscience and Bioengineering，Japan编辑，pp.97-98，Baifukan，1992)来制备染色体DNA。

然后，将pgl基因连接到在宿主微生物的细胞中可操作的载体DNA中以制备重组DNA。优选地，使用可以在宿主微生物的细胞中自主复制的载体。

可以在大肠杆菌中自主复制的载体的例子包括pUC19，pUC18，pHSG299，pHSG399，pHSG398，pACYC184，(pHSG和pACYC可以从Takara Bio获得)，RSF1010，pBR322，pMW219(pMW可以从Nippon Gene获得)，等等。

为了通过连接pgl基因和上述任一个载体来制备重组DNA，用限制性酶消化该载体和含有pgl基因的片段，并通常通过使用连接酶如T4 DNA连接酶来相互连接。

为了将如上述制备的重组DNA导入微生物，可以使用目前报道过的任何已知的转化方法。例如，一种用氯化钙处理受体细胞以增加DNA的通透性的方法，其已被报道用于大肠杆菌(Mandel M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))，和一种使用由生长的细胞制备的感受态细胞来导入DNA的方法，其已被报道用于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Young，F.E.，Gene，1，153(1977))，都可以使用。除了这些方法以外，可以使用将重组DNA导入原生质体状或原生质球状受体细胞中的方法，其已被报道适用于枯草芽孢杆菌，放线菌(actinomycetes)和酵母(Chang S.和Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci.，USA，75，1929(1978))。

也可以通过将pgl基因的多个拷贝整合到微生物的染色体DNA上来增加pgl基因的拷贝数。为了将pgl基因的多个拷贝整合到微生物的染色体DNA上，可以通过将序列以多拷贝定向于染色体DNA上来进行同源重组。作为在染色体DNA上以多拷贝存在的序列，重复DNA和转座子末端存在的反向重复序列可以用作在染色体DNA上存在有多个拷贝的序列。或者，如JP2-109985A所公开的，也可能将pgl基因掺入转座子，并允许其被转移，以使得该基因的多个拷贝整合到染色体DNA中。pgl基因整合入染色体可以使用具有pgl基因部分序列的探针通过southern杂交来证实。

本发明的细菌包括一种这样的细菌，其中通过改变该细菌的染色体上编码如(A)或(B)所定义的蛋白质的DNA的表达调控序列，来增强本发明的蛋白质的活性(WO00/18935)。可以通过将本发明的DNA置于取代天然启动子的更强的启动子的控制之下来实现基因表达的增强。例如，lac启动子，trp启动子，trc启动子，tac启动子，PR启动子等等都是已知的强启动子。术语“天然启动子”指在野生型生物体中存在的DNA区域，其位于基因的开放阅读框(ORF)的上游，并具有促进该基因转录的功能。启动子的强度由RNA合成起始的作用频率来定义。评估启动子强度的方法在，例如，Deuschle U.，Kammerer W.，Gentz R.，Bujard H.(Promoters in Escherichia coli：a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures.EMBO.J.1986，5，2987-2994)中描述。Goldstein等(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1995，1，105-128)公开了一种评估启动子强度的方法和强启动子的例子。

可以通过向本发明的DNA中引入更高效的核糖体结合位点(RBS)取代天然的RBS序列来实现翻译的增强。RBS序列是位于mRNA的起始密码子上游的一个区域，其与核糖体的16S RNA相互作用(Shine J.和DalgarnoL.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1974，71，4，1342-6)。术语“天然的RBS序列”是指野生型生物体中存在的RBS序列。来自T7噬菌体基因10的RBS序列是高效的RBS序列的一个例子(Olins P.O.等，Gene，1988，73，227-235)。

可以通过将上述的DNAs导入本身具有产L-氨基酸能力的细菌中而得到本发明的细菌。或者，可以通过将产生L-氨基酸的能力赋予已经包含了上述DNAs的细菌而得到本发明的细菌。

作为有待增强本发明的蛋白活性的亲代菌株，可以使用属于埃希氏菌属的产L-色氨酸细菌，缺失了突变的trpS基因所编码的色氨酰-tRNA合成酶的大肠杆菌菌株JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123)(美国专利5,756,345)，具有不受丝氨酸反馈抑制的serA等位基因的大肠杆菌菌株SV164(pGH5)(美国专利6,180,373)；色氨酸酶缺陷的大肠杆菌菌株AGX17(pGX44)(NRRL B-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)(美国专利4,371,614)，及磷酸烯醇丙酮酸生产能力增强的大肠杆菌菌株AGX17/pGX50，pACKG4-pps(WO9708333，美国专利6,319,696)。本发明的发明人先前已确认，yddG基因编码不参与任何L-氨基酸的生物合成途径的膜蛋白，而当该基因的野生型等位基因在微生物中的多拷贝载体上扩增时，使得该微生物获得对于L-苯丙氨酸和数种氨基酸的类似物的抗性。另外，当将额外的拷贝分别导入产生L-苯丙氨酸和L-色氨酸的菌株时，yddG基因可以增强L-苯丙氨酸和L-色氨酸的生产(俄罗斯专利申请2002121670，WO03044192)。因此，希望进一步修饰产L-色氨酸细菌以增强yddG开放阅读框的表达。

对L-色氨酸生物合成有效的基因包括trpEDCBA操纵子的基因，芳香族酸共有途径的基因，诸如aroF，aroG，aroH，aroB，aroD，aroE，aroK，aroL，aroA，和aroC基因，L-丝氨酸生物合成基因，诸如serA，serB和serC基因等等。

作为有待增强本发明的蛋白活性的亲代菌株，可以使用属于埃希氏菌属的产苯丙氨酸细菌，大肠杆菌AJ12739株(tyrA::Tn10，tyrR)；含有pheA34基因的HW1089株(ATCC登记号55371)(US5,354,672)；突变的MWEC101-b株(KR8903681)；NRRL B-12141，NRRL B-12145，NRRLB-12146和NRRL B-12147株(US4,407,952)等。属于埃希氏菌属的产苯丙氨酸细菌进一步包括大肠杆菌菌株K-12[W3110(tyrA)/pPHAB]，大肠杆菌菌株K-12[W3110(tyrA)/pPHAD]；大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm]，及命名为AJ 12604的大肠杆菌菌株K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB]等(欧洲专利EP488424B1)。

作为有待增强本发明的蛋白活性的亲代菌株，还可以使用属于埃希氏菌属的产酪氨酸细菌，产磷酸烯醇丙酮酸的能力被增强或者芳香族共有途径的酶被增强的大肠杆菌菌株等等(EP0877090A)。

本发明的方法包括生产L-氨基酸的方法，其包括下列步骤：在培养基中培养本发明的细菌，使L-氨基酸在培养基中产生和积累，然后从培养基中收集L-氨基酸。同时，本发明的方法包括生产L-色氨酸的方法，其包括下列步骤：在培养基中培养本发明的细菌，使L-色氨酸在培养基中产生和积累，然后从培养基中收集L-色氨酸。本发明的方法包括生产L-苯丙氨酸的方法，其包括下列步骤：在培养基中培养本发明的细菌，使L-苯丙氨酸在培养基中产生和积累，然后从培养基中收集L-苯丙氨酸。本发明的方法进一步包括生产L-酪氨酸的方法，其包括下列步骤：在培养基中培养本发明的细菌，使L-酪氨酸在培养基中产生和积累，然后从培养基中收集L-酪氨酸。

在本发明中，培养、收集并从培养基中纯化L-氨基酸，尤其是芳香族氨基酸例如L-色氨酸，L-苯丙氨酸和L-酪氨酸等，可以用与常规的发酵方法相似的方式进行，其中使用微生物来产生氨基酸。

用于培养的培养基可以是合成或天然的培养基，只要该培养基包括碳源和氮源和矿物质及，必要的话，还包括微生物生长所需的适量营养物。

碳源包括多种碳水化合物例如葡萄糖和蔗糖，和多种有机酸。根据所选择的微生物的同化作用模式，可以使用醇类，包括乙醇和甘油。

作为氮源，可以使用各种铵盐如氨和硫酸铵，其它的氮化合物诸如胺类，天然氮源如蛋白胨，大豆水解物，和经过消化的发酵微生物。

作为矿物质，可以使用单磷酸钾(potassium monophosphate)，硫酸镁，氯化钠，硫酸亚铁，硫酸锰，氯化钙等等。

必要时，可将附加营养物加入培养基。例如，如果微生物生长需要酪氨酸(酪氨酸营养缺陷型)，可以将足量的酪氨酸加入培养基用于培养。

优选在有氧条件下进行培养，例如在20至42℃，优选37至40℃的温度振荡培养和通气搅拌培养。培养的pH通常在5和9之间，优选在6.5和7.2之间。可以用氨，碳酸钙，多种酸，多种碱和缓冲液调节培养的pH。通常，1-5天的培养导致目标L-氨基酸在液体培养基中的积累。

培养后，可以通过离心或膜过滤将固体如细胞从液体培养基中移除，然后收集目标L-氨基酸，并通过离子交换，浓缩和结晶方法纯化。

实施例

下面，参考如下非限定性的实施例将对本发明作更具体的说明。

实施例1.从大肠杆菌中鉴定pgl基因及核苷酸序列的比较

Kupor和Fraekel将pgl突变定位于大肠杆菌染色体上chlD(现在称为modC)和bioA基因之间(Kupor，S.R.和Fraenkel，D.G.，J.Bacteriol.，100：3，1296-1301(1969))。这对应于大肠杆菌遗传图谱上17.18和17.40分钟的位置。在这个区域中有8个编码功能未知的蛋白的开放阅读框。另外，E.coliStock Center Database将pgl突变定位于17.20和17.22分钟之间。此坐标几乎与位于ybhA和ybhD开放阅读框(ORF)之间的ybhE开放阅读框的坐标完全相符(图1)。

对ybhE编码的YbhE蛋白进行BLAST搜索显示在不同的生物体中存在许多功能未知的同源物，这些生物体例如弗氏志贺氏菌(Shigella flexmeri)(98.8％相似度)，伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)(92.8％相似度)，鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)(68.4％相似度)，有些同源物具有已知的功能，例如来自炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)的细胞色素D1血红素域(28％同一性)，通过自动计算分析预测的来自荧光假单孢菌(Pseudomonasfluorescens)的3-羧甲基粘康酸环化酶(28％同一性)，来自白吉利丝孢酵母(Trichosporon beigelii)的黏康酸环式异构酶(26％同一性)，以及来自蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，在数据库中以登记号为NP 833107被称为6-磷酸葡糖酸内酯酶的一种，但其没有引用已发表的实验工作。

同时，使用NCBI保守域搜索(NBCI Conserved Domain Search)找到了3个重叠的保守蛋白域。其中的两个属于功能未被表征的保守蛋白质家族，另外一个属于3-羧甲基粘康酸环化酶家族。

在大肠杆菌蛋白质组中进行的BLAST搜索并没有揭示出，例如来自恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)的所述6-磷酸葡糖酸内酯酶的同源物。

于是，为了鉴定大肠杆菌染色体中标记为ybhE的ORF是否是编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的pgl基因，将ybhA、ybhE和ybhD ORF破坏，并检查所得的突变体的“麦芽糖蓝色”表型(见下)。

实施例2.ybhE ORF的破坏。用带有氯霉素抗性基因(Cm^R)的DNA片段取代ybhE ORF。

为了破坏ybhE ORF，将带有由cat基因编码的氯霉素抗性标记(Cm^R)的DNA片段整合到大肠杆菌菌株BW25113[pKD46]的染色体中取代天然的ybhE ORF，使用Datsenko K.A.和Wanner B.L.所描述的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，6640-6645)，该方法又被称为“Red介导整合”(Red-mediated integration)和/或“Red驱动整合”(Red-driven integration)。被取代的天然的ybhE ORF区域的核苷酸序列和由该ORF编码的氨基酸序列在序列表中列出(分别为SEQ ID NO：1和2)。含有该重组质粒pKD46的大肠杆菌菌株BW25113可以从美国耶鲁大学大肠杆菌遗传保藏中心(E.coli Genetic Stock Center，Yale University，New Haven，USA)获得，其登记号为CGSC7630。

使用商业上可得到的质粒pACYC184(GenBank/EMBL登记号X06403，“Fermentas”，立陶宛)作为模板，和引物P1(SEQ ID NO：3)和P2(SEQID NO：4)，通过PCR获得了含有Cm^R标记的DNA片段。引物P1含有与ybhE ORF的5’端同源的36个核苷酸，引物P2含有与ybhE ORF的3’端同源的36个核苷酸。这些ybhE基因的序列被引入到P1和P2引物中用于进一步整合到细菌染色体中。

使用“TermoHybaid PCR Express”扩增仪进行PCR。反应混合物(总体积-50μl)由下列组成：含有15mM MgCl₂的10x PCR缓冲液(“Fermentas”，立陶宛)5μl，dNTP每种200μM，选用的引物各25pmol，及Taq-聚合酶(“Fermentas”，立陶宛)1U。在反应混合物中加入大约5ng的质粒DNA作为PCR扩增的模板DNA。温度变化情况是：95℃初始DNA变性5分钟；然后进行25个循环：95℃下变性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸30秒；和在72℃最终延伸7分钟。

然后，将扩增的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化，用“GenElute SpinColumns”(“Sigma”，美国)提取，并用乙醇沉淀。构建的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

将由上述纯化所得的DNA片段用于电穿孔及Red介导整合入大肠杆菌菌株BW25113[pKD46]的细菌染色体。用含有该热敏感复制子的重组质粒pKD46(Datsenko K.A.和Wanner B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，6640-6645)作为供体提供负责在Red介导的重组系统中起作用的源于λ噬菌体的基因。

BW25113[pKD46]细胞在加入了氨苄青霉素(100μg/ml)的液体LB培养基中在30℃生长过夜，然后用加入了氨苄青霉素(100μg/ml)和L-阿拉伯糖(10mM)(阿拉伯糖用于诱导编码Red系统的基因的质粒)的SOB培养基(酵母提取物，5g/l；NaCl，0.5g/l；胰蛋白胨，20g/l；KCl，2.5mM；MgCl₂，10mM)按1∶100稀释，并在30℃生长以达到细菌培养物的光密度OD₆₀₀＝0.4-0.7。将来自10ml细菌培养物的培养细胞用冰冷的去离子水洗涤3次，再用100μl这样的水重悬。将10μl溶于去离子水的DNA片段(100ng)加入细胞悬浮液。通过“Bio-Rad”电穿孔仪(美国)(No.165-2908，版本2-89)参照制造商的说明进行电穿孔。将被电击的细胞加入到1ml SOC培养基中(Sambrook等，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，SecondEdition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))，37℃下温育2小时，然后铺到含有25μg/ml氯霉素的L-琼脂上。使用引物P3(SEQ ID NO：6)和P4(SEQ ID NO：7)通过PCR来检测生长24小时之内的菌落中取代了天然ybhE ORF的Cm^R标记的存在。为此，将新鲜分离的菌落悬浮于20μl水中，然后将1μl所得的悬液用于PCR。温度变化情况是：在95℃初始DNA变性10分钟；然后进行30个循环：95℃下变性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸1分钟；在72℃最终延伸7分钟。少数受试的Cm^R菌落含有预期的1279bp的DNA片段，这证明了取代了天然ybhE ORF的Cm^R标记DNA的存在。将所得菌株中的一个通过在37℃培养以消除(cure)其热敏感型质粒pKD46，由此得到的菌株被命名为大肠杆菌菌株BW25113-ΔybhE。

图2显示了ybhE ORF被破坏的细菌DNA区域的结构。

实施例3.ybhA和ybhD ORF的破坏。用带有氯霉素抗性基因(Cm^R)的DNA片段取代ybhA和ybhD ORFs。

为了破坏ybhA和ybhD ORFs，通过实施例2中描述的方法，将带有由cat基因编码的氯霉素抗性标记(Cm^R)的DNA片段单独地整合到大肠杆菌BW25113[pKD46]的染色体中分别取代天然的ybhA和ybhD ORFs。

为了得到用于电穿孔和破坏ybhA和ybhD ORFs的片段，分别合成两对引物：P5(SEQ ID NO：8)和P6(SEQ ID NO：9)，及P7(SEQ ID NO：10)和P8(SEQ ID NO：11)用于PCR。P5引物含有与ybhA ORF的3’端同源的36个核苷酸。P6引物含有与ybhA ORF的5’端同源的36个核苷酸。P7引物含有与ybhD ORF的3’端互补的36个核苷酸。P8引物含有与ybhD ORF的5’端互补的36个核苷酸。这些序列被引入引物P5、P6、P7和P8中以用于进一步整合到细菌染色体中。

构建的DNA片段的核苷酸序列分别显示在SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：13中。被取代的天然的ybhA和ybhD区域的核苷酸序列以登记号NC_000913.1显示在GenBank中(分别为：核苷酸号796836至797654和798845至799777，gi：16128734和gi：33347481)。图3和图4分别显示了ybhA和ybhD ORFs被破坏的细菌DNA区域的结构。

电穿孔以后，通过PCR检测相应菌落中Cm^R标记的存在，对于ybhA ORF的破坏，使用引物P9(SEQ ID NO：14)和P10(SEQ ID NO：15)；对于ybhDORF的破坏，使用引物P11(SEQ ID NO：16)和P12(SEQ ID NO：17)。

在第一种情况下，少数受试的Cm^R菌落含有预期的1424bp的DNA片段，这证明取代了天然ybhA ORF的Cm^R基因的存在。在第二种情况下，少数受试的Cm^R菌落含有预期的1386bp的DNA片段，这证明取代了天然ybhD ORF的Cm^R基因的存在。在每一种情况中，将所得菌株中的一个通过在37℃培养以消除其热敏感型质粒pKD46，由此得到的菌株分别被命名为大肠杆菌菌株BW25113-ΔybhA和BW25113-ΔybhD。

实施例4.检查ybhE^-、ybhA^-和ybhD^-突变体的“麦芽糖蓝色”表型。

用Kupor，S.R.和Fraenkel，D.G.的方法(J.Bacteriol.，100：3，1926-1301(1969))检测所得三种突变体菌株的每一种的“麦芽糖蓝色”表型。在培养物点样在含有0.8％麦芽糖的M9基本培养基平板上。6小时后，用5ml含0.01M I₂和0.03M KI的溶液浸没培养平板，将点样颜色视觉评价为“蓝色”或“不是蓝色”。

所得的BW25113-ΔybhE被记为“蓝色”，而BW25113-ΔybhA、BW25113-ΔybhD和BW25113株(作为对照菌株)则“不是蓝色”。

实施例5.构建带有pgi以及ybhE或ybhD缺失的双突变菌株。比较所述菌株在不同碳源上的生长。

缺少磷酸葡糖异构酶的突变株(pgi^-)只使用戊糖磷酸途径中的氧化性分支，在葡萄糖上生长缓慢。第二个突变株还缺少了催化此分支中第二步的磷酸葡糖酸内酯酶(pgl)，这个突变株应生长得更慢，因为6-磷酸葡糖酸内酯酶只能自发地水解为6-磷酸葡糖酸。因此，如果ybhE ORF真的是pgl基因，那么pgi，ybhE双突变体将比野生型菌株和pgi突变体生长得更慢。为支持这个意见，制备了pgi，ybhE双突变体。

pgi基因的突变是这样进行的：通过实施例2描述的方法，用带有卡那霉素抗性基因(Km^R)的DNA片段取代大肠杆菌菌株BW25113[pKD46]中的天然细菌染色体区域。被取代的天然pgi基因区域的核苷酸序列以登记号NC_000913.1显示于GenBank中所示(核苷酸号4231337至4232986；gi：16131851)。

使用商业上可得到的质粒pUC4KAN(GenBank/EMBL登记号X06404，“Fermentas”，立陶宛)作为模板，和引物P13(SEQ ID NO：18)和P14(SEQ ID NO：19)，通过PCR获得了含有Km^R标记的DNA片段。P13引物含有与pgi基因的3’端同源的36个核苷酸，而P14引物含有与pgi基因的5’端同源的36个核苷酸。这些来自pgi基因的序列被引入P13和P14引物中用于进一步整合到细菌染色体中。

PCR按实施例2描述的方法进行。

然后，将扩增的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳浓缩，通过经“GenEluteSpin Columns”(“Sigma”，美国)离心从凝胶上提取，并用乙醇沉淀。构建的DNA区域的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。

如实施例2所描述的一样，将如上所述纯化所得的DNA片段用于电穿孔及Red介导整合入大肠杆菌菌株BW25113[pKD46]的细菌染色体，不同之处是将细胞被铺于含有50μg/ml卡那霉素的L-琼脂平板上。

使用引物P15(SEQ ID NO：21)和P16(SEQ ID NO：22)进行PCR来检测生长24小时之内的菌落中取代pgi基因的Km^R标记的存在。为此，将新鲜分离的菌落悬于20μl水中，然后将1μl所得的悬液用于PCR。PCR的条件如实施例2所描述的。少数受试的Km^R菌落含有预期的1286bp的DNA片段，这证明取代了pgi基因的Km^R基因的存在。将所得菌株中的一个通过在37℃培养以消除其热敏感型质粒pKD46，并将得到的菌株命名为大肠杆菌菌株BW25113-Δpgi。

图5显示pgi基因缺失的细菌DNA区域的结构。

用Fraenkel的方法(J.Bacteriol.93(1967)，1582-1587)将pgi缺失转导入大肠杆菌MG1655菌株，然后在含有卡那霉素的平板上筛选。将获得的菌株命名为MG-Δpgi。然后，从实施例2和3描述的菌株BW25113-ΔybhE和BW25113-ΔybhD中将ybhE和ybhD ORFs中突变转导到所得的该菌株中，然后在含氯霉素的平板上筛选。将所得的菌株分别命名为MG-Δpgi-ΔybhE和MG-Δpgi-ΔybhD。

将这两种菌株连同MG1655和MG1655-Δpgi点样到用葡萄糖或葡糖酸作碳源的M9基本培养基平板上。经过24小时温育，视觉观察测定菌株的生长情况。MG-Δpgi-ΔybhE在含葡萄糖的平板上的生长比其他菌株都差，而在含葡糖酸的平板上则无差别。

实施例6.构建带有来自恶臭假单孢菌的pgl基因的质粒及ybhE突变的互补。

已描述了来自数种生物的pgl基因。其中包括来自恶臭假单孢菌的6-磷酸葡糖酸内酯酶，恶臭假单孢菌与大肠杆菌的亲缘关系相当近。已经将数个基因从恶臭假单孢菌克隆到大肠杆菌中，而且报道了大肠杆菌中出现了相应突变的互补(Ramos-Gonzalez，M.I.和Molin，S.，J.Bacteriol.，v180，13，p.3421，1998)。

使用引物17(SEQ ID NO：23)和18(SEQ ID NO：24)克隆了来自恶臭假单孢菌的pgl基因。引物P17含有一段序列，其与来自恶臭假单孢菌的pgl基因的1到19bp的序列相同。该引物还包含位于上游来自大肠杆菌lacZ基因的核糖体结合位点(RBS)，以及引入到其5’末端的限制酶SacI的识别位点。引物P18含有与来自恶臭假单孢菌的pgl基因的709到729bp的序列互补的序列，以及引入到其5’末端的限制酶EcoRI的识别位点。

用通常的方法制备恶臭假单孢菌KT2440菌株TG1的染色体DNA(Bagdasarian，M和Timmis，K.N.Current Topics of Microbiology andImmunology，Goebel，W和Hofschneider，P.H.编(Springer，Berlin)，pp.47-67(1981))。在“Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400”中进行PCR，条件如下：95℃下40秒，53℃下40秒，72℃下40秒，25个循环，使用Taq聚合酶(Fermentas)。用SacI和EcoRI限制酶处理所得的含有来自恶臭假单孢菌的pgl基因并具有lacZ基因RBS的PCR扩增片段，并将其插入预先用同样的限制酶处理过的多拷贝载体pUC19。于是得到了质粒pUC19-pgl。

用所得的质粒pUC19-pgl转化菌株BW25113-ΔybhE。将该培养物点样到含100μl氨苄青霉素的基本麦芽糖平板上，并如前所述处理以检查其“麦芽糖蓝色”表型。与对照菌株BW25113-ΔybhE相反，转化子并没有显示“麦芽糖蓝色”表型。

因此，来自恶臭假单孢菌的pgl基因的克隆的拷贝与大肠杆菌中ybhE突变互补，这再一次支持了我们关于ybhE ORF是pgl基因的编码区的假设。

实施例7.测定ybhE突变体中6-磷酸葡糖酸内酯酶的活性。

将菌株BW25113和BW25113-ΔybhE的过夜培养物用含葡萄糖的基本M9培养基稀释50倍。培养细胞直到培养物的光密度达到OD₅₄₀＝1。从3ml培养物中制备提取物。用生理溶液洗涤细胞，将细胞重悬于400μl磷酸钾缓冲液(pH7.0)并超声处理。然后将离心所得的上清组分用于分析，不需进一步稀释。

使用Collard，F.等描述的方法(FEBS Letters 459(1999)223-226)测量6-磷酸葡糖酸内酯酶的活性。通过在30℃将50μM 6-磷酸葡萄糖(Sigma，美国)在0.2mM NADP、25mM HEPES(pH 7.1)、2mM MgCl₂和1.75U的酵母6-磷酸葡萄糖脱氢酶(Sigma，美国)存在的条件下温育(总体积-1ml)来即时制备内酯。当反应混合物的光密度在A₃₄₀达到稳定水平时，加入0.5U/ml的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(Sigma，美国)连同先前所得的待测上清级分，再于A₃₄₀测量光密度10分钟。根据Bradford，M.M.(Anal.Biochem.72，248-254(1976))的方法测量蛋白质的量。所得的数据如表1所示。活性以每mg总蛋白的相对单位数表示。

表1

菌株	6-磷酸葡糖酸内酯酶活性(对于不同的提取物浓度)
		BW25113BW25113-ΔybhE自发水解	4.06.15.40.30.20.3

从上表可见，ybhE突变体中的6-磷酸葡糖酸内酯酶活性比“野生型”菌株中至少低1个数量级(one order of magnitude)，并且可以和自发水解的速率相比较。

实施例8.zwf-edd-eda操纵子的缺失。用带有卡那霉素抗性基因(Km^R)的DNA片段取代zwf-edd-eda基因区域。

为了获得具有增加的YbhE表达的菌株，我们计划使用Red-介导的整合(见实施例9)将来自P_tac的组成型启动子整合到ybhE RBS和其天然启动子之间。

但是我们未能提供“野生型”菌株MG1665的这种染色体修饰。我们不能解释pgl(ybhE)增强表达的毒性效应，但我们认为这和增加的6-磷酸葡糖酸内酯酶活性有关，6-磷酸葡糖酸内酯酶活性增加造成戊糖磷酸途径(PPP)的不平衡，并可能造成某些有毒的中间产物的积累(或某些对细胞生存必需的中间产物的缺乏)。因此，我们决定通过缺失编码PPP的第一个酶的zwf基因来彻底关闭PPP。

缺失zwf-edd-eda通过实施例5描述的缺失pgi基因的方法来进行。被取代的天然zwf-edd-eda操纵子区域的核苷酸序列以登记号NC_000913.1显示于GenBank中(zwf、edd和eda基因分别为：核苷酸号1932863至1934338，gi：16129805；1930817至1932868，gi：16129804；和1930139至1930780，gi：16129803)。使用引物P19(SEQ ID NO：25)和P20(SEQ ID NO：26)通过PCR获得带有Km^R基因的DNA片段。引物P19含有与eda基因的3’端互补的36个核苷酸，引物P20含有与zwf基因的5’端互补的36个核苷酸。构建的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示。

使用引物P21(SEQ ID NO：28)和P22(SEQ ID NO：29)通过PCR来检测生长24小时之内的菌落中取代zwf-edd-eda操纵子的Km^R标记的存在。少数受试的Km^R菌落含有预期的1287bp的DNA片段，这证明了取代zwf-edd-eda操纵子的Km^R基因的存在。将所得菌株中的一个通过在37℃下培养以消除其热敏感型质粒pKD46，并将得到的菌株命名为大肠杆菌菌株BW25113-Δzwf-edd-eda。图6显示zwf-edd-eda操纵子被缺失的细菌DNA区域的结构。

实施例9.用带有合成的P_tac ^*启动子的新调控元件取代位于大肠杆菌染色体上的ybhE基因的天然上游区域。

为了进一步将不同强度的人工P_tac ^*启动子整合到pgl(ybhE)基因的上游，用pKD46质粒再转化大肠杆菌菌株BW25113-Δzwf-edd-eda。所得的卡那霉素和氨苄青霉素抗性菌株命名为大肠杆菌菌株BW25113-Δzwf-edd-eda[pKD46]。由于pKD46质粒是热敏感的，进一步的转化子筛选在30℃下进行。

具有由带有σ⁷⁰的大肠杆菌RNA聚合酶复合物所识别的修饰的启动子“-35”区的突变体，具有显著变化的转录起始效率，这是一个确证的事实(WO00/18935)。所以，在获得的由初始的随机启动子样序列产生的启动子当中，可以获得具有不同强度的启动子。因此，这种普通方法可以用来对目标基因的表达水平进行微调。本发明的发明人先前获得了具有不同强度的经过修饰的P_tac启动子(以下将这种修饰过的P_tac启动子以星号标记)的文库。这些启动子在“-35”区的4个中心核苷酸上有差异。在本发明中，使用具有不同强度的两个P_tac ^*启动子。基于在相应启动子控制下所表达的β-半乳糖苷酶的活性值，这些启动子被命名为P_tac-10000(通常的P_tac)和P_tac-3900(以TTGC中心核苷酸代替原始的TGAC)。

然后，通过上述的方法(参见实施例2)将这些人工P_tac ^*启动子的每一个整合到大肠杆菌菌株BW25113-Δzwf-edd-eda[pKD46]染色体中pgl基因编码区的上游。另外，还整合了在启动子区的上游具有氯霉素抗性基因(Cm^R)的人工DNA片段(参见图7)。

构建上述的整合到细菌染色体的相应区域中的人工DNA片段是通过如下几个步骤进行的。第一步，通过PCR获得在上游区带有BglII限制性位点并带有相应的P_tac ^*启动子的DNA片段。

使用染色体中整合了人工P_tac-3900启动子和P_tac-10000启动子的大肠杆菌MG1655菌株的染色体DNA作为PCR的模板。P_{tac-3900(3000)}和P_tac-10000的PCR分别使用引物P23(SEQ ID NO：30)和P24(SEQ ID NO：31)，并在两种情况中都使用引物P25(SEQ ID NO：32)。引物P23和P24含有在其5’末端引入的BglII限制性位点。引物P25含有pgl基因上游的11个核苷酸(包括RBS)以及pgl编码区的最前面的25个核苷酸。将上述序列导入引物P25中用于进一步整合到细菌染色体中。

使用扩增式“TermoHybaid PCR Express PCR System”进行PCR。反应混合物(总体积50μl)由下列组成：含有15mM MgCl₂的10xPCR缓冲液(“Fermentas”，立陶宛)5μl，dNTP每种200μM，选用的引物各25pmol，及Taq-聚合酶(“Fermentas”，立陶宛)1U。反应混合物中加入0.5μg的染色体DNA作为模板DNA用于进一步PCR驱动的扩增。PCR温度条件如下：在95℃初始DNA变性5分钟；然后进行25个循环：95℃下变性30秒，53℃下退火30秒，72℃下延伸30秒；和在72℃最终聚合7分钟。

进行构建目标DNA片段的第二个阶段。使用商业上可得到的质粒pACYC184(GenBank/EMBL登记号X06403，“Fermentas”，立陶宛)作为模板和引物P26(SEQ ID NO：33)和P27(SEQ ID NO：34)，通过PCR扩增Cm^R基因。引物P26含有用于进一步与先前获得的带有PX^*启动子的DNA片段相连接的BglII限制性位点。引物P27含有与位于来自大肠杆菌pgl(ybhE)基因起始密码子上游的核苷酸58至12互补的46个核苷酸，它们对于进一步将该片段整合入细菌染色体是必需的。

然后通过琼脂糖凝胶电泳浓缩扩增后的DNA片段，通过经“GenEluteSpin Columns”(“Sigma”，美国)离心从凝胶中提取，并用乙醇沉淀。然后用BglII限制性内切酶处理所得的两个DNA片段，然后使用T4 DNA连接酶连接(Maniatis T.，Fritsch E.F.，Sambrook，J.：Molecular Cloning：ALaboratory Manual.2^nd edn.Cold Spring Harbor，NY：Cold Spring Harbor Press，1989)。

将连接产物使用引物P25和P27通过PCR扩增。PCR的反应混合物(总体积50μl)由下列组成：10x AccuTaq LA缓冲液(“Sigma”，美国)5μl，dNTP每种200μM，选用的引物各25pmol，及AccuTaq LA聚合酶(“Sigma”，美国)1U(μ)。在反应混合物中加入大约50ng的DNA连接产物作为模板。PCR温度循环如下：在95℃初始DNA变性5分钟；然后进行25个循环：95℃下变性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸4分钟；并在72℃最终聚合7分钟。

对P_tac-3900和P_tac-10000启动子，所构建的DNA区域的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：35和SED ID NO：26所示。

将如上所述纯化所得的DNA片段用于电穿孔并Red介导整合入大肠杆菌菌株BW25113-Δzwf-edd-eda[pKD46]的细菌染色体中，如实施例2所述。

用引物P27(SEQ ID NO：34)和P10(SEQ ID NO：15)通过PCR来检测在含有氯霉素的培养基中生长了24小时之内的菌落中pgl基因上游Cm^R标记的存在。还通过PCR检测相同菌落中pgl基因上游的P_tac ^*启动子区域的存在，对P_tac-3900和P_tac-10000分别使用引物P23(SEQ ID NO：30)和P24(SEQID NO：31)，以及P10(SEQ ID NO：15)。为此，将新鲜分离的菌落悬浮于20μl水中，然后将1μl的悬浮液用于PCR。PCR的条件如下：在95℃初始DNA变性10分钟；然后进行30个循环：95℃下变性30秒，54℃下退火30秒，72℃下延伸1分钟；并在72℃最终聚合7分钟。少数受试的Cm^R菌落含有预期的1193bp和124bp的DNA片段，这分别证明：pgl基因的上游存在着整个构建的DNA区域；大肠杆菌染色体上存在带有P_tac ^*启动子的杂合调控元件。在两种情况下都将所得菌株中的一个通过在37℃培养以消除其热敏感型质粒pKD46，并将得到的菌株分别命名为大肠杆菌菌株BW25113-P_tac-3900-ybhE和BW25113-P_tac-10000-ybhE。pgl基因上游的构建的DNA区域的结构如图7所示。

实施例10.测定具有增强的pgl基因表达的菌株中的6-磷酸葡糖酸内酯酶活性。

如实施例7所述，测量了菌株BW25113-P_tac-3900-ybhE和BW25113-P_tac-10000-ybhE的6-磷酸葡糖酸内酯酶活性。所得数据如表2所示。已经减去了自发水解的水平。

表2.

菌株	6-磷酸葡糖酸内酯酶活性，相对单位
		BW25113	5.6
BW25113-P_tac-3900-ybhE	21.1

BW25113-P_tac-10000-ybhE

54.0

所以，增强的pgl基因的表达导致6-磷酸葡糖酸内酯酶活性的增加。

实施例11.增强的pgl基因表达对色氨酸生产的影响。

用产色氨酸的大肠杆菌菌株SV164[pMW-P_lacUV5-serA5-fruR，pYDDG2]作为亲本菌株来评估增强的pgl基因表达对色氨酸生产的影响。美国专利6,180,373详细描述了菌株SV164。菌株SV164[pMW-P_lacUV5-serA5-fruR，pYDDG2]是菌株SV164的衍生物，并附加地含有质粒pMW-P_lacUV5-serA5-fruR和pYDDG2。质粒pMW-P_lacUV5-serA5-fruR带有编码蛋白的突变体serA5基因，其不受丝氨酸的反馈抑制(WO2004090125 A2)。serA5基因的扩增对增加L-色氨酸的前体-丝氨酸的量是必要的(美国专利6,180,373)。质粒pYDDG2是根据pAYCTER3载体(WO03/044192)而构建的，其含有编码对L-色氨酸生产有用的跨膜蛋白(推定的输出蛋白(exporter))的yddG基因。pAYCTER3载体是pAYC32的衍生物，pAYC32是一种具有中等拷贝数且非常稳定的载体，其基于质粒RSF1010构建，且含有链霉素抗性标记(Christoserdov A.Y.，Tsygankov Y.D，Broad-host rangevectors derived from a RSF 1010 Tnl plasmid，Plasmid，1986，v.16，pp.161-167)。pAYCTER3是通过将来自pUC19质粒的多接头和强终止子rrnB导入pAYC32质粒以取代其启动子从而得到的。

为了测试受

启动子控制的pgl基因的增强的表达对于色氨酸生产的影响，通过P1转导(Miller，J.H.(1972)Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Lab.Press，Plainview，NY)将来自上述大肠杆菌菌株BW25113-P_tac-3900-ybhE和BW25113-P_tac-10000-ybhE的染色体的DNA片段转入产色氨酸的大肠杆菌菌株SV164[pMW-P_lacUV5-serA5-fruR]中。然后将质粒pYDDG2引入SV164[pMW-P_lacUV5-serA5-fruR]菌株和所得的转导物中。

将SV164[pMW-P_lacUV5-serA5-fruR，pYDDG2]、SV164-P_{tac-3900-ybhE}[pMW-P_lacUV5-serA5-fruR，pYDDG2]和SV164-P_tac-10000-ybhE[pMW-P_lacUV5-serA5-fruR，pYDDG2]菌株都在3ml添加了100μl/ml氨苄青霉素和50μl/ml链霉素的营养肉汤中，37℃振荡下培养过夜。将0.3ml所得的培养物接种到20x200mm的试管中的3ml含上述抗生素的发酵培养基中，用250rpm的旋转振荡器在37℃培养40小时。

发酵培养基的组成如表3所示。

表3

A部分用NH₄OH调到pH 7.1。每部分单独消毒。

培养后，通过TLC测定培养基中积累的L-色氨酸的量。使用包被0.11mm Sorbfil硅胶层而无荧光指示剂的10×15cm TLC平板(Stock CompanySorbpolymer，Krasnodar，俄罗斯)。Sorbfil平板用流动相：2-丙醇∶乙酸乙酯∶25％氨水∶水＝16∶16∶3∶9(v/v)展开，用茚三酮的丙酮溶液(2％)作显色剂。所得的数据如表4所示。

表4

菌株	OD₆₀₀	色氨酸的量g/l
			SV164[pMW-P_lacUV5-serA5-fruR，pYDDG2]SV164-P_{tac-3900-ybhE}[pMW-P_lacUV5-serA5-fruR，pYDDG2]SV164-P_{tac-10000-ybhE}[pMW-P_lacUV5-serA5-fruR，pYDDG2]	7.57.57.5	4.204.614.92

从表4可见，pgl基因表达的增强改进了SV164[pMW-P_lacUV5-serA5-fruR，pYDDG2]菌株的色氨酸生产能力。

实施例12.纯化带组氨酸标签的YbhE蛋白及测定其6-PGL(6-磷酸葡糖酸内酯酶)活性。

前面实施例1-7描述的所有结果间接地显示ybhE ORF是大肠杆菌中编码功能活性的6-PGL的pgl基因。另一方面，可能ybhE ORF编码例如另一种未知基因表达的正调节物，而该未知基因又编码6-PGL。因此，只有通过直接确定ybhE ORF的蛋白质产物的生物学活性，才能最终作出有关ybhEORF性质的最终结论。

为此，通过利用T7表达系统过表达ybhE ORF，T7表达系统包括作为受体菌株的大肠杆菌BL21(DE3)，其在染色体中带有T7 RNA聚合酶，和pET-22b(+)载体质粒，该质粒带有T7后期启动子(late protmoter)和T7基因10的有效RBS。为了后续蛋白纯化的方便，在ybhE ORF的5’端紧接着ATG起始密码子的后面插入了6个组氨酸的密码子。

为了在T7表达系统中克隆带有组氨酸标签序列的ybhE ORF，使用引物P28(SEQ ID NO：37)和P29(SEQ ID NO：38)，以大肠杆菌菌株MG1655的染色体DNA作为模板进行PCR。引物P28含有NdeI限制性位点，以及与6个附加的组氨酸密码子相连的ATG密码子，之后则是ybhE ORF的第二个密码子。引物P29在其5’末端含有BamHI限制性位点用于进一步克隆。将扩增的DNA片段分离，用NdeI和BamHI限制酶处理，并连接到已用同样的限制酶处理过的pET-22b(+)质粒中。通过测序来验证所得pET-HT-ybhE质粒的构建。

然后，用pET-HT-ybhE质粒转化BL21(DE3)细胞，所述细胞在其染色体上带有在乳糖启动子控制之下的T7 RNA聚合酶基因。将来自单菌落的过夜培养物用LB稀释50倍，并生长至OD₆₀₀～1.0，然后加入IPTG(1mM)以诱导重组质粒中T7RNA聚合酶驱动的ybhE ORF的表达。温育2小时后，从20ml中收集细胞，在含20mM Tris-HCl，pH8.0和2mM PMSF的缓冲液中通过超声处理制备细胞提取物。然后，在16,000xg，4℃将探针离心20min，然后使用Hitrap Chelating HP Columns(Amersham Biosciences)按照制造商的推荐从上清中纯化组氨酸标记的蛋白质。

在指数培养中诱导T7表达系统2个小时后，观察到蛋白质的积累，所述蛋白质具有对应于带组氨酸标签的YbhE(MW＞＞37Kda的蛋白)的电泳迁移率。该蛋白质的量为总细胞多肽的大约15％。观察到该蛋白质大部分存在于可溶相中(参见图8A)。

使用Ni-NTA柱纯化所得的His₆-YbhE蛋白。通过根据由Laemmli U.K.(Nature，227，680-685(1970))描述的方法进行SDS-PAGE电泳来测定重组蛋白质的合成水平及纯化过程的控制。由图8B可见，所得蛋白质的纯度高于90％，而且其在标准内酯酶测试中显示出6-PGL活性(Collard，F.等，FEBSLetters，459，223-226(1999)；实施例7)。有趣的是测得的纯化的His₆-YbhE的6-PGL比活性(780U/mg)与先前报道的类似地带有His₆标签的人6-PGL(710U/mg)(Collard，F.等，FEBS Letters，459，223-226(1999))非常接近。

因此，可以断定来自大肠杆菌的功能未知的ybhE ORF的确是编码6-PGL的pgl基因。

实施例13.增强的pgl基因表达对于苯丙氨酸生产的影响。

将产苯丙氨酸的大肠杆菌菌株AJ12739用作亲代菌株用于评价增强的pgl基因表达对于苯丙氨酸生产的影响。此菌株AJ12739在2001年11月6日以登记号VKPM B-8197保藏在工业微生物俄罗斯国家保藏中心(RussianNational Collection of Industrial Microorganisms)(VKPM)(Russia，113545Moscow，1^st Dorozhny proezd，1)。

通过P1转导将来自BW25113-P_tac-3900-ybhE和BW25113-P_tac-10000-ybhE菌株的染色体DNA片段转入产苯丙氨酸的菌株AJ12739中，分别获得AJ12739P_tac-3900-ybhE和AJ12739P_tac-10000-ybhE菌株。将这些菌株分别在含25mg/l氯霉素的营养肉汤中在37℃培养18小时，并将0.3ml所得的培养物接种到20×200mm的试管中的3ml含25mg/l氯霉素的发酵培养基中，并用旋转振荡器在34℃培养24小时。培养后，通过TLC测定培养基中积累的苯丙氨酸的量。使用包被0.11mm Sorbfil硅胶层而无荧光指示剂的10×15cm TLC平板(Stock Company Sorbpolymer，Krasnodar，俄罗斯)。将Sorbfil平板用流动相：2-丙醇∶乙酸乙酯∶25％氨水∶水＝40∶40∶7∶9(v/v)展开，用茚三酮的丙酮溶液(2％)作显色剂。

发酵培养基的组成为(g/l)：

葡萄糖 40.0

(NH₄)₂SO₄ 16.0

K₂HPO₄ 0.1

MgSO₄·7H₂O 1.0

FeSO₄·7H₂O 0.01

MnSO₄·5H₂O 0.01

盐酸硫胺素 0.0002

酵母提取物 2.0

酪氨酸 0.125

CaCO₃ 20.0

葡萄糖和硫酸镁单独消毒。CaCO₃在180℃干热消毒2h。pH调到7.0。抗生素在消毒后加入培养基中。结果如表5所示。

表5

大肠杆菌菌株	OD₆₀₀	苯丙氨酸的量，g/l
			AJ12739AJ12739P_tac-3900-ybhEAJ12739P_tac-10000-ybhE	18.2±0.117.0±0.316.3±0.2	0.65±0.40.9±0.11.3±0.1

从表5可见pgl基因的表达的提高改善了AJ12739菌株的苯丙氨酸的生产。

本发明已参照其优选的实施例得以详细地说明，但对于本领域的技术人员而言显而易见地可以作出多种改变或使用同等方案，而不背离本发明的范围。所有引用的参考文献在此都引入作为本申请的一部分供参考。

工业应用性

根据本发明，可以提高L-氨基酸例如L-色氨酸，L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的生产。

序列表

<110>味之素株式会社

<120>生产L-氨基酸的方法

<130>C2550PC4299

<140>

<141>

<150>RU2004105179

<151>2004-02-25

<150>US60/604,698

<151>2004-08-27

<150>RU2005101700

<151>2005-01-26

<160>38

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>996

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(996)

<400>1

atg aag caa aca gtt tat atc gcc agc cct gag agc cag caa att cac 48

Met Lys Gln Thr Val Tyr Ile Ala Ser Pro Glu Ser Gln Gln Ile His

1 5 10 15

gtc tgg aat ctg aat cat gaa ggc gca ctg acg ctg aca cag gtt gtc 96

Val Trp Asn Leu Asn His Glu Gly Ala Leu Thr Leu Thr Gln Val Val

20 25 30

gat gtg ccg ggg cag gtg cag ccg atg gtg gtc agc ccg gac aaa cgt 144

Asp Val Pro Gly Gln Val Gln Pro Met Val Val Ser Pro Asp Lys Arg

35 40 45

tat ctc tat gtt ggt gtt cgc cct gag ttt cgc gtc ctg gcg tat cgt 192

Tyr Leu Tyr Val Gly Val Arg Pro Glu Phe Arg Val Leu Ala Tyr Arg

50 55 60

atc gcc ccg gac gat ggc gca ctg acc ttt gcc gca gag tct gcg ctg 240

Ile Ala Pro Asp Asp Gly Ala Leu Thr Phe Ala Ala Glu Set Ala Leu

65 70 75 80

ccg ggt agt ccg acg cat att tcc acc gat cac cag ggg cag ttt gtc 288

Pro Gly Ser Pro Thr His Ile Ser Thr Asp His Gln Gly Gln Phe Val

85 90 95

ttt gta ggt tct tac aat gcg ggt aac gtg agc gta acg cgt ctg gaa 336

Phe Val Gly Ser Tyr Asn Ala Gly Asn Val Ser Val Thr Arg Leu Glu

100 105 110

gat ggc ctg cca gtg ggc gtc gtc gat gtg gtc gag ggg ctg gac ggt 384

Asp Gly Leu Pro Val Gly Val Val Asp Val Val Glu Gly Leu Asp Gly

115 120 125

tgc cat tcc gcc aat atc tca ccg gac aac cgt acg ctg tgg gtt ccg 432

Cys His Ser Ala Asn Ile Ser Pro Asp Asn Arg Thr Leu Trp Val Pro

130 135 140

gca tta aag cag gat cgc att tgc ctg ttt acg gtc agc gat gat ggt 480

Ala Leu Lys Gln Asp Arg Ile Cys Leu Phe Thr Val Ser Asp Asp Gly

145 150 155 160

cat ctc gtg gcg cag gac cct gcg gaa gtg acc acc gtt gaa ggg gcc 528

His Leu Val Ala Gln Asp Pro Ala Glu Val Thr Thr Val Glu Gly Ala

165 170 175

ggc ccg cgt cat atg gta ttc cat cca aac gaa caa tat gcg tat tgc 576

Gly Pro Arg His Met Val Phe His Pro Asn Glu Gln Tyr Ala Tyr Cys

180 185 190

gtc aat gag tta aac agc tca gtg gat gtc tgg gaa ctg aaa gat ccg 624

Val Asn Glu Leu Asn Ser Ser Val Asp Val Trp Glu Leu Lys Asp Pro

195 200 205

cac ggt aat atc gaa tgt gtc cag acg ctg gat atg atg ccg gaa aac 672

His G1y Asn Ile Glu Cys Val Gln Thr Leu Asp Met Met Pro Glu Asn

210 215 220

ttc tcc gac acc cgt tgg gcg gct gat att cat atc acc ccg gat ggt 720

Phe Ser Asp Thr Arg Trp A1a A1a Asp Ile His Ile Thr Pro Asp Gly

225 230 235 240

cgc cat tta tac gcc tgc gac cgt acc gcc agc ctg att acc gtt ttc 768

Arg His Leu Tyr Ala Cys Asp Arg Thr Ala Ser Leu Ile Thr Val Phe

245 250 255

agc gtt tcg gaa gat ggc agc gtg ttg agt aaa gaa ggc ttc cag cca 816

Ser Val Ser Glu Asp Gly Ser Val Leu Ser Lys Glu Gly Phe Gln Pro

260 265 270

acg gaa acc cag ccg cgc ggc ttc aat gtt gat cac agc ggc aag tat 864

Thr Glu Thr Gln Pro Arg Gly Phe Asn Val Asp His Ser Gly Lys Tyr

275 280 285

ctg att gcc gcc ggg caa aaa tct cac cac atc tcg gta tac gaa att 912

Leu Ile Ala Ala Gly Gln Lys Ser His His Ile Ser Val Tyr Glu Ile

290 295 300

gtt ggc gag cag ggg cta ctg cat gaa aaa ggc cgc tat gcg gtc ggg 960

Val Gly Glu Gln Gly Leu Leu His Glu Lys Gly Arg Tyr Ala Val Gly

305 310 315 320

cag gga cca atg tgg gtg gtg gtt aac gca cac taa 996

Gln Gly Pro Met Trp Val Val Val Asn Ala His

325 330

<210>2

<211>331

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>2

Met Lys Gln Thr Val Tyr Ile Ala Ser Pro Glu Ser Gln Gln Ile His

1 5 10 15

Val Trp Asn Leu Asn His Glu Gly Ala Leu Thr Leu Thr Gln Val Val

20 25 30

Asp Val Pro Gly Gln Val Gln Pro Met Val Val Ser Pro Asp Lys Arg

35 40 45

Tyr Leu Tyr Val Gly Val Arg Pro Glu Phe Arg Val Leu Ala Tyr Arg

50 55 60

Ile Ala Pro Asp Asp Gly Ala Leu Thr Phe Ala Ala Glu Ser Ala Leu

65 70 75 80

Pro Gly Ser Pro Thr His Ile Ser Thr Asp His Gln Gly Gln Phe Val

85 90 95

Phe Val Gly Ser Tyr Asn Ala Gly Asn Val Ser Val Thr Arg Leu Glu

100 105 110

Asp Gly Leu Pro Val Gly Val Val Asp Val Val Glu Gly Leu Asp Gly

115 120 125

Cys His Ser Ala Asn Ile Ser Pro Asp Asn Arg Thr Leu Trp Val Pro

130 135 140

Ala Leu Lys Gln Asp Arg Ile Cys Leu Phe Thr Val Ser Asp Asp Gly

145 150 155 160

His Leu Val Ala Gln Asp Pro Ala Glu Val Thr Thr Val Glu Gly Ala

165 170 175

Gly Pro Arg His Met Val Phe His Pro Asn Glu Gln Tyr Ala Tyr Cys

180 185 190

Val Asn Glu Leu Asn Ser Ser Val Asp Val Trp Glu Leu Lys Asp Pro

195 200 205

His Gly Asn Ile Glu Cys Val Gln Thr Leu Asp Met Met Pro Glu Asn

210 215 220

Phe Ser Asp Thr Arg Trp Ala Ala Asp Ile His Ile Thr Pro Asp Gly

225 230 235 240

Arg His Leu Tyr Ala Cys Asp Arg Thr Ala Ser Leu Ile Thr Val Phe

245 250 255

Ser Val Ser Glu Asp Gly Ser Val Leu Ser Lys Glu Gly Phe Gln Pro

260 265 270

Thr Glu Thr Gln Pro Arg Gly Phe Asn Val Asp His Ser Gly Lys Tyr

275 280 285

Leu Ile Ala Ala Gly Gln Lys Ser His His Ile Ser Val Tyr Glu Ile

290 295 300

Val Gly Glu Gln Gly Leu Leu His Glu Lys Gly Arg Tyr Ala Val Gly

305 310 315 320

Gln Gly Pro Met Trp Val Val Val Asn Ala His

325 330

<210>3

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P1

<400>3

catgaagcaa acagtttata tcgccagccc tgagagctta cgccccgccc tgccactc 58

<210>4

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P2

<400>4

ttagtgtgcg ttaaccacca cccacattgg tccctggctg atgtccggcg gtgcttttg 59

<210>5

<211>1096

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：来自ybhE基因5’-端的36个核苷酸，cm-抗性基因，来自ybhE基因3’-端的36个核苷酸

<400>5

catgaagcaa acagtttata tcgccagccc tgagagctta cgccccgccc tgccactcat 60

cgcagtactg ttgtaattca ttaagcattc tgccgacatg gaagccatca cagacggcat 120

gatgaacctg aatcgccagc ggcatcagca ccttgtcgcc ttgcgtataa tatttgccca 180

tggtgaaaac gggggcgaag aagttgtcca tattggccac gtttaaatca aaactggtga 240

aactcaccca gggattggct gagacgaaaa acatattctc aataaaccct ttagggaaat 300

aggccaggtt ttcaccgtaa cacgccacat cttgcgaata tatgtgtaga aactgccgga 360

aatcgtcgtg gtattcactc cagagcgatg aaaacgtttc agtttgctca tggaaaacgg 420

tgtaacaagg gtgaacacta tcccatatca ccagctcacc gtctttcatt gccatacgga 480

attccggatg agcattcatc aggcgggcaa gaatgtgaat aaaggccgga taaaacttgt 540

gcttattttt ctttacggtc tttaaaaagg ccgtaatatc cagctgaacg gtctggttat 600

aggtacattg agcaactgac tgaaatgcct caaaatgttc tttacgatgc cattgggata 660

tatcaacggt ggtatatcca gtgatttttt tctccatttt agcttcctta gctcctgaaa 720

atctcgataa ctcaaaaaat acgcccggta gtgatcttat ttcattatgg tgaaagttgg 780

aacctcttac gtgccgatca acgtctcatt ttcgccaaaa gttggcccag ggcttcccgg 840

tatcaacagg gacaccagga tttatttatt ctgcgaagtg atcttccgtc acaggtattt 900

attcggcgca aagtgcgtcg ggtgatgctg ccaacttact gatttagtgt atgatggtgt 960

ttttgaggtg ctccagtggc ttctgtttct atcagctgtc cctcctgttc agctactgac 1020

ggggtggtgc gtaacggcaa aagcaccgcc ggacatcagc cagggaccaa tgtgggtggt 1080

ggttaacgca cactaa 1096

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P3

<400>6

tacaccgata ccactatcgg acaaa 25

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P4

<400>7

gaacgccaga gacacgcgt 19

<210>8

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P5

<400>8

ttaaatcagg tggctataaa tgaactgggc aatgctgctg atgtccggcg gtgcttttg 59

<210>9

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P6

<400>9

atgaccacac gcgtgattgc tctcgactta gacggcttac gccccgccct gccactc 57

<210>10

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P7

<400>10

ttaacctatc tcctgtaacg cgtgtctctg gcgttcgctg atgtccggcg gtgcttttg 59

<210>11

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P8

<400>11

atgcagttaa aatttttaac ggccagccac ccaaaattac gccccgccct gccactc 57

<210>12

<211>1095

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：来自ybhE基因3’-端的36个核苷酸，Cm-抗性基因，来自ybhA基因5’-端的36个核苷酸

<400>12

ttaaatcagg tggctataaa tgaactgggc aatgctgctg atgtccggcg gtgcttttgc 60

cgttacgcac caccccgtca gtagctgaac aggagggaca gctgatagaa acagaagcca 120

ctggagcacc tcaaaaacac catcatacac taaatcagta agttggcagc atcacccgac 180

gcactttgcg ccgaataaat acctgtgacg gaagatcact tcgcagaata aataaatcct 240

ggtgtccctg ttgataccgg gaagccctgg gccaactttt ggcgaaaatg agacgttgat 300

cggcacgtaa gaggttccaa ctttcaccat aatgaaataa gatcactacc gggcgtattt 360

tttgagttat cgagattttc aggagctaag gaagctaaaa tggagaaaaa aatcactgga 420

tataccaccg ttgatatatc ccaatggcat cgtaaagaac attttgaggc atttcagtca 480

gttgctcaat gtacctataa ccagaccgtt cagctggata ttacggcctt tttaaagacc 540

gtaaagaaaa ataagcacaa gttttatccg gcctttattc acattcttgc ccgcctgatg 600

aatgctcatc cggaattccg tatggcaatg aaagacggtg agctggtgat atgggatagt 660

gttcaccctt gttacaccgt tttccatgag caaactgaaa cgttttcatc gctctggagt 720

gaataccacg acgatttccg gcagtttcta cacatatatt cgcaagatgt ggcgtgttac 780

ggtgaaaacc tggcctattt ccctaaaggg tttattgaga atatgttttt cgtctcagcc 840

aatccctggg tgagtttcac cagttttgat ttaaacgtgg ccaatatgga caacttcttc 900

gcccccgttt tcaccatggg caaatattat acgcaaggcg acaaggtgct gatgccgctg 960

gcgattcagg ttcatcatgc cgtctgtgat ggcttccatg tcggcagaat gcttaatgaa 1020

ttacaacagt actgcgatga gtggcagggc ggggcgtaag ccgtctaagt cgagagcaat 1080

cacgcgtgtg gtcat 1095

<210>13

<211>1095

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：来自ybhE基因3’-端的36个核苷酸，Cm-抗性基因，来自ybhD基因5’-端的36个核苷酸

<400>13

ttaacctatc tcctgtaacg cgtgtctctg gcgttcgctg atgtccggcg gtgcttttgc 60

cgttacgcac caccccgtca gtagctgaac aggagggaca gctgatagaa acagaagcca 120

ctggagcacc tcaaaaacac catcatacac taaatcagta agttggcagc atcacccgac 180

gcactttgcg ccgaataaat acctgtgacg gaagatcact tcgcagaata aataaatcct 240

ggtgtccctg ttgataccgg gaagccctgg gccaactttt ggcgaaaatg agacgttgat 300

cggcacgtaa gaggttccaa ctttcaccat aatgaaataa gatcactacc gggcgtattt 360

tttgagttat cgagattttc aggagctaag gaagctaaaa tggagaaaaa aatcactgga 420

tataccaccg ttgatatatc ccaatggcat cgtaaagaac attttgaggc atttcagtca 480

gttgctcaat gtacctataa ccagaccgtt cagctggata ttacggcctt tttaaagacc 540

gtaaagaaaa ataagcacaa gttttatccg gcctttattc acattcttgc ccgcctgatg 600

aatgctcatc cggaattccg tatggcaatg aaagacggtg agctggtgat atgggatagt 660

gttcaccctt gttacaccgt tttccatgag caaactgaaa cgttttcatc gctctggagt 720

gaataccacg acgatttccg gcagtttcta cacatatatt cgcaagatgt ggcgtgttac 780

ggtgaaaacc tggcctattt ccctaaaggg tttattgaga atatgttttt cgtctcagcc 840

aatccctggg tgagtttcac cagttttgat ttaaacgtgg ccaatatgga caacttcttc 900

gcccccgttt tcaccatggg caaatattat acgcaaggcg acaaggtgct gatgccgctg 960

gcgattcagg ttcatcatgc cgtctgtgat ggcttccatg tcggcagaat gcttaatgaa 1020

ttacaacagt actgcgatga gtggcagggc ggggcgtaat tttgggtggc tggccgttaa 1080

aaattttaac tgcat 1095

<210>14

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P9

<400>14

cggccaggtg gaagtgg 17

<210>15

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P10

<400>15

ggctctcagg gctggc 16

<210>16

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P11

<400>16

cgagcagggg ctactgc 17

<210>17

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P12

<400>17

aacgcgcccc tcgagg 16

<210>18

<211>68

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P13

<400>18

ttaaccgcgc cacgctttat agcggttaat cagaccgaaa gccacgttgt gtctcaaaat 60

ctctgatg 68

<210>19

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P14

<400>19

aatgaaaaac atcaatccaa cgcagaccgc tgcctggcgc tgaggtctgc ctcgtgaaga 60

aggtg 65

<210>20

<211>1286

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：来自pgi基因3’-端的36个核苷酸，Km-抗性基因，来自pgi基因5’-端的36个核苷酸

<400>20

ttaaccgcgc cacgctttat agcggttaat cagaccgaaa gccacgttgt gtctcaaaat 60

ctctgatgtt acattgcaca agataaaaat atatcatcat gaacaataaa actgtctgct 120

tacataaaca gtaatacaag gggtgttatg agccatattc aacgggaaac gtcttgctcg 180

aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg ggtataaatg ggctcgcgat 240

aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat cgattgtatg ggaagcccga tgcgccagag 300

ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg ttacagatga gatggtcaga 360

ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca agcattttat ccgtactcct 420

gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc cccgggaaaa cagcattcca ggtattagaa 480

gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg cagtgttcct gcgccggttg 540

cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc gcgtatttcg tctcgctcag 600

gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga cgagcgtaat 660

ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataagc ttttgccatt ctcaccggat 720

tcagtcgtca ctcatggtga tttctcactt gataacctta tttttgacga ggggaaatta 780

ataggttgta ttgatgttgg acgagtcgga atcgcagacc gataccagga tcttgccatc 840

ctatggaact gcctcggtga gttttctcct tcattacaga aacggctttt tcaaaaatat 900

ggtattgata atcctgatat gaataaattg cagtttcatt tgatgctcga tgagtttttc 960

taatcagaat tggttaattg gttgtaacac tggcagagca ttacgctgac ttgacgggac 1020

ggcggctttg ttgaataaat cgaacttttg ctgagttgaa ggatcagatc acgcatcttc 1080

ccgacaacgc agaccgttcc gtggcaaagc aaaagttcaa aatcaccaac tggtccacct 1140

acaacaaagc tctcatcaac cgtggctccc tcactttctg gctggatgat ggggcgattc 1200

aggcctggta tgagtcagca acaccttctt cacgaggcag acctcagcgc caggcagcgg 1260

tctgcgttgg attgatgttt ttcatt 1286

<210>21

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P15

<400>21

ttaaccgcgc cacgct 16

<210>22

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P16

<400>22

aatgaaaaac atcaatccaa cg 22

<210>23

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P17

<400>23

gacaaagagc tccacacagg aaacagctat gggagggcgt ggtatgg 47

<210>24

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P18

<400>24

ttagtagaat tctcatgggc accagtagat gtc 33

<210>25

<211>68

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P19

<400>25

ttacagctta gcgccttcta cagcttcacg cgccaggaaa gccacgttgt gtctcaaaat 60

ctctgatg 68

<210>26

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P20

<400>26

atggcggtaa cgcaaacagc ccaggcctgt gacctggcgc tgaggtctgc ctcgtgaaga 60

aggtg 65

<210>27

<211>1286

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：来自eda基因3’-端的36个核苷酸，Km-抗性基因，来自zwf基因5’-端的36个核苷酸

<400>27

ttacagctta gcgccttcta cagcttcacg cgccaggaaa gccacgttgt gtctcaaaat 60

ctctgatgtt acattgcaca agataaaaat atatcatcat gaacaataaa actgtctgct 120

tacataaaca gtaatacaag gggtgttatg agccatattc aacgggaaac gtcttgctcg 180

aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg ggtataaatg ggctcgcgat 240

aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat cgattgtatg ggaagcccga tgcgccagag 300

ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg ttacagatga gatggtcaga 360

ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca agcattttat ccgtactcct 420

gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc cccgggaaaa cagcattcca ggtattagaa 480

gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg cagtgttcct gcgccggttg 540

cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc gcgtatttcg tctcgctcag 600

gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga cgagcgtaat 660

ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataagc ttttgccatt ctcaccggat 720

tcagtcgtca ctcatggtga tttctcactt gataacctta tttttgacga ggggaaatta 780

ataggttgta ttgatgttgg acgagtcgga atcgcagacc gataccagga tcttgccatc 840

ctatggaact gcctcggtga gttttctcct tcattacaga aacggctttt tcaaaaatat 900

ggtattgata atcctgatat gaataaattg cagtttcatt tgatgctcga tgagtttttc 960

taatcagaat tggttaattg gttgtaacac tggcagagca ttacgctgac ttgacgggac 1020

ggcggctttg ttgaataaat cgaacttttg ctgagttgaa ggatcagatc acgcatcttc 1080

ccgacaacgc agaccgttcc gtggcaaagc aaaagttcaa aatcaccaac tggtccacct 1140

acaacaaagc tctcatcaac cgtggctccc tcactttctg gctggatgat ggggcgattc 1200

aggcctggta tgagtcagca acaccttctt cacgaggcag acctcagcgc caggtcacag 1260

gcctgggctg tttgcgttac cgccat 1286

<210>28

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P21

<400>28

ttacagctta gcgccttcta cag 23

<210>29

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P22

<400>29

catggcggta acgcaaac 18

<210>30

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P23

<400>30

ctagtaagat ctccctgttt gcaattaatc atcgg 35

<210>31

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P24

<400>31

ctagtaagat ctccctgttg acaattaatc atcgg 35

<210>32

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P25

<400>32

tggcgatata aactgtttgc ttcatgaatg ctcctttcct gtgtgaaatt gttatccgc 59

<210>33

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P26

<400>33

ctagtaagat ctgctgatgt ccggcggtgc ttttg 35

<210>34

<211>67

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P27

<400>34

gccaaaagcg actaatttta gctgttacag tcagttgcta aatgcattac gccccgccct 60

gccactc 67

<210>35

<211>1099

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Cm-抗性基因，Ptac-3900启动子

<400>35

ttacgccccg ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat tcattaagca ttctgccgac 60

atggaagcca tcacagacgg catgatgaac ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc 120

gccttgcgta taatatttgc ccatggtgaa aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc 180

cacgtttaaa tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg gctgagacga aaaacatatt 240

ctcaataaac cctttaggga aataggccag gttttcaccg taacacgcca catcttgcga 300

atatatgtgt agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt 360

ttcagtttgc tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc 420

accgtctttc attgccatac ggaattccgg atgagcattc atcaggcggg caagaatgtg 480

aataaaggcc ggataaaact tgtgcttatt tttctttacg gtctttaaaa aggccgtaat 540

atccagctga acggtctggt tataggtaca ttgagcaact gactgaaatg cctcaaaatg 600

ttctttacga tgccattggg atatatcaac ggtggtatat ccagtgattt ttttctccat 660

tttagcttcc ttagctcctg aaaatctcga taactcaaaa aatacgcccg gtagtgatct 720

tatttcatta tggtgaaagt tggaacctct tacgtgccga tcaacgtctc attttcgcca 780

aaagttggcc cagggcttcc cggtatcaac agggacacca ggatttattt attctgcgaa 840

gtgatcttcc gtcacaggta tttattcggc gcaaagtgcg tcgggtgatg ctgccaactt 900

actgatttag tgtatgatgg tgtttttgag gtgctccagt ggcttctgtt tctatcagct 960

gtccctcctg ttcagctact gacggggtgg tgcgtaacgg caaaagcacc gccggacatc 1020

agcagatctc cctgtttgca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg 1080

ataacaattt cacacagga 1099

<210>36

<211>1099

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Cm-抗性基因，Ptac-10000启动子

<400>36

ttacgccccg ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat tcattaagca ttctgccgac 60

atggaagcca tcacagacgg catgatgaac ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc 120

gccttgcgta taatatttgc ccatggtgaa aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc 180

cacgtttaaa tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg gctgagacga aaaacatatt 240

ctcaataaac cctttaggga aataggccag gttttcaccg taacacgcca catcttgcga 300

atatatgtgt agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt 360

ttcagtttgc tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc 420

accgtctttc attgccatac ggaattccgg atgagcattc atcaggcggg caagaatgtg 480

aataaaggcc ggataaaact tgtgcttatt tttctttacg gtctttaaaa aggccgtaat 540

atccagctga acggtctggt tataggtaca ttgagcaact gactgaaatg cctcaaaatg 600

ttctttacga tgccattggg atatatcaac ggtggtatat ccagtgattt ttttctccat 660

tttagcttcc ttagctcctg aaaatctcga taactcaaaa aatacgcccg gtagtgatct 720

tatttcatta tggtgaaagt tggaacctct tacgtgccga tcaacgtctc attttcgcca 780

aaagttggcc cagggcttcc cggtatcaac agggacacca ggatttattt attctgcgaa 840

gtgatcttcc gtcacaggta tttattcggc gcaaagtgcg tcgggtgatg ctgccaactt 900

actgatttag tgtatgatgg tgtttttgag gtgctccagt ggcttctgtt tctatcagct 960

gtccctcctg ttcagctact gacggggtgg tgcgtaacgg caaaagcacc gccggacatc 1020

agcagatctc cctgttgaca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg 1080

ataacaattt cacacagga 1099

<210>37

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P28

<400>37

gatatacata tgcaccacca ccaccaccac aagcaaacag tttatatcgc cag 53

<210>38

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P29

<400>38

agactaggat ccttagtgtg cgttaaccac cac 33

Claims

1.产生L-氨基酸的方法，其包括在培养基中培养大肠杆菌(Escherichiacoli)和从所述培养基收集所述L-氨基酸，其中通过增加6-磷酸葡糖酸内酯酶基因的表达而使所述大肠杆菌受到修饰以具有增强的6-磷酸葡糖酸内酯酶活性。

2.根据权利要求1的方法，其中增加该6-磷酸葡糖酸内酯酶基因的拷贝数或修饰该6-磷酸葡糖酸内酯酶基因的表达调控序列。

3.根据权利要求1的方法，其中所述6-磷酸葡糖酸内酯酶基因的天然启动子已被更强的启动子所取代。

4.根据权利要求1的方法，其中所述基因的天然SD序列已被更高效的SD序列所取代。

5.根据权利要求1的方法，其中所述6-磷酸葡糖酸内酯酶基因源自肠杆菌科。

6.根据权利要求5的方法，其中所述6-磷酸葡糖酸内酯酶基因编码由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列组成的蛋白质。

7.根据权利要求5的方法，其中所述6-磷酸葡糖酸内酯酶基因为由SEQID NO：1中的核苷酸1至993的核苷酸序列组成的DNA。

8.根据权利要求1的方法，其中所述大肠杆菌被进一步修饰以具有增强的yddG开放阅读框的表达。

9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中所述L-氨基酸是芳香族L-氨基酸，其选自L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸。