CN110592109A - 一种spoT基因改造的重组菌株及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多核苷酸序列以及包括该多核苷酸序列的产重组菌株，是对大肠杆菌中的spoT基因进行点突变形成，改造后的基因序列如SEQ ID NO:2所示。该重组菌株与未突变的野生型菌株相比，有利于生产高浓度的L‑苏氨酸，且菌株稳定性好，作为L‑苏氨酸生产菌株能够进一步降低生产成本。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种spoT基因改造的重组菌株及其构建方法与应用。
背景技术
L-苏氨酸是八大必需氨基酸之一，且是人和动物自身不能合成的氨基酸。L-苏氨酸具有恢复人体疲劳，促进生长发育的效果，其主要用于医药、化学试剂、食品强化剂以及饲料添加剂等方面。长期以来，国内外市场对L-苏氨酸的需求持续稳定增长，特别是在化学及生化、食品添加剂、饲料添加剂等方面的用量增长快速，因此其市场的巨大需求使国内不少企业纷纷投入力量研制开发苏氨酸产品。
微生物发酵法生产L-苏氨酸是目前主要的工业生产方法，其生产成本低、生产强度高、对环境污染小。多种细菌可用于L-苏氨酸的微生物发酵生产，如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌株。然而，L-苏氨酸生产菌在发酵产生L- 苏氨酸的同时还会产生乙酸、乳酸、丙氨酸、天冬氨酸等代谢副产物，在一定程度上影响菌体生长及L-苏氨酸产率。因此仍然存在对开发以高产率更经济地生产L-苏氨酸的菌株的需要。
发明内容
本发明提供一种核苷酸序列，所述核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示的spoT基因编码序列第520位碱基发生突变而形成的核苷酸序列。
根据本发明，所述突变是指所述位点的碱基/核苷酸发生变化，所述突变方法可以选自诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。
根据本发明，所述突变为SEQ ID NO:1中第520位碱基由鸟嘌呤(G)突变为胸腺嘧啶 (T)；具体地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明提供如上所述的核苷酸序列编码的重组蛋白。
根据本发明的重组蛋白，其包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；具体地，所述重组蛋白包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列第174位甘氨酸被半胱氨酸取代。
本发明提供包括上述核苷酸序列或重组蛋白的重组载体。
根据本发明的重组载体，是将上述核苷酸序列导入质粒构建而成；作为一个实施方案，所述质粒为pKOV质粒。具体地，可以将所述核苷酸序列和所述质粒通过内切酶进行酶切，形成互补的粘性末端，将二者连接构建成重组载体。
本发明进一步提供一种重组菌株，其含有编码序列发生点突变的spoT基因编码核苷酸序列，例如SEQ ID NO:1所示spoT基因编码核苷酸序列第520位碱基发生点突变。
根据本发明的重组菌株，所述SEQ ID NO:1序列中第520位碱基由鸟嘌呤(G)突变为胸腺嘧啶(T)。
作为本发明的一个实施方案，其含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
作为本发明的一个实施方案，其含有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
根据本发明的重组菌株，是将上述重组载体导入宿主菌株中重组形成；所述宿主菌株没有特别的限定，可以选自本领域已知的保留spoT基因的产L-苏氨酸菌株，例如选自大肠杆菌。作为本发明的一个实施方案，所述宿主菌株为E.coli K12(W3110)菌株、E.coliCGMCC 7.232 菌株。
根据本发明的重组菌株，是以pKOV质粒为载体。
根据本发明的重组菌株，其可以进一步包括或者不包括其他改造。
本发明提供一种重组菌株的构建方法，包括如下步骤：
改造如SEQ ID NO:1所示的spoT基因编码区的核苷酸序列，使其第520位碱基发生突变，得到包含突变spoT编码基因的重组菌株。
根据本发明的构建方法，所述改造包括诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。
根据本发明的构建方法，所述突变是指SEQ ID NO:1中第520位碱基由鸟嘌呤(G)突变为胸腺嘧啶(T)；具体地，突变后得到的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步地，所述构建方法包括如下步骤：
(1)改造如SEQ ID NO:1所示的野生型spoT基因开放阅读框区域的核苷酸序列，使其第520位碱基发生突变，得到突变的核苷酸序列；
(2)将所述突变的核苷酸序列与质粒连接，构建重组载体；
(3)将所述重组载体导入宿主菌株，得到所述包含点突变的重组菌株。
根据本发明的构建方法，所述步骤(1)包括：点突变的spoT基因编码区构建，即根据 spoT基因编码序列，合成两对扩增spoT基因编码区片段的引物，通过PCR定点突变法在野生型spoT基因编码区(SEQ ID NO:1)中引入点突变，得到点突变的spoT基因编码区核苷酸序列(SEQ ID NO:2)，记为spoT(G520T)。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)中，所述引物为：
P1:5'CGGGATCCGAACAGCAAGAGCAGGAAGC 3'(划线部分为限制性酶切位点BamH I)(SEQ ID NO:5)
P2:5'TGTGGTGGATACATAAACG 3'(SEQ ID NO:6)
P3:5'GCACCGTTTATGTATCCACC 3'(SEQ ID NO:7)
P4:5'AAGGAAAAAAGCGGCCGCACGACAAAGTTCAGCCAAGC 3'(划线部分为限制性酶切位点Not I)(SEQ ID NO:8)。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)包括：以E.coli K12为模板，分别以引物P1 和P2、P3和P4，进行PCR扩增，获得两条含有点突变的spoT基因编码区分离的大小为620bp 和880bp DNA片段(spoT(G520T)-Up和spoT(G520T)-Down片段)。将上述两条DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，再以上述两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过重叠PCR扩增(Overlap PCR)，获得spoT(G520T)-Up-Down片段。
在本发明的一个实施方案中，所述spoT(G520T)-Up-Down片段核苷酸序列大小为1500bp。
在本发明的一个实施方案中，所述PCR扩增按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火 30s，以及72℃延伸30s(30个循环)。
在本发明的一个实施方案中，所述重叠PCR扩增按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸60s(30个循环)。
根据本发明的构建方法，所述步骤(2)包括重组载体的构建，将上述spoT(G520T)-Up-Down 片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化，然后将其和pKOV质粒分别用BamH I/Not I双酶切，将酶切后的spoT(G520T)-Up-Down片段和pKOV质粒经琼脂糖凝胶电泳分离纯化并连接，获得重组载体pKOV-spoT(G520T)。
根据本发明的构建方法，所述步骤(3)包括重组菌株的构建：将重组载体pKOV-spoT(G520T)导入宿主菌株，得到重组菌株。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤(3)的导入为电转化法。
根据本发明的构建方法，还进一步包括筛选重组菌株的步骤；示例性地，采用含氯霉素的培养基进行筛选。
本发明还提供如上所述的构建方法所获得的重组菌株。
本发明提供如上所述的重组菌株在L-苏氨酸制备中的应用。
根据本发明所述的核苷酸序列、重组蛋白、重组载体、重组菌株在L-苏氨酸制备中的应用，包括采用所述重组菌株进行发酵，制备得到L-苏氨酸。
有益效果
本发明通过对产L-苏氨酸的大肠杆菌中spoT基因编码序列引入点突变，获得重组型菌株，所获得的菌株与未突变的野生型菌株相比，有利于生产高浓度的L-苏氨酸，且菌株稳定性好，作为L-苏氨酸生产菌株能够进一步降低生产成本。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。但本领域技术人员了解，本发明的保护范围不仅限于以下实施例。根据本发明公开的内容，本领域技术人员将认识到在不脱离本发明技术方案所给出的技术特征和范围的情况下，对以上所述实施例做出许多变化和修改都属于本发明的保护范围。
实施例1构建用于spoT基因编码区定点突变(G520T)(对应编码蛋白的氨基酸序列第174位甘氨酸被半胱氨酸取代(G174C))的质粒pKOV-spoT(G520T)
SPOT酶由spoT基因编码，在E.coli K12菌株及其衍生菌株(如W3110等)中，野生型的spoT 基因ORF序列如Genbank登录号为AP009048.1中序列3815907-3818015所示。依据该序列设计并合成两对扩增spoT的引物，构建载体用于将出发菌株中spoT基因编码区序列第520位碱基G 变为T。引物设计如下(由上海invitrogen公司合成)：
P1:5'CGGGATCCGAACAGCAAGAGCAGGAAGC 3'(划线部分为限制性酶切位点BamH I)(SEQ ID NO:5)
P2:5'TGTGGTGGATACATAAACG 3'(SEQ ID NO:6)
P3:5'GCACCGTTTATGTATCCACC 3'(SEQ ID NO:7)
P4:5'AAGGAAAAAAGCGGCCGCACGACAAAGTTCAGCCAAGC 3'(划线部分为限制性酶切位点Not I)(SEQ ID NO:8)。
构建方法为：以野生型菌株E.coli K12基因组为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4进行 PCR扩增，获得含有点突变的、长度分别为620bp和880bp的两条DNA片段(spoT(G520T)-Up和 spoT(G520T)-Down片段)。PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL， Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL，所述PCR按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸30s(30个循环)。将上述两条DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，再以纯化后的两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过Overlap PCR扩增出长度约为1500bp的片段(spoT(G520T)-Up-Down片段)。PCR体系：10×ExTaq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL，所述Overlap PCR按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸60s(30个循环)。将上述spoT(G520T)-Up-Down片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化，然后将其和pKOV质粒(购自Addgene公司)分别用BamH I/Not I双酶切，将酶切后的spoT(G520T)-Up-Down片段和pKOV质粒经琼脂糖凝胶电泳分离纯化并通过DNA连接酶连接，获得载体pKOV-spoT(G520T)。将载体pKOV-spoT(G520T)送测序公司进行测序鉴定，将含有正确的点突变(spoT(G520T))的载体pKOV-spoT(G520T)保存备用。
实施例2包含点突变基因spoT(G520T)的工程菌株的构建
野生型大肠杆菌菌株E.coli K12(W3110)和高产L-苏氨酸的菌株E.coli CGMCC7.232(保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心，China General MicrobiologicalCulture Collection Center)的染色体上均保留了野生型的spoT基因。将构建好的质粒pKOV-spoT(G520T)分别转入E. coli K12(W3110)和E.coli CGMCC 7.232，通过等位基因置换，将这两个菌株染色体中的spoT 基因序列第520位碱基G变为T。具体过程为：将质粒pKOV-spoT(G520T)通过电击转化转入宿主菌感受态细胞后加入0.5mL的SOC液体培养基；在30℃、100rpm的摇床中复苏2h；取100μL培养液涂布于氯霉素含量为34μg/mL的LB固体培养基，30℃培养18h；挑选长出的单克隆菌落，接种于10mL LB液体培养基中，37℃、200rpm培养8h；取100μL培养液涂布于氯霉素含量为 34μg/mL的LB固体培养基，42℃培养12h；挑选1-5个单菌落接种于1mL LB液体培养基中， 37℃、200rpm培养4h；取100μL培养液涂布于含有10％蔗糖的LB固体培养基，30℃培养24h；挑选单克隆，并一一对应划线于LB固体培养基和氯霉素含量为34μg/mL的LB固体培养基；挑选在LB固体培养基上生长，同时在氯霉素含量为34μg/mL的LB固体培养基不能生长的对应菌株进行PCR扩增鉴定。PCR扩增采用如下引物(上海invitrogen公司合成)：
P5：5'ctttcgcaagatgattatgg 3'(SEQ ID NO:9)
P6：5'cacggtattcccgcttcctg 3'(SEQ ID NO:10)
上述PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL，所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，(94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸90s，30个循环)，72℃过度延伸10min， PCR扩增产物进行SSCP(单链构象多态性，Single-Strand ConformationPolymorphism)电泳，以质粒pKOV-spoT(G520T)扩增片段为阳性对照，野生型大肠杆菌扩增片段为阴性对照，水作为空白对照。在SSCP电泳中，长度相同而序列排列不同的单链寡核苷酸链在冰浴中形成的空间结构不同，电泳时迁移率也会有所差异。所以，片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致，且与阳性对照片段位置一致的菌株即为等位替换成功的菌株。以等位替换成功的菌株为模板，用引物P5和P6再次通过PCR扩增目的片段，并将目的片段连接到pMD19-T载体，测序。通过测序结果序列比对，spoT基因编码区序列第520位碱基G变为T的重组子即为改造成功的菌株。将来自E.coli K12(W3110)的重组子命名为YPThr03，将来自E.coli CGMCC 7.232的重组子命名为YPThr04。
实施例3苏氨酸发酵实验
将E.coli K12(W3110)菌株、E.coli CGMCC 7.232菌株以及突变菌株YPThr03、YPThr04 分别接种在25mL表1所述的液体培养基中，于37℃、200rpm培养12h。然后，分别取1mL各菌株的培养物接种在25mL表1所述的液体培养基中，于37℃、200rpm发酵培养36h。通过HPLC 测定L-苏氨酸的含量，每株菌做三个平行，计算平均值，检测结果见表2。
表1培养基配方
| 成分 | 配方g/L |
| 葡萄糖 | 40 |
| 硫酸铵 | 12 |
| 磷酸二氢钾 | 0.8 |
| 七水硫酸镁 | 0.8 |
| 七水硫酸亚铁 | 0.01 |
| 一水硫酸锰 | 0.01 |
| 酵母提取物 | 1.5 |
| 碳酸钙 | 0.5 |
| L-甲硫氨酸 | 0.5 |
| 氢氧化钾调节pH值 | pH 7.0 |
表2苏氨酸发酵实验结果
由表2结果所示，无论对于高产还是低产L-苏氨酸的原始菌株，spoT基因的氨基酸序列第 174位甘氨酸被半胱氨酸取代后，都有助于L-苏氨酸产量的提高。
序列表
<110> 黑龙江伊品生物科技有限公司
<120> 一种spoT基因改造的重组菌株及其构建方法与应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2109
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 1
atgtatctgt ttgaaagcct gaatcaactg attcaaacct acctgccgga agaccaaatc 60
aagcgtctgc ggcaggcgta tctcgttgca cgtgatgctc acgaggggca aacacgttca 120
agcggtgaac cctatatcac gcacccggta gcggttgcct gcattctggc cgagatgaaa 180
ctcgactatg aaacgctgat ggcggcgctg ctgcatgacg tgattgaaga tactcccgcc 240
acctaccagg atatggaaca gctttttggt aaaagcgtcg ccgagctggt agagggggtg 300
tcgaaacttg ataaactcaa gttccgcgat aagaaagagg cgcaggccga aaactttcgc 360
aagatgatta tggcgatggt gcaggatatc cgcgtcatcc tcatcaaact tgccgaccgt 420
acccacaaca tgcgcacgct gggctcactt cgcccggaca aacgtcgccg catcgcccgt 480
gaaactctcg aaatttatag cccgctggcg caccgtttag gtatccacca cattaaaacc 540
gaactcgaag agctgggttt tgaggcgctg tatcccaacc gttatcgcgt aatcaaagaa 600
gtggtgaaag ccgcgcgcgg caaccgtaaa gagatgatcc agaagattct ttctgaaatc 660
gaagggcgtt tgcaggaagc gggaataccg tgccgcgtca gtggtcgcga gaagcatctt 720
tattcgattt actgcaaaat ggtgctcaaa gagcagcgtt ttcactcgat catggacatc 780
tacgctttcc gcgtgatcgt caatgattct gacacctgtt atcgcgtgct gggccagatg 840
cacagcctgt acaagccgcg tccgggccgc gtgaaagact atatcgccat tccaaaagcg 900
aacggctatc agtctttgca cacctcgatg atcggcccgc acggtgtgcc ggttgaggtc 960
cagatccgta ccgaagatat ggaccagatg gcggagatgg gtgttgccgc gcactgggct 1020
tataaagagc acggcgaaac cagtactacc gcacaaatcc gcgcccagcg ctggatgcaa 1080
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tccgatctct tcccggatga gatttacgtt ttcacaccgg aagggcgcat tgtcgagctg 1200
cctgccggtg caacgcccgt cgacttcgct tatgcagtgc ataccgatat cggtcatgcc 1260
tgcgtgggcg cacgcgttga ccgccagcct tacccgctgt cgcagccgct taccagcggt 1320
caaaccgttg aaatcattac cgctccgggc gctcgcccga atgccgcttg gctgaacttt 1380
gtcgttagct cgaaagcgcg cgccaaaatt cgtcagttgc tgaaaaacct caagcgtgat 1440
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aatgaaatcc cgcaggaaaa tattcagcgc gagctggatc gcatgaagct ggcaacgctt 1560
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gcaaacctga cggcggcaat taacaccacg acttcgaata ttcaaagttt gaatacggaa 1980
gagaaagatg gtcgcgtcta cagcgccttt attcgtctga ccgctcgtga ccgtgtgcat 2040
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cgaaattaa 2109
<210> 2
<211> 2109
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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aagatgatta tggcgatggt gcaggatatc cgcgtcatcc tcatcaaact tgccgaccgt 420
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aacggctatc agtctttgca cacctcgatg atcggcccgc acggtgtgcc ggttgaggtc 960
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cacggtattc ccgcttcctg 20
Claims (10)
1.一种核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:1所示的spoT基因编码序列第520位碱基发生突变而形成的核苷酸序列；
优选地，所述突变为SEQ ID NO:1中第520位碱基由鸟嘌呤(G)突变为胸腺嘧啶(T)；，所述突变后的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.重组蛋白，由权利要求1所述的核苷酸序列编码；例如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列第174位甘氨酸被半胱氨酸取代。
3.根据权利要求2所述的重组蛋白，其包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
4.重组载体，包括权利要求1所述的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的重组载体，所述重组载体是将所述核苷酸序列导入质粒构建而成。
6.一种重组菌株，其含有权利要求1所述的核苷酸序列；
优选地，所述重组菌株是将权利要求4的重组载体导入宿主菌株中重组形成；所述宿主菌株选自大肠杆菌；例如，所述宿主菌株为E.coli K12(W3110)菌株、E.coli CGMCC 7.232菌株。
7.如权利要求6所述的重组菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)改造如SEQ ID NO:1所示的野生型spoT基因开放阅读框区域的核苷酸序列，使其第520位碱基发生突变，得到如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
(2)将所述突变的核苷酸序列与质粒连接，构建重组载体；
(3)将所述重组载体导入宿主菌株，得到所述重组菌株。
8.根据权利要求7所述的构建方法，所述步骤(1)包括根据spoT基因编码序列，合成两对扩增spoT基因编码区片段的引物，通过PCR定点突变法在野生型spoT基因编码区(SEQ IDNO:1)中引入点突变，得到点突变的spoT基因编码区核苷酸序列(SEQ ID NO:2)，记为spoT(G520T)；
优选地，所述步骤(1)包括：以E.coli K12为模板，分别以引物P1和P2、P3和P4，进行PCR扩增，获得两条含有点突变的spoT基因编码区分离的DNA片段spoT(G520T)-Up和spoT(G520T)-Down片段，再以所述DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过重叠PCR扩增，获得spoT(G520T)-Up-Down片段，所述引物P1-P4分别为：P1：SEQ ID NO:5，P2：SEQ ID NO:6，P3：SEQ ID NO:7，P4：SEQ ID NO:8；优选地，所述spoT(G520T)-Up和spoT(G520T)-Down的DNA片段大小分别为620bp和880bp。
9.根据权利要求7或8所述的构建方法，所述步骤(2)包括将所述spoT(G520T)-Up-Down片段和pKOV质粒分别用BamH I/NotI双酶切，将酶切后的spoT(G520T)-Up-Down片段和质粒经琼脂糖凝胶电泳分离纯化并连接，获得重组载体。
10.权利要求1-6所述的核苷酸序列、重组蛋白、重组载体、重组菌株在L-苏氨酸制备中的应用，优选地，所述应用包括采用所述重组菌株进行发酵，制备得到L-苏氨酸。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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| GR01 | Patent grant | ||
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Denomination of invention: A recombinant strain modified by spot gene and its construction method and Application Effective date of registration: 20210715 Granted publication date: 20201009 Pledgee: Heilongjiang Xinzheng financing guarantee Group Co.,Ltd. Pledgor: Heilongjiang Yipin Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2021230000019 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20220926 Granted publication date: 20201009 Pledgee: Heilongjiang Xinzheng financing guarantee Group Co.,Ltd. Pledgor: Heilongjiang Yipin Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2021230000019 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A Recombinant Strain of SpoT Gene Transformation and Its Construction Method and Application Effective date of registration: 20220927 Granted publication date: 20201009 Pledgee: Heilongjiang Xinzheng financing guarantee Group Co.,Ltd. Pledgor: Heilongjiang Yipin Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2022230000071 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |