CN101107355A - 使用具有破坏的糖原生物合成途径的肠杆菌科细菌产生l-氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供使用肠杆菌科的细菌，尤其是属于埃希氏菌属或泛菌属、具有破坏的糖原生物合成途径的细菌产生L－氨基酸的方法。
Description
技术领域
本发明涉及微生物工业，并且具体涉及使用肠杆菌科(Enterobacteriaceaefamily)的细菌产生L-氨基酸的方法，该细菌中糖原生物合成途径(glycogenbiosynthesis pathway)已被破坏。
背景技术
糖原代表了大肠杆菌(Escherichia coli)和许多其它原核生物贮藏的碳的主要形式，并且提供用于保持能量的容易代谢的底物。大肠杆菌中糖原的积累与生长速率是反相关的，并且当细胞进入稳定期时最活跃地发生。在这些条件下三种生物合成酶的水平经历相应的改变，意味着酶生物合成的遗传控制可占调控的至少一部分(Preiss，J.，Annu.Rev.Microbiol.38，419-458(1984))。在大肠杆菌中，糖原生物合成的结构基因簇集在相邻的操纵子glgBX和glgCAP上。有趣的是，糖原生物合成基因(glgCA)和降解基因(glgP)一起位于簇中，可能促进这些系统的体内调控(Romeo，T.，Gene.70(2)，363-76(1988))。glgC基因是葡糖-1-磷酸腺苷酰转移酶(glucose-1-phosphate adenylyltransferase)的结构基因。葡糖-1-磷酸腺苷酰转移酶的同义词是ADP-葡糖合酶、ADP-葡糖焦磷酸化酶、ADP：a-D-葡糖-1-磷酸腺苷酰转移酶、GlgC蛋白。
葡糖-1-磷酸腺苷酰转移酶(EC 2.7.7.27)是真细菌的糖原生物合成途径中的别构酶(allosteric enzyme)。在肠细菌中，葡糖-1-磷酸腺苷酰转移酶由糖酵解中间物调控，用1，6-二磷酸果糖作为活化剂，以及AMP、ADP和Pi作为抑制剂。所述酶催化从葡糖1-磷酸和ATP合成ADP葡萄糖和PPi。该反应是细菌糖原生物合成中第一个独特的步骤。
已知大肠杆菌的碳贮藏调控系统控制涉及糖代谢和细胞运动性(motility)的基因的表达。CsrA与glgCAP转录物的结合通过促进glgCAP mRNA衰变(decay)来抑制糖原代谢。CsrB RNA通过隔离CsrA蛋白并且阻止该蛋白的作用来起到CsrA拮抗物的作用(Baker，C.S.et al，Mol.Microbiol.，44(6)，1599-610(2002))。
glgCAP操纵子处于环腺苷酸(cAMP)和环腺苷酸受体蛋白(CRP)的正控制下。编码腺苷酸环化酶(EC 4.6.1.1)的cya基因和编码CRP的crp基因二者均是糖原的最优合成所必需的(Fletterick，R.J.and Madsen，N.B.，Annu.Rev.Biochem.，49，31-61(1980))。CRP结合至位于glgC基因上游的位点。大肠杆菌中的糖原合成还由ppGpp正调节，其刺激glgCAP操纵子的转录(Preiss.J.，and Romeo，T.，Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.47，299-329(1994))。
通过使用mini-Mu随机染色体文库和对于糖原超量产生的筛选，鉴定了涉及糖原合成的新基因(glgS)(Hengge-Aronis，R.and Fischer，D.，MolMicrobiol.6，14，1877-86(1992))。还显示大肠杆菌蛋白质GlgS在对饥饿胁迫的应答中被上调，并且显示它的过量表达刺激糖原合成(Kozlov，G.et al，BMCBiol.，2，1，10(2004))。
糖酵解生物合成的初始底物是葡糖-1-P，其得自葡糖-6-P，所以所述途径与糖酵解竞争葡糖-6-P。但是目前，还没有将glgBX和/或glgCAP操纵子失活或将glgS基因失活用于产生L-氨基酸的报道。
发明内容
本发明的目的包括增强产生L-氨基酸的菌株的生产力(productivity)和提供使用这些菌株产生L-氨基酸的方法。
上述目的通过发现将glgBX和/或glgCAP操纵子失活能够增强L-氨基酸的产生来实现，所述L-氨基酸例如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-半胱氨酸、L-亮氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸。
本发明提供产生氨基酸的能力增加的肠杆菌科的细菌，所述氨基酸如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-半胱氨酸、L-亮氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸。
本发明的目的是提供肠杆菌科的产生L-氨基酸的细菌，其中已将所述细菌修饰以破坏糖原生物合成途径。
本发明的另一个目的是提供如上所述的细菌，其中通过衰减(attenuation)glgBX和/或glgCAP操纵子的表达来破坏糖原生物合成途径。
本发明的另一个目的是提供如上所述的细菌，其中通过将glgBX和/或glgCAP操纵子失活来破坏糖原生物合成途径。
本发明的另一个目的是提供如上所述的细菌，其中通过缺失至少一个选自下组的基因来进行glgBX和/或glgCAP操纵子的失活：glgB、glgX、glgC和glg、glgP，以及它们的组合。
本发明的另一个目的是提供如上所述的细菌，其中通过衰减glgS基因的表达来破坏糖原生物合成途径。
本发明的另一个目的是提供如上所述的细菌，其中通过将glgS基因失活来破坏糖原生物合成途径。
本发明的另一个目的是提供如上所述的细菌，其中该细菌属于埃希氏菌属(Escherichia)。
本发明的另一个目的是提供如上所述的细菌，其中该细菌属于泛菌属(Pantoea)。
本发明的另一个目的是提供如上所述的细菌，其中所述L-氨基酸选自下组：芳族L-氨基酸和非芳族L-氨基酸。
本发明的另一个目的是提供如上所述的细菌，其中所述芳族L-氨基酸选自下组：L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。
本发明的另一个目的是提供如上所述的细菌，其中所述非芳族L-氨基酸选自下组：L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、L-甘氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸。
本发明的另一个目的是提供产生L-氨基酸的方法，起包括：
-在培养基中培养如上所述的细菌以将L-氨基酸产生和分泌到培养基中，和
-从培养基中收集所述L-氨基酸。
本发明的另一个目的是提供如上所述的方法，其中所述L-氨基酸选自下组：芳族L-氨基酸和非芳族L-氨基酸。
本发明的另一个目的是提供如上所述的方法，其中所述芳族L-氨基酸选自下组：L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。
本发明的另一个目的是提供如上所述的方法，其中所述非芳族L-氨基酸选自下组：L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、L-甘氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸。
附图简述
图1显示引物glgCL和glgCR在质粒pACYC184上的相对位置，其用于扩增cat基因。
图2显示含有失活的glgC基因的染色体DNA片段的构建。
图3显示含有失活的glgBX和glgCAP操纵子的染色体DNA片段的构建。
优选实施方案详述
以下对本发明做详细的描述。
1.本发明的细菌
本发明的细菌是肠杆菌科的产生L-氨基酸的细菌，其中已将该细菌修饰从而破坏了糖原生物合成途径。
在本发明中，“产生L-氨基酸的细菌”的意思是这样的细菌，将该细菌培养在培养基中时，其具有将L-氨基酸产生和分泌到培养基中的能力。
本文所用的术语“产生L-氨基酸的细菌”还表示能够在培养基中产生和引起L-氨基酸积累的细菌，其中积累的L-氨基酸的量大于大肠杆菌的野生型或亲本菌株，例如大肠杆菌K-12，并且优选地表示所述微生物能够引起在培养基中积累量不少于0.5g/L，更优选不少于1.0g/L的目标L-氨基酸。术语“L-氨基酸”包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸。
术语“芳族L-氨基酸”包含L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。术语“非芳族L-氨基酸”包含L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、L-甘氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸。L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-半胱氨酸、L-亮氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸是特别优选的。
肠杆菌科包括属于以下属的细菌：埃希氏菌属、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属、光杆状菌属(Photorhabdus)、普罗威登斯菌属(Providencia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、摩根氏菌属(Morganella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)等。具体而言，能使用那些根据NCBI(国家生物技术信息中心)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg？mode＝Tree&id＝1236&lvl＝3&keep＝1&srchmode＝1&unlock)所用分类法归类于肠杆菌科的细菌。属于埃希氏菌属或泛菌属的细菌是优选的。
短语“属于埃希氏菌属的细菌”的意思是根据微生物领域技术人员已知的分类法归类于埃希氏菌属的细菌。本发明中所用的属于埃希氏菌属的细菌的实例包括，但不限于，大肠杆菌(E.coli)。
能够用在本发明中的属于埃希氏菌属的细菌没有具体限制，然而举例来说，由Neidhardt，F.C.等(Escherichia coli and Salmonella typhimurium，AmericanSociety for Microbiology，Washington D.C.，1208，表1)描述的细菌包括在本发明中。
短语“属于泛菌属的细菌”的意思是根据微生物领域技术人员公知的分类法归类于泛菌属的细菌。基于16S rRNA的核苷酸序列分析等，成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)的某些菌种最近被重新分类于成团泛菌(Pantoeaagglomerans)、Pantoea ananatis、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)等(Int.J.Syst.Bacteriol.，43，162-173(1993))。这些菌株包含在“属于泛菌属的细菌”中。
短语“已将细菌修饰以具有破坏的糖原生物合成途径”的意思是已将细菌以这样一种方式修饰，以使修饰的细菌与未修饰的细菌相比具有减少的合成糖原的能力，或不能合成和积累糖原。糖原生物合成途径的破坏可通过衰减基因的表达进行，该基因编码涉及糖原生物合成的酶，例如GlgB、GlgX、GlgC、GlgA、GlgP和GlgS，并且优选地通过将所述基因失活来进行。
短语“衰减glgBX和/或glgCAP操纵子的表达”或“衰减glgS基因的表达”的意思是将目标操纵子或基因以这样一种方式修饰，以使修饰的操纵子或基因编码突变蛋白质，其具有减少的活性。短语“glgBX和/或glgCAP操纵子的失活”或“glgS基因的失活”的意思是，这种修饰的操纵子或基因编码完全失活的蛋白质。也可能由于缺失基因的部分、移动基因阅读框、引入错义/无义突变或修饰基因的邻近区域(包括控制基因表达的序列，例如启动子、增强子、衰减子、核糖体结合位点等)，修饰的DNA区域不能天然地表达该基因。
能够通过使用各种已知的方法，包括Northern印迹、定量RT-PCR等测定从该基因转录的mRNA的量来评估基因表达水平。能够通过已知方法，包括SDS-PAGE继之以免疫印迹测定(Western印迹分析)等来测定由该基因编码的蛋白质的量。
glgC基因编码葡糖-1-磷酸腺苷酰转移酶(同物异名-B3430)。glgC基因(gi：16131304；GenBank登录号NC_000913.2中核苷酸3566056至3567351的互补核苷酸；SEQ ID NO：1)位于大肠杆菌K-12染色体上的glgA和glgX基因之间。glgC基因的核苷酸序列和由glgC基因编码的葡糖-1-磷酸腺苷酰转移酶的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
glgA基因编码糖原合酶(同物异名-B3429)的亚基。glgA基因(核苷酸位置：3,566,056至3,564,623；GenBank登录号NC_000913.2；gi：49175990)位于大肠杆菌K-12染色体上的glgP和glgC基因之间。glgA基因的核苷酸序列和由glgA基因编码的糖原合酶亚基的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。
glgP基因编码糖原磷酸化酶/糖原-麦芽四糖磷酸化酶(glycogen-maltotetraose phosphorylase)(同物异名-B3428、GlgY)的亚基。glgP基因(核苷酸位置：3,564,604至3,562,157；GenBank登录号NC_000913.2；gi：49175990)位于大肠杆菌K-12染色体上的yzgL和glgA基因之间。glgP基因的核苷酸序列和由glgP基因编码的糖原磷酸化酶/糖原-麦芽四糖磷酸化酶的亚基的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14。
glgX基因编码糖原磷酸化酶-极限糊精α-1，6-葡糖水解酶(同物异名-B3431、GlyX)。glgX基因(核苷酸位置：3,569,342至3,567,369；GenBank登录号NC_000913.2；gi：49175990)位于大肠杆菌K-12染色体上的glgC和glgB基因之间。glgX基因的核苷酸序列和由glgX基因编码的糖原磷酸化酶-极限糊精α-1，6-葡糖水解酶的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：15和SEQ IDNO：16。
glgB基因编码糖原分支酶(同物异名-B3432)。glgB基因(核苷酸位置：3,571,525至3,569,339；GenBank登录号NC_000913.2；gi：49175990)位于大肠杆菌K-12染色体上的glgX和asd基因之间。glgB基因的核苷酸序列和由glgB基因编码的糖原分支酶的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：17和SEQ IDNO：18。
glgS基因编码糖原生物合成的rpoS-依赖性蛋白(同物异名-B3049)。glgS基因(核苷酸位置：3,189,961至3,189,761；GenBank登录号NC_000913.2；gi：49175990)位于大肠杆菌K-12染色体上的yqiI和yqiJORF之间。glgS基因的核苷酸序列和由glgS基因编码的糖原生物合成的rpoS-依赖性蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20。
因为在肠杆菌科的属或菌株之间可能存在DNA序列的某些不同，所以染色体上将要缺失的glgC基因不限于SEQ ID No：1所示的基因，而可以包括SEQ ID No：1的同源基因。因此，由glgC基因编码的蛋白质变体可与SEQ IDNO.2所示的完整的编码氨基酸序列具有不少于80％，优选不少于90％，并且最优选不少于95％的同源性，只要该蛋白质变体在失活之前保持了葡糖-1-磷酸腺苷酰转移酶的活性。
此外，glgC基因可以是变体，其在严紧条件下与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列杂交，或与可从该核苷酸序列制备的探针杂交，只要该变体在失活之前编码1-磷酸腺苷酰转移酶。“严紧条件”包括那些在该条件下形成特异性杂合体，例如，具有不少于60％，优选不少于70％，更优选不少于80％，还更优选不少于90％，最优选不少于95％的同源性的杂合体，并且不形成非特异性杂合体，例如具有低于上述同源性的杂合体。举例来说，作为示例的严紧条件是在60℃在相当于1×SSC、0.1％SDS，优选0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度洗涤一次，优选两次或三次。探针长度可以根据杂交条件合适地选择，并且通常是100bp至1kbp。
如上所述对于glgC基因的相似表述能够应用于glgBX和glgCAP操纵子的其它基因的变体。
基因失活能够通过常规方法进行，例如使用UV照射或亚硝基胍(N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍)处理的诱变处理、定点诱变、使用同源重组的基因破坏或/和插入-缺失突变(Yu，D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97：12：5978-83)和(Datsenko，K.A.and Wanner，B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97：12：6640-45)也称为“Red-驱动的整合”。
由glgC基因编码的葡糖-1-磷酸腺苷酰转移酶活性能够通过例如由Haugen，T.H.等(J.Biol.Chem.251(24)，7880-5(1976))所述的方法测量。所以，当与亲本未修饰的细菌相比时，能够测定在根据本发明的细菌中葡糖-1-磷酸腺苷酰转移酶活性的减少或缺失。
由glgA基因编码的糖原合酶的活性能够通过例如由Fox，J.等(MethodsEnzymol.，28，539-544(1972))所述的方法测量。所以，当与亲本未修饰的细菌相比时，能够测定在根据本发明的细菌中糖原合酶活性的减少或缺失。
由glgP基因编码的糖原磷酸化酶/糖原-麦芽四糖磷酸化酶的活性能够通过例如由Graves，D.J.和Wang，J.H.(The Enzymes，7(3rd ed.)，435-482(1972))所述的方法测量。所以，当与亲本未修饰的细菌相比时，能够测定在根据本发明的细菌中糖原磷酸化酶/糖原-麦芽四糖磷酸化酶活性的减少或缺失。
由glgX基因编码的糖原磷酸化酶-极限糊精α-1，6-葡糖水解酶的活性能够通过例如由Jeanningros，R.等(Biochim Biophys Acta，438(1)，186-199(1976))所述的方法测量。所以，当与亲本未修饰的细菌相比时，能够测定在根据本发明的细菌中糖原磷酸化酶-极限糊精α-1，6-葡糖水解酶活性的减少或缺失。
由glgB基因编码的糖原分支酶的活性能够通过例如由Illingworth，B.B.和Brown，D.H.(Methods Enzymol.，8，395-403(1966))所述的方法测量。所以，当与亲本未修饰的细菌相比时，能够测定在根据本发明的细菌中糖原分支酶活性的减少或缺失。
由glgS基因编码的糖原生物合成的rpoS-依赖性蛋白的活性能够通过glgS缺失突变(glgS-null mutation)的补全来检测，所述glgS缺失突变抑制糖原合成，例如由Hengge-Aronis，R，和Fischer，D.(Mol.Microbiol.，6，14，1877-1886(1992))所述。所以，当与亲本未修饰的细菌相比时，能够测定在根据本发明的细菌中糖原生物合成的rpoS依赖性蛋白活性的减少或缺失。
用于制备质粒DNA、消化和连接DNA、转化、选择寡核苷酸作为引物等的方法可以是本领域技术人员熟知的常规方法。这些方法在例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，SecondEdition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中有所描述。
产生L-氨基酸的细菌
作为本发明的细菌，其被修饰以使glgBX和/或glgCAP操纵子或glgS基因失活，可以使用能够产生芳族或非芳族L-氨基酸的细菌。
能够通过将固有地具有产生L-氨基酸的能力的细菌中的glgBX和/或glgCAP操纵子或glgS基因失活来获得本发明的细菌。或者，能够通过将产生L-氨基酸的能力赋予已经具有glgBX和/或glgCAP操纵子或glgS基因的细菌来获得本发明的细菌。
产生L-苏氨酸的细菌
用于得到本发明的产生L-苏氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，例如大肠杆菌TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)(美国专利号5,175,107、美国专利号5,705,371)、大肠杆菌NRRL-21593(美国专利号5,939,307)、大肠杆菌FERM BP-3756(美国专利号5,474,918)、大肠杆菌FERM BP-3519和FERM BP-3520(美国专利号5,376,538)、大肠杆菌MG442(Gusyatiner等，Genetika(俄语)，14，947-956(1978))、大肠杆菌VL643和VL2055(EP 1149911 A)等。
菌株TDH-6是thrC基因缺陷的，也是蔗糖同化性的(sucrose-assimilative)，并且ilvA基因具有渗漏突变(leaky mutation)。所述菌株还在rhtA基因中具有突变，该突变赋予对高浓度苏氨酸或高丝氨酸的抗性。菌株B-3996含有质粒pVIC40，其通过将包括突变thrA基因的thrA*BC操纵子插入由RSF1010衍生的载体而获得。这种突变型thrA基因编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I，其具有基本上脱敏的苏氨酸反馈抑制。菌株B-3996于1987年11月19日以登录号RIA 1867保藏在All-Union Scientific Center ofAntibiotics(NagatinskayaStreet 3-A，117105 Moscow，Russian Federation)。该菌株还于1987年4月7日以登录号B-3996保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian NationalCollection of Industrial Microorganisms)(VKPM)(Russia，117545 Moscow，1Dorozhny proezd，.1)。
优选地，将本发明所述细菌另外地修饰以增强一种或多种下列基因的表达：
-突变thrA基因，其编码对苏氨酸反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I；
-thrB基因，其编码高丝氨酸激酶；
-thrC基因，其编码苏氨酸合酶；
-rhtA基因，其编码推定的跨膜蛋白质；
-asd基因，其编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶；和
-aspC基因，其编码天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)；
已阐明编码大肠杆菌天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因(核苷酸位置337至2799，GenBank登录号NC_000913.2，gi：49175990)。thrA基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrL和thrB基因之间。已阐明编码大肠杆菌高丝氨酸激酶的thrB基因(核苷酸位置2801至3733，GenBank登录号NC_000913.2，gi：49175990)。thrB基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrA和thrC基因之间。已阐明编码大肠杆菌苏氨酸合酶的thrC基因(核苷酸位置3734至5020，GenBank登录号NC_000913.2，gi：49175990)。thrC基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrB基因和yaaX开放阅读框之间。所有三种基因作为单独的苏氨酸操纵子发挥功能。
编码对苏氨酸反馈抑制具有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的突变thrA基因，以及thrB和thrC基因，能够作为一个操纵子从熟知的质粒pVIC40获得，该质粒存在于产生苏氨酸的大肠杆菌菌株VKPM B-3996中。质粒pVIC40在美国专利号5,705,371中有详细描述。
rhtA基因存在于大肠杆菌染色体上接近于glnHPQ操纵子的18分钟处，该操纵子编码谷氨酰胺运送系统的组分。rhtA基因与ORF1(ybiF基因，核苷酸位置764至1651，GenBank登录号AAA218541，gi：440181)是相同的，并且位于pexB和ompX基因之间。将表达由ORF1编码的蛋白质的单位定名为rhtA基因(rht：对高丝氨酸和苏氨酸的抗性)。而且，显示rhtA23突变是在相对于ATG起始密码子的位置-1的A取代G的取代(ABSTRACTS of the 17thInternational Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugationwith Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and MolecularBiology，San Francisco，California August 24-29，1997，abstract No.457，EP1013765 A)。
已经阐明大肠杆菌的asd基因(核苷酸位置3572511至3571408，GenBank登录号NC_000913.1，gi：16131307)，并且能够使用基于该基因核苷酸序列制备的引物通过PCR(聚合酶链式反应；参见White，T.J.et al.，Trends Genet.，5，185(1989))获得。其它微生物的asd基因能够以类似的方式获得。
同样，已经阐明大肠杆菌的aspC基因(核苷酸位置983742至984932，GenBank登录号NC_000913.1，gi：16128895)，并且其能够通过PCR获得。其它微生物的aspC基因能够以类似的方式获得。
产生L-赖氨酸的细菌
属于埃希氏菌属的产生L-赖氨酸的细菌的实例包括对L-赖氨酸类似物具有抗性的突变体。L-赖氨酸类似物抑制属于埃希氏菌属的细菌的生长，但当L-赖氨酸共存于培养基中时，这种抑制将完全或部分地脱敏。L-赖氨酸类似物的实例包括，但不限于，溶菌素(oxalysine)、赖氨酸氧肟酸(lysinehydroxamate)、S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(S-(2-aminoethyl)-L-cysteine)(AEC)、γ-甲基赖氨酸(γ-methyllysine)、α-氯己内酰胺(α-chlorocaprolactam)等。对这些赖氨酸类似物具有抗性的突变体能够通过对属于埃希氏菌属的细菌施以常规的人工诱变处理而获得。用于产生L-赖氨酸的细菌菌属的具体实例包括大肠杆菌AJ11442(FERM BP-1543、NRRL B-12185；参见美国专利号4,346,170)和大肠杆菌VL611。在这些微生物中，L-赖氨酸的天冬氨酸激酶反馈抑制是脱敏的。
可以将菌株WC196作为大肠杆菌的产生L-赖氨酸的细菌使用。该细菌菌株通过将AEC抗性赋予菌株W3110来培育，所述菌株W3110源自大肠杆菌K-12。将所得菌株定名为大肠杆菌AJ13069菌株，并且于1994年12月6日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(National Instituteof Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science andTechnology)(目前为独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology，InternationalPatent Organism Depositary)，Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan)，并且获得登录号FERM P-14690。然后，根据布达佩斯条约的规定于1995年9月29日将其转为国际保藏，并且获得登录号FERM BP-5252(美国专利号5,827,698)。
用于得到本发明的产生L-赖氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，在其中将编码L-赖氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达增强的菌株。涉及L-赖氨酸生物合成的酶的实例包括，但不限于，二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)、天冬氨酸激酶(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)(美国专利号6,040,160)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶(pntAB)和天冬氨酸酶(aspA)(EP 1253195 A)。
用于得到本发明的产生L-赖氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括酶活性减少或消除的菌株，所述酶催化通过从L-赖氨酸生物合成途径分支而产生L-赖氨酸以外的化合物的反应。催化通过从L-赖氨酸生物合成途径分支而产生L-赖氨酸以外的化合物的反应的酶的实例包括高丝氨酸脱氢酶和赖氨酸脱羧酶(美国专利号5,827,698)。
产生L-半胱氨酸的细菌
用于得到本发明的产生L-半胱氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，例如用编码反馈抗性丝氨酸乙酰转移酶的不同cysE等位基因转化的大肠杆菌JM15(美国专利号6,218,168，俄罗斯专利申请2003121601)；具有过表达的基因的大肠杆菌W3110，所述基因编码适用于分泌对细胞有毒的物质的蛋白质(美国专利号5,972,663)；半胱氨酸脱巯基酶(desulfhydrase)活性降低的大肠杆菌菌株(JP11155571A2)；对于由cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正转录调节物活性增加的大肠杆菌W3110(WO0127307A1)，等。
产生L-亮氨酸的细菌
得到本发明的产生L-亮氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，例如对亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌株(例如，菌株57(VKPM B-7386，美国专利6,124,121))或对亮氨酸类似物有抗性的大肠杆菌菌株，所述亮氨酸类似物包括如β-2-噻吩丙氨酸、3-羟基亮氨酸、4-氮杂亮氨酸、5，5，5-三氟亮氨酸(JP 62-34397 B和JP 8-70879 A)；通过WO96/06926中所述的基因工程方法获得的大肠杆菌菌株；大肠杆菌H-9068(JP 8-70879 A)等。
可以通过增强涉及L-亮氨酸生物合成的一种或多种基因的表达来改进本发明的细菌。实例包括leuABCD操纵子的基因，其优选地由突变leuA基因代表，所述突变leuA基因编码解除L-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合酶(美国专利6,403,342)。此外，可以通过增强一种或多种基因的表达来改进本发明的细菌，所述基因编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白质。这些基因的实例包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP 1239041 A2)。
产生L-组氨酸的细菌
用于得到本发明的产生L-组氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，例如大肠杆菌菌株24(VKPM B-5945，RU2003677)；大肠杆菌菌株80(VKPM B-7270，RU2119536)；大肠杆菌NRRLB-12116-B12121(美国专利号4,388,405)；大肠杆菌H-9342(FERM BP-6675)和H-9343(FERM BP-6676)(美国专利号6,344,347)；大肠杆菌H-9341(FERMBP-6674)(EP1085087)；大肠杆菌AI80/pFM201(美国专利号6,258,554)等。
用于得到本发明的产生L-组氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括，在其中将编码L-组氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达增强的菌株。L-组氨酸生物合成酶的实例包括ATP磷酸核糖基转移酶(hisG)、磷酸核糖基AMP环水解酶(hisI)、磷酸核糖基-ATP焦磷酸水解酶(hisIE)、磷酸核糖基亚胺甲基-5-氨基咪唑甲酰胺核糖核苷酸异构酶(hisA)、酰胺转移酶(hisH)、组氨醇磷酸氨基转移酶(hisC)、组氨醇磷酸酶(hisB)、组氨醇脱氢酶(hisD)等。
已知编码L-组氨酸生物合成酶(hisG，hisBHAFI)的基因受L-组氨酸抑制，并且因此L-组氨酸产生能力也能够通过将突变引入ATP磷酸核糖基转移酶(hisG)来有效地增强，该突变赋予对反馈抑制的抗性(俄罗斯专利号2003677和2119536)。
具有L-组氨酸产生能力的菌株的具体实例包括大肠杆菌FERM-P 5038和5048，其已经引入携带编码L-组氨酸生物合成酶的DNA的载体(JP 56-005099A)；引入rht的大肠杆菌菌株，所述rht是用于氨基酸输出的基因(EP1016710A)；赋予磺胺胍、DL-1，2，4-三唑-3-丙氨酸和链霉素抗性的大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270，俄罗斯专利号2119536)等。
产生L-谷氨酸的细菌
用于得到本发明的产生L-谷氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，例如大肠杆菌VL334thrC+(EP 1172433)。大肠杆菌VL334(VKPM B-1641)是L-异亮氨酸和L-苏氨酸营养缺陷型菌株，其在thrC和ilvA基因中具有突变(美国专利号4,278,765)。通过一般转导方法使用生长在野生型大肠杆菌菌株K-12(VKPM B-7)细胞上的噬菌体P1来转移thrC基因的野生型等位基因。结果，获得L-异亮氨酸缺陷型菌株VL334thrC+(VKPM B-8961)。该菌株能够产生L-谷氨酸。
用于得到本发明的产生L-谷氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，其中编码L-谷氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达增强的菌株。涉及L-谷氨酸生物合成的酶的实例包括谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶、柠檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、烯醇酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、果糖磷酸激酶和葡糖磷酸异构酶。
经修饰以使其柠檬酸合成酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达增强的菌株的实例包括那些公开于EP1078989A、EP955368A和EP952221A中的菌株。
用于得到本发明的产生L-谷氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括酶活性减少或消除的菌株，所述酶催化合成L-谷氨酸以外的化合物，并且该合成从L-谷氨酸生物合成途径分支。这些酶的实例包括异柠檬酸裂合酶、α-酮戊二酸脱氢酶、磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、乙酰羟酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰转移酶、乳酸脱氢酶和谷氨酸脱羧酶。α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的或α-酮戊二酸脱氢酶活性减少的属于埃希氏菌属的细菌，和用于获得它们的方法在美国专利号5,378,616和5,573,945中有所描述。具体地，这些菌株包括以下所列：
大肠杆菌W3110sucA::Kmr
大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)
大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854)
大肠杆菌AJ12949(FERM BP-4881)
大肠杆菌W3110sucA::Kmr是通过破坏大肠杆菌W3110的α-酮戊二酸脱氢酶基因(在下文中称为“sucA基因”)而获得的菌株。该菌株是α-酮戊二酸脱氢酶完全缺陷的。
产生L-谷氨酸的细菌的其它实例包括那些属于埃希氏菌属并且对天冬氨酸抗代谢物具有抗性的菌株。这些菌株也可以是α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的，并且包括，例如，大肠杆菌AJ13199(FERM BP-5807)(美国专利号5,908,768)，FFRM P-12379，其额外地具有低L-谷氨酸分解能力(美国专利号5,393,671)；AJ13138(FERM BP-5565)(美国专利号6,110,714)等。
产生L-谷氨酸的细菌的实例包括属于泛菌属的突变菌株，其是α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的或具有减少的α-酮戊二酸脱氢酶活性，并且该菌株能够如上所述获得。这些菌株包括Pantoea ananatis AJ13356(美国专利号6,331,419)。Pantoea ananatis AJ13356于1998年2月19日以登录号FERMP-16645保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(目前为目前为独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心，Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan)。其随后根据布达佩斯条约的规定于1999年1月11日转为国际保藏，并且获得登录号FERMBP-6615。由于αKGDH-E1亚基基因(sucA)的破坏，Pantoea ananatis AJ13356是α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的。当将上述菌株分离时，曾将其鉴定为成团肠杆菌，并且作为成团肠杆菌AJ13356保藏。然而，根据16S rRNA的核苷酸测序等最近将其重新归类为Pantoea ananatis。尽管AJ13356作为成团肠杆菌保藏在前述的保藏所，但就本说明书而言，将它们描述为Pantoea ananatis。
产生L-苯丙氨酸的细菌
用于得到本发明的产生L-苯丙氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，例如大肠杆菌AJ12739(tyrA::Tn10，tyrR)(VKPM B-8197)；大肠杆菌HW1089(ATCC 55371)，其含有pheA34基因(美国专利号5,354,672)；大肠杆菌MWEC101-b(KR8903681)；大肠杆菌NRRLB-12141、NRRL B-12145、NRRL B-12146和NRRL B-12147(美国专利号4,407,952)。同样，作为亲本菌株，可以使用大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAB(FERM BP-3566)、大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659)、大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERMBP-12662)和命名为AJ 12604(FERM BP-3579)的大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB](EP 488424 B1)。此外，也可使用属于埃希氏菌属的产生L-苯丙氨酸的细菌，其具有由yedA基因或yddG基因编码的蛋白的增强的活性(美国专利申请2003/0148473 A1和2003/0157667 A1)。
产生L-色氨酸的细菌
用于得到本发明的产生L-色氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，例如可以使用大肠杆菌JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123)，其为由突变trpS基因编码的色氨酰-tRNA合成酶缺陷的(美国专利号5,756,345)；大肠杆菌SV164(pGH5)，其具有serA等位基因和trpE等位基因，所述serA等位基因编码无丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶，所述trpE等位基因编码无色氨酸反馈抑制的邻氨基苯甲酸合酶(美国专利号6,180,373)；大肠杆菌AGX17(pGX44)(NRRLB-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)，其为色氨酸酶缺陷的(美国专利号4,371,614)；大肠杆菌AGX17/pGX50，pACKG4-pps，其中产生磷酸烯醇丙酮酸的能力增强(WO9708333，美国专利号6,319,696)等。
先前，鉴定了编码膜蛋白的yddG基因，该基因不涉及任何L-氨基酸的生物合成途径，并且当该基因的野生型等位基因在微生物中的多拷贝载体上扩增时，赋予所述微生物对L-苯丙氨酸和几个氨基酸类似物的抗性。此外，将额外的拷贝引入各个氨基酸产生菌株的细胞时，yddG基因能够增强L-苯丙氨酸或L-色氨酸的产生(WO03044192)。所以将产生L-色氨酸的细菌进一步修饰以具有yddG开放阅读框的增强表达是理想的。
用于得到本发明的产生L-色氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括，其中一种或多种选自下组的酶的活性增强的菌株：邻氨基苯甲酸合酶、磷酸甘油酸脱氢酶和色氨酸合酶。邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶都受到L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，所以可将使该反馈抑制脱敏的突变引入这些酶。具有这种突变的菌株的具体实例包括大肠杆菌SV164，其包含脱敏的邻氨基苯甲酸合酶，以及转化体菌株，其通过将质粒pGH5引入到大肠杆菌SV164中而获得(WO94/08031)，该菌株含有突变serA基因编码的反馈脱敏的磷酸甘油酸脱氢酶。
用于得到本发明的产生L-色氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括，其中引入了含有编码脱敏的邻氨基苯甲酸合酶的基因的色氨酸操纵子的菌株(JP57-71397 A、JP 62-244382 A、美国专利号4,371,614)。此外，可以通过增强基因的表达来赋予L-色氨酸产生能力，该基因是色氨酸操纵子(trpBA)中编码色氨酸合酶的基因。所述色氨酸合酶由α和β亚基组成，其分别由trpA和trpB编码。
产生L-脯氨酸的细菌
用于得到本发明的产生L-脯氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，例如大肠杆菌702ilvA(VKPM B-8012)，其是ilvA基因缺陷的并且能够产生L-脯氨酸(EP 1172433)。可以通过增强涉及L-脯氨酸生物合成的一种或多种基因的表达来改进本发明的细菌。用于产生L-脯氨酸的细菌的这些基因的优选实例包括proB基因，其编码L-脯氨酸反馈抑制脱敏的谷氨酸激酶(DE专利3127361)。此外，可以通过增强一种或多种基因的表达来改进本发明的细菌，所述基因编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白质。这些基因的实例是b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041 A2)。
具有产生L-脯氨酸的活性、属于埃希氏菌属的细菌的实例包括以下大肠杆菌菌株：NRRL B-12403和NRRL B-12404(GB专利2075056)、VKPM B-8012(俄罗斯专利申请2000124295)、DE专利3127361中所述的质粒突变体、由Bloom F.R.等(The 15th Miami winter symposium，1983，p.34)描述的质粒突变体等。
产生L-精氨酸的细菌
用于得到本发明的产生L-精氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，例如大肠杆菌菌株237(VKPM B-7925)(美国专利申请2002/058315 A1)及其含有突变N-乙酰谷氨酸合酶的衍生菌株(俄罗斯专利申请号2001112869)，大肠杆菌菌株382(VKPM B-7926)(EP1170358A1)，其为产生精氨酸的菌株，其中引入了编码N-乙酰谷氨酸合成酶的argA基因(JP57-5693 A)等。
用于得到本发明的产生L-精氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括，其中将编码L-精氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达增强的菌株。L-精氨酸生物合成酶的实例包括N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)、鸟氨酸氨基甲酰转移酶(argF)、精氨琥珀酸合成酶(argG)、精氨琥珀酸裂合酶(argH)和氨甲酰磷酸合成酶。
2.本发明的方法
本发明所述方法是用于产生L-氨基酸的方法，其包括在培养基中培养本发明的细菌以将L-氨基酸产生和分泌到培养基中，以及从所述培养基收集L-氨基酸。
在本发明中，从培养基等培养、收集和纯化L-氨基酸可按类似于常规发酵方法的方式进行，所述常规发酵方法中使用细菌产生氨基酸。
用于培养的培养基可以是合成的或天然的培养基，只要该培养基包括碳源和氮源和矿物质和，如有必要，细菌生长所需的适量营养物。碳源可包括各种糖例如葡萄糖和蔗糖，以及各种有机酸。根据所用微生物同化作用的模式，可以使用醇，包括乙醇和甘油。作为氮源，能够使用各种铵盐例如氨和硫酸铵，其它氮化合物例如胺，天然氮源例如蛋白胨、大豆水解物和消化的发酵微生物。作为矿物质，能够使用单磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙等。作为维生素，能够使用硫胺素、酵母提取物等。
培养优选地在需氧条件下进行，例如摇动培养，以及通气搅拌培养，在20至40℃，优选地30至38℃的温度进行。培养物的pH通常是5至9之间，优选地6.5至7.2之间。能够用氨、碳酸钙、各种酸、各种碱和缓冲液调节培养物的pH。通常，1至5天的培养导致液体培养基中目标L-氨基酸的积累。
培养之后，能够通过离心或膜过滤从液体培养基中去除固体例如细胞，随后能够通过离子交换、浓缩和/或结晶方法收集和纯化L-氨基酸。
实施例
下面将通过如下非限制性实施例更具体地说明本发明。
实施例1构建具有失活的glgC基因的菌株
1.缺失glgC基因
能够通过最初由Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97(12)，6640-6645)开发的称为“Red-驱动的整合”的方法来构建缺失glgC基因的菌株。根据这种方法，能够构建与模板质粒中邻近glgC基因的区域和赋予抗生素抗性的基因均互补的PCR引物glgCL(SEQ ID NO：3)和glgCR(SEQ ID NO：4)。可将质粒pACYC184(NBL Gene Sciences Ltd.，UK)(GenBank/EMBL登录号X06403)用作PCR反应的模板。PCR的条件可以如下：变性步骤于95℃持续3分钟；前两个循环的概况：95℃ 1分钟、50℃ 30秒、72℃ 40秒；后25个循环的概况：95℃ 30秒、54℃ 30秒、72℃ 40秒；最终步骤：72℃ 5分钟。
能够获得1093-bp PCR产物(图1)，并在琼脂糖凝胶中纯化，并且能够用于大肠杆菌MG1655(ATCC 700926)的电穿孔，该大肠杆菌含有具有温度敏感复制的质粒pKD46。质粒pKD46(Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97：12：6640-45)包括噬菌体λ(GenBank登录号J02459)的2,154个核苷酸(31088-33241)的DNA片段，并且含有在阿拉伯糖可诱导的ParaB启动子控制下的λRed同源重组系统的基因(γ，β，exo基因)。质粒pKD46是将PCR产物整合到菌株MG1655的染色体上所必需的。
电感受态细胞能够如下制备：可将大肠杆菌MG1655的过夜培养物(nightculture)于30℃在补加氨苄青霉素(100mg/l)的LB培养基中培养，然后用含有氨苄青霉素和L-阿拉伯糖(1mM)的5ml SOB培养基(Sambrook等，“MolecularCloning A Laboratory Manual，Second Edition”，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989))稀释100倍。可将所得培养物在通气下于30℃培养至OD600≈0.6，然后可通过浓缩100倍和用冰冷的去离子水洗涤3次来制成电感受态。可使用70μl细胞和≈100ng的所述PCR产物进行电穿孔。电穿孔之后的细胞可与1ml SOC培养基(Sambrook等，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))一起于37℃温育2.5小时，此后可涂布于L-琼脂上，并且于37℃生长以选择CmR重组体。然后，为了消除pKD46质粒，可在含Cm的L-琼脂上于42℃进行两次传代，并可测试所得菌落对氨苄青霉素的敏感性。
2.通过PCR确认glgC基因缺失
能够通过PCR验证含有glgC基因缺失、用Cm抗性基因标记的突变体。位点特异性引物glgC1(SEQ ID NO：5)和glgC2(SEQ ID NO：6)能够在用于验证的PCR中使用。PCR验证的条件可为如下：变性步骤于94℃持续3分钟；30个循环的概况：94℃ 30秒、54℃ 30秒、72℃ 1分钟；最终步骤：72℃ 7分钟。在使用亲本菌株MG1655 glgC+作为模板的反应中可获得的PCR产物应长为1471bp。在使用突变MG1655 ΔglgC::cat菌株作为模板的反应中可获得的PCR产物应长为1197bp(图2)。
实施例2由大肠杆菌VL334thrC+-ΔglgC产生L-谷氨酸
产生L-谷氨酸的大肠杆菌菌株VL334thrC+(EP 1172433)染色体上的glgC基因的缺失能够通过常规的熟知的方法进行，例如，从MG1655 ΔglgC::cat菌株通过P1转导进行，以获得菌株VL334thrC+ΔglgC。已将菌株VL334thrC+于2004年12月6日以登录号VKPM B-8961保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russia，117545 Moscow，1 Dorozhny proezd，1)，然后于2004年12月8日转为根据布达佩斯条约的保藏。
两种菌株，VL334thrC+和VL334thrC+-ΔglgC，都能够在L-琼脂平板上于37℃生长18-24小时。然后，可将一环细胞转移至含有2ml发酵培养基的试管中。所述发酵培养基(pH7.2)应含有葡萄糖(60g/l)、硫酸铵(25g/l)、KH2PO4(2g/l)、MgSO4(1g/l)、硫胺素(0.1mg/ml)、L-异亮氨酸(70μg/ml)和CaCO3(25g/l)。葡萄糖和CaCO3应该分别灭菌。培养可于30℃摇动进行3天。培养之后，产生的L-谷氨酸量能够通过纸层析(液相组成：丁醇-乙酸-水＝4∶1∶1)测定，随后用茚三酮(ninhydrin)(1％丙酮溶液)染色，并且在含0.5％CdCl2的50％乙醇中进一步洗脱所述化合物。
实施例3由大肠杆菌702ilvA-ΔglgC产生L-脯氨酸
产生L-脯氨酸的大肠杆菌菌株702ilvA(VKPM B-8012，俄罗斯专利申请2000124295，EP1172433)染色体上的glgC基因的缺失能够通过如上所述常规的熟知的方法进行，以获得菌株702ilvA-ΔglgC。已将菌株702ilvA于2000年7月18日以登录号VKPM B-8012保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russia，117545 Moscow，1 Dorozhny proezd，1)。
两种大肠杆菌菌株，702ilvA和702ilvA-ΔglgC，都能够在L-琼脂平板上于37℃生长18-24小时。然后可将这些菌株在如上所述的相同条件下培养。
实施例4由大肠杆菌237-ΔglgC产生L-精氨酸
产生L-精氨酸的大肠杆菌菌株237(VKPM B-7925)染色体上的glgC基因的缺失能够通过如上所述常规的熟知的方法进行，以获得菌株237-ΔglgC。已将菌株237于2000年4月10日以登录号VKPM B-7925保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russia，113545 Moscow，1 Dorozhny proezd，1)，然后于2001年5月18日转为根据布达佩斯条约的保藏。
两种大肠杆菌菌株，237和237-ΔglgC，都能够在L-琼脂平板上于37℃生长18-24小时。然后可将这些菌株在如上所述的相同条件下培养。
实施例5由大肠杆菌57-ΔglgC产生L-亮氨酸
产生L-亮氨酸的大肠杆菌菌株57(VKPM B-7386，美国专利6,124,121)染色体上的glgC基因的缺失能够通过如上所述常规的熟知的方法进行，以获得菌株57-ΔglgC。已将菌株57于1997年5月19日以登录号VKPM B-7386保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russia，117545 Moscow，1Dorozhny proezd，1)。
两种大肠杆菌菌株，57和57-ΔglgC，都能够在L-琼脂平板上于37℃生长18-24小时。然后可将这些菌株在如上所述的相同条件下培养，只是培养基中不添加异亮氨酸。
实施例6由大肠杆菌JM15(ydeD)-ΔglgC产生L-半胱氨酸
产生L-半胱氨酸的大肠杆菌菌株JM15(ydeD)染色体上的glgC基因的缺失能够通过如上所述常规的熟知的方法进行，以获得菌株JM15(ydeD)-ΔglgC。
大肠杆菌JM15(美国专利6,218,168)的衍生物大肠杆菌JM15(ydeD)，能够用具有ydeD基因的DNA转化，该基因编码膜蛋白并且不涉及任何L-氨基酸的生物合成途径(美国专利5,972,663)。
用于评估L-半胱氨酸产生的发酵条件在美国专利6,218,168的实施例6中有详细描述。
实施例7由大肠杆菌B-3996-ΔglgC产生L-苏氨酸
产生L-苏氨酸的大肠杆菌菌株B-3996(VKPM B-3996)染色体上的glgC基因的缺失能够通过如上所述常规的熟知的方法进行，以获得菌株B-3996-ΔglgC。
两种大肠杆菌菌株，B-3996和B-3996-ΔglgC，都能够在L-琼脂平板上于37℃生长18-24小时。然后可将这些菌株在如上所述的相同条件下培养。
实施例8由大肠杆菌AJ11442-ΔglgC产生L-赖氨酸
产生L-赖氨酸的大肠杆菌菌株AJ11442(FERM BP-1543，NRRL B-12185)染色体上的glgC基因的缺失能够通过如上所述常规的熟知的方法进行，以获得菌株AJ11442-ΔglgC。将菌株AJ11442于1981年5月1日保藏在FermentationResearch Institute，Agency of Industrial Science and Technology(目前为独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心，Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan)并且获得登录号FERM P-5084。然后根据布达佩斯条约的规定于1987年10月29日将其转为国际保藏，并获得登录号FERM BP-1543。
两种大肠杆菌菌株，AJ11442和AJ11442-ΔglgC，都能够在L-琼脂平板上于37℃生长18-24小时。然后可将这些菌株在如上所述的相同条件下培养。
实施例9由大肠杆菌AJ12739-ΔglgC产生L-苯丙氨酸
产生L-苯丙氨酸的大肠杆菌菌株AJ12739(tyrA::Tn10，tyrR)(VKPMB-8197)染色体上的glgC基因的缺失能够通过如上所述常规的熟知的方法进行，以获得菌株AJ12739-ΔglgC。已将菌株AJ12739于2001年11月6日以登录号VKPM B-8197保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russia，117545 Moscow，1 Dorozhny proezd，1)。
两种大肠杆菌菌株，AJ12739和AJ12739-ΔglgC，都能够在L-琼脂平板上于37℃生长18-24小时。然后可将这些菌株在如上所述的相同条件下培养。
实施例10构建含有失活的glgBX和glgCAP操纵子的菌株
1.缺失glgBX和glgCAP操纵子
通过最初由Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97(12)，6640-6645)开发的称为“Red-驱动的整合”的方法来构建缺失glgBX和glgCAP操纵子的菌株。根据这种方法，构建了与模板质粒中邻近glgBX和glgCAP操纵子的区域和赋予抗生素抗性的基因均互补的PCR引物glgBXCAPL(SEQ ID NO：7)和glgBXCAPR(SEQ ID NO：8)。将质粒pACYC184(NBL Gene Sciences Ltd.，UK)(GenBank/EMBL登录号X06403)用作PCR中的模板。PCR条件在实施例1中有详细描述。
将在琼脂糖凝胶中纯化的1152-bp PCR产物用于大肠杆菌MG1655(ATCC 700926)的电穿孔，该大肠杆菌含有具有温度敏感复制的质粒pKD46，如实施例1所述。
2.通过PCR验证glgBX和glgCAP操纵子的缺失
通过PCR来验证缺失glgBX和glgCAP操纵子并且用Cm抗性基因标记的突变体。将位点特异性引物glgBXCAP1(SEQ ID NO：9)和glgBXCAP2(SEQ ID NO：10)在用于验证的PCR中使用。PCR验证的条件在实施例1中描述。在使用亲本菌株MG1655 glgBXCAP+作为模板的反应中获得的PCR产物长为9425bp。在使用突变菌株MG1655 ΔglgBXCAP::cat作为模板的反应中获得的PCR产物长为1208bp(图3)。
实施例11由大肠杆菌菌株B-3996-ΔglgBXCAP产生L-苏氨酸
为了测试glgBX和glgCAP操纵子的失活对产生苏氨酸的影响，将来自上述大肠杆菌菌株MG1655 ΔglgBXCAP::cat染色体的DNA片段通过P1转导(Miller，J.H.Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Lab.Press，1972，Plainview，NY)转移至产生苏氨酸的大肠杆菌菌株B-3996。
两种大肠杆菌菌株，B-3996和B-3996-ΔglgBXCAP，都在L-琼脂平板上于37℃生长18-24小时。为了获得种子培养物，将所述菌株在旋转摇床(250rpm)上在20×200-mm试管中于32℃培养18小时，该试管含有补加4％葡萄糖的2ml L-肉汤(L-broth)。然后将发酵培养基用0.21ml(10％)种子材料接种。发酵在20×200-mm试管中在用于发酵的2ml基本培养基中进行。将细胞于32℃以250rpm振荡培养65小时。
培养之后，使用以下流动相：丁醇-乙酸-水＝4∶1∶1(v/v)通过纸层析测定培养基中积累的L-苏氨酸的量。将茚三酮(2％)的丙酮溶液用作显色试剂(visualizing reagent)。将含有L-苏氨酸的点(spot)剪下，将L-苏氨酸用0.5％CdCl2水溶液洗脱，并且通过分光光度法于540nm估计L-苏氨酸的量。十个独立的试管发酵的结果示于表1。
发酵培养基的组成(g/l)如下：
葡萄糖 80.0
(NH4)2SO4 22.0
NaCl 0.8
KH2PO4 2.0
MgSO4·7H2O 0.8
FeSO4·7H2O 0.02
MnSO4·5H2O 0.02
硫胺素HCl 0.0002
酵母提取物 1.0
CaCO3 30.0
将葡萄糖和硫酸镁分别灭菌。CaCO3通过180℃ 2小时干热灭菌。将pH调节至7.0。在灭菌后将抗生素加入培养基。
如下表1中所示，与B-3996相比，B-3996-ΔglgBXCAP引起较高的L-苏氨酸积累量。
实施例12由大肠杆菌WC196-ΔglgBXCAP产生L-赖氨酸
为了测试glgBX和glgCAP操纵子的失活对产生L-赖氨酸的影响，将来自上述大肠杆菌菌株MG1655 ΔglgBXCAP::cat染色体的DNA片段通过P1转导(Miller，J.H.Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Lab.Press，1972，Plainview，NY)转移至产生L-赖氨酸的大肠杆菌菌株WC196(FERMBP-5252)。
为了获得种子培养物，将两种大肠杆菌菌株WC196和WC196-ΔglgBXCAP在旋转摇床(250rpm)上在20×200-mm试管中于32℃培养18小时，该试管含有2ml与下述发酵培养基相比稀释两倍的培养基。然后用0.21ml(10％)种子材料接种发酵培养基。发酵在20×200-mm试管中在用于发酵的2ml基本培养基中进行。将细胞在32℃以250rpm振荡培养24小时。
培养之后，使用以下流动相：丁醇-乙酸-水＝4∶1∶1(v/v)通过纸层析测定培养基中积累的L-赖氨酸的量。将茚三酮(2％)的丙酮溶液用作显色试剂。将含有L-赖氨酸的点剪下，将L-赖氨酸用0.5％CdCl2水溶液洗脱，并且通过分光光度法在540nm估计L-赖氨酸的量。十个独立试管发酵的结果示于表2。
发酵培养基的组成(g/l)如下：
葡萄糖 40.0
(NH4)2SO4 24.0
KH2PO4 1.0
MgSO4·7H2O 1.0
FeSO4·7H2O 0.01
MnSO4·5H2O 0.01
酵母提取物 2.0
CaCO3 30.0
将葡萄糖、磷酸钾和硫酸镁分别灭菌。CaCO3通过180℃ 2小时干热灭菌。将pH调节至7.0。
如下表2中所示，与WC196相比，WC196-ΔglgBXCAP引起较高的L-赖氨酸积累量。
尽管已参照本发明的优选实施方案详细描述了本发明，但对本领域内的技术人员显而易见的是，可在不背离由本发明范围的前提下进行各种修改，以及使用等价物。本文中所有引用的参考文献作为本申请的一部分并入以作参考。
表1.
| 菌株 | OD540 | L-苏氨酸的量，g/l |
| B-3996 | 23.5±0.3 | 27.5±0.4 |
| B-3996-ΔglgBXCAP | 22.1±0.2 | 28.2±1.2 |
表2.
| 菌株 | OD540 | L-赖氨酸的量，g/l |
| WC196 | 26.2±0.5 | 2.1±0.1 |
| WC196-ΔglgBXCAP | 26.9±0.3 | 2.4±0.1 |
工业适用性
根据本发明，能够提高肠杆菌科细菌的芳族L-氨基酸或非芳族L-氨基酸的产量。
序列表
<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)
<120>使用具有破坏的糖原生物合成途径的肠杆菌科细菌产生L-氨基酸的方法
<130>C440-C5323
<150>RU2005101110
<151>2005-0119
<160>20
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1296
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1296)
<400>1
atg gtt agt tta gag aag aac gat cac tta atg ttg gcg cgc cag ctg 48
Met Val Ser Leu Glu Lys Asn Asp His Leu Met Leu Ala Arg Gln Leu
1 5 10 15
cca ttg aaa tct gtt gcc ctg ata ctg gcg gga gga cgt ggt acc cgc 96
Pro Leu Lys Ser Val Ala Leu Ile Leu Ala Gly Gly Arg Gly Thr Arg
20 25 30
ctg aag gat tta acc aat aag cga gca aaa ccg gcc gta cac ttc ggc 144
Leu Lys Asp Leu Thr Asn Lys Arg Ala Lys Pro Ala Val His Phe Gly
35 40 45
ggt aag ttc cgc att atc gac ttt gcg ctg tct aac tgc atc aac tcc 192
Gly Lys Phe Arg Ile Ile Asp Phe Ala Leu Ser Asn Cys Ile Asn Ser
50 55 60
ggg atc cgt cgt atg ggc gtg atc acc cag tac cag tcc cac act ctg 240
Gly Ile Arg Arg Met Gly Val Ile Thr Gln Tyr Gln Ser His Thr Leu
65 70 75 80
gtg cag cac att cag cgc ggc tgg tca ttc ttc aat gaa gaa atg aac 288
Val Gln His Ile Gln Arg Gly Trp Ser Phe Phe Asn Glu Glu Met Asn
85 90 95
gag ttt gtc gat ctg ctg cca gca cag cag aga atg aaa ggg gaa aac 336
Glu Phe Val Asp Leu Leu Pro Ala Gln Gln Arg Met Lys Gly Glu Asn
100 105 110
tgg tat cgc ggc acc gca gat gcg gtc acc caa aac ctc gac att atc 384
Trp Tyr Arg Gly Thr Ala Asp Ala Val Thr Gln Asn Leu Asp Ile Ile
115 120 125
cgc cgt tat aaa gcg gaa tac gtg gtg atc ctg gcg ggc gac cat atc 432
Arg Arg Tyr Lys Ala Glu Tyr Val Val Ile Leu Ala Gly Asp His Ile
130 135 140
tac aag caa gac tac tcg cgt atg ctt atc gat cac gtc gaa aaa ggc 480
Tyr Lys Gln Asp Tyr Ser Arg Met Leu Ile Asp His Val Glu Lys Gly
145 150 155 160
gca cgt tgc acc gtt gct tgt atg cca gta ccg att gaa gaa gcc tcc 528
Ala Arg Cys Thr Val Ala Cys Met Pro Val Pro Ile Glu Glu Ala Ser
165 170 175
gca ttt ggc gtt atg gcg gtt gat gag aac gat aaa att atc gaa ttc 576
Ala Phe Gly Val Met Ala Val Asp Glu Asn Asp Lys Ile Ile Glu Phe
180 185 190
gtt gaa aaa cct gct aac ccg ccg tca atg ccg aac gat ccg agc aaa 624
Val Glu Lys Pro Ala Asn Pro Pro Ser Met Pro Asn Asp Pro Ser Lys
195 200 205
tct ctg gcg agt atg ggt atc tac gtc ttt gac gcc gac tat ctg tat 672
Ser Leu Ala Ser Met Gly Ile Tyr Val Phe Asp Ala Asp Tyr Leu Tyr
210 215 220
gaa ctg ctg gaa gaa gac gat cgc gat gag aac tcc agc cac gac ttt 720
Glu Leu Leu Glu Glu Asp Asp Arg Asp Glu Asn Ser Ser His Asp Phe
225 230 235 240
ggc aaa gat ttg att ccc aag atc acc gaa gcc ggt ctg gcc tat gcg 768
Gly Lys Asp Leu Ile Pro Lys Ile Thr Glu Ala Gly Leu Ala Tyr Ala
245 250 255
cac ccg ttc ccg ctc tct tgc gta caa tcc gac ccg gat gcc gag ccg 816
His Pro Phe Pro Leu Ser Cys Val Gln Ser Asp Pro Asp Ala Glu Pro
260 265 270
tac tgg cgc gat gtg ggt acg ctg gaa gct tac tgg aaa gcg aac ctc 864
Tyr Trp Arg Asp Val Gly Thr Leu Glu Ala Tyr Trp Lys Ala Asn Leu
275 280 285
gat ctg gcc tct gtg gtg ccg gaa ctg gat atg tac gat cgc aat tgg 912
Asp Leu Ala Ser Val Val Pro Glu Leu Asp Met Tyr Asp Arg Asn Trp
290 295 300
cca att cgc acc tac aat gaa tca tta ccg cca gcg aaa ttc gtg cag 960
Pro Ile Arg Thr Tyr Asn Glu Ser Leu Pro Pro Ala Lys Phe Val Gln
305 310 315 320
gat cgc tcc ggt agc cac ggg atg acc ctt aac tca ctg gtt tcc ggc 1008
Asp Arg Ser Gly Ser His Gly Met Thr Leu Asn Ser Leu Val Ser Gly
325 330 335
ggt tgt gtg atc tcc ggt tcg gtg gtg gtg cag tcc gtt ctg ttc tcg 1056
Gly Cys Val Ile Ser Gly Ser Val Val Val Gln Ser Val Leu Phe Ser
340 345 350
cgc gtt cgc gtg aat tca ttc tgc aac att gat tcc gcc gta ttg tta 1104
Arg Val Arg Val Asn Ser Phe Cys Asn Ile Asp Ser Ala Val Leu Leu
355 360 365
ccg gaa gta tgg gta ggt cgc tcg tgc cgt ctg cgc cgc tgc gtc atc 1152
Pro Glu Val Trp Val Gly Arg Ser Cys Arg Leu Arg Arg Cys Val Ile
370 375 380
gat cgt gct tgt gtt att ccg gaa ggc atg gtg att ggt gaa aac gca 1200
Asp Arg Ala Cys Val Ile Pro Glu Gly Met Val Ile Gly Glu Asn Ala
385 390 395 400
gag gaa gat gca cgt cgt ttc tat cgt tca gaa gaa ggc atc gtg ctg 1248
Glu Glu Asp Ala Arg Arg Phe Tyr Arg Ser Glu Glu Gly Ile Val Leu
405 410 415
gta acg cgc gaa atg cta cgg aag tta ggg cat aaa cag gag cga taa 1296
Val Thr Arg Glu Met Leu Arg Lys Leu Gly His Lys Gln Glu Arg
420 425 430
<210>2
<211>431
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>2
Met Val Ser Leu Glu Lys Asn Asp His Leu Met Leu Ala Arg Gln Leu
1 5 10 15
Pro Leu Lys Ser Val Ala Leu Ile Leu Ala Gly Gly Arg Gly Thr Arg
20 25 30
Leu Lys Asp Leu Thr Asn Lys Arg Ala Lys Pro Ala Val His Phe Gly
35 40 45
Gly Lys Phe Arg Ile Ile Asp Phe Ala Leu Ser Asn Cys Ile Asn Ser
50 55 60
Gly Ile Arg Arg Met Gly Val Ile Thr Gln Tyr Gln Ser His Thr Leu
65 70 75 80
Val Gln His Ile Gln Arg Gly Trp Ser Phe Phe Asn Glu Glu Met Asn
85 90 95
Glu Phe Val Asp Leu Leu Pro Ala Gln Gln Arg Met Lys Gly Glu Asn
100 105 110
Trp Tyr Arg Gly Thr Ala Asp Ala Val Thr Gln Asn Leu Asp Ile Ile
115 120 125
Arg Arg Tyr Lys Ala Glu Tyr Val Val Ile Leu Ala Gly Asp His Ile
130 135 140
Tyr Lys Gln Asp Tyr Ser Arg Met Leu Ile Asp His Val Glu Lys Gly
145 150 155 160
Ala Arg Cys Thr Val Ala Cys Met Pro Val Pro Ile Glu Glu Ala Ser
165 170 175
Ala Phe Gly Val Met Ala Val Asp Glu Asn Asp Lys Ile Ile Glu Phe
180 185 190
Val Glu Lys Pro Ala Asn Pro Pro Ser Met Pro Asn Asp Pro Ser Lys
195 200 205
Ser Leu Ala Ser Met Gly Ile Tyr Val Phe Asp Ala Asp Tyr Leu Tyr
210 215 220
Glu Leu Leu Glu Glu Asp Asp Arg Asp Glu Asn Ser Ser His Asp Phe
225 230 235 240
Gly Lys Asp Leu Ile Pro Lys Ile Thr Glu Ala Gly Leu Ala Tyr Ala
245 250 255
His Pro Phe Pro Leu Ser Cys Val Gln Ser Asp Pro Asp Ala Glu Pro
260 265 270
Tyr Trp Arg Asp Val Gly Thr Leu Glu Ala Tyr Trp Lys Ala Asn Leu
275 280 285
Asp Leu Ala Ser Val Val Pro Glu Leu Asp Met Tyr Asp Arg Asn Trp
290 295 300
Pro Ile Arg Thr Tyr Asn Glu Ser Leu Pro Pro Ala Lys Phe Val Gln
305 310 315 320
Asp Arg Ser Gly Ser His Gly Met Thr Leu Asn Ser Leu Val Ser Gly
325 330 335
Gly Cys Val Ile Ser Gly Ser Val Val Val Gln Ser Val Leu Phe Ser
340 345 350
Arg Val Arg Val Asn Ser Phe Cys Asn Ile Asp Ser Ala Val Leu Leu
355 360 365
Pro Glu Val Trp Val Gly Arg Ser Cys Arg Leu Arg Arg Cys Val Ile
370 375 380
Asp Arg Ala Cys Val Ile Pro Glu Gly Met Val Ile Gly Glu Asn Ala
385 390 395 400
Glu Glu Asp Ala Arg Arg Phe Tyr Arg Ser Glu Glu Gly Ile Val Leu
405 410 415
Val Thr Arg Glu Met Leu Arg Lys Leu Gly His Lys Gln Glu Arg
420 425 430
<210>3
<211>59
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>3
gtgtgtgttc cagagatgat aaaaaaggag ttagtctgat gtccggcggt gcttttgcc 59
<210>4
<211>57
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>4
cgggaacatc tctgaacata catgtaaaac ctgcatttac gccccgccct gccactc 57
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>5
ataacccagt gattacggct gtc 23
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>6
cgatttgtgc tgcgggtaat g 21
<210>7
<211>57
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>7
atgtccgatc gtatcgatag agacgtgatt aacgcgtagt aagccagtat acactcc 57
<210>8
<211>57
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>8
ttacaatctc accggatcga tatgccagat atgatcttaa gggcaccaat aactgcc 57
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>9
ggggtgacac aataaaacag g 21
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>10
tggccccgtt ctatttattg g 21
<210>11
<211>1434
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1434)
<400>11
atg cag gtt tta cat gta tgt tca gag atg ttc ccg ctg ctt aaa acc 48
Met Gln Val Leu His Val Cys Ser Glu Met Phe Pro Leu Leu Lys Thr
1 5 10 15
ggc ggt ctg gct gat gtt att ggg gca tta ccc gca gca caa atc gca 96
Gly Gly Leu Ala Asp Val Ile Gly Ala Leu Pro Ala Ala Gln Ile Ala
20 25 30
gac ggc gtt gac gct cgc gta ctg ttg cct gca ttt ccc gat att cgc 144
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gta gaa ctg tgt gtc ttt gac gcc aat ggc cag gaa cat cgc tat gac 144
Val Glu Leu Cys Val Phe Asp Ala Asn Gly Gln Glu His Arg Tyr Asp
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ttg cca ggg cac agt ggc gac att tgg cac ggt tat ctg ccg gat gcg 192
Leu Pro Gly His Ser Gly Asp Ile Trp His Gly Tyr Leu Pro Asp Ala
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Gln Lys Phe Ala Asn Leu Arg Ala Tyr Tyr Gly Trp Met Trp Ala Phe
545 550 555 560
Pro Gly Lys Lys Leu Leu Phe Met Gly Asn Glu Phe Ala Gln Gly Arg
565 570 575
Glu Trp Asn His Asp Ala Ser Leu Asp Trp His Leu Leu Glu Gly Gly
580 585 590
Asp Asn Trp His His Gly Val Gln Arg Leu Val Arg Asp Leu Asn Leu
595 600 605
Thr Tyr Arg His His Lys Ala Met His Glu Leu Asp Phe Asp Pro Tyr
610 615 620
Gly Phe Glu Trp Leu Val Val Asp Asp Lys Glu Arg Ser Val Leu Ile
625 630 635 640
Phe Val Arg Arg Asp Lys Glu Gly Asn Glu Ile Ile Val Ala Ser Asn
645 650 655
Phe Thr Pro Val Pro Arg His Asp Tyr Arg Phe Gly Ile Asn Gln Pro
660 665 670
Gly Lys Trp Arg Glu Ile Leu Asn Thr Asp Ser Met His Tyr His Gly
675 680 685
Ser Asn Ala Gly Asn Gly Gly Thr Val His Ser Asp Glu Ile Ala Ser
690 695 700
His Gly Arg Gln His Ser Leu Ser Leu Thr Leu Pro Pro Leu Ala Thr
705 710 715 720
Ile Trp Leu Val Arg Glu Ala Glu
725
<210>19
<211>201
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(201)
<400>19
atg gat cat agt ctt aat tct tta aat aat ttc gat ttc ctg gcg cgt 48
Met Asp His Ser Leu Asn Ser Leu Asn Asn Phe Asp Phe Leu Ala Arg
1 5 10 15
agt ttt gcc aga atg cac gca gaa ggt cgc ccg gtc gat att ctg gcc 96
Ser Phe Ala Arg Met His Ala Glu Gly Arg Pro Val Asp Ile Leu Ala
20 25 30
gtt act ggt aac atg gat gaa gaa cat aga acc tgg ttt tgc gca cgt 144
Val Thr Gly Asn Met Asp Glu Glu His Arg Thr Trp Phe Cys Ala Arg
35 40 45
tat gcc tgg tat tgt caa cag atg atg cag gca aga gag ctg gag tta 192
Tyr Ala Trp Tyr Cys Gln Gln Met Met Gln Ala Arg Glu Leu Glu Leu
50 55 60
gag cac tga 201
Glu His
65
<210>20
<211>66
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>20
Met Asp His Ser Leu Asn Ser Leu Asn Asn Phe Asp Phe Leu Ala Arg
1 5 10 15
Ser Phe Ala Arg Met His Ala Glu Gly Arg Pro Val Asp Ile Leu Ala
20 25 30
Val Thr Gly Asn Met Asp Glu Glu His Arg Thr Trp Phe Cys Ala Arg
35 40 45
Tyr Ala Trp Tyr Cys Gln Gln Met Met Gln Ala Arg Glu Leu Glu Leu
50 55 60
Glu His
65
Claims (15)
1.肠杆菌科的产生L-氨基酸的细菌，其中已将所述细菌修饰，因而将糖原生物合成途径破坏。
2.根据权利要求1的细菌，其中通过衰减glgBX和/或glgCAP操纵子的表达来破坏所述糖原生物合成途径。
3.根据权利要求1的细菌，其中通过将glgBX和/或glgCAP操纵子失活来破坏所述糖原生物合成途径。
4.根据权利要求3的细菌，其中所述glgBX和/或glgCAP操纵子的失活通过缺失选自下组的基因来进行：glgB、glgX、glgC、glgA、glgP和它们的组合。
5.根据权利要求1的细菌，其中通过衰减glgS基因的表达来破坏所述糖原生物合成途径。
6.根据权利要求1的细菌，其中通过将glgS基因失活来破坏所述糖原生物合成途径。
7.根据权利要求1的细菌，其中所述细菌属于埃希氏菌属。
8.根据权利要求1的细菌，其中所述细菌属于泛菌属。
9.根据权利要求1的产生L-氨基酸的细菌，其中所述L-氨基酸选自下组：芳族L-氨基酸和非芳族L-氨基酸。
10.根据权利要求9的产生L-氨基酸的细菌，其中所述芳族L-氨基酸选自下组：L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。
11.根据权利要求9的产生L-氨基酸的细菌，其中所述非芳族L-氨基酸选自下组：L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、L-甘氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸。
12.产生L-氨基酸的方法，包括：
-在培养基中培养根据权利要求1的细菌以将所述L-氨基酸产生和分泌至培养基中，和
-从培养基中收集所述L-氨基酸。
13.根据权利要求12的方法，其中所述L-氨基酸选自下组：芳族L-氨基酸和非芳族L-氨基酸。
14.根据权利要求13的方法，其中所述芳族L-氨基酸选自下组：L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。
15.根据权利要求13的方法，其中所述非芳族L-氨基酸选自下组：L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、L-甘氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸。
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