CN101402935B - 使用肠杆菌科的细菌产生氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
描述了通过使用肠杆菌科的细菌的发酵来产生L-氨基酸例如L-苯丙氨酸和L-组氨酸的方法,其中已通过以下方式修饰该细菌:将能够被转录并且编码SEQ ID NO:2中所示的肽或它的变体的DNA片段,尤其是一部分ssrA基因附接到编码细菌酶的基因的3’末端,所述酶影响该L-氨基酸生物合成,例如分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶或者磷酸葡糖异构酶。
Description
技术领域
本发明涉及通过发酵产生L-氨基酸的方法,更具体地涉及有助于这种发酵的基因。这些基因可用于改进L-氨基酸的产生,特别是L-苯丙氨酸和L-组氨酸的产生。
背景技术
常规地,在工业上通过发酵方法,使用获自天然来源的微生物菌株或者它们的突变株来产生L-氨基酸。通常而言,将所述微生物修饰以增强L-氨基酸的产率(yield)。
已报道了许多提高L-氨基酸产率的技术,包括用重组DNA转化微生物(参见,例如美国专利No.4,278,765)。其它增强产率的技术包括增加在氨基酸生物合成中涉及的酶的活性和/或脱敏目标酶受到的由所得L-氨基酸引起的反馈抑制(参见,例如WO95/16042或者美国专利Nos.4,346,170、5,661,012和6,040,160);和产生基因缺陷的细菌菌株,所述基因将该目的化合物的前体用于其它途径;或者产生基因缺陷的细菌菌株,所述基因负责该目的化合物的降解。
这些操作通常导致菌株不可生长、仅以显著降低的速率生长、或者需要另外的营养物,例如氨基酸。例如,增强一些基因的表达可能变为过量,并且可以导致对细菌生长的显著抑制,结果降低了细菌产生目的化合物的能力。
避免上述困难的可能的方法是:优化基因的表达,所述基因编码在碳、氮或者磷通量(flux)的分配中涉及的蛋白质,或者将目标物质分泌到细菌细胞外所涉及的蛋白质。
经常通过以下方式完成这种目标:将突变导入氨基酸生物合成基因或者核酸生物合成基因的启动子序列(欧洲专利申请EP1033407A1),获得不同强度的合成启动子的文库(Jensen P R.,and Hammer K.,Appl.Environ. Microbiol.,1998,64,No.1.82-87Biotechnol.Bioeng.,1998,58,2-3,191-5),和产生人造启动子的文库(PCT申请WO03089605)。
已知,用由SsrA RNA编码的ssrA肽标签来标记蛋白质使带标签的蛋白质具有用于蛋白质水解的标记(Gottesmann S.and al,Genes&Dev.,12:1338-1347(1998))。SsrA RNA(同物异名:SsrA,tmRNA,10Sa RNA,转移-信使RNA,SipB,B2621)通过发挥tRNA和mRNA两者的作用,使用“反式翻译”机理,起到从缺失了终止密码子的“破坏的”mRNA的末端释放受阻(stalled)核糖体的功能。SsrA也介导由于缺乏适当的tRNA而受阻的核糖体的释放(Hayes C.S.and al,PNAS,99(6):3440-3445(2002))。其它翻译问题也可能导致SsrA活性。另外,SsrA RNA刺激了缺陷的mRNAs的降解(Yamamoto Y.et al,RNA,9:408-418(2003))。
SsrA RNA含有tRNA样结构的区域,其为RNase P所加工并为丙氨酰-tRNA合成酶所氨基酰化(aminoacylated)(Komine Y等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91(20):9223-7(1994))。SsrA RNA还含有起信使RNA作用并编码翻译的标记物的区域,将该标记物添加到初生蛋白质,并且其使得这个蛋白质成为降解的标靶(Tu G.-F.and al,J Biol Chem,270(16):9322-9326(1995))。已详细地研究了SsrA RNA的结构和翻译的机理(Corvaisier S.et al,J Biol Chem,278(17):14788-97(2003))。将SsrARNA作为较大的前体RNA转录,然后将该前体RNA加工形成成熟的RNA。
SsrA与以下来源的RNA相似:山羊支原体(Mycoplasma capricolum)的RNA、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的RNA(Muto A.and al,Genes Cells,7(5):509-19(2000))、节瘤偶蹄形菌(Dichelobacter nodosus)的RNA、聚球蓝细菌属菌种(Synechococcus sp.)菌株PCC6301和PCC6803的RNA、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的RNA、肠沙门氏菌鼠伤寒血清型(Salmonellaenterica serovar Typhimurium)的RNA和新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)的两件套RNA(two-piece RNA)。tmRNA基因已用作鉴定细菌种类的探针(Schonhuber W.and al,BMC Microbiology,1(1):20(2001))。
但是,还未有报道描述用于L-氨基酸产生(例如L-苯丙氨酸或者L-组氨酸产生)的ssrA标记的用途。特别地,之前没有描述使用含有编码SEQ IDNO:2的肽的DNA或者其变体的肠杆菌科(Enterobacteriaceae family)细菌,该DNA或者其变体附接在编码细菌酶的基因的紧邻下游,所述细菌酶影响L-氨基酸生物合成。
附图说明
L-氨基酸生物合成。
图1显示了tyrA基因延伸的方案。
图2显示了引物P1和P2在质粒pMW118-attL-Cm-attR上的相对位置。
图3显示了缺失pheA基因的染色体DNA片段的构建。
图4显示了用pheA基因替换cat基因座的方案。大肠杆菌染色体基因座包含tyrA-ssrA等位基因和cat基因。用于检查所得构建的P4和P5的位点如黑色箭头所示。
发明内容
图5显示了来源于以下菌种的tmRNA编码的诱导蛋白水解的肽标记物(tmRNA-encoded proteolysis-inducing peptide tag)一级序列的比对:枯草芽孢杆菌(BACSU)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus;BACST)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens;SERMA)、大肠杆菌(ECOLI)、荧光假单胞菌(Pseudomonas flurescens;PSEFL)、绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis;PSECL)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida;PSEUPU)。通过使用PIR多重比对程序(http://pir.georgetown.edu)来完成该比对。完全相同的氨基酸以星号(*)标记,相似氨基酸以冒号(:)标记。
本发明的方面包括增强产生L-氨基酸的菌株的生产率(productivity)和使用这些菌株来产生L-氨基酸的方法。通过以下发现实现上述方面:用SsrA标记在其生物合成途径中与其它氨基酸共享共同步骤的目标氨基酸的合成中涉及的酶,能够以损失所述具有共同生物合成步骤和/或前体的氨基酸为代价增强目标氨基酸的产生。也发现:用SsrA标记涉及不同糖酵解途径(例如戊糖磷酸途径和Entner-Duodoroff途径)之间碳通量分配的酶能够增强其前体产生于所述糖酵解途径之一的那些氨基酸的产量。在这两种情况中的任一种中,发现经修饰的细菌的原养型特性得到了维持。
这种目标是通过构建新变体tyrA基因和新变体pgi基因来达成,其中所得蛋白质均具有由部分ssrA基因编码的C-末端短肽序列。显示了当把该突变的tyrA-ssrA基因导入产生L-苯丙氨酸的菌株的细胞,替代天然的tyrA基因时,这种突变的TyrA-ssrA的使用可以提高L-苯丙氨酸产生。也显示了当把该突变的pgi-ssrA基因导入产生L-组氨酸的菌株的细胞,替代天然的pgi基因时,这种突变的Pgi-ssrA的使用可以增强L-组氨酸产生。因此,已 完成了本发明。
本发明的一方面提供了包含DNA的肠杆菌科的产生L-氨基酸的细菌,该DNA包含编码影响L-氨基酸生物合成的细菌酶的基因,和能够被转录并编码SEQ ID NO:2的肽的DNA片段,或者其变体,其中将所述DNA片段附接于所述基因,在所述基因的3’末端。
本发明的进一步的方面提供了上文描述的细菌,其中所述细菌属于埃希氏菌属(genus Escherichia)。
本发明的进一步的方面提供了上文描述的细菌,其中所述细菌是产生L-苯丙氨酸的细菌。
本发明的进一步的方面提供了上文描述的细菌,其中该酶是分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶(prephenate dehydrogenase)。
本发明的进一步的方面提供了上文描述的细菌,其中所述细菌是产生L-组氨酸的细菌。
本发明的进一步的方面提供了上文描述的细菌,其中该酶是磷酸葡糖异构酶。
本发明的进一步的方面提供了产生L-氨基酸的方法,其包括在培养基中培养上文所述的细菌,并从该培养基中分离该L-氨基酸。
本发明的进一步的方面提供了上文描述的方法,其中所述L-氨基酸是L-苯丙氨酸。
本发明的进一步的方面提供了上文描述的方法,其中所述L-氨基酸是L-组氨酸。
本发明的进一步的方面提供了产生α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯的方法,其包括在培养基中培养上文所述细菌以在培养基中产生并积累L-苯丙氨酸,并且自天冬氨酸或它的衍生物和获得的L-苯丙氨酸合成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯。
本发明的进一步的方面提供了上文所述的方法,其中该方法进一步包括:酯化L-苯丙氨酸以产生L-苯丙氨酸的低级烷基酯;将L-苯丙氨酸的低级烷基酯与天冬氨酸衍生物缩合,其中该衍生物是N-酰基-L-天冬氨酸酐;从该反应混合物中分离N-酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯;并且氢化N-酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯以产生该α-L-天冬酰胺-L-苯丙氨酸的低级烷基酯。
优选实施方案的详述
1.本发明的细菌
已知一些L-氨基酸在由细胞进行的生物合成过程中具有共同的前体,这些L-氨基酸例如芳香族氨基酸、支链氨基酸等。当在细菌菌株中产生这种氨基酸时,有用的是使菌株对其它氨基酸为营养缺陷型,所述其它氨基酸与目标氨基酸具有共同的前体。这可以预防该共同的前体引导生物合成远离目的氨基酸的生物合成途径。
确保产生目的氨基酸而非那些具有共同前体的氨基酸的另一种方法是,在负责从共同前体产生其它氨基酸的酶中形成所谓的“渗漏”突变。在这种情况中,没有必要用所述其它的氨基酸培养细菌,因为在该细菌中这些L-氨基酸的合成受到阻抑。
用SsrA标记酶导致酶活性的降低,因为该酶由转录的ssrA标记的RNA通过RNase P降解(Komine Y等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91(20):9223-7(1994)),并且因ClpXP和ClpAP蛋白酶对ssrA标记的酶的蛋白水解而降解(Wah D.A.等,Chem.Biol.,9(11):1237-45(2002))。当呈现渗漏型表型(leaky-type phenotype)时,通过ssrA标记的这种修饰允许保留修饰的细菌的原养性质。同样,通过降低副产物生物合成中涉及的一种或者几种酶的活性,ssrA标记允许这些副产物水平的下降。
在本发明中,“产生L-氨基酸的细菌”指在培养基中培养该细菌时,所述细菌具有在培养基中引起L-氨基酸积累的能力。通过育种可以赋予或者增强产生L-氨基酸的能力。这里使用的短语“产生L-氨基酸的细菌”也指,在培养基中,能够以大于大肠杆菌野生型或者亲株例如大肠杆菌K12的量,产生并引起L-氨基酸积累的细菌,并且优选地指该微生物能够在培养基中以不低于0.5g/L,更优选地不低于1.0g/L目的L-氨基酸的量引起积累。术语“L-氨基酸”包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸。特别优选L-组氨酸。更优选芳香族氨基酸例如L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸,并且特别优选L-苯丙氨酸。
肠杆菌科包括属于以下属的细菌:埃希氏菌属、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、普罗威登斯菌属(Providencia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、摩根氏菌属(Morganella)等。具体地,可以使用根据在NCBI(National Ceter for Biotechnology Information;美国国立生物技术信息中心)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock)中使用的分类法而归入肠杆菌科的那些菌。优选属于埃希氏菌属或者泛菌属的细菌。
短语“属于埃希氏菌属的细菌”指根据微生物领域的技术人员所知的分类方法将该细菌归入埃希氏菌属。在本发明中使用的属于埃希氏菌属的细菌的实例包括但不限于大肠杆菌(E.coli)。
没有特别限制在本发明中可以使用的属于埃希氏菌属的细菌;但是,例如,本发明包括Neidhardt,F.C.等(大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌,美国微生物学会,华盛顿特区,1208,表1;Escherichia coli andSalmonellatyphimurium,American Society for Microbiology,Washington D.C.,1208,Table1)描述的细菌。
本发明的细菌包括肠杆菌科的菌株,其具有产生L-氨基酸的能力并已被如下修饰:将具有部分ssrA基因的DNA片段附接到编码细菌酶的基因的3’末端。该部分ssrA基因编码SEQ ID NO:2中所示的肽或它的变体,并且该细菌酶涉及L-氨基酸的生物合成途径,所述L-氨基酸与目的L-氨基酸具有共同的前体。另外,本发明的细菌包括肠杆菌科的菌株,所述菌株具有产生L-氨基酸的能力,并已用编码部分ssrA基因的DNA片段将其转化,因此表达由该DNA片段编码的肽的成分。
ssrA基因(同物异名:ECK2617,b2621,sipB)编码tmRNA(同物异名:SsrA,10Sa RNA,转移-信使RNA,SipB,B2621)。ssrA基因(在GenBank登记号NC_000913.2,gi:49175990的序列中从2753615至2753977的核苷酸)位于大肠杆菌K-12染色体上的smpB和intA基因之间。来自大肠杆菌的ssrA基因以SEQ ID NO:1代表。tmRNA编码的诱导蛋白水解的肽标记物的序列以SEQ ID NO:2代表。这种肽是由在SEQ ID NO:1中所示的ssrA基因的90至119位置上的核苷酸编码。也已阐明了其它ssrA基因,如下:来自 枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、粘质沙雷氏菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌、绿针假单胞菌和恶臭假单胞菌的tmRNA编码的诱导蛋白水解的肽标记物。
可以使用能够同时地产生具有共同的前体的两种L-氨基酸的细菌。通过使用之前已修饰成可同时产生两种氨基酸,即L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的菌株来达成本发明的目标。可以通过以下方式获得这种菌株:以标准的Red-驱动的重组方法来破坏转录的双重调节子,即tyrR基因。tyrR基因的缺失可以通过PCR确认,所述PCR使用转化的菌株的染色体DNA作为模板。可以使用能够产生L-氨基酸的细菌,并且优选能够同时产生苯丙氨酸和酪氨酸的细菌。大肠杆菌MG1655ΔtyrR是这种菌株的实例。通过以下方式获得大肠杆菌MG1655ΔtyrR:用含有Cm标记的DNA盒取代染色体tyrR基因,接着用在WO05/010175中描述的标准技术来切除该标记。同样,也包括并描述了产生L-组氨酸的菌株,其中通过ssrA标记来修饰pgi基因以增加D-葡萄糖-6-磷酸到戊糖磷酸途径的通量,从而增强L-组氨酸的生产率。
短语“能够被转录并编码SEQ ID NO:2的肽或它的变体的DNA片段,其中将所述片段附接于所述基因,在所述基因的3’末端”指已将编码细菌酶的基因修饰,以使其相较于无修饰的基因(例如,野生型菌株的基因)而言在它的3’末端具有额外的核苷酸残基。在编码该细菌酶的基因的3’末端,这种DNA片段(编码SEQ ID NO:2或它的变体)的存在导致标记的mRNA种类的形成,并且翻译的相应蛋白质具有额外的肽,该肽标记所述蛋白质的C末端或者附接于所述蛋白质的C末端。通过包括遗传重组、C末端延伸、C末端融合等方法可以修饰细菌酶。可以测量该修饰的酶蛋白的长度,例如,通过使用特异性抗体的Western印迹,蛋白质测序和类似的方法。短语“将SEQ ID NO:2的肽或者它的变体附接于该蛋白质的羧基末端”也可以指在细菌中以这样的方式来表达翻译的修饰蛋白质:所述修饰的蛋白质以可控制的速率降解(McGinness K.E.and al,Molecular Cell,22:701-707(2006))。
短语“能够被转录的DNA片段”指将该DNA片段以这样的方式附接于编码细菌酶的基因的3’末端:去除编码细菌酶的基因的终止密码子并且在紧接着该基因最后的密码子之后导入必需的DNA片段。将这种DNA构建体作为一个转录单位转录,其将期望的DNA片段标记到目的基因(细菌酶)的mRNA。它也导致ssrA标记的蛋白质的表达。
如本发明中使用的短语“它的变体”指在序列中具有变化的肽,不管这些变化是氨基酸的缺失、插入、添加还是取代,但是所述肽仍将期望的活性保持在有用的水平,例如,可用于降低标记的蛋白质的活性并继而增强L-氨基酸的产生的水平。在变体肽中的变化的数量依赖于在所述肽的一级结构中氨基酸残基的位置或类型。对于如SEQ ID NO:2所列出的肽,变化的数量可以是1至4并且优选1至2。在变体中的这些变化可以发生在对肽的功能不是关键的肽的区域中。这是因为一些氨基酸相互之间具有高度的同源性,因此这种变化不会影响该活性。因此,相对于SEQ ID NO:2中显示的全部的氨基酸序列,所述肽变体可以具有不低于70%的同源性,优选的是不低于80%,并且更优选的是不低于90%,并且最优选的是不低于95%,只要导致随后降解的蛋白酶识别该ssrA标记的蛋白质。使用公知的方法可以确定两个氨基酸之间的同源性,例如,计算机程序BLAST2.0,其算出三个参数:分值、同一性和相似性。
一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加应该是保守的突变,因此维持了活性。代表性的保守突变是保守取代。保守取代的实例包括用Ser或Thr取代Ala;用Gln、His或Lys取代Arg;用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn;用Asn、Glu或Gln取代Asp;用Ser或Ala取代Cys;用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln;用Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu;用Pro取代Gly;Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His;用Leu、Met、Val或Phe取代Ile;用Ile、Met、Val或Phe取代Leu;用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys;用Ile、Leu、Val或Phe取代Met;用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe;用Thr或Ala取代Ser;Ser或Ala取代Thr;用Phe或Tyr取代Trp;用His、Phe或Trp取代Tyr;以及用Met、Ile或Leu取代Val。
数据显示了在C-末端中的氨基酸序列“YALAA”的高水平同源性(参见图5),该数据对比了来自下列菌种的tmRNA编码的诱导蛋白质水解的肽标记物的一级序列:枯草芽孢杆菌(BACSU)、嗜热脂肪芽孢杆菌(BACST)、粘质沙雷氏菌(SERMA)、大肠杆菌(ECOLI)、荧光假单胞菌(PSEFL)、绿针假单胞菌(PSECL)、恶臭假单胞菌(PSEUPU)。可能的是,通过相似(以冒号标记)的氨基酸残基取代相似的氨基酸残基而不削弱该肽活性。但是对其它非保守的氨基酸残基的修饰可能不导致tmRNA编码的诱导蛋白质水解的肽标 记物的活性的改变。也可以考虑将McGinness K.E.等(Molecular Cell,22:701-707(2006))提及的肽标记的氨基酸序列作为本发明的肽变体。
可以获得编码与该标记肽的组分基本上相同的肽的DNA,例如,通过修饰编码标记肽组分的DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:1),例如,依靠定点诱变方法,从而使在特定位点上的一个或多个氨基酸残基包括缺失、取代、插入或添加。通过常规已知的突变处理可以获得如上文所述修饰的DNA。这些处理包括羟胺处理编码本发明的蛋白质的DNA,或者用UV照射或者用试剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍或亚硝酸来处理含有该DNA的细菌。可以通过以下方式获得编码与标记肽基本上相同的肽的DNA:在适当的细胞中表达具有如上文所述突变的DNA,并且研究表达的产物的活性。也可以通过分离在严紧条件下与探针可以杂交并且编码具有标记肽活性的肽的DNA来获得编码与标记肽基本上相同的肽的DNA,所述探针具有核苷酸序列,其含有例如在SEQ ID NO:1中显示的核苷酸序列。这里提及的“严紧条件”是这样的条件:在该条件下形成所谓的特异性杂合体并且不形成非特异性杂合体。例如,可以以一些条件作为严紧条件的例示,在所述这些条件下,具有高度同源性的DNA能够相互杂交,例如具有不低于50%,优选不低于60%,更优选不低于70%,进一步优选不低于80%,并且还更优选不低于90%,并且最优选不低于95%的同源性的DNA能够相互杂交;但是分别具有低于上述各项的同源性的DNA不能够相互杂交。可选地,可以以一些条件作为严紧条件的例示,在所述这些条件下,DNA能够在下述盐浓度下杂交,该盐浓度等同于Southern杂交中通常的洗涤条件,即1xSSC,0.1%SDS,优选0.1xSSC,0.1%SDS,在60℃。洗涤的持续时间依赖于印迹使用的膜的类型,并且通常依赖于由制造商推荐的持续时间。例如,推荐的洗涤持续时间,例如,对于HybondTMN+尼龙膜(Amersham),在严紧条件下大约是15分钟。优选地,可以进行2至3次洗涤。
也可以将SEQ ID NO:1的核苷酸序列的部分序列用作探针。可以通过PCR制备探针,所述PCR使用基于SEQ ID NO:1的核苷酸序列的引物和含有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的DNA片段作为模板。
如上文所述的核苷酸的取代、缺失、插入或添加也包括天然存在的突变(突变体或变体),例如,由于细菌的种或者属的多样性而天然存在的突变,所述突变含有标记肽的组分。
通过下列方式完成细菌基因的表达,该细菌基因具有编码SEQ ID NO:2中所示的肽或它的变体的DNA片段,其附接于所述基因的3’末端:用编码该肽的DNA转化细菌,并且更准确地,通过将该DNA片段导入编码该蛋白质的基因下游的细菌染色体中而不破坏编码框,或者优选地,通过常规方法用编码该带标签的蛋白质的突变基因来替换天然染色体基因。用DNA转化细菌将导致新染色体突变基因的形成,该突变基因编码本发明的延长的(elongated)蛋白质。转化的方法包括目前已报道的任何已知的方法。
例如,可以使用下列方法通过基因重组导入编码该突变基因的DNA。制备突变基因,并且用含有该突变基因的DNA片段来转化细菌。然后,通过同源重组,用该突变基因来替换在染色体上的天然基因,并且选择所得菌株。可以通过以下方法进行通过同源重组进行的这种基因替换:使用线性DNA,其称作“Red-驱动的整合”(Datsenko,K.A.and Wanner,B.L,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,12,p6640-6645(2000)),或者使用含有温度敏感复制的质粒的方法(美国专利6,303,383或者JP05-007491A)。为了增加所述细胞对该DNA的通透性,用氯化钙对受体细胞的处理已报道适用于大肠杆菌K-12(Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970))并且可以使用该处理。
制备质粒DNA的方法包括但不限于消化和连接DNA、转化、选择寡核苷酸作为引物等,或者本领域技术人员公知的其它方法。这些方法例如在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.,“Molecular Cloning ALaboratory Manual,Second Edition”,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中描述。
在本发明中,短语“影响L-氨基酸生物合成的细菌酶”指在非期望的产物的生物合成途径中涉及的酶,该非期望的产物例如与目的L-氨基酸分享共同前体的产物。短语“在非期望的产物的生物合成途径中涉及的细菌酶”指催化将目的L-氨基酸和该非期望的产物的共同前体转化成非期望的产物的反应的酶。这种情况的发生是因为该酶指导反应沿着生物合成途径中导致非期望产物产生的支路进行。短语“影响L-氨基酸生物合成的细菌酶”也指目的L-氨基酸的副产物的生物合成途径中涉及的酶。这些副产物的存在可能在纯化过程中引起重大的技术问题,并且对L-氨基酸生产产生负面影响。
编码影响L-氨基酸生物合成的细菌酶的基因是本发明的目的基因。以下列基因代表这些基因,但不限于下列基因:编码分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶的tyrA基因、编码磷酸葡糖异构酶的pgi基因、编码支链氨基酸氨基转移酶的ilvE基因、编码苏氨酸脱水酶的ilvA和tdcB基因、编码L-苏氨酸脱氨酶的sdaA和sdaB基因、编码N-乙酰谷氨酸合酶的argA基因、编码精氨琥珀酸合酶的argG基因、编码γ-谷氨酰激酶的proB基因、编码高丝氨酸激酶的thrB基因、编码高丝氨酸脱氢酶的基因等。一般而言,编码下述酶的任何基因是本发明的目的基因,所述酶引起因偏离目的L-氨基酸的途径而获得的代谢物的产生和/或涉及副产物的形成。
分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶(同物异名:B2600,TyrA)催化分支酸和预苯酸之间的可逆转化以及预苯酸和对羟苯丙酮酸之间的可逆转化,对羟苯丙酮酸是酪氨酸生物合成途径中的中间产物。分支酸转化是酪氨酸和苯丙氨酸两者的生物合成中的第一步。通过ssrA标记修饰该TyrA蛋白质可以用于降低预苯酸到L-酪氨酸生物合成途径的通量,并增强L-苯丙氨酸的产生。可以通过以下方法来测量分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶的活性:在2.5mM分支酸的存在下使用停时测定法(stopped-time assay)或者通过在用0.8%琼脂糖制备的平板中的酶-抗体复合物的免疫扩散分析(Rood J.I.,Perrot B.et al.,Eur J Biochem.;124,513-519(1982))。已阐明了编码来自大肠杆菌的分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶的野生型tyrA基因(同物异名:ECK2597,b2600)。该tyrA基因(与GenBank登记号NC_000913.2,gi:49175990的序列中从2736970至2738091的核苷酸互补的核苷酸)位于大肠杆菌K-12的染色体上的pheA和aroF基因之间。来自大肠杆菌的tyrA基因示于SEQ ID NO:3,而tyrA基因编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO:4。
在苯丙氨酸的生物合成途径中,预苯酸和苯丙酮酸之间的可逆转化由分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶(同物异名:B2599,PheA)催化,其亚单位由大肠杆菌中的pheA基因(同物异名:ECK2596,b2599)编码。pheA基因(在GenBank登记号NC_000913.2,gi:49175990的序列中从2735767至2736927的核苷酸)位于大肠杆菌K-12的染色体上的pheA基因前导肽和tyrA基因之间。来自大肠杆菌的pheA基因示于SEQ ID NO:5,而pheA基因编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO:6。通过ssrA标记对TyrA和PheA蛋白质的同时修饰可以用于降低分支酸到L-酪氨酸和L-酪氨酸生物合成途径的通量,并且 增强L-苯丙氨酸的产生。
磷酸葡糖异构酶(同物异名:B4025,Pgi,葡萄糖-6-磷酸异构酶,D-葡萄糖-6-磷酸-酮醇-异构酶)催化在糖异生和糖酵解途径中的β-D-葡萄糖-6-磷酸和D-果糖-6-磷酸之间的可逆转化。降低磷酸葡糖异构酶的活性导致碳通量的重新分配,其有利于戊糖磷酸途径,其中产生组氨酸前体代谢物5-磷酸核糖-1-焦磷酸。可以通过例如Friedberg I.(J Bacteriol.,112,3:1201-1205(1972))描述的方法,在偶联的测定中通过使用G6P脱氢酶(Winkler H.H.,JBacteriol.,101,2:470-475(1970))来检测磷酸葡糖异构酶的活性。已阐明了编码来自大肠杆菌的葡萄糖-6-磷酸异构酶的野生型pgi基因(同物异名:ECK4017,b4025)。pgi基因(在GenBank登记号NC_000913.2,gi:49175990的序列中从4,231,781至4,233,430的核苷酸)位于大肠杆菌K-12的染色体上的lysC和yjbE基因之间。来自大肠杆菌的pgi基因示于SEQ ID NO:7,而由pgi基因编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO:8。
支链氨基酸氨基转移酶(同物异名:B3770,IlvE)催化一系列转氨基反应,每种转氨基反应产生α-酮戊二酸和三种脂肪族支链氨基酸之一。通过ssrA标记来修饰IlvE蛋白质可以用于降低2-酮异戊酸到L-缬氨酸生物合成途径的通量,这也导致降低了作为副产物的L-异亮氨酸的量并且增强了L-亮氨酸的产生。可以通过例如在Lee-Peng FC等(J.Bacteriol.,139(2);339-45(1979))中描述的方法来测量支链氨基酸氨基转移酶的活性。已阐明了编码来自大肠杆菌的支链氨基酸氨基转移酶的野生型ilvE基因(同物异名:ECK3762,b3770,苏氨酸脱氨酶,L-苏氨酸水解酶)。ilvE基因(在GenBank登记号NC_000913.2,gi:49175990的序列中从3,950,507至3,951,436的核苷酸)位于大肠杆菌K-12的染色体上的ilvM和ilvD基因之间。
苏氨酸脱水酶(同物异名:B3772,Ile,IlvA)催化L-苏氨酸的脱氨基作用。通过ssrA标记来修饰IlvA蛋白质可以用于预防L-苏氨酸降解和降低L-苏氨酸到L-异亮氨酸生物合成途径的通量,也能用于L-精氨酸产生。可以通过例如在Eisenstein,E(J.Biol.Chem.,266(9);5801-7(1991))中描述的方法来测量苏氨酸脱水酶的活性。已阐明了编码来自大肠杆菌的苏氨酸脱水酶的野生型ilvA基因(同物异名:ECK3764,b3772,ile)。ilvA基因(在GenBank登记号NC_000913.2,gi:49175990的序列中从3,953,354至3,954,898的核苷酸)位于大肠杆菌K-12的染色体上的ilvD和ilvY基因之间。
苏氨酸脱水酶(同物异名:B3117,Tdc,TdcB,苏氨酸脱氨酶,L-丝氨酸脱水酶,丝氨酸脱氨酶,L-苏氨酸水解酶)催化L-苏氨酸的脱氨基作用。通过ssrA标记来修饰TdcB蛋白质可以用于预防L-苏氨酸降解和降低L-苏氨酸到L-异亮氨酸生物合成途径的通量。已阐明了编码来自大肠杆菌的苏氨酸脱水酶的野生型tdcB基因(同物异名:ECK3106,b3117,tdc)。tdcB基因(与在GenBank登记号NC_000913.2,gi:49175990的序列中从3,263,061至3,264,050的核苷酸互补的核苷酸)位于大肠杆菌K-12的染色体上的tdcC和tdcA基因之间。
苏氨酸脱氨酶SdaA(同物异名:B1814,SdaA,SDH1,L-SD,L-苏氨酸脱氨酶I,L-丝氨酸脱水酶1,SDH-1,L-SD1,L-羟基氨基酸脱水酶1,L-丝氨酸脱氨酶1,L-丝氨酸水解酶1)和SdaB(同物异名:B2797,SdaB,L-苏氨酸脱氨酶II,L-丝氨酸脱氨酶2,L-丝氨酸脱水酶2,SDH-2,L-SD2,L-丝氨酸水解酶2)催化L-苏氨酸的脱氨基作用。通过ssrA标记来修饰苏氨酸脱氨酶可以用于预防L-苏氨酸降解和降低L-苏氨酸到L-异亮氨酸生物合成途径的通量。已阐明了编码来自大肠杆菌的苏氨酸脱氨酶的野生型sdaA基因(同物异名:ECK1812,b1814)和sdaB基因(同物异名:ECK2792,b2797)。sdaA基因(在GenBank登记号NC_000913.2,gi:49175990的序列中从1,894,956至1,896,320的核苷酸)位于大肠杆菌K-12的染色体上的yeaB和yoaD基因之间。sdaB基因(在GenBank登记号NC_000913.2,gi:49175990的序列中从2,927,598至2,928,965的核苷酸)位于大肠杆菌K-12的染色体上的sdaC和xni基因之间。
N-乙酰谷氨酸合酶(同物异名:B2818,ArgA,NAGS,乙酰-CoA:L-谷氨酸N-乙酰转移酶,氨基酸-N-乙酰转移酶)催化从L-谷氨酸和乙酰-CoA合成N-乙酰谷氨酸,其是在精氨酸和鸟氨酸生物合成的超级途径(superpathway)中的第一步。通过ssrA标记来修饰ArgA蛋白质可以用于为L-脯氨酸的产生积累谷氨酸。可以通过例如在Marvil,D.K.和Leisinger,T.(J.Biol.Chem.,252(10);3295-303(1977))中描述的方法来测量N-乙酰谷氨酸合酶的活性。已阐明了编码来自大肠杆菌的N-乙酰谷氨酸合酶的野生型argA基因(同物异名:ECK2814,Arg2,Argl,b2818)。argA基因(在GenBank登记号NC_000913.2,gi:49175990的序列中从2,947,264至2,948,595的核苷酸)位于大肠杆菌K-12的染色体上的amiC和recD基因之间。
精氨琥珀酸合酶(同物异名:B3172,ArgG,精氨琥珀酸合成酶,瓜氨酸-天冬氨酸连接酶,L-瓜氨酸:L-天冬氨酸连接酶)催化从L-天冬氨酸和瓜氨酸合成精氨琥珀酸。通过ssrA标记来修饰ArgG蛋白质可以用于瓜氨酸产生。已阐明了编码来自大肠杆菌的精氨琥珀酸合酶的野生型argG基因(同物异名:ECK3161,b3172)。argG基因(在GenBank登记号NC_000913.2,gi:49175990的序列中从3,316,659至3,318,002的核苷酸)位于大肠杆菌K-12的染色体上的argR和yhbX基因之间。
γ-谷氨酰激酶(同物异名:B0242,ProB,谷氨酸5-激酶,GK,ATP:L-谷氨酸5-磷酸转移酶,G5K)催化谷氨酸磷酸化的反应,其是在脯氨酸合成中的第一反应。通过ssrA标记来修饰ProB蛋白质可以用于为L-精氨酸的产生积累谷氨酸。可以通过例如在Smith,C.J.等(J.Bacteriol.,157(2);545-51(1984))中描述的方法来测量γ-谷氨酰激酶的活性。已阐明了编码来自大肠杆菌的γ-谷氨酰激酶的野生型proB基因(同物异名:ECK0243,pro(2),b0242,pro2)。proB基因(在GenBank登记号NC_000913.2,gi:49175990的序列中从259,612至260,715的核苷酸)位于大肠杆菌K-12的染色体上的phoE和proA基因之间。
高丝氨酸激酶(同物异名:B0003,ThrB,ATP:L-高丝氨酸O-磷酸转移酶)催化高丝氨酸磷酸化的反应。通过ssrA标记来修饰ThrB蛋白质可以用于L-甲硫氨酸产生。可以通过例如在Shames,S.L and Wedler,F.C.(Arch.Biochem.Biophys.,235(2);359-70(1984))中描述的方法来测量高丝氨酸激酶的活性。已阐明了编码来自大肠杆菌的高丝氨酸激酶的野生型thrB基因(同物异名:ECK0003,b0003)。thrB基因(在GenBank登记号NC_000913.2,gi:49175990的序列中从2,801至3,733的核苷酸)位于大肠杆菌K-12的染色体上的thrA和thrC基因之间。
高丝氨酸脱氢酶催化从高丝氨酸形成L-天冬氨酸半醛的反应。在大肠杆菌中,高丝氨酸脱氢酶是由thrA基因编码的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶蛋白质的一部分。但是在其它微生物中,例如棒状杆菌(Corynebacteria)中,高丝氨酸脱氢酶是单独的酶。通过ssrA标记来修饰高丝氨酸脱氢酶可以用于L-赖氨酸产生。
ssrA、tyrA、pheA、pgi、ilvE、ilvA、tdcB、sdaA、sdaB、argA、argG、proB、thrB和其它目的基因可以通过PCR(聚合酶链式反应;参考White,T.J. et al.,Trends Genet.,5,185(1989))获得,使用基于所述基因的已知的核苷酸序列制备的引物。可以以相似的方式获得编码来自其它微生物的标记肽的基因。
可以将上文描述的用于将能够被转录并编码SEQ ID NO:2中所示肽或它的变体的DNA片段附接于编码分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶或者磷酸葡萄糖异构酶的基因的3’末端的技术和教导相似地应用于修饰从其它目的基因转录的其它蛋白质的活性。
本发明的细菌可以通过以下方式获得:将之前提及的DNA导入天然具有产生L-氨基酸能力的细菌。或者,本发明的细菌可以通过以下方式获得:将产生L-氨基酸的能力赋予已经含有所述DNA的细菌。
产生L-氨基酸的细菌
可以在本发明中使用能够产生或是芳香族L-氨基酸或是非芳香族L-氨基酸的细菌。
产生L-苯丙氨酸的细菌
用于得到本发明产生L-苯丙氨酸的细菌的亲株的实例包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株,例如大肠杆菌AJ12739(tyrA::Tn10,tyrR)(VKPMB-8197);含有突变pheA34基因的大肠杆菌HW1089(ATCC55371)(美国专利No.5,354,672);大肠杆菌MWEC101-b(KR8903681);大肠杆菌NRRLB-12141,NRRL B-12145,NRRL B-12146和NRRL B-12147(美国专利No.4,407,952)。此外,作为亲株,可以使用大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAB](FERM BP-3566),大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659),大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662)和称为AJ12604的大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4,pACMAB](FERM BP-3579)(EP488424B1)。另外,也可以使用属于埃希氏菌属的产生L-苯丙氨酸的细菌,其具有增强的由yedA基因或者yddG基因编码的蛋白质活性(美国专利申请2003/0148473A1和2003/0157667A1)。
产生L-组氨酸的细菌
用于得到本发明的产生L-组氨酸的细菌的亲株的实例包括但不限于属 于埃希氏菌属的菌株,例如大肠杆菌菌株24(VKPM B-5945,RU2003677);大肠杆菌菌株80(VKPM B-7270,RU2119536);大肠杆菌NRRL B-12116—B12121(美国专利No.4,388,405);大肠杆菌H-9342(FERM BP-6675)和H-9343(FERM BP-6676)(美国专利No.6,344,347);大肠杆菌H-9341(FERMBP-6674)(EP1085087);大肠杆菌AI80/pFM201(美国专利No.6,258,554)等。
用于得到本发明产生L-组氨酸的细菌的亲株的实例还包括其中将编码L-组氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达增强的菌株。这些基因的实例包括编码ATP磷酸核糖基转移酶(hisG)、磷酸核糖基AMP环化水解酶(hisI)、磷酸核糖基ATP焦磷酸水解酶(hisIE)、磷酸核糖基亚胺甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核糖核苷酸异构酶(hisA)、酰胺转移酶(hisH)、组氨醇磷酸氨基转移酶(hisC)、组氨醇磷酸酶(hisB)、组氨醇脱氢酶(hisD)等的基因。
已知,由hisG和hisBHAFI编码的L-组氨酸生物合成的酶受L-组氨酸的抑制,因此也可以通过以下方式有效地增强产生L-组氨酸的能力:将赋予对反馈抑制的抗性的突变导入ATP磷酸核糖基转移酶(俄罗斯专利Nos.2003677和2119536)。
具有产生L-组氨酸能力的菌株的具体的实例包括:已导入携带编码L-组氨酸生物合成酶的DNA的载体的大肠杆菌FERM-P5038和5048(JP56-005099A),导入了用于氨基酸输出的基因rht的大肠杆菌菌株(EP1016710A),赋予了磺胺胍抗性、DL-1,2,4-三唑-3-丙氨酸抗性和链霉素抗性的大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270,俄罗斯专利No.2119536)等。
产生L-色氨酸的细菌
用于得到本发明产生L-色氨酸的细菌的亲株的实例包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株,例如可使用大肠杆菌JP4735/pMU3028(DSM10122)和大肠杆菌JP6015/pMU91(DSM10123),其在由突变trpS基因编码的色氨酰-tRNA合成酶中有缺陷(美国专利No.5,756,345);大肠杆菌SV164(pGH5),其具有编码不受丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因和编码不受色氨酸反馈抑制的邻氨基苯甲酸合酶的trpE等位基因(美国专利No.6,180,373);大肠杆菌AGX17(pGX44)(NRRLB-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264),其在色氨酸酶中有缺陷(美国专利No.4,371,614);大肠杆菌AGX17/pGX50,pACKG4-pps,其中增强了产生磷酸烯醇丙酮酸的能力 (WO9708333,美国专利No.6,319,696)等。也可以使用属于埃希氏菌属的产生L-色氨酸的菌株,其具有增强的经鉴定的蛋白质的活性,该蛋白质由yedA基因或者yddG基因编码(美国专利申请2003/0148473A1和2003/0157667A1)。
用于得到本发明产生L-色氨酸的细菌的亲株的实例还包括这样的一些菌株,其中增强了选自邻氨基苯甲酸合酶、磷酸甘油酸脱氢酶和色氨酸合酶的酶中的一种或多种活性。邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶两者都受到L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制,因此可以将脱敏该反馈抑制的突变导入这些酶。具有这种突变的菌株的具体实例包括含有脱敏的邻氨基苯甲酸合酶的大肠杆菌SV164和通过将质粒pGH5导入大肠杆菌SV164而获得的转化体菌株(WO94/08031),质粒pGH5含有编码反馈脱敏的磷酸甘油酸脱氢酶的突变serA基因。
用于得到本发明产生L-色氨酸的细菌的亲株的实例还包括这样的一些菌株,已向这些菌株中导入了含有编码脱敏的邻氨基苯甲酸合酶的基因的色氨酸操纵子(JP57-71397A,JP62-244382A,美国专利No.4,371,614)。另外,通过增强色氨酸操纵子(trpBA)中的编码色氨酸合酶的基因的表达可以赋予产生L-色氨酸的能力。色氨酸合酶由分别通过trpA和trpB基因编码的α亚基和β亚基构成。另外,通过增强异柠檬酸裂合酶-苹果酸合酶操纵子的表达可以改进产生L-色氨酸的能力(WO2005/103275)。
产生L-缬氨酸的细菌
用于得到本发明产生L-缬氨酸的细菌的亲株的实例包括但不限于,已经过修饰以过表达ilvGMEDA操纵子的菌株(美国专利No.5,998,178)。理想的是去除弱化所需要的ilvGMEDA操纵子的区域,从而使产生的L-缬氨酸不弱化该操纵子的表达。另外,期望地破坏在该操纵子中的ilvA基因,从而降低苏氨酸脱氨酶活性。
用于得到本发明产生L-缬氨酸的细菌的亲株的实例也包括具有氨酰t-RNA合成酶的突变的突变株(美国专利No.5,658,766)。例如,可以使用大肠杆菌VL1970,其在编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突变。已于1988年6月24日以登录号VKPM B-4411将大肠杆菌VL1970保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms)(VKPM)(俄罗斯,117545莫斯科,1stDorozhny Proezd,1)。
另外,也可以使用需要硫辛酸用于生长和/或缺乏H+-ATPase的突变株作为亲株(WO96/06926)。
产生L-异亮氨酸的细菌
用于得到本发明产生L-异亮氨酸的细菌的亲株的实例包括但不限于以下突变株:具有针对6-二甲氨基嘌呤的抗性的突变株(JP5-304969A),具有针对异亮氨酸类似物,如硫代异亮氨酸(thiaisoleucine)和异亮氨酸氧肟酸盐的抗性的突变株,和额外地具有针对DL-乙硫氨酸和/或精氨酸氧肟酸盐的抗性的突变株(JP5-130882A)。另外,也可以将使用在L-亮氨酸生物合成中涉及的蛋白的编码基因转化的重组菌株作为亲株,所述蛋白例如苏氨酸脱氨酶和乙酰氧肟酸合酶(acetohydroxate synthase)(JP2-458A,FR0356739,和美国专利No.5,998,178)。
产生L-亮氨酸的细菌
用于得到本发明产生L-亮氨酸的细菌的亲株的实例包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株,例如针对亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌株(例如,菌株57(VKPM B-7386,美国专利No.6,124,121))或者针对包括β-2-噻吩丙氨酸、3-羟基亮氨酸、4-氮亮氨酸、5,5,5-三氟亮氨酸的亮氨酸类似物有抗性的大肠杆菌菌株(JP62-34397B和JP8-70879A);通过在WO96/06926中描述的基因工程方法来获得的大肠杆菌菌株;大肠杆菌H-9068(JP8-70879A)等。
通过增强在L-亮氨酸生物合成中涉及的一种或多种基因的表达可以改进本发明的细菌。实例包括leuABCD操纵子的基因,其优选地以编码异丙基苹果酸合酶的突变leuA基因来代表,该异丙基苹果酸合酶不受L-亮氨酸的反馈抑制(美国专利6,403,342)。另外,可以通过增强编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白质的一种或多种基因的表达来改进本发明的细菌。这些基因的实例包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041A2)。
产生L-精氨酸的细菌
用于得到本发明产生L-精氨酸的细菌的亲株的实例包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株,例如大肠杆菌菌株237(VKPM B-7925)(美国专利申请 2002/058315A1)和含有突变的N-乙酰谷氨酸合酶的它的衍生菌株(俄罗斯专利申请No.2001112869),大肠杆菌菌株382(VKPM B-7926)(EP1170358A1),将编码N-乙酰谷氨酸合成酶的argA基因导入其中的产生精氨酸的菌株(EP1170361A1)等。
用于得到本发明产生L-精氨酸的细菌的亲株的实例也包括这些菌株,其中增强了编码L-精氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达。这些基因的实例包括编码以下这些酶的基因:N-乙酰谷氨酰基磷酸还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)、鸟氨酸氨甲酰转移酶(argF)、精氨琥珀酸合成酶(argG)、精氨琥珀酸裂合酶(argH)和氨甲酰磷酸合成酶(carAB)。
产生L-瓜氨酸的细菌
用于得到本发明产生L-瓜氨酸的细菌的亲株的实例包括但不限于,属于埃希氏菌属的菌株,其含有突变的抗反馈的氨甲酰磷酸合成酶(美国专利6,991,924),和类似的菌株。
2.本发明的方法
本发明的方法是通过以下方式产生L-氨基酸的方法:在培养基中培养本发明的细菌以产生L-氨基酸并将其分泌到该培养基中,然后从该培养基收集该L-氨基酸。
在本发明中,可以按照与使用细菌来产生氨基酸的常规发酵法相似的方式进行L-氨基酸的培养、收集和从该培养基纯化等。
用于培养的培养基可以或是合成培养基或是天然培养基,只要该培养基包括碳源和氮源和矿物质,如有需要,还包括细菌生长所需的合适量的营养物。碳源可以包括各种碳水化合物,例如葡萄糖和蔗糖和各种有机酸。依赖于使用的微生物的同化模式,可以使用醇,包括乙醇和丙三醇。作为氮源,可以使用各种铵盐例如氨水和硫酸铵,其它氮化合物例如胺,天然氮源例如蛋白胨、大豆水解物,以及消化的发酵微生物。作为矿物质,可以使用磷酸二氢钾或磷酸氢二钾(potassium monophosphate or potassiumdiphosphate)、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙等。作为维生素,可以使用硫胺素、酵母提取物等。
优选在以下条件进行培养:在有氧条件下,例如振荡培养和带有通气的搅拌培养;在20至40℃,优选30至38℃的温度。培养的pH通常为5-9,优选6.5-7.2。用氨水、碳酸钙、各种酸、各种碱和缓冲液调整培养物的pH。通常,1至5天培养导致目的氨基酸在液体培养基中的积累。
培养后,通过离心或膜过滤来将固体例如细胞从液体培养基去除,然后可以通过离子交换、浓缩和/或结晶方法来收集并纯化L-氨基酸。
通过本发明的方法产生的苯丙氨酸可以用于例如产生α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯(也称作“阿司帕坦(aspartame)”)。就是说,本发明的方法包括通过使用L-苯丙氨酸作为原料来产生α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯。本方法包括从L-苯丙氨酸和天冬氨酸或它的衍生物合成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯,所述L-苯丙氨酸通过如上文所述的本发明的方法来产生。作为低级烷基酯,可以提到的是甲酯、乙酯和丙酯等。
在本发明的方法中,用于从L-苯丙氨酸和天冬氨酸或它的衍生物合成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯的方法不受特别地限制,并且可以采用任何常规的方法,只要能够将L-苯丙氨酸或它的衍生物用于合成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯。具体地,例如可以通过以下方法(美国专利No.3,786,039)来产生α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯。将L-苯丙氨酸酯化以获得L-苯丙氨酸的低级烷基酯。然后将该L-苯丙氨酸烷基酯与氨基和β羧基受到保护的L-天冬氨酸衍生物反应,并且将α-羧基酯化以活化。该衍生物包括N-酰基-L-天冬氨酸酐,例如N-甲酰-L-天冬氨酸酐、N-苄氧羰基-L-天冬氨酸酐或者N-对甲氧基苄氧羰基-L-天冬氨酸酐。通过缩合反应,获得N-酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸和N-酰基-β-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的混合物。如果该缩合反应是在于37℃时具有10-4或更小的酸解离常数的有机酸存在下进行,那么该混合物中的α形式对β形式的比例将增加(日本专利特许公开No.51-113841)。然后,将N-酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸从该混合物分离,接着进行氢化以获得α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸。
实施例
以下将参考下列非限制性实施例来更加具体地说明本发明。
实施例1.含有突变的tyrA-ssrA基因的大肠杆菌菌株MG1655ΔtyrRtyrA-ssrA的构建
1.用突变tyrA-ssrA基因取代大肠杆菌中天然的pheA基因和位于tyrA基因区的3’末端的36-nt。
为了取代天然的pheA基因和位于tyrA基因区的3’末端的36-nt,通过Datsenko K.A.和Wanner B.L(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97,6640-6645)描述的也被称为“Red介导的整合”和/或“Red驱动的整合”的方法将DNA片段整合到大肠杆菌MG1655 ΔtyrR的染色体中,替代天然的pheA基因和3’末端tyrA基因区,所述DNA片段带有1)位于pheA基因的5’末端的36-nt,2)具有attL和attR位点的cat基因,3)编码氯霉素抗性标记(CmR)的DNA片段,4)终止密码子TAA,5)位于ssrA基因的90至119位的30-nt,和6)位于tyrA基因的3’末端的36-nt(图1)。
在两次连续PCR运行(runs)中获得这种DNA片段,其中使用来自第一次PCR的5μl扩增产物作为第二次PCR的模板。
通过PCR,使用引物P1(SEQ ID NO:9)和引物P2(SEQ ID NO:10)和作为模板的质粒pMW118-attL-Cm-attR(WO05/010175)(图2)来获得含有由cat基因编码的CmR标记的该第一DNA片段。引物P1含有与位于pheA基因的5’末端的36-nt区相同的区和与pMW118-attL-Cm-attR的27-nt attL区互补的区。引物P2含有与ssrA基因的30-nt区相同的区和与pMW118-attL-Cm-attR的27-nt attR区互补的区。在这两区之间,将终止密码子TAA插入引物P2。PCR条件如下:95℃变性5分钟;30个循环的设定方案:在95℃30秒,在50℃30秒,在72℃1分钟;最终步骤:在72℃5分钟。
获得了1709-bp PCR产物,并将其在琼脂糖凝胶中纯化,并将5μl这种产物用作第二次PCR反应的模板,使用引物P1(SEQ ID NO:9)和引物P3(SEQ ID NO:11)。引物P3含有与位于tyrA基因的3’末端的36-nt区互补的区和与位于引物P2的5’末端的18-nt区相同的区。PCR条件如下:95℃变性5分钟;30个循环的设定方案:在95℃30秒,在50℃30秒,在72℃1分钟;最终步骤:在72℃5分钟。
获得了1745-bp PCR产物,并将其在琼脂糖凝胶中纯化,然后将其用于电穿孔大肠杆菌菌株MG1655ΔtyrR,该菌株含有具有温度敏感性复制起 点的质粒pKD46。质粒pKD46(Datsenko,K.A.and Wanner,B.L,Proc·Natl·Acad.Sci.USA,2000,97:12:6640-45)包括噬菌体λ的2,154个核苷酸的DNA片段(核苷酸位置31088至33241,GenBank登录号J02459),并含有在阿拉伯糖可诱导的ParaB启动子控制下的λRed同源重组系统的基因(γ基因、β基因、exo基因)。质粒pKD46是PCR产物整合入大肠杆菌菌株MG1655ΔtyrR的染色体替代天然pheA基因和位于tyrA基因区的3’末端的36-nt所必需的。
如下制备电感受态细胞:将大肠杆菌MG1655ΔtyrR/pKD46在含有氨苄青霉素(100mg/l)的LB培养基中于30℃培养过夜,然后用含有氨苄青霉素和L-阿拉伯糖(10mM)(将阿拉伯糖用于诱导编码Red系统基因的质粒)的5ml SOB培养基(Sambrook et al,“Molecular Cloning:A Laboratory Mannual,Second Edition”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)将该培养物稀释100倍。将细胞在30℃通气培养至OD600约0.6,然后通过浓缩100倍并用冰冷的去离子H2O洗涤3次来使细胞成为电感受态。使用70μl细胞和约100ng所述PCR产物来进行电穿孔。根据制造商的说明,使用“BioRad”电穿孔仪(USA,No.165-2098,版本2-89)来完成电转化。用1ml SOC培养基(Sambrook et al,“Molecular Cloning:A Laboratory Mannual,Second Edition”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)稀释电激的(shocked)细胞,在37℃培养2小时,然后涂布在含有氯霉素(20μg/ml)的L-琼脂上并在37℃培养以选择CmR重组体。
2.通过PCR证实pheA基因缺失
培养24小时后,通过PCR使用基因座特异性的引物P4(SEQ ID NO:12)和P5(SEQ ID NO:13)来检验菌落的CmR标记的存在。为了这个目的,将新近分离的菌落悬浮在水(20μl)中并将1μl获得的悬液用于PCR。温度设定方案如下:在95℃初始DNA变性5分钟;然后30个循环(在95℃变性30秒,在50℃退火30秒,并在72℃延伸1分10秒),并且在72℃最终延伸5分钟。
检测的少数CmR菌落含有需要的2373-bp DNA片段,确认了用杂合tyrA-ssrA基因取代了pheA基因的1869-bp天然区(参见图1和3)。将所得的突变菌株命名为MG1655ΔtyrRΔpheA::cattyrA-ssrA。
3.用野生型pheA基因取代在大肠杆菌MG1655ΔtyrRΔpheA::cattyrA-ssrA菌株中的cat基因
为了取代cat基因,将携带野生型pheA基因的DNA片段整合入大肠杆菌MG1655ΔtyrRΔpheA::cat tyrA-ssrA/pKD46的染色体替代cat基因,其通过Datsenko,K.A.and Wanner,B.L.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97,6640-6645)描述的也称为“Red-介导的整合”和/或“Red-驱动的整合”方法,也在实施例1(图3.)中描述了该方法。
使用大肠杆菌MG1655的染色体DNA作为模板,以及引物P4(SEQ IDNO:12)和引物P6(SEQ ID NO:14)通过PCR来获得野生型pheA基因。
引物P6含有与位于具有终止密码子TTA的ssrA基因的90至119位的区相同的30-nt区和与位于pheA基因的3’末端的19-nt区互补的区。
PCR条件如下:95℃变性5分钟;30个循环的设定方案:在95℃30秒,在50℃30秒,在72℃1分钟;最终步骤:在72℃5分钟。
将扩增的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳来纯化,使用“GenElute旋转柱(GenElute Spin Colomn)”(“Sigma”,USA)来提取并且通过乙醇来沉淀。将获得的DNA片段用于电穿孔并且如前所述Red介导整合入大肠杆菌MG1655ΔtyrRΔpheA::cattyrA-ssrA/pKD46的细菌染色体。在基本培养基M9上选择所得大肠杆菌菌株MG1655ΔtyrRtyrA-ssrA/pKD46。在该培养基中L-苯丙氨酸的缺失使得能够选择带有原养性质的Phe+的菌落。
4.通过PCR证实pheA基因重建(reconstruction)
培养24小时后,使用基因座特异性的引物P4(SEQ ID NO:12)和P5(SEQID NO:13)通过PCR来检测pheA基因的存在。为了这种目的,将新近分离的菌落悬浮在水(20μl)中并将1μl获得的悬液用于PCR。温度设定方案如下:在95℃初始DNA变性5分钟;然后30个循环(在95℃变性30秒,在50℃退火30秒,并在72℃延伸1分10秒),并且在72℃最终延伸5分钟。
检测的少数Phe+菌落含有需要的1827-bp DNA片段,确认了用pheA基因取代了cat基因的2373bp区(参见图2)。将所得突变菌株命名为MG1655ΔtyrR tyrA-ssrA/pKD46(图4)。
然后,为了消除pKD46质粒,在带有Cm的L-琼脂上于42℃进行了两 次传代(passage),并且检测出现的菌落对氨苄青霉素的敏感性。
因此,获得了带有突变tyrA基因并且缺失tyrR基因的菌株。将这种菌株命名为MG1655 ΔtyrRtyrA-ssrA。
实施例2.用ssrA标记tyrA基因对产生L-苯丙氨酸的影响
然后在营养肉汤(nutrient broth)中将大肠杆菌菌株MG1655 ΔtyrRtyrA-ssrA和MG1655ΔtyrR各自于37℃培养18小时,并且将0.3ml每种这些培养物接种于20x200mm试管中的3ml发酵培养基并且用旋转式摇床在32℃培养72小时,所述发酵培养基具有下列组成。
培养后,通过TLC来确定在培养基中的L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的积累量。对使用等分试样(1-2μl)的培养液点样的薄层硅胶板(10x15cm)用显影溶剂(2-丙醇:乙酸乙酯:氨水:水=16:16:3:9)显影并且用茚三酮试剂来检测L-苯丙氨酸和L-酪氨酸。将四管发酵的结果显示在表1中。
发酵培养基(g/l)的组成如下:
葡萄糖 40.0
(NH4)2SO4 16.0
K2HPO4 1.0
MgSO4·7H2O 1.0
MnSO4·5H2O 0.01
FeSO4·7H2O 0.01
酵母提取物 2.0
CaCO3 30.0
将MgSO4·7H2O和CaCO3各自单独地灭菌。
从表1可以看出,相比MG1655 ΔtyrR,MG1655 ΔtyrR tyrA-ssrA引起了更高量的L-苯丙氨酸的积累和更低量的L-酪氨酸的积累。
实施例3.用ssrA标记pgi基因对产生L-组氨酸的影响
获得了带有用肽SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:15标记的pgi基因的产生L-组氨酸的菌株。这两种肽的区别在于一个末端氨基酸残基的取代,该残基或者是丙氨酸或者是缬氨酸。如下获得这些菌株。首先,使用大肠杆菌菌株MG1655的染色体DNA,并且分别使用引物pgil(SEQ ID NO:16)和 pgi-LAA(SEQ ID NO:17)或者pgil(SEQ ID NO:16)和pgiLVA(SEQ IDNO:18),通过PCR获得了基因3’-末端含有编码肽SEQ ID NO:2或者SEQ IDNO:15的额外核苷酸序列的pgi基因的两种变体。引物pgil与pgi基因的5’末端互补并且在它的5’末端含有SacI限制性位点。引物pgi-LVA和pgi-LAA含有减去了终止密码子的pgi基因的3’末端区,分别编码短肽SEQ ID NO:2或者SEQ ID NO:15的区,终止密码子,和在它们的5’末端的XbaI限制性位点。其次,将两种PCR片段分别用SacI和XbaI限制酶来处理并且连接到之前已用相同的限制酶处理的pMW119质粒中。将所得质粒分别命名为pMW-pgi-ssrALAA和pMWpgi-ssrALVA。
然后,在产生L-组氨酸的菌株80中使野生型pgi基因缺失。
为了这种目的,使用引物P7(SEQ ID NO:19)和P8(SEQ ID NO:20),以及作为模板的质粒pMW118-attL-Cm-attR(WO05/010175)通过PCR获得了含有由cat基因编码的CmR标记的DNA片段(图2)。引物P7含有与位于pgi基因的5’末端的36-nt区相同的区和与pMW118-attL-Cm-attR的28-nt attR区互补的区。引物P8含有与位于pgi基因的3’末端36-nt区相同的区和与pMW118-attL-Cm-attR的28-nt attL区互补的区。如上所述来进行获得的DNA片段的PCR和电穿孔(参见实施例1,部分1)。
使用基因座特异性的引物P9(SEQ ID NO:21)和P10(SEQ ID NO:22)通过PCR来证实pgi基因的缺失。为了这种目的,将新近分离的菌落悬浮在水(20μl)中并将1μl这种悬液用于PCR。温度设定方案如下:在95℃初始DNA变性5分钟;然后30个循环(在95℃变性30秒,在50℃退火30秒,并在72℃延伸1分10秒),并且在72℃最终延伸5分钟。
检测的少数CmR菌落含有需要的1709-bp DNA片段,确认了用cat基因取代了pgi基因的1651-bp天然区。将所得突变菌株命名为80Δpgi。
如上所述,用质粒pMW-pgi-ssrALAA和pMWpgi-ssrALVA来转化获得的菌株80Δpgi。将所得菌株分别命名为80Δpgi/pMW-pgi-ssrALAA和80Δpgi/pMWpgi-ssrALVA。
为了小罐(mini-jar)分批发酵,将培养在L-琼脂上的一接种环的每种菌株80、80Δpgi/pMW-pgi-ssrALAA和80Δpgi/pMWpgi-ssrALVA转移至L-培养液,并在30℃旋转(140rpm)培养以达到培养物的光密度OD540约为2.0。然后将25ml种子培养物加入250ml发酵培养基并在29℃旋转(1500rpm)培 养。分批发酵的持续时间大约是35-40小时。培养后,通过纸层析来确定已在培养基中积累的组氨酸的量。用流动相:正丁醇:乙酸:水=4:1:1(体积/体积)来显影该纸。将在茚三酮的丙酮溶液(0.5%)用作显示试剂(visualizingreagent)。将这些结果在表2中显示。从表2中可以看出,相对于菌株80,80Δpgi/pMW-pgi-ssrALAA和80Δpgi/pMWpgi-ssrALVA引起了更高量的L-组氨酸的积累。
发酵培养基的组成(pH6.0)(g/l):
葡萄糖 50.0
豆浓(Mameno) 0.2的TN
(NH4)2SO4 8.0
KH2PO4 0.5
MgSO4·7H2O 0.4
FeSO4·7H2O 0.02
MnSO4 0.02
硫胺素 0.001
甜菜碱(Betaine) 2.0
L-脯氨酸 0.8
L-谷氨酸 3.0
L-天冬氨酸 1.0
腺苷(Adenosine) 0.2
虽然已参考其优选的实施方案详细地描述了本发明,但是对本领域的技术人员明显的是,可以在不背离本发明范围的前提下进行各种变化和使用等同物。这里所有引用的参考文献作为本申请的一部分并入作为参考。
表1
菌株 | OD540 | Phe,g/l | Tyr,g/l |
MG1655ΔtyrRMG1655ΔtyrR tyrA-ssrA | 28.5±0.626.3±0.4 | 0.13±0.010.46±0.04 | 0.017±0.002痕量 |
[0167] 表2
菌株 | OD450 | 组氨酸的量,g/l | 每葡萄糖的产率,% |
80(VKPM B-7270)80Δpgi80Δpgi/pMW-pgi-ssrALAA80Δpgi/pMW-pgi-ssrALVA | 31.020.223.222.8 | 9.08.110.710.6 | 18.016.221.421.2 |
[0169] 序列表
<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.,Inc.)
<120>使用肠杆菌科的细菌产生氨基酸的方法
<130>ssrA
<160>22
<170>PatentIn version3.1
<210>1
<211>363
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>1
<210>2
<211>11
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>2
<210>3
<211>1122
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
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<223>tyrA
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<212>PRT
<213>大肠杆菌
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<210>5
<211>1161
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1161)
<223>pheA
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<210>6
<211>386
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>6
<210>7
<211>1650
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1650)
<223>
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<211>549
<212>PRT
<213>大肠杆菌
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<213>人工序列:引物P1
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<212>DNA
<213>人工序列:引物P5
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<212>DNA
<213>人工序列:引物P6
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<211>11
<212>PRT
<213>大肠杆菌
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<212>DNA
<213>人工序列:引物pgil
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<212>DNA
<213>人工序列:引物pgi-LVA
<400>17
<210>18
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列:引物pgi-LAA
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<210>19
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<212>DNA
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列:引物P9
<400>22
Claims (10)
1.一种肠杆菌科的产生L-氨基酸的细菌,其包含DNA,所述DNA由如下组成:
A)编码影响L-氢基酸生物合成的细菌酶的基因,其为tyrA或pgi,和
B)能够被转录并且编码SEQ ID NO:2的肽或者SEQ ID NO:15的DNA片段,其中将所述片段附接于所述基因,在所述基因的3’末端,
其中所述细菌是大肠杆菌(Escherichia coli),
且其中如果所述基因是tryA,则所述L-氨基酸是L-苯丙氨酸,且如果所述基因是pgi,则所述L-氨基酸是L-组氨酸。
2.根据权利要求1的细菌,其中所述细菌是产生L-苯丙氨酸的细菌。
3.根据权利要求2的细菌,其中该酶是分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶。
4.根据权利要求1的细菌,其中所述细菌是产生L-组氨酸的细菌。
5.根据权利要求4的细菌,其中该酶是磷酸葡糖异构酶。
6.一种产生L-氨基酸的方法,其包括在培养基中培养根据权利要求1至5中任一项的细菌,并且从该培养基分离该L-氨基酸,其中如果所述基因是tryA,则所述L-氨基酸是L-苯丙氨酸,且如果所述基因是pgi,则所述L-氨基酸是L-组氨酸。
7.根据权利要求6的方法,其中所述L-氨基酸是L-苯丙氨酸。
8.根据权利要求6的方法,其中所述L-氨基酸是L-组氨酸。
9.一种产生α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯的方法,其包括在培养基中培养根据权利要求2或3的细菌以在培养基中产生并积累L-苯丙氨酸,并且自天冬氨酸或它的衍生物和所述获得的L-苯丙氨酸合成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯,其中所述天冬氨酸的衍生物为N-酰基-L-天冬氨酸酐。
10.根据权利要求9的方法,其进一步包括:酯化L-苯丙氨酸以产生L-苯丙氨酸的低级烷基酯,将该L-苯丙氨酸的低级烷基酯和天冬氨酸衍生物缩合,其中所述衍生物是N-酰基-L-天冬氨酸酐,从该反应混合物中分离N-酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯,并且氢化该N-酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯以产生α-L-天冬酰胺-L-苯丙氨酸的低级烷基酯。
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