KR20070108380A - 글리코겐 생합성 경로가 붕괴된 엔테로박테리아세애 과의세균을 사용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법 - Google Patents

글리코겐 생합성 경로가 붕괴된 엔테로박테리아세애 과의세균을 사용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

글리코겐 생합성 경로가 붕괴된 엔테로박테리아세애 (Enterobacteriaceae) 과의 세균, 특히 에스체리키아 (Escherichia) 또는 판토에아 (Pantoea) 속에 속하는 세균을 사용하여, L-아미노산을 생산하는 방법이 제공된다.
글리코겐 생합성 경로, 엔테로박테리아세애, L-아미노산, glgBX 오페론, glgCAP 오페론

Description

글리코겐 생합성 경로가 붕괴된 엔테로박테리아세애 과의 세균을 사용하여 Ｌ-아미노산을 생산하는 방법{A method for producing an L-amino acid using a bacterium of the Enterobacteriaceae family having a pathway of glycogen biosynthesis disrupted}
본 발명은 미생물학 산업에 관한, 구체적으로 글리코겐 생합성 경로가 붕괴되어진 엔테로박테리아세애 (Enterobacteriaceae) 과의 세균을 사용하여 L-아미노산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
글리코겐은 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 많은 다른 원핵생물을 위한 저장 탄소의 주요 형이며, 유지 에너지를 위해 쉽게 대사되는 기질을 제공한다. 에스체리키아 콜라이 내의 글리코겐 축적은 성장 속도와 반비례하며, 세포가 정지기에 들어갔을 때 가장 활발히 일어난다. 3종의 생합성 효소의 수준은 이들 조건하에서 상응하는 변화를 겪는데, 이는 효소 생합성의 유전자 제어가 적어도 조절의 일부를 설명할 수 있다는 것을 제시한다 (Preiss, J., Annu. Rev. Microbiol. 38, 419-458 (1984)). 에스체리키아 콜라이에서, 글리코겐 생합성을 위한 구조 유전자는 인접 오페론인 glgBX 및 glgCAP 상에 군집된다. 흥미롭게도, 글리코겐 생합성 (glgCA) 및 분해 (glgP) 유전자는, 아마도 생체내에서 이들 시스템의 조절을 용이하게 하기 위하여, 클러스터(cluster)로 함께 모여있다 (Romeo, T., Gene. 70(2), 363-76 (1988)). glgC 유전자는 글루코스-1-포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라제에 대한 구조 유전자이다. 글루코스-1--포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라제에 대한 동의어는 ADP-글루코스 신타제, ADP-글루코스 피로포스포랄라제, ADP: a-D-글루코스-1-포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라제, GlgC 단백질이다.
글루코스-1-포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 (EC 2.7.7.27)는 진정세균(eubacteria)의 글리코겐 생합성 경로 중의 알로스테릭(allosteric) 효소이다. 장내 세균(enteric bacteria) 중에서, 글루코스-1-포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라제는 당분해 중간체에 의해, 즉 활성화제로서 프럭토스 1,6-바이포스페이트 및 억제제로서 AMP, ADP 및 Pi에 의해 조절된다. 상기 효소는 글루코스 1-포스페이트 및 ATP로부터 ADP 글루코스 및 PPi의 합성을 촉매한다. 이 반응은 세균 글리코겐 생합성의 제1의 특유 단계이다.
에스체리키아 콜라이의 탄소 저장 조절 시스템이 탄수화물 대사 및 세포 운동성과 관련된 유전자의 발현을 제어한다는 것은 공지되어있다. glgCAP 전사체에 대한 CsrA의 결합이 glgCAP mRNA의 붕괴를 촉진하여 글리코겐 대사를 억제한다. CsrB RNA는 CsrA 단백질을 격리시키고 이의 작용을 방해함으로써 CsrA의 길항제로서 작용한다 (Baker, C.S. et al, Mol. Microbiol., 44(6), 1599-610 (2002)).
상기 glgCAP 오페론은 사이클릭 AMP (cAMP) 및 cAMP 수용체 단백질 (CRP)의 양성 조절하에 있다. 아데닐레이트 사이클라제 (EC 4.6.1.1)를 암호화하는 cya 유전자 및 CRP를 암호화하는 crp 유전자 둘 모두가 글리코겐의 최적 합성에 요구된다 (Fletterick, R.J. and Madsen, N.B., Annu. Rev. Biochem., 49, 31-61 (1980)). CRP는 glgC 유전자의 상류에 위치한 부위에 결합한다. 이.콜라이 (E. coli) 내에서의 글리코겐 생합성은 또한 ppGpp에 의해 양성으로 조절되는데, 이는 glgCAP 오페론의 전사를 자극한다 (Preiss. J., and Romeo, T., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 47, 299-329 (1994)).
미니-Mu 램덤 염색체 라이브러리를 사용하여 글리코겐 과발현을 스크리닝함으로써, 글리코겐 합성에 관여하는 신규 유전자 (glgS)를 동정하였다 (Hengge-Aronis, R. and Fischer, D., Mol Microbiol. 6, 14, 1877-86 (1992)). 또한, 에스체리키아 콜라이 단백질 GlgS가 결핍 스트레스에 반응하여 상향조절된다는 것이 밝혀졌으며, 이의 과발현이 글리코겐 합성을 자극한다는 것이 밝혀졌다 (Kozlov, G. et al, BMC Biol., 2, 1, 10 (2004)).
당분해 생합성에 대한 초기 기질은 글루코스-6-P로부터 수득된 글루코스-1-P이므로, 상기 경로는 글루코스-6-P에 대하여 당분해와 경쟁한다. 그러나, 현재 L-아미노산의 생산을 위하여, glgBX 및/또는 glgCAP 오페론을 불활성화시키거나 또는 glgS 유전자를 불활성화시킨다는 보고는 없다.
발명의 개요
본 발명의 목적은 L-아미노산 생산 균주의 생산성을 증가시키고, 이들 균주 를 사용하여 L-아미노산을 생산하는 방법을 제공함을 포함한다.
상기 목적은, glgBX 및/또는 glgCAP 오페론의 불활성화가 L-아미노산, 예를 들어 L-트레오닌, L-리신, L-시스테린, L-류신, L-히스티딘, L-글루탐산, L-페닐알라닌, L-트립토판, L-프롤린 및 L-아르기닌의 생산을 증강시킬 수 있다는 발견을 토대로 달성되었다.
본 발명은 아미노산, 예를 들어 L-트레오닌, L-리신, L-시스테인, L-류신, L-히스티딘, L-글루탐산, L-페닐알리닌, L-트립토판, L-프롤린 및 L-아르기닌을 생산할 수 있는 능력이 증가된 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae) 과의 세균을 제공한다.
본 발명의 목적은, 글리코겐 생합성 경로가 붕괴되도록 변형되어진, 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae) 과의 L-아미노산 생산 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 글리코겐 생합성 경로가 glgBX 및/또는 glgCAP 오페론의 발현을 감쇠(attenuation)시킴으로써 붕괴되어진, 상기와 바와 같은 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 글리코겐 생합성 경로가 glgBX 및/또는 glgCAP 오페론을 불활성화시킴으로써 붕괴되어진, 상기와 바와 같은 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, glgBX 및/또는 glgCAP 오페론의 불활성화가 glgB, glgX , glgC , glgA 및 glgP, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자의 하나 이상을 결실시킴으로써 달성되어진, 상기한 바아 같은 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 글리코겐 생합성 경로가 glgS 유전자의 발현을 감쇠시킴으로써 붕괴되어진, 상기한 바와 같은 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 글리코겐 생합성 경로가 glgS 유전자를 불활성화시킴으로써 붕괴되어진, 상기한 바와 같은 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 에스체리키아(Escherichia) 속에 속하는 상기한 바와 같은 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 판토에아(Pantoea) 속에 속하는 상기한 바와 같은 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 L-아미노산이 방향족 L-아미노산 및 비-방향족 L-아미노산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기한 바와 같은 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방향족 L-아미노산이 L-페닐알라닌, L-티로신 및 L-트립토판으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기한 바와 같은 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 비-방향족 L-아미노산이 L-트레오닌, L-리신, L-시스테인, L-메티오닌, L-류신, L-이소류신, L-발린, L-히스티딘, L-글리신, L-세린, L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루타민, L-글루탐산, L-프롤린 및 L-아르기닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기한 바와 같은 세균 을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은,
- 상기한 바와 같은 세균을 배지 중에 배양하여, 배지 중에 L-아미노산을 생성 및 분비시키는 단계, 및
- 상기 배지로부터 상기 L-아미노산을 수집하는 단계
를 포함하여, L-아미노산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 L-아미노산이 방향족 L-아미노산 및 비-방향족 L-아미노산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기한 바와 같은 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방향족 L-아미노산이 L-페닐알라닌, L-티로신 및 L-트립토판으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기한 바와 같은 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 비-방향족 L-아미노산이 L-트레오닌, L-리신, L-시스테인, L-메티오닌, L-류신, L-이소류신, L-발린, L-히스티딘, L-글리신, L-세린, L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루타민, L-글루탐산, L-프롤린 및 L-아르기닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기한 바와 같은 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 cat 유전자의 증폭에 사용되는 플라스미드 pACYC184 상에서 프라이머 glgCL 및 glgCR의 상대적 위치를 보여준다.
도 2는 불활성화된 glgC 유전자를 함유하는 염색체 DNA 단편의 작제를 도시한다.
도 3은 불활성화된 glgBX 및 glgCAP 오페론을 함유하는 염색체 DNA 단편의 작제를 도시한다.
본 발명은 아래에 상세히 기술된다.
1. 본 발명의 세균
본 발명의 세균은, 글리코겐 생합성 경로가 붕괴되도록 변형되어진, 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae) 과의 L-아미노산-생산 세균이다.
본 발명에서, "L-아미노산 생산 세균"은 세균을 배지에서 배양하는 경우, 배지 중에 L-아미노산을 생성 및 분비할 수 있는 능력을 갖는 세균을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "L-아미노산 생산 세균"은 또한 이. 콜라이 K-12와 같은 이. 콜라이의 야생형 또는 모균주 보다 다량으로 L-아미노산을 배양 배지 중에 생성 및 축적시킬 수 있는 세균을 의미하고, 바람직하게는 표적 L-아미노산을 0.5g/L 이상, 보다 바람직하게는 1.0g/L 이상의 양으로 배지에 축적시킬 수 있는 세균을 의미한다. 상기 용어 "L-아미노산"은 L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-글루탐산, L-글루타민, L-글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판 및 L-발린을 포함한다.
"방향족 L-아미노산"이란 용어는 L-페닐알라닌, L-티로신 및 L-트립토판을 포함한다. "비-방향족 L-아미노산"이란 용어는 L-트레오닌, L-리신, L-시스테인, L-메티오닌, L-류신, L-이소류신, L-발린, L-히스티딘, L-글리신, L-세린, L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루타민, L-글루탐산, L-프롤린 및 L-아르기닌을 포함한다. L-트레오닌, L-리신, L-시스테인, L-류신, L-히스티딘, L-글루탐산, L-페닐알라닌, L-트립토판, L-프롤린 및 L-아르기닌이 특히 바람직하다.
엔테로박테리아세애 과에는 에스체리키아(Escherichia) 속, 엔테로박터(Enterobacter) 속, 에르위니아(Erwinia) 속, 크렙시엘라(Klebsiella) 속, 판토에아 (Pantoea) 속, 포토르하브두스 (Photorhabdus) 속, 프로비덴시아 (Providencia) 속, 살모넬라 (Salmonella) 속, 세라티아 (Serratia) 속, 쉬겔라 (Shigella) 속, 모르가넬라 (Morganella) 속 및 예르시니아 (Yersinia) 속 등에 속하는 세균이 포함된다. 구체적으로, NCBI (National Center for Biotechnology Information) 데이타베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock)에 사용되는 분류법에 따라 엔테로박테리아세애로 분류되는 것들이 사용될 수 있다. 에스체리키아 속 또는 판토에아 속에 속하는 세균이 바람직하다.
"에스체리키아 속에 속하는 세균"이란 표현은, 세균이 미생물학 분야의 당업자에게 공지된 분류법에 따라 에스체리키아 속으로 분류됨을 의미한다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 에스체리키아 속에 속하는 세균의 예로는 에스체리키아 콜라이(이. 콜라이)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용될 수 있는 에스체리키아 속에 속하는 세균은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 문헌 [Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1]에 기재된 세균이 본 발명에 포함된다.
"판토에아 속에 속하는 세균"이란 표현은, 세균이 미생물학 분야의 당업자에게 공지된 분류법에 따라 판토에아 속으로 분류됨을 의미한다. 엔테로박터 애글로메란스 (Enterobacter agglomerans)의 일부 종은 최근에 16S rRNA의 뉴클레오티드 서열 분석 등을 토대로 하여 판토에아 애글로메란스(Pantoea agglomerans), 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) 및 판토에아 스튜아르티( Pantoea stewartii) 등으로 재분류되었다 [참조문헌: Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)]. 이러한 균주는 "판토에아 속에 속하는 세균"에 포함된다.
"글리코겐 생합성 경로가 붕괴되도록 세균이 변형되어졌다"란 표현은, 세균이 변형되어, 변형된 세균이 변형되지 않은 세균에 비해 글리코겐을 합성할 수 있는 능력이 감소되거나, 또는 글리코겐을 합성 및 축적할 수 없도록 되어졌다는 것을 의미한다. 글리코겐 생합성 경로의 붕괴는 글리코겐 생합성에 관련된 효소를 암호화하는 유전자, 예를 들어 GlgB, GlgX, GlgC, GlgA, GlgP 및 GlgS의 발현을 감쇠시킴으로써, 바람직하게는 상기 유전자들을 불활성화시킴으로써 달성될 수 있다.
"glgBX 및/또는 glgCAP 오페론의 발현의 감쇠" 또는 "glgS 유전자의 발현의 감쇠"란 표현은, 표적 오페론 또는 유전자가 변형되어, 변형된 오페론 또는 유전자가 활성이 감소한 돌연변이 단백질(들)을 암호화하는 것을 의미한다. "glgBX 및/또는 glgCAP 오페론의 불활성화" 또는 "glgS 유전자의 불활성화"란 표현은, 이러한 변형된 오페론 또는 유전자가 완전히 불활성인 단백질(들)을 암호화하는 것을 의미한다. 또한, 변형된 DNA 영역은, 유전자(들)의 일부의 결실, 유전자(들)의 판독 프레임의 이동, 미스센스/넌센스 돌연변이(들)의 도입, 또는 유전자(들)의 인접 영역, 예를 들어 프로모터(들), 인핸서(들), 감쇠인자(attenuator), 리보솜-결합 부위(들)와 같이 유전자 발현을 조절하는 서열의 변형, 등으로 인해 유전자(들)을 천연적으로 발현할 수 없을 수도 있다.
유전자 발현의 수준은, 다양한 공지된 방법, 예를 들어 노던 블롯팅, 정량적 RT-PCR 등을 사용하여, 유전자로부터 전사된 mRNA의 양을 측정함으로써 판단될 수 있다. 유전자에 의해 암호화된 단백질의 양은, 공지된 방법, 예를 들어 SDS-PAGE 후의 면역블롯팅 검정 (웨스턴 블롯팅 분석) 등에 의해 측정될 수 있다.
glgC 유전자는 글루코스-1-포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 (동의어 B3430)를 암호화한다. glgC 유전자 (gi: 16131304; GenBank 승인 번호 NC_000913.2 하의 뉴클레오티드 3566056 내지 3567351에 상보적인 뉴클레오티드; 서열번호 1)는 이.콜라이 K-12의 염색체 상의 glgA와 g lgX 유전자 사이에 위치한다. glgC 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 glgC 유전자에 의해 암호화되는 글루코스-1-포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라제의 아미노산 서열은 서열번호 1 및 서열번호 2로 각각 제시된다.
glgA 유전자는 글리코겐 신타제 (동의어 B3429)의 아단위를 암호화한다. glgA 유전자 (뉴클레오티드 위치: 3,566,056 내지 3,564,623; GenBank 승인 번호NC_000913.2; gi: 49175990)는 이.콜라이 K-12의 염색체 상의 glgP와 g lgC 유전자 사이에 위치한다. glgA 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 glgA 유전자에 의해 암호화되는 글리코겐 신타제의 아단위의 아미노산 서열은 서열번호 11 및 서열번호 12로 각각 제시된다.
glgP 유전자는 글리코겐 포스포릴라제/글리코겐-말토테트라오스 포스포릴라제 (동의어 B3428, GlgY)를 암호화한다. glgP 유전자 (뉴클레오티드 위치: 3,564,604 내지 3,562,157; GenBank 승인 번호 NC_000913.2; gi: 49175990)는 이.콜라이 K-12의 염색체 상의 yzgL와 glgA 유전자 사이에 위치한다. glgP 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 glgP 유전자에 의해 암호화되는 글리코겐 포스포릴라제/글리코겐-말토테트라오스 포스포릴라제의 아단위의 아미노산 서열은 서열번호 13 및 서열번호 14로 각각 제시된다.
glgX 유전자는 글리코겐 포스포릴라제-한계 덱스트린 (limit dextrin) α-1,6-글루코하이드롤라제 (동의어 -B3431, GlyX)를 암호화한다. glgX 유전자 (뉴클레오티드 위치: 3,569,342 내지 3,567,369; GenBank 승인 번호 NC_000913.2; gi: 49175990)는 이.콜라이 K-12의 염색체 상의 glgC와 glgB 유전자 사이에 위치한다. glgX 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 glgX 유전자에 암호화되는 글리코겐 포스포릴라제-한계 덱스트린(limit dextrin) α-1,6-글루코하이드롤라제의 아미노산 서열은 서열번호 15 및 서열번호 1으로 각각 제시된다.
glgB 유전자는 글리코겐 분지(branching) 효소 (동의어 B3432)를 암호화한다. glgB 유전자 (뉴클레오티드 위치: 3,571,525 내지 3,569,339; GenBank 승인 번호 NC_000913.2; gi: 49175990)는 이.콜라이 K-12의 염색체 상의 glgX와 asd 유전자 사이에 위치한다. glgB 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 glgB 유전자에 의해 암호화되는 글리코겐 분지(branching) 효소의 아미노산 서열은 서열번호 17 및 서열번호 18로 각각 제시된다.
glgS 유전자는 글리코겐 생합성의 rpoS-의존성 단백질 (동의어 B3049)를 암호화한다. glgS 유전자 (뉴클레오티드 위치: 3,189,961 내지 3,189,761; GenBank 승인 번호 NC_000913.2; gi: 49175990)는 이.콜라이 K-12의 염색체 상의 yqiI와 yqiJ ORF 사이에 위치한다. glgS 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 glgS 유전자에 의해 암호화되는 글리코겐 생합성의 rpoS-의존성 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 19 및 서열번호 20으로 각각 제시된다.
엔테로박테리아세애 과의 속 또는 균주 간의 DNA 서열이 다소 상이할 수 있기 때문에, 염색체 상에서 결실될 glgC 유전자가 서열번호 1에 제시된 유전자로 한정되지 않으며, 서열번호 1의 상동성 유전자를 포함할 수 있다. 따라서, glgC 유전자에 암호화되는 단백질 변이체는, 불활성화 전에 글루코스-1-포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라제의 활성이 유지되는 한, 서열번호 2에 제시된 암호화된 전체 아미노산 서열에 대해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
또한, glgC 유전자는 엄격한 조건하에 서열번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화되는 변이체이거나, 또는 상기 뉴클레오티드 서열로부터 제조될 수 있는 프로브일 수 있으나, 단, 이는 불활성화 전에 1-포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라제를 암호화한다. "엄격한 조건"은 특이적 하이브리드, 예를 들면 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 갖는 하이브리드는 형성되어지고, 비-특이적 하이브리드, 예를 들면 상기한 것보다 낮은 상동성을 갖는 하이브리드는 형성되지 않는 조건을 포함한다. 예를 들면, 엄격한 조건은, 60℃에서 1 X SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 0.1 X SSC, 0.1% SDS에 상응하는 염 농도에서 1회, 바람직하게는 2회 또는 3회 세척하는 것으로 예시된다. 프로브의 길이는 하이브리드화 조건에 따라 적절히 선택될 수 있고, 통상적으로 100 bp 내지 1 kbp이다.
glgC 유전자에 대한 상기한 바와 유사한 표현이 glgBX 및 glgCAP 오페론의 다른 유전자의 변이체에 대해 적용될 수 있다.
유전자의 불활성화는 통상의 방법, 예를 들면 UV 조사 또는 니트로소구아니딘 (N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘) 처리를 사용한 돌연변이유발 처리, 부위-지시된 돌연변이유발, 상동 재조합을 사용한 유전자 파괴, 및/또는 레드-유도된 통합 (Red-driven integration)이라 불리는 삽입-결실 돌연변이유발에 의해 실행될 수 있다 [참조문헌: Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 5978-83 및 Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45].
glgC 유전자에 의해 암호화되는 글루코스-1-포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라제의 활성은 예를 들면 문헌 [Haugen, T.H. et al., J. Biol. Chem. 251 (24), 7880-5 (1976)]에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 세균에서 글루코스-1-포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라제의 활성 감소 또는 부재는 변형되지 않은 모(母) 세균과 비교하면 판정할 수 있다.
glgA 유전자에 의해 암호화되는 글리코겐 신타제의 활성은 예를 들어 문헌[Fox, J. et al., Methods Enzymol., 28, 539-544 (1972)]에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 세균에서 글리코겐 신타제의 활성 감소 또는 부재는 변형되지 않은 모 세균과 비교하면 판정할 수 있다.
glgP 유전자에 의해 암호화되는 글리코겐 포스포릴라제/글리코겐-말토테트라오스 포스포릴라제의 활성은 예를 들어 문헌[Graves, D.J. and Wang, J.H., The Enzymes, 7 (3rd ed.), 435-482 (1972)]에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 세균에서 글리코겐 포스포릴라제/글리코겐-말토테트라오스 포스포릴라제의 활성 감소 또는 부재는 변형되지 않은 모 세균과 비교하면 판정할 수 있다.
glgX 유전자에 의해 암호화되는 글리코겐 포스포릴라제-한계 덱스트린 α-1,6-글루코하이드롤라제의 활성은, 예를 들어 문헌[Jeanningros, R. et al., Biochim Biophys Acta, 438(1), 186-199 (1976)]에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 세균에서 글리코겐 포스포릴라제-한계 덱스트린 α-1,6-글루코하이드롤라제의 활성 감소 또는 부재는 변형되지 않은 모 세균과 비교하면 판정할 수 있다.
glgB 유전자에 암호화되는 글리코겐-분지 효소의 활성은, 예를 들어 문헌 [Illingworth, B.B. and Brown, D.H., Methods Enzymol., 8, 395-403 (1966)]에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 세균에서 글리코겐-분지 효소의 활성 감소 또는 부재는 변형되지 않은 모 세균과 비교하면 판정할 수 있다.
glgS 유전자에 의해 암호화되는 글리코겐 생합성의 rpoS-의존성 단백질의 활성은, 예를 들어 문헌 [Hengge-Aronis, R, and Fischer, D., Mol. Microbiol., 6, 14, 1877-1886 (1992)]에 기재된 바와 같이 글리코겐 합성을 억제하는 glgS-무효화 돌연변이 (null mutation)의 보충에 의해 검출될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 세균에서 글리코겐 생합성의 rpoS-의존성 단백질의 활성 감소 또는 부재는 변형되지 않은 모 세균과 비교하면 판정할 수 있다.
플라스미드 DNA의 제조 방법, DNA의 분해 및 연결 방법, 형질전환 방법, 프라이머로서 올리고뉴클레오티드의 선택 방법 등은 당업자에게 익히 공지된 통상의 방법일 수 있다. 이들 방법은 예를 들어 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 기재되어 있다. .
L-아미노산 생산 세균
glgBX 및/또는 glgCAP 오페론 또는 glgS 유전자가 불활성화되도록 변형된 본 발명의 세균으로서, 방향족 또는 비-방향족 L-아미노산을 생산할 수 있는 세균이 사용될 수 있다.
본 발명의 세균은, 본질적으로 L-아미노산을 생산할 수 있는 능력을 가진 세균에서 glgBX 및/또는 glgCAP 오페론 또는 glgS 유전자를 불활성화시킴으로써 수득될 수 있다. 달리, 본 발명의 세균은, 이미 불활성화된 glgBX 및/또는 glgCAP 오페론 또는 glgS 유전자를 가진 세균에 L-아미노산 생산 능력을 부여함으로써 수득될 수 있다.
L-트레오닌 생산 세균
본 발명의 L-트레오닌 생산 세균을 수득하기 위한 모균주의 예로는 이. 콜라이 TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (미국 특허 제5,175,107호 및 제5,705,371호), 이. 콜라이 NRRL-21593 (미국 특허 제5,939,307호), 이. 콜라이 FERM BP-3756 (미국 특허 제5,474,918호), 이. 콜라이 FERM BP-3519 및 FERM BP-3520 (미국 특허 제5,376,538호), 이. 콜라이 MG442 (참조문헌: Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 1978, 14: 947-956), 이. 콜라이 VL643 및 VL2055 (EP 1149911 A) 등과 같은 에스체리키아 속에 속하는 균주가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
균주 TDH-6은 수크로스-동화작용을 가질 뿐만 아니라 thrC 유전자가 결핍되어 있고, ilvA 유전자는 누설(leaky) 돌연변이를 갖는다. 이러한 균주는 또한 rhtA 유전자에 돌연변이를 갖고 이러한 돌연변이는 고농도의 트레오닌 또는 호모세린에 대해 내성을 부여한다. 균주 B-3996은 돌연변이 thrA 유전자를 함유하는 thrA * BC 오페론을 RSF1010-유도된 벡터 속에 삽입함으로써 수득된 플라스미드 pVIC40을 함유한다. 이러한 돌연변이 thrA 유전자는 트레오닌에 의한 피드백 억제가 실질적으로 탈감작된 아스파르토키나제 호모세린 데하이드로게나제 I를 암호화한다. 균주 B-3996은 1987년 11월 19일자로 기탁기관 [All-Union Scientific Center of Antibiotics (Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russian Federation)]에 수탁번호 RIA 1867로 기탁되었다. 당해 균주는 또한 1987년 4월 7일자로 기탁기관 [Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd,. 1)]에 기탁번호 B-3996으로 기탁되었다.
바람직하게는, 본 발명의 세균은 하기의 하나 이상의 유전자의 발현이 증강되도록 추가로 변형된다:
- 트레오닌에 의한 피드백 억제에 내성인 아스파르토키나제 호모세린 데하이드로게나제 I를 암호화하는 돌연변이 thrA 유전자;
- 호모세린 키나제를 암호화하는 thrB 유전자;
- 트레오닌 신타제를 암호화하는 thrC 유전자;
- 추정 막관통(transmembrane) 단백질을 암호화하는 rhtA 유전자;
- 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제를 암호화하는 asd 유전자; 및
- 아스파르테이트 아미노트랜스페라제 (아스파르테이트 트랜스아미나제)를 암호화하는 aspC 유전자.
에스체리키아 콜라이의 아스파르토키나제 호모세린 데하이드로게나제 I를 암호화하는 thrA 유전자가 밝혀졌다 (뉴클레오티드 위치 337번 내지 2799번, GenBank 승인 번호 NC_000913.2, gi:49175990). thrA 유전자는 이. 콜라이 K-12의 염색체 상에서 thrL과 thrB 유전자 사이에 위치한다. 에스체리키아 콜라이의 호모세린 키나제를 암호화하는 thrB 유전자가 밝혀졌다 (뉴클레오티드 위치 2801번 내지 3733번; GenBank 승인 번호 NC_000913.2, gi:49175990). thrB 유전자는 이. 콜라이 K-12의 염색체 상에서 thrA와 thrC 유전자 사이에 위치한다. 에스체리키아 콜라이의 트레오닌 신타제를 암호화하는 thrC 유전자가 밝혀졌다 (뉴클레오티드 위치 3734번 내지 5020번, GenBank 승인 번호 NC_000913.2, gi:49175990). thrC 유전자는 이. 콜라이 K-12의 염색체 상에서 thrB 유전자와 yaaX 개방 판독 프레임 사이에 위치한다. 3개의 유전자 모두가 단일 트레오닌 오페론으로서 작용한다.
thrB 및 thrC 유전자뿐만 아니라, 트레오닌에 의한 피드백 억제에 내성인 아스파르토키나제 호모세린 데하이드로게나제 I를 암호화하는 돌연변이 thrA 유전자는 트레오닌 생산 이. 콜라이 균주 VKPM B-3996로 제공되는 널리 공지된 플라스미드 pVIC40으로부터 하나의 오페론으로서 수득될 수 있다. 플라스미드 pVIC40은 미국 특허 제5,705,371호에 상세히 기재되어 있다.
rhtA 유전자는 글루타민 수송 시스템의 성분을 암호화하는, glnHPQ 오페론에 인접하게 이. 콜라이 염색체상의 18분에 존재한다. rhtA 유전자는 ORF1 (ybiF 유전자, 뉴클레오티드 위치 764번 내지 1651번, GenBank 승인번호 AAA218541, gi:440181)과 동일하고 pexB와 ompX 유전자 사이에 위치한다. ORF1에 의해 암호화되는 단백질을 발현하는 단위는 rhtA 유전자 (rht: 호모세린 및 트레오닌에 대한 내성)로 명명되었다. 또한, rhtA23 돌연변이는 ATG 개시 코돈에 대해 -1번 위치에서 G가 A로 치환된 것으로 밝혀졌다 [참조문헌: ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with the Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California, August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A).
이. 콜라이의 asd 유전자는 이미 밝혀졌고 (뉴클레오티드 위치 3572511번 내지 3571408번, GenBank 승인 번호 NC_000913.1, gi:16131307), 유전자의 뉴클레오티드 서열을 토대로 제조된 프라이머를 사용하여 PCR (중합효소 연쇄 반응, White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989) 참조)에 의해 수득될 수 있다. 다른 미생물의 asd 유전자는 유사한 방식으로 수득될 수 있다.
또한, 이. 콜라이의 aspC 유전자는 이미 밝혀졌고 (뉴클레오티드 위치 983742번 내지 984932번, GenBank 승인 번호 NC_000913.1, gi:16128895), PCR에 의해 수득될 수 있다. 다른 미생물의 aspC 유전자는 유사한 방식으로 수득될 수 있다.
L-리신 생산 세균
에스체리키아 속에 속하는 L-리신 생산 세균의 예로는 L-리신 유사체에 내성을 갖는 돌연변이가 포함된다. L-리신 유사체는 에스체리키아 속에 속하는 세균의 성장을 억제하지만, 이러한 억제는 L-리신이 배지 중에 공존하는 경우 완전히 또는 부분적으로 탈감작된다. L-리신 유사체의 예로는 옥살리신, 리신 하이드록사메이트, S-(2-아미노에틸)-L-시스테인(AEC), γ-메틸리신, α-클로로캄프롤락탐 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 리신 유사체에 내성을 갖는 돌연변이체는 에스체리키아 속에 속하는 세균을 통상적인 인공 돌연변이유발 처리에 적용함으로써 수득될 수 있다. L-리신의 생산에 유용한 세균 균주의 구체적 예로는 에스체리키아 콜라이 AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 미국 특허 제4,346,170호) 및 에스체리키아 콜라이 VL611가 포함된다. 이들 미생물에서, L-리신에 의한 아스파르토키나제의 피드백 억제는 탈감작된다.
균주 WC196은 에스체리키아 콜라이의 L-리신 생산 세균으로서 사용할 수 있다. 이 세균 균주는 에스체리키아 콜라이 K-12로부터 유래하는 균주 W3110에 AEC 내성을 부여함으로써 개량되었다. 수득된 균주는 에스체리키아 콜라이 AJ13069 균주로 명명되었고, 1994년 12월 6일자로 기탁기관 [National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (현재, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan)]에 기탁되어, 수탁번호 FERM P-14690을 부여받았다. 이어서, 부다페스트 조약하에 1995년 9월 29일자로 국제 기탁으로 이관되었고, 수탁 번호 FERM BP-5252 (미국 특허 제5,827,698호)를 부여받았다.
본 발명의 L-리신 생산 세균을 수득하기 위한 모균주의 예로는, L-리신 생합성 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자의 발현이 증강된 균주가 포함된다. L-리신 생합성에 관련된 효소의 예로는 디하이드로디피콜리네이트 신타제 (dapA), 아스파르토키나제 (lysC), 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제 (dapB), 디아미노피멜레이트 데카복실라제 (lysA), 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제 (ddh) (미국 특허 제6,040,160호), 포스포엔올피르베이트 카복실라제 (ppc), 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제 (asd), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 트랜스하이드로게나제 (pntAB), 및 아스파르타제 (aspA) (EP 1253195 A)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 L-리신 생산 세균을 수득하기 위한 모균주의 예로는, L-리신의 생합성 경로로부터 분기시킴으로써 L-리신 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매시키는 효소의 활성이 감소되거나 제거된 균주가 포함된다. L-리신의 생합성 경로로부터 분기시킴으로써 L-리신 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매시키는 효소의 예로는 호모세린 데하이드로게나제 및 리신 데카복실라제 (미국 특허 제5,827,698호)가 포함된다.
L-시스테인 생산 세균
본 발명의 L-시스테인 생산 세균을 수득하기 위한 모균주의 예로는, 피드백-내성 세린 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 상이한 cysE 대립형질유전자로 형질전환된 이. 콜라이 JM15 (미국 특허 제6,218,168호, 러시아 특허 출원 제2003121601호); 세포에 독성인 물질을 분비하는데 적합한 단백질을 암호화하는 과발현된 유전자를 가진 이. 콜라이 W3110 (미국 특허 제5,972,663호); 시스테인 데설포하이드라제 활성이 저하된 이. 콜라이 균주 (JP11155571A2); cysB 유전자에 의해 암호화되는 시스테인 레귤론(regulon)에 대한 양성 전사 조절인자의 활성이 증가된 이. 콜라이 W3110 (WO0127307A1) 등과 같은 에스체리키아 속에 속하는 균주가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
L-류신 생산 세균
본 발명의 L-류신 생산 세균을 수득하기 위한 모균주의 예로는, 류신에 내성인 이. 콜라이 균주, 예를 들어 균주 57 (VKPM B-7386, 미국 특허 제 6,124,121호) 또는 β-2-티에닐알라닌, 3-하이드록시류신, 4-아자류신, 5,5,5-트리플루오로류신과 같은 류신 유사체에 대해 내성인 이.콜라이 균주 (JP 62-34397 B 및 JP 8-70879 A); WO96/06926에 기재된 유전 공학에 의해 수득된 이.콜라이 균주; 이. 콜라이 H-9068 (JP 8-70879 A), 등과 같은 에스체리키아 속에 속하는 균주가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 세균은 L-류신 생합성에 관련된 하나 이상의 유전자의 발현을 증강시킴으로써 개량될 수 있다. 바람직하게는, L-류신에 의한 피드백 억제로부터 자유로운 이소프로필말레이트 신타제를 암호화하는 돌연변이 leuA 유전자로 대표되는 leuABCD 오페론의 유전자가 예로 포함된다 (미국 특허 제6,403,342호). 추가로, 본 발명의 세균은, 세균 세포로부터 L-아미노산을 분비하는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자의 발현을 증강시킴으로써 개량될 수 있다. 이러한 유전자의 예로는 b2682 및 b2683 유전자 (ygaZH 유전자) (EP 1239041 A2)가 포함된다.
L-히스티딘 생산 세균
본 발명의 L-히스티딘 생산 세균을 수득하기 위한 모균주의 예로는 이. 콜라이 균주 24 (VKPM B-5945, RU2003677); 이. 콜라이 균주 80 (VKPM B-7270, RU2119536); 이. 콜라이 NRRL B-12116-B12121 (미국 특허 제4,388,405호); 이. 콜라이 H-9342 (FERM BP-6675) 및 H-9343 (FERM BP-6676) (미국 특허 제6,344,347호); 이. 콜라이 H-9341 (FERM BP-6674) (EP 1085087); 이. 콜라이 AI80/pFM201 (미국 특허 제6,258,554호) 등과 같은 에스체리키아 속에 속하는 균주가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 L-히스티딘 생산 세균을 수득하기 위한 모균주의 예로는 또한, L-히스티딘 생합성 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자의 발현이 증강된 균주가 포함된다. L-히스티딘-생합성 효소의 예로는 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (hisG), 포스포리보실 AMP 사이클로하이드롤라제 (hisI), 포스포리보실-ATP 피로포스포하이드롤라제 (hisIE), 포스포리보실포르미미노-5-아미노이미다졸 카복사미드 리보타이드 이소머라제 (hisA), 아미도트랜스퍼라제 (hisH), 시스티디놀 포스페이트 아미노트랜스퍼라제 (hisC), 히스티디놀 포스파타제 (hisB), 히스티디놀 데하이드로게나제 (hisD), 등이 포함된다.
L-히스티딘 생합성 효소를 암호화하는 유전자 (hisG, hisBHAFI)가 L-히스티딘에 의해 억제된다는 것이 공지되었으므로, L-히스티딘 생산 능력이 또한 피드백 억제에 대한 내성을 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (hisG)에 부여하는 돌연변이를 도입함으로써 효율적으로 증강될 수 있다 (러시아 특허 제2003677호 및 제2119536호).
L-히스티딘 생산 능력을 가진 균주의 구체적 예로는, L-히스티딘 생합성 효소를 암호화하는 DNA를 보유하는 벡터가 도입되어진 이.콜라이 FERM-P 5038 및 5048 (JP 56-005099 A), 아미노산 배출을 위한 유전자인 rht가 도입된 이.콜라이 균주 (EP1016710A), 설파구아니딘, DL-1,2,4-트리아졸-3-알라닌 및 스트렙토마이신-내성이 부여된 이.콜라이 80 균주 (VKPM B-7270, 러시아 특허 제2119536호), 등이 포함된다.
L-글루탐산 생산 세균
본 발명의 L-글루탐산 생산 세균을 수득하기 위한 모균주의 예로는 이. 콜라이 VL334thrC+ (EP 1172433)과 같은 에스체리키아 속에 속하는 균주가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이. 콜라이 VL334 (VKPM B-1641)은 thrC 및 ilvA 유전자에 돌연변이를 갖는 L-이소류신 및 L-트레오닌 영양요구성 균주이다 (미국 특허 제4,278,765호). thrC 유전자의 야생형 대립형질 유전자는 야생형 이. 콜라이 K12 (VKPM B-7) 세포 상에서 성장된 박테리오파아지 P1을 사용하는 일반적인 형질도입 방법에 의해 전달되었다. 결과로서, L-이소류신 영양요구성 균주 VL334thrC+ (VKPM B-8961)가 수득되었다. 이 균주는 L-글루탐산을 생산할 수 있다.
본 발명의 L-글루탐산 생산 세균을 수득하기 위한 모균주의 예로는 L-글루탐산 생합성 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자의 발현이 증강된 균주가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. L-글루탐산 생합성에 관련된 효소의 예로는 글루타메이트 데하이드로게나제, 글루타민 신테타제, 글루타메이트 신테타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 아코니테이트 하이드라타제, 시트레이트 신타제, 포스포엔올피루베이트 카복실라제, 피루베이트 카복실라제, 피루베이트 데하이드로게나제, 피루베이트 키나제, 포스포엔올피루베이트 신타제, 엔올라제, 포스포글리세로무타제, 포스포글리세레이트 키나제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 프럭토스 바이포스페이트 알돌라제, 포스포프럭토키나제 및 글루코스 포스페이트 이소머라제가 포함된다.
시트레이트 신테타제 유전자, 포스포엔올피루베이트 카복실라제 유전자 및/또는 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자의 발현이 증강되도록 변형된 균주의 예로는 EP1078989A, EP955368A 및 EP952221A에 기재된 것들이 포함된다.
본 발명의 L-글루탐산 생산 세균을 수득하기 위한 모균주의 예로는 또한, L-글루탐산 생합성 경로로부터 분기시킴으로써 L-글루탐산 이외의 화합물의 합성을 촉매하는 효소의 활성이 감소하거나 제거된 균주가 포함된다. 이러한 효소의 예로는 이소시트레이트 리아제, α-케토글루타레이트 데하이드로게나제, 포스포트랜스아세틸라제, 아세테이트 키나제, 아세토하이드록시 산 신타제, 아세토락테이트 신타제, 포르메이트 아세틸트랜스퍼라제, 락테이트 데히드로게나제 및 글루타메이트 데카복실라제가 포함된다. α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성이 결핍되거나 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성이 감소된 에스체리키아 속에 속하는 세균 및 이를 수득하는 방법은 미국 특허 제5,378,616호 및 제5,573,945호에 기재되어 있다. 구체적으로, 이들 균주는 하기의 균주를 포함한다:
이. 콜라이 W3110sucA::Kmr
이. 콜라이 AJ12624 (FERM BP-3853)
이. 콜라이 AJ12628 (FERM BP-3854)
이. 콜라이 AJ12949 (FERM BP-4881)
이. 콜라이 W3110sucA::Kmr은 이. 콜라이 W3110의 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 유전자 (이후부터 "sucA 유전자"로서 호칭함)를 붕괴시켜 수득된 균주이다. 이 균주는 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제가 완전 결핍이다.
L-글루탐산 생산 세균의 다른 예로는 에스체리키아 속에 속하고, 아스파르트산 항대사산물에 내성을 갖는 것들이 포함된다. 이들 균주는 또한 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성이 결핍일 수 있고, 예를 들어 이.콜라이 AJ13199 (FERM BP-5807) (미국 특허 제5.908,768호), 추가로 낮은 L-글루탐산 분해 능력을 갖는 FFRM P-12379 (미국 특허 제5,393,671호); AJ13138 (FERM BP-5565) (미국 특허 제6,110,714호), 등을 포함한다.
L-글루탐산 생산 세균의 예로는 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성이 결핍이거나 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성이 감소된 판토에아 속에 속하는 돌연변이 균주가 포함되고, 상기된 바와 같이 수득될 수 있다. 이러한균주로는 판토에아 아나나티스 (Pantoea ananatis) AJ13356 (미국 특허 제6,331,419호)이 포함된다. 판토에아 아나나티스 AJ13356은 1998년 2월 19일자로 기탁기관 [National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (현재, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan)]에 수탁번호 FERM P-16645로서 기탁되었다. 이어서, 이는 1999년 1월 11일자로 부다페스트 조약하에 국제기탁기관으로 이관되었고, 수탁번호 FERM BP-6615를 부여받았다. 판토에아 아나나티스 AJ13356은 αKGDH-E1 아단위 유전자 (sucA)가 붕괴된 결과로서 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성이 결핍되어 있다. 상기 균주는 분리될 때 엔테로박터 애글로메란스 (Enterobacter agglomerans)로서 동정되었고, 엔테로박터 애글로메란스 AJ13356으로서 기탁되었다. 그러나, 최근에 16S rRNA의 뉴클레오티드 서열 분석 등에 의해 판토에아 아나나티스로서 재분류되었다. AJ13356이 상기 기탁기관에 엔테로박터 애글로메란스로서 기탁되었지만, 본원의 목적을 위해 이들은 판토에아 아나나티스로서 기재한다.
L-페닐알라닌 생산 세균
본 발명의 L-페닐알라닌 생산 세균을 수득하기 위한 모균주의 예로는 이. 콜라이 AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197); pheA34 유전자를 보유하는 이. 콜라이 HW1089 (ATCC 55371) (미국 특허 제5,354,672호); 이. 콜라이 MWEC101-b (KR8903681); 이. 콜라이 NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 및 NRRL B-12147 (미국 특허 제4,407,952호)와 같은 에스체리키아 속에 속하는 균주가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 모균주로서, 이. 콜라이 K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566)], 이. 콜라이 K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)], 이. 콜라이 K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662), 및 AJ 12604로 명명되는 이. 콜라이 K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)가 사용될 수 있다 (EP 488424B1). 추가로, yedA 유전자 또는 yddG 유전자에 의해 암호화된 단백질의 활성이 증강된 에스체리키아 속에 속하는 L-페닐알라닌 생산 세균이 또한 사용될 수 있다 (미국 특허원 제2003/0148473 A1호 및 제2003/0157667 A1호).
L-트립토판 생산 세균
본 발명의 L-트립토판 생산 세균을 수득하기 위한 모균주의 예로는, 돌연변이 trpS 유전자에 의해 암호화되는 트립토파닐-tRNA 신테타제가 결핍된 이. 콜라이 JP4735/pMU3028 (DSM10122) 및 JP6015/pMU91 (DSM10123) (미국 특허 제5,756,345호); 세린에 의한 피드백 억제로부터 자유로운 포스포글리세레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 serA 대립형질 유전자 및 트립토판에 의한 피드백 억제로부터 자유로운 안트라닐레이트 신타제를 암호화하는 trpE 대립형질 유전자를 갖는 이. 콜라이 SV164 (pGH5) (미국 특허 제6,180,373호); 효소 트립토파나제가 결핍된 이. 콜라이 AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) 및 AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (미국 특허 제4,371,614호); 포스포엔올피루베이트 생산 능력이 증강된 이. 콜라이 AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 미국 특허 제6,319,696호), 등과 같은 에스체리키아 속에 속하는 균주가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
임의의 L-아미노산의 생합성 경로에는 관여하지 않으며, 당해 유전자의 야생형 대립형질 유전자가 미생물 내에서 다중-복사체 벡터로 증폭되었을 때, 미생물에 L-페닐알라닌 및 몇몇 아미노산 유사체에 대한 내성을 부여하는 막 단백질을 암호화하는 yddG 유전자가 예전에 동정되었다. 게다가, yddG 유전자는, 추가적 복사체가 각각의 생산 균주의 세포 속에 도입되면, L-페닐알라닌 또는 L-트립토판의 생산을 증강시킬 수 있다 (WO03044192). 따라서, L-트립토판 생산 균주를 추가로 변형시켜 yddG 개방형 판독 프레임의 발현을 증강시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 L-트립토판 생산 세균을 수득하기 위한 모균주의 예로는, 안트라닐레이트 신타제, 포스포글리세레이트 데하이드로게나제 및 트립토판 신타제로부터 선택된 효소의 하나 이상의 활성이 증강된 균주가 포함된다. 안트라닐레이트 신타제 및 포스포글리세레이트 데하이드로게나제는 둘다 L-트립토판 및 L-세린에 의해 피드백 억제되므로, 피드백 억제를 탈감작하는 돌연변이가 이들 효소에 도입될 수 있다. 이러한 돌연변이를 갖는 균주의 구체적 예로는 탈감작된 안트라닐레이트 신타제를 보유하는 이. 콜라이 SV164, 및 피드백-탈감작된 포스포글리세레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 돌연변이 serA 유전자를 함유하는 플라스미드 pGH5 (WO 94/08031)를 이. 콜라이 SV164 속에 도입하여 수득된 형질전환체 균주가 포함된다.
본 발명의 L-트립토판 생산 세균을 수득하기 위한 모균주의 예로는 또한, 탈감작된 안트라닐레이트 신타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 트립토판 오페론이 도입된 균주가 포함된다 (JP 57-71397 A, JP 62-244382 A, 미국 특허 제4,371,614호). 또한, 트립토판 오페론 (trpBA) 중에서 트립토판 신타제를 암호화하는 유전자의 발현을 증강시킴으로써 L-트립토판 생산 능력이 부여될 수 있다. 트립토판 신타제는 trpA 및 trpB에 의해 각각 암호화되는 α 및 β 아단위로 이루어진다.
L-프롤린 생산 세균
본 발명의 L-프롤린 생산 세균을 수득하기 위한 모균주의 예로는, ilvA 유전자 결핍되고 L-프롤린을 생산할 수 있는 이. 콜라이 702ilvA (VKPM B-8012) (EP 1172433)와 같은 에스체리키아 속에 속하는 균주가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 세균은 L-프롤린 생합성에 관여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 증강시킴으로써 개량될 수 있다. L-프롤린 생산 세균에 대한 바람직한 이러한 유전자의 예로는, L-프롤린에 의한 피드백 억제가 탈감작된 글루타메이트 키나제를 암호화하는 proB 유전자 (독일 특허 제3127361호)가 포함된다. 추가로, 본 발명의 세균은 세균 세포로부터 L-아미노산을 분비하는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자의 발현을 증강시킴으로써 개량될 수 있다. 이러한 유전자는 b2682 및 b2683 유전자 (ygaZH 유전자) (EP1239041 A2)로 예시된다.
L-프롤린을 생산하는 활성을 갖는 에스체리키아 속에 속하는 세균의 예로는 아래의 이. 콜라이 균주가 포함된다: NRRL B-12403 및 NRRL B-12404 (영국 특허 제2075056호), VKPM B-8012 (러시아 특허 출원 제2000124295호), 독일 특허 제3127361호에 기재된 플라스미드 돌연변이체, 문헌 [Bloom F.R. et al., The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34]에 기재된 플라스미드 돌연변이체, 등.
L-아르기닌 생산 세균
본 발명의 L-아르기닌 생산 세균을 수득하기 위한 모균주의 예로는 이. 콜라이 균주 237 (VKPM B-7925)(미국 특허원 제2002/0058315 A1호) 및 돌연변이 N-아세틸글루타메이트 신타제를 함유하는 이의 유도체 균주(러시아 특허원 제2001112869호), 이. 콜라이 균주 382 (VKPM B-7926)(EP 1170358 A1), N-아세틸글루타메이트 신테타제를 암호화하는 argA 유전자가 도입된 아르기닌 생산 균주 (JP 57-5693A) 등과 같은 에스체리키아 속에 속하는 균주가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 L-아르기닌 생산 세균을 수득하기 위한 모균주의 예로는 또한, L-아르기닌 생합성 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자의 발현이 증강된 균주가 포함된다. L-아르기닌 생합성 효소의 예로는 N-아세틸글루타밀 포스페이트 리덕타제 (argC), 오르니틴 아세틸 트랜스퍼라제 (argJ), N-아세틸글루타메이트 키나제 (argB), 아세틸오르니틴 트랜스아미나제 (argD), 오르니틴 카바모일 트랜스퍼라제 (argF), 아르기니노석신산 신테타제 (argG), 아르기니노석신산 리아제 (argH), 및 카바모일 포스페이트 신테아제가 포함된다.
2. 본 발명의 방법
본 발명의 방법은, 본 발명의 세균을 배양 배지에서 배양하여, L-아미노산을 배지 중에 생성 및 분비하도록 하고, 배지로부터 L-아미노산을 수집함을 포함하여, L-아미노산을 생산하는 방법이다.
본 발명에서, 배지로부터 L-아미노산의 배양, 수집 및 정제 등은 세균을 사용하여 아미노산을 생산하는 통상의 발효 방법과 유사한 방법으로 수행될 수 있다.
배양에 사용되는 배지는, 배지가 탄소원, 질소원 및 무기물, 및 경우에 따라, 세균이 성장을 위해 필요로 하는 적당량의 영양물을 포함하는 한, 합성 또는 천연 배지일 수 있다. 탄소원은 글루코스 및 수크로스와 같은 다양한 탄수화물 및 다양한 유기산을 포함할 수 있다. 사용된 미생물의 동화 방식에 따라, 알코올, 예를 들어 에탄올 및 글리세롤이 사용될 수 있다. 질소원으로서, 암모니아 및 황산암모늄과 같은 다양한 암모늄 염, 아민과 같은 다른 질소 화합물, 펩톤, 대두 가수분해물 및 분해된 발효 미생물과 같은 천연 질소원이 사용될 수 있다. 무기물로서, 일인산칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제일철, 황산망간, 염화칼슘 등이 사용될 수 있다. 비타민으로서, 티아민, 효모 추출물 등이 사용될 수 있다.
배양은 진탕 배양 및 통기 교반 배양과 같은 호기적 조건하에, 20 내지 40℃, 바람직하게는 30 내지 38℃의 온도에서 수행하는 것이 바람직하다. 배양 pH는 통상적으로 5 내지 9이고, 바람직하게는 6.5 내지 7.2이다. 배양 pH는 암모니아, 탄산칼슘, 다양한 산, 다양한 염기 및 완충제로 조정될 수 있다. 통상적으로, 1 내지 5일간의 배양은 액체 배지 내에 표적 L-아미노산을 축적시킨다.
배양 후, 세포와 같은 고체는 원심분리 또는 막 여과에 의해 액체 배지로부터 제거될 수 있고, 이어서 L-아미노산은 이온 교환, 농축 및/또는 결정화 방법에 의해 수집되고 정제될 수 있다.
본 발명은 아래의 비-제한적 실시예를 참조하여 보다 구체적으로 설명될 것이다.
실시예 1. 불활성화된 glgC 유전자를 가진 균주의 작제
1. glgC 유전자의 결실
glgC 유전자가 결실된 균주는, 다첸코 케이 에이(Datsenko, K.A.)와 완너 비 엘 (K.A. and Wanner, B.L)에 의해 최초로 개발된, 레드-유도된 통합(Red-driven integration)이라 불리는 방법 [참조문헌: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645]에 의해 작제할 수 있다. 이 방법에 따르면, glgC 유전자의 인접 영역 및 주형 플라스미드에 항생제 내성을 부여하는 유전자 둘 모두에 상보적인 PCR 프라이머 glgCL (서열번호 3) 및 glgCR (서열번호 4)가 작제될 수 있다. 플라스미드 pACYC184 (NBL Gene Sciences Ltd., UK) (GenBank/EMBL 승인번호 X06403)는 PCR 반응에서 주형으로서 사용될 수 있다. PCR의 조건은 다음과 같다: 95℃에서 3분간의 변성(denaturation) 단계; 2회의 제1 사이클에 대한 프로파일: 95℃에서 1분, 50℃에서 30초, 72℃에서 40초; 최종 25 사이클에 대한 프로파일: 95℃에서 30 초, 54℃에서 30 초, 72℃에서 40 초; 최종 단계: 72℃에서 5분.
1093-bp PCR 생성물 (도 1)이 수득될 수 있고 아가로스 겔에서 정제할 수 있으며, 온도-감수성 복제를 하는 플라스미드 pKD46를 함유하는 이. 콜라이 MG1655 (ATCC 700926)의 전기천공에 사용될 수 있다. 플라스미드 pKD46 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45)는 파아지 λ의 2,154개 뉴클레오티드 (31088-33241) DNA 단편 (GenBank 승인 번호 J02459)을 포함하며, 아라비노스-유도성 ParaB 프로모터의 통제하에 λ레드 (Red) 상동 재조합 시스템의 유전자 (γ, β, 엑소 유전자)를 함유한다. 플라스미드 pKD46은 PCR 생성물을 균주 MG1655의 염색체 속으로 통합시키는데 필요하다.
전기수용적격(electrocompetent) 세포는 다음과 같이 제조할 수 있다: 이. 콜라이 MG1655의 야간 배양물을, 앰피실린 (100 mg/l)이 보충된 LB 배지 중에, 30℃에서 성장시킨 다음, 앰피실린 및 L-아라비노스 (1 mM)을 함유하는 SOB 배지 [참조문헌: Sambrook et al, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] 5 ml로 100배 희석시킬 수 있다. 수득된 배양물을 통기하에 300℃에서 약 0.6의 OD600로 성장시킬 수 있고, 이어서 100배 농축시키고 빙냉의 탈이온된 H2O로 3회 세척하여 전기수용적격(electrocompetent)으로 만들 수 있다. 전기천공은 70 ㎕의 세포 및 약 100 ng의 PCR 생성물을 사용하여 수행할 수 있다. 전기천공 후 세포를 1 ml의 SOC 배지 [참조 문헌: Sambrook et al, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]로 37℃에서 2.5 시간 동안 항온처리할 수 있고, 이후 L-아가 상에 도말하여 37℃에서 성장시켜, CmR 재조합체를 선별할 수 있다. 이어서, pKD46 플라스미드를 제거하기 위하여, 42℃에서, Cm을 함유하는 L-아가 상에서 2회 계대배양을 수행할 수 있고, 수득된 콜로니를 앰피실린에 대한 감수성에 대해 시험할 수 있다.
2. PCR에 의한 glgC 유전자 결실의 검증
glgC 유전자의 결실을 함유하는, Cm 내성 유전자로 식별되는 돌연변이체는 PCR에 의해 검증할 수 있다. 유전자좌-특이적 프라이머 glgC1 (서열번호 5) 및 glgC2 (서열번호 6)이 검증을 위해 PCR에 사용할 수 있다. PCR 검증을 위한 조건은 다음과 같다: 94℃에서 3분간의 변성 단계; 30 사이클에 대한 프로파일: 94℃에서 30초, 54℃에서 30초, 72℃에서 1분; 최종 단계: 72℃에서 1분. 모균주 MG1655 glgC+를 주형으로서 사용하는 반응에서 수득될 수 있는 PCR 생성물은 1471 bp 길이이어야 한다. 돌연변이체 MG1655 glgC::cat 균주를 주형으로서 사용하는 반응에서 수득될 수 있는 PCR 생성물은 1197 bp 길이이어야 한다 (도 2).
실시예 2. 이. 콜라이 VL334thrC + -Δ glgC 에 의한 L- 글루타메이트의 생산
이. 콜라이 L-트레오닌 생산 균주 VL334thrC+ (EP 1172433)의 염색체 중의 glgC 유전자의 결실을, 통상의 익히 공지된 방법, 예를 들어 MG1655 glgC::cat 균주로부터의 P1 형질도입에 의해 수행하여, 균주 VL334thrC+-ΔglgC를 수득할 수 있다. 균주 VL334thrC+는 기탁기관 [Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1)]에 2004년 12월 6일자로, 수탁번호 VKPM B-8961으로 기탁되었고, 이어서, 2004년 12월 8일자로 부다페스트 조약 하의 기탁기관으로 이관되었다.
균주 VL334thrC+ 및 VL334thrC+-ΔglgC 둘 모두를 L-아가 플레이트 상에서 18 내지 24 시간 동안 37℃에서 성장시킬 수 있다. 이어서, 세포의 1 루프를 2ml의 발효 배지를 함유하는 시험관으로 옮길 수 있다. 발효 배지 (pH 7.2)는 글루코스 (60g/l), 황산암모늄 (25 g/l), KH2PO4 (2g/l), MgSO4 (1 g/l), 티아민 (0.1 mg/ml), L-이소류신 (70 ㎍/ml) 및 CaCO3 (25 g/l)를 함유해야 한다. 글루코스 및 CaCO3는 별도로 멸균되어야 한다. 배양을 3일간 30℃에서 진탕하에 수행할 수 있다. 배양 후, 생산된 L-글루탐산의 양을, 종이 크로마토그래피 (액체 상 조성: 부탄올-아세트산-물=4:1:1) 및 후속적인 닌하이드린 (아세톤 중의 1% 용액)에 의한 염색 및 0.5% CdCl2를 함유하는 50% 에탄올에 의한 화합물의 추가적 용출로 측정할 수 있다.
실시예 3. 이. 콜라이 702 ilvA -Δ glgC 에 의한 L-프롤린의 생산
이. 콜라이 L-프롤린 생산 균주 702ilvA (VKPM B-8012, 러시아 특허 출원 제2000124295호, EP1172433)의 염색체 중의 glgC 유전자의 결실을 상기한 바와 같은 통상의 익히 공지된 방법에 의해 수행하여 균주 702ilvA-ΔglgC를 수득할 수 있다. 균주 702ilvA는 기탁기관 [Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1)]에 2000년 7월 18일자로, 수탁번호 VKPM B-8012로 기탁되었다.
이. 콜라이 균주 702ilvA 및 702ilvA-ΔglgC 둘 모두를 L-아가 플레이트 상에서 18 내지 24 시간 동안 37℃에서 성장시킬 수 있다. 이어서, 이들 균주를 상기한 바와 동일한 조건하에 배양할 수 있다.
실시예 4. 이. 콜라이 237-Δ glgC 에 의한 L-아르기닌의 생산
이. 콜라이 L-아르기닌 생산 균주 237 (VKPM B-7925)의 염색체 중의 glgC 유전자의 결실을 상기한 바와 같은 통상의 익히 공지된 방법에 의해 수행하여 균주 237-ΔglgC를 수득할 수 있다. 균주 237은 기탁기관 [Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 113545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1)]에 2000년 4월 10일자로, 수탁번호 VKPM B-7925로 기탁되었고, 이어서, 2001년 5월 18일자로 부다페스트 조약 하의 기탁기관으로 이관되었다.
이. 콜라이 균주 237 및 237-ΔglgC 둘 모두를 L-아가 플레이트 상에서 18 내지 24 시간 동안 37℃에서 성장시킬 수 있다. 이어서, 이들 균주를 상기한 바와 동일한 조건하에 배양할 수 있다.
실시예 5. 이. 콜라이 57-Δ glgC 에 의한 L- 류신의 생산
이. 콜라이 L-류신 생산 균주 57 (VKPM B-7386, 미국 특허 제6,124,121호)의 염색체 중의 glgC 유전자의 결실을 상기한 바와 같은 통상의 익히-공지된 방법에 의해 수행하여 균주 57-pMW-glgC를 수득할 수 있다. 균주 57은 기탁기관 [Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 117545 Moscow , 1 Dorozhny proezd, 1)]에 1997년 5월 19일자로, 수탁번호 VKPM B-7386로 기탁되었다.
이. 콜라이 균주 57 및 57-ΔglgC 둘 모두를 L-아가 플레이트 상에서 18 내지 24 시간 동안 37℃에서 성장시킬 수 있다. 이어서, 이들 균주를, 이소류신을 배지에 첨가하지 않는 점을 제외하고는 상기한 바와 동일한 조건하에 배양할 수 있다.
실시예 6. 이. 콜라이 JM15 ( ydeD )- Δ glgC 에 의한 L-시스테인의 생산
이. 콜라이 L-시스테인 생산 균주 JM15(ydeD)의 염색체 중의 glgC 유전자의 결실을 상기와 바와 같은 통상의 익히 공지된 방법에 의해 수행하여 균주 JM15(ydeD)-ΔglgC를 수득할 수 있다.
이. 콜라이 JM15 (미국 특허 제6,218,168호)의 유도체인 이. 콜라이 JM15(ydeD)를, 막 단백질을 암호화하고 임의의 L-아미노산의 생합성 경로와 관련없는 ydeD 유전자를 함유하는 DNA로 형질전환시킬 수 있다 (미국 특허 제5,972,663호).
L-시스테인 생산의 평가를 위한 발효 조건은 미국 특허 제6,218,168호의 실시예 6에 상세히 기재되었다.
실시예 7. 이. 콜라이 B-3996-Δ glgC 에 의한 L-트레오닌의 생산
이. 콜라이 L-트레오닌 생산 균주 B-3996 (VKPM B-3996)의 염색체 중의 glgC 유전자의 결실을 상기한 바와 같은 통상의 익히 공지된 방법에 의해 수행하여, 균주 B-3996-ΔglgC를 수득할 수 있다.
이. 콜라이 균주 B-3996 및 B-3996-ΔglgC 둘 모두를 L-아가 플레이트 상에서 18 내지 24 시간 동안 37℃에서 성장시킬 수 있다. 이어서, 이들 균주를 상기한 바와 동일한 조건하에 배양할 수 있다.
실시예 8. 이. 콜라이 AJ11442 -Δ glgC 에 의한 L- 리신의 생산
이. 콜라이 L-리신 생산 균주 AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185)의 염색체 중의 glgC 유전자의 결실을 상기한 바와 같은 통상의 익히 공지된 방법에 의해 수행하여 균주 AJ11442-ΔglgC를 수득할 수 있다. 균주 AJ11442는 기탁기관 [Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (현재, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary), Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan]에 1981년 5월 1일자로 기탁되어, 수탁번호 FERM P-5084를 부여받았다. 이어서, 이는 1987년 10월 29일자로 부다페스트 조약 하의 국제 기탁기관으로 이관되어, 수탁번호 FERM BP-1543를 부여받았다.
이. 콜라이 균주 AJ11442 및 AJ11442-ΔglgC 둘 모두를 L-아가 상에서 18 내지 24 시간 동안 37℃에서 성장시킬 수 있다. 이어서, 이들 균주를 상기한 바와 동일한 조건하에 배양할 수 있다.
실시예 9. 이. 콜라이 AJ12739 -Δ glgC 에 의한 L-페닐알라닌의 생산
이. 콜라이 L-페닐알라닌 생산 균주 AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)의 염색체 중의 glgC 유전자의 결실을 상기한 바와 같은 통상의 익히 공지된 방법에 의해 수행하여, 균주 AJ12739-ΔglgC를 수득할 수 있다. 균주 AJ12739는 기탁기관 [Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1]에 2001년 11월 6일자로, 수탁번호 VKPM B-8197로 기탁되었다.
이. 콜라이 균주 AJ12739 및 AJ12739-ΔglgC 둘 모두를 L-아가 플레이트 상에서 18 내지 24 시간 동안 37℃에서 성장시킬 수 있다. 이어서, 이들 균주를 상기한 바와 동일한 조건하에 배양할 수 있다.
실시예 10. glgBX 및 glgCAP 오페론이 불활성화된 균주의 작제
1. glgBX 및 glgCAP 오페론의 결실
glgBX 및 glgCAP 오페론이 결실된 균주는, 다첸코 케이 에이(Datsenko, K.A.)와 완너 비 엘 (K.A. and Wanner, B.L)에 의해 최초로 개발된, 레드-유도된 통합이라 불리는 방법 [참조문헌: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645]에 의해 작제하였다. 이 방법에 따라, glgBX 및 glgCAP 오페론의 인접 영역 및 주형 플라스미드에 항생제 내성을 부여하는 유전자 둘 모두에 상보적인 PCR 프라이머 glgBXCAPL (서열번호 7) 및 glgBXCAPR (서열번호 8)를 작제하였다. 플라스미드 pACYC184 (NBL Gene Sciences Ltd., UK) (GenBank/EMBL 승인번호 X06403)를 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다. PCR의 조건은 실시예 1에서 상세히 기재되었다.
아가로스 겔에서 정제된 1152-bp PCR 생성물을, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 온도-감수성 복제를 하는 플라스미드 pKD46를 함유하는 이. 콜라이 MG1655 (ATCC 700926)의 전기천공에 사용하였다.
2. PCR에 의한 glgBX 및 glgCAP 오페론의 결실의 검증
glgBX 및 glgCAP 오페론의 결실을 함유하는, Cm 내성 유전자로 식별되는 돌연변이체를 PCR로 검증하였다. 유전자좌-특이적 프라이머 glgBXCAP1 (서열번호 9) 및 glgBXCAP2 (서열번호 10)을 검증을 위해 PCR에 사용하였다. PCR 검증을 위한 조건은 실시예 1에 기재되었다. 모균주 MG1655 glgBXCAP+를 주형으로서 사용하는 반응에서 수득된 PCR 생성물은 9425 bp 길이였다. 돌연변이체 MG1655 glgBXCAP::cat 균주를 주형으로서 사용하는 반응에서 수득된 PCR 생성물은 1208 bp 길이였다 (도 3).
실시예 11. 이. 콜라이 균주 B-3996-Δ glgBXCAP 에 의한 L-트레오닌의 생산
트레오닌 생산에 대한 glgBX 및 glgCAP 오페론의 불활성화의 효과를 시험하기 위하여, 상기한 이. 콜라이 균주 MG1655 glgBXCAP::cat의 염색체로부터의 DNA 단편을 P1 형질도입 [참조문헌: Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY]에 의해 트레오닌 생산 이. 콜라이 균주 B-3996로 이전시켰다.
이. 콜라이 균주 B-3996 및 B-3996-ΔglgBXCAP 둘 모두를 L-아가 플레이트 상에서 18 내지 24 시간 동안 37℃에서 성장시켰다. 종균(seed) 배양물을 수득하기 위하여, 상기 균주를 4% 글루코스가 보충된 2 ml의 L-브로쓰를 함유하는 20x200-mm 시험관 내에서 18 시간 동안 32℃에서 회전 진탕기 (250 rpm)로 성장시켰다. 이어서, 발효 배지를 0.21 ml (10%)의 종균 물질로 접종시켰다. 20x200-mm 시험관 내에서의 발효를 위해 2 ml의 최소 배지에서 발효를 수행하였다. 250 rpm으로 진탕시키면서, 32℃에서 65 시간 동안 세포를 성장시켰다.
배양 후, 배지 중에 축적된 L-트레오닌의 양을 다음의 이동 상을 사용하는 종이 크로마토그래피로 측정하였다: 부탄올 - 아세트산 - 물 = 4 : 1 : 1 (v/v). 아세톤 중의 닌하이드린 (2%)의 용액을 가시화 시약으로서 사용하였다. L-트레오닌을 함유하는 스폿을 컷-오프하고, L-트레오닌을 CdCl2의 0.5% 수용액으로 용출시키고, L-트레오닌의 양을 540 nm에서 분광측정으로 추정하였다. 10개의 독립적인 시험관 발효의 결과는 표 1에 제시된다.
발효 배지의 조성 (g/l)은 다음과 같았다:
글루코스 80.0
(NH4)2SO4 22.0
NaCl 0.8
KH2PO4 2.0
MgSO4ㆍ7H2O 0.8
FeSO4ㆍ7H2O 0.02
MnSO4ㆍ5H2O 0.02
티아민 HCl 0.0002
효모 추출물 1.0
CaCO3 30.0
글루코스 및 황산마그네슘을 별도로 멸균하였다. 2 시간 동안 180℃에서 건조 가열하여 CaCO3를 멸균하였다. pH를 7.0으로 조정하였다. 멸균 후, 항생제를 배지에 첨가하였다.
표 1에 따르면, B-3996-ΔglgBXCAP가 B-3996에 비해 더 많은 양의 L-트레오닌을 축적시켰다.
실시예 12. 이. 콜라이 WC196 -Δ glgBXCAP 에 의한 L- 리신의 생산
L-리신 생산에 대한 glgBX 및 glgCAP 오페론의 불활성화의 효과를 시험하기 위하여, 상기한 이. 콜라이 균주 MG1655 glgBXCAP::cat의 염색체로부터의 DNA 단편 을 P1 형질도입 [참조문헌: Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY]에 의해 L-리신 생산 이. 콜라이 균주 WC196 (FERM BP-5252)로 이전시켰다.
종균(seed) 배양물을 수득하기 위하여, 이. 콜라이 균주 WC196 및 WC196-ΔglgBXCAP 둘 모두를, 후술되는 발효 배지에 비해 2배 희석된 2 ml의 배지를 함유하는 20x200-mm 시험관 내에서 18 시간 동안 32℃에서 회전 진탕기 (250 rpm)로 성장시켰다. 이어서, 발효 배지를 0.21 ml (10%)의 종균 물질로 접종시켰다. 20x200-mm 시험관 내에서의 발효를 위해 2 ml의 최소 배지에서 발효를 수행하였다. 250 rpm으로 진탕시키면서, 32℃에서 24 시간 동안 세포를 성장시켰다.
배양 후, 배지 중에 축적된 L-리신의 양을 다음의 이동 상을 사용하는 종이 크로마토그래피로 측정하였다: 부탄올 - 아세트산 - 물 = 4 : 1 : 1 (v/v). 아세톤 중의 닌하이드린 (2%)의 용액을 가시화 시약으로서 사용하였다. L-리신을 함유하는 스폿을 컷-오프하고, L-리신을 CdCl2의 0.5% 수용액으로 용출시키고, L-리신의 양을 540 nm에서 분광측정으로 추정하였다. 10개의 독립적인 시험관 발효의 결과는 표 12 제시된다.
발효 배지의 조성 (g/l)은 다음과 같았다:
글루코스 40.0
(NH4)2SO4 24.0
KH2PO4 1.0
MgSO4ㆍ7H2O 1.0
FeSO4ㆍ7H2O 0.01
MnSO4ㆍ5H2O 0.01
효모 추출물 2.0
CaCO3 30.0
글루코스, 인산칼륨 및 황산마그네슘을 별도로 멸균하였다. 2 시간 동안 180℃에서 건조 가열하여 CaCO3를 멸균하였다. pH를 7.0으로 조정하였다.
표 2에 따르면, WC196-ΔglgBXCAP가 WC196에 비해 더 많은 양의 L-트레오닌을 축적시켰다.
본 발명이 이의 바람직한 태양을 참조하여 상세히 설명되었지만, 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화가 가능하고, 등가물이 사용될 수 있음이 당업자에게는 명백할 것이다. 본원에서 인용된 모든 참조문헌은 참조로서 본원의 일부로서 인용된다.
균주 OD540 L-트레오닌의 양, g/l
B-3996 23.5 ±0.3 27.5 ±0.4
B-3996-ΔglgBXCAP 22.1 ±0.2 28.2 ±1.2
균주 OD540 L-리신의 양, g/l
WC196 26.2 ±0.5 2.1 ±0.1
WC196-ΔglgBXCAP 26.9 ±0.3 2.4 ±0.1
본 발명에 따르면, 엔테로박테리아세애 과의 세균의 방향족 L-아미노산 또는 비-방향족 L-아미노산의 생산이 증강될 수 있다.
<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> A method for producing an L-amino acid using a bacterium of the Enterobacteriaceae family having a pathway of glycogen biosynthesis disrupted <130> C440-C5323 <150> RU 2005101110 <151> 2005-01-19 <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1296 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(1296) <400> 1 atg gtt agt tta gag aag aac gat cac tta atg ttg gcg cgc cag ctg 48 Met Val Ser Leu Glu Lys Asn Asp His Leu Met Leu Ala Arg Gln Leu 1 5 10 15 cca ttg aaa tct gtt gcc ctg ata ctg gcg gga gga cgt ggt acc cgc 96 Pro Leu Lys Ser Val Ala Leu Ile Leu Ala Gly Gly Arg Gly Thr Arg 20 25 30 ctg aag gat tta acc aat aag cga gca aaa ccg gcc gta cac ttc ggc 144 Leu Lys Asp Leu Thr Asn Lys Arg Ala Lys Pro Ala Val His Phe Gly 35 40 45 ggt aag ttc cgc att atc gac ttt gcg ctg tct aac tgc atc aac tcc 192 Gly Lys Phe Arg Ile Ile Asp Phe Ala Leu Ser Asn Cys Ile Asn Ser 50 55 60 ggg atc cgt cgt atg ggc gtg atc acc cag tac cag tcc cac act ctg 240 Gly Ile Arg Arg 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ctt ttt gca gtg gtg agc cgt ctg acc agc cag 912 Asp Asp Lys Val Pro Leu Phe Ala Val Val Ser Arg Leu Thr Ser Gln 290 295 300 aaa ggt ctc gac ctg gtg ctg gaa gcc tta ccg ggt ctt ctg gag cag 960 Lys Gly Leu Asp Leu Val Leu Glu Ala Leu Pro Gly Leu Leu Glu Gln 305 310 315 320 ggc ggg cag ctg gcg cta ctc ggc gcg ggc gat ccg gtg ctg cag gaa 1008 Gly Gly Gln Leu Ala Leu Leu Gly Ala Gly Asp Pro Val Leu Gln Glu 325 330 335 ggt ttc ctt gcg gcg gca gcg gaa tac ccc ggt cag gtg ggc gtt cag 1056 Gly Phe Leu Ala Ala Ala Ala Glu Tyr Pro Gly Gln Val Gly Val Gln 340 345 350 att ggc tat cac gaa gca ttt tcg cat cgc att atg ggc ggc gcg gac 1104 Ile Gly Tyr His Glu Ala Phe Ser His Arg Ile Met Gly Gly Ala Asp 355 360 365 gtc att ctg gtg ccc agc cgt ttt gaa ccg tgc ggc tta acg caa ctt 1152 Val Ile Leu Val Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Thr Gln Leu 370 375 380 tat gga ttg aag tac ggt acg ctg ccg tta gtg cgg cgc acc ggt ggg 1200 Tyr Gly Leu Lys Tyr Gly Thr Leu Pro Leu Val Arg Arg Thr Gly Gly 385 390 395 400 ctt gct gat acg gtt tct gac tgt tct ctt gag aac ctt gca gat ggc 1248 Leu Ala Asp Thr Val Ser Asp Cys Ser Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly 405 410 415 gtc gcc agt ggg ttt gtc ttt gaa gat agt aat gcc tgg tcg ctg tta 1296 Val Ala Ser Gly Phe Val Phe Glu Asp Ser Asn Ala Trp Ser Leu Leu 420 425 430 cgg gct att cga cgt gct ttt gta ctg tgg tcc cgt cct tca ctg tgg 1344 Arg Ala Ile Arg Arg Ala Phe Val Leu Trp Ser Arg Pro Ser Leu Trp 435 440 445 cgg ttt gtg caa cgt cag gct atg gca atg gat ttt agc tgg cag gtc 1392 Arg Phe Val Gln Arg Gln Ala Met Ala Met Asp Phe Ser Trp Gln Val 450 455 460 gcg gcg aag tcg tac cgt gag ctt tac tat cgc ttg aaa tag 1434 Ala Ala Lys Ser Tyr Arg Glu Leu Tyr Tyr Arg Leu Lys 465 470 475 <210> 12 <211> 477 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 12 Met Gln Val Leu His Val Cys Ser Glu Met Phe Pro Leu Leu Lys Thr 1 5 10 15 Gly Gly Leu Ala Asp Val Ile Gly Ala Leu Pro Ala Ala Gln Ile Ala 20 25 30 Asp Gly Val Asp Ala Arg Val Leu Leu Pro Ala Phe Pro Asp Ile Arg 35 40 45 Arg Gly Val 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gag att ctg gga gtc gct tac gat cag ata atc cct ggt tac gac 672 Glu Glu Ile Leu Gly Val Ala Tyr Asp Gln Ile Ile Pro Gly Tyr Asp 210 215 220 acc gac gcg acc aac acg ctg cgt ttg tgg agt gcg caa gcc agt agc 720 Thr Asp Ala Thr Asn Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ala Gln Ala Ser Ser 225 230 235 240 gaa att aac ctc ggt aaa ttc aac cag ggt gac tac ttc gcg gca gtg 768 Glu Ile Asn Leu Gly Lys Phe Asn Gln Gly Asp Tyr Phe Ala Ala Val 245 250 255 gaa gat aaa aac cac tcc gag aac gta tct cgc gta ctg tat ccg gat 816 Glu Asp Lys Asn His Ser Glu Asn Val Ser Arg Val Leu Tyr Pro Asp 260 265 270 gac tcc acc tac tcc ggg cgt gag ctg cgc ctg cgt cag gaa tac ttc 864 Asp Ser Thr Tyr Ser Gly Arg Glu Leu Arg Leu Arg Gln Glu Tyr Phe 275 280 285 ctg gtt tcc tcg acc att cag gac att tta agc cgc cat tat cag ttg 912 Leu Val Ser Ser Thr Ile Gln Asp Ile Leu Ser Arg His Tyr Gln Leu 290 295 300 cat aaa acc tac gat aac ctg gcg gat aaa atc gcg att cat ctc aat 960 His Lys Thr Tyr Asp Asn Leu Ala Asp Lys Ile Ala Ile His Leu Asn 305 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gat tgt cag gat 2304 His Tyr Gln Val Leu Ala Asp Tyr Arg Ser Tyr Val Asp Cys Gln Asp 755 760 765 aaa gtc gat gaa ctc tac gag ctt cag gaa gag tgg acc gca aaa gcg 2352 Lys Val Asp Glu Leu Tyr Glu Leu Gln Glu Glu Trp Thr Ala Lys Ala 770 775 780 atg ctg aac att gcc aat atg ggc tac ttc tct tct gac cgt act atc 2400 Met Leu Asn Ile Ala Asn Met Gly Tyr Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile 785 790 795 800 aaa gag tac gcc gat cat atc tgg cat atc gat ccg gtg aga ttg taa 2448 Lys Glu Tyr Ala Asp His Ile Trp His Ile Asp Pro Val Arg Leu 805 810 815 <210> 14 <211> 815 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 14 Met Asn Ala Pro Phe Thr Tyr Ser Ser Pro Thr Leu Ser Val Glu Ala 1 5 10 15 Leu Lys His Ser Ile Ala Tyr Lys Leu Met Phe Thr Ile Gly Lys Asp 20 25 30 Pro Val Val Ala Asn Lys His Glu Trp Leu Asn Ala Thr Leu Phe Ala 35 40 45 Val Arg Asp Arg Leu Val Glu Arg Trp Leu Arg Ser Asn Arg Ala Gln 50 55 60 Leu Ser Gln Glu Thr Arg Gln Val Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu 65 70 75 80 Ile Gly Arg Thr Leu Ser Asn Ala Met 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gta ctg gga atg cat aaa acc acc gcg 96 His Phe Ala Asp Pro Phe Ser Val Leu Gly Met His Lys Thr Thr Ala 20 25 30 gga ctg gaa gtc cgt gcc ctt tta ccc gac gct acc gat gtg tgg gtg 144 Gly Leu Glu Val Arg Ala Leu Leu Pro Asp Ala Thr Asp Val Trp Val 35 40 45 att gaa ccg aaa acc ggg cgc aaa ctc gca aaa ctg gag tgt ctc gac 192 Ile Glu Pro Lys Thr Gly Arg Lys Leu Ala Lys Leu Glu Cys Leu Asp 50 55 60 tca cgg gga ttc ttt agc ggc gtc att ccg cga cgt aag aat ttt ttc 240 Ser Arg Gly Phe Phe Ser Gly Val Ile Pro Arg Arg Lys Asn Phe Phe 65 70 75 80 cgc tat cag ttg gct gtt gtc tgg cat ggt cag caa aac ctg att gat 288 Arg Tyr Gln Leu Ala Val Val Trp His Gly Gln Gln Asn Leu Ile Asp 85 90 95 gat cct tac cgt ttt ggt ccg cta atc cag gaa atg gat gcc tgg cta 336 Asp Pro Tyr Arg Phe Gly Pro Leu Ile Gln Glu Met Asp Ala Trp Leu 100 105 110 tta tct gaa ggt act cac ctg cgc ccg tat gaa acc tta ggc gcg cat 384 Leu Ser Glu Gly Thr His Leu Arg Pro Tyr Glu Thr Leu Gly Ala His 115 120 125 gca gat act atg gat ggc gtc aca 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att tat gaa gtt cac ctg ggt tcc tgg cgt cgc cac 768 Ala Pro Ile Ser Ile Tyr Glu Val His Leu Gly Ser Trp Arg Arg His 245 250 255 acc gac aac aat ttc tgg ttg agc tac cgc gag ctg gcc gat caa ctg 816 Thr Asp Asn Asn Phe Trp Leu Ser Tyr Arg Glu Leu Ala Asp Gln Leu 260 265 270 gtg cct tat gct aaa tgg atg ggc ttt acc cac ctc gaa cta ctg ccc 864 Val Pro Tyr Ala Lys Trp Met Gly Phe Thr His Leu Glu Leu Leu Pro 275 280 285 att aac gag cat ccc ttc gat ggc agt tgg ggt tat cag cca acc ggc 912 Ile Asn Glu His Pro Phe Asp Gly Ser Trp Gly Tyr Gln Pro Thr Gly 290 295 300 ctg tat gcg cca acc cgc cgt ttt ggt act cgc gac gac ttc cgt tat 960 Leu Tyr Ala Pro Thr Arg Arg Phe Gly Thr Arg Asp Asp Phe Arg Tyr 305 310 315 320 ttc att gat gcc gca cac gca gct ggt ctg aac gtg att ctc gac tgg 1008 Phe Ile Asp Ala Ala His Ala Ala Gly Leu Asn Val Ile Leu Asp Trp 325 330 335 gtg cca ggc cac ttc ccg act gat gac ttt gcg ctt gcc gaa ttt gat 1056 Val Pro Gly His Phe Pro Thr Asp Asp Phe Ala Leu Ala Glu Phe Asp 340 345 350 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<213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(201) <400> 19 atg gat cat agt ctt aat tct tta aat aat ttc gat ttc ctg gcg cgt 48 Met Asp His Ser Leu Asn Ser Leu Asn Asn Phe Asp Phe Leu Ala Arg 1 5 10 15 agt ttt gcc aga atg cac gca gaa ggt cgc ccg gtc gat att ctg gcc 96 Ser Phe Ala Arg Met His Ala Glu Gly Arg Pro Val Asp Ile Leu Ala 20 25 30 gtt act ggt aac atg gat gaa gaa cat aga acc tgg ttt tgc gca cgt 144 Val Thr Gly Asn Met Asp Glu Glu His Arg Thr Trp Phe Cys Ala Arg 35 40 45 tat gcc tgg tat tgt caa cag atg atg cag gca aga gag ctg gag tta 192 Tyr Ala Trp Tyr Cys Gln Gln Met Met Gln Ala Arg Glu Leu Glu Leu 50 55 60 gag cac tga 201 Glu His 65 <210> 20 <211> 66 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 20 Met Asp His Ser Leu Asn Ser Leu Asn Asn Phe Asp Phe Leu Ala Arg 1 5 10 15 Ser Phe Ala Arg Met His Ala Glu Gly Arg Pro Val Asp Ile Leu Ala 20 25 30 Val Thr Gly Asn Met Asp Glu Glu His Arg Thr Trp Phe Cys Ala Arg 35 40 45 Tyr Ala Trp Tyr Cys Gln Gln Met Met Gln Ala Arg Glu Leu Glu Leu 50 55 60 Glu His 65

Claims (15)

  1. 글리코겐 생합성 경로가 붕괴되도록 변형되어진, 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae) 과의 L-아미노산 생산 세균.
  2. 제1항에 있어서, 글리코겐 생합성 경로가 glgBX 및/또는 glgCAP 오페론의 발현을 감쇠(attenuation)시킴으로써 붕괴된, 세균.
  3. 제1항에 있어서, 글리코겐 생합성 경로가 glgBX 및/또는 glgCAP 오페론을 불활성화시킴으로써 붕괴된, 세균.
  4. 제3항에 있어서, glgBX 및/또는 glgCAP 오페론의 불활성화가 glgB , glgX , glgC, glgA 및 glgP, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자를 결실시킴으로써 달성된, 세균.
  5. 제1항에 있어서, 글리코겐 생합성 경로가 glgS 유전자의 발현을 감쇠시킴으로써 붕괴된, 세균.
  6. 제1항에 있어서, 글리코겐 생합성 경로가 glgS 유전자를 불활성화시킴으로써 붕괴된, 세균.
  7. 제1항에 있어서, 에스체리키아(Escherichia) 속에 속하는 세균.
  8. 제1항에 있어서, 판토에아(Pantoea) 속에 속하는 세균.
  9. 제1항에 있어서, 상기 L-아미노산이 방향족 L-아미노산 및 비-방향족 L-아미노산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, L-아미노산 생산 세균.
  10. 제9항에 있어서, 방향족 L-아미노산이 L-페닐알라닌, L-티로신 및 L-트립토판으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, L-아미노산 생산 세균.
  11. 제9항에 있어서, 비-방향족 L-아미노산이 L-트레오닌, L-리신, L-시스테인, L-메티오닌, L-류신, L-이소류신, L-발린, L-히스티딘, L-글리신, L-세린, L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루타민, L-글루탐산, L-프롤린 및 L-아르기닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, L-아미노산 생산 세균.
  12. - 제1항에 따른 세균을 배지 중에 배양하여, 배지 중에 L-아미노산을 생성 및 분비시키는 단계, 및
    - 상기 배지로부터 상기 L-아미노산을 수집하는 단계
    를 포함하여, L-아미노산을 생산하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, L-아미노산이 방향족 L-아미노산 및 비-방향족 L-아미노산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 방향족 L-아미노산이 L-페닐알라닌, L-티로신 및 L-트립토판으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  15. 제13항에 있어서, 비-방향족 L-아미노산이 L-트레오닌, L-리신, L-시스테인, L-메티오닌, L-류신, L-이소류신, L-발린, L-히스티딘, L-글리신, L-세린, L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루타민, L-글루탐산, L-프롤린 및 L-아르기닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
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