CN1572878A - L－氨基酸的生产方法 - Google Patents

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Abstract

通过在培养基中培养具有生产L－氨基酸能力的细菌，以使L－氨基酸在培养基中积累，从培养物中收集L－氨基酸，来生产L－氨基酸，所述细菌被修饰，从而增强其细胞内合成ppGpp的能力。

Description

L-氨基酸的生产方法
                        发明背景
发明领域
本发明涉及发酵工业。更特别的是，本发明涉及一种具有生产L-氨基酸能力的细菌，以及使用该菌生产L-氨基酸的方法。
相关技术的描述
目前，广泛认为ppGpp(鸟苷-3’-二磷酸-5’-二磷酸)和pppGpp(鸟苷-3’-三磷酸-5’-二磷酸)在微生物细胞中作为信号物质发挥着重要的作用。已知ppGpp是一种基本的物质，当微生物增殖所必须的细胞内氨基酸和糖都被耗尽时，该物质能够诱导微生物体内的适应机制，从而使其在此条件下得以存活。
据报道，ppGpp分别由RelA蛋白和SpoT蛋白产生，两者又分别是大肠杆菌体内的relA基因和spoT基因的编码产物。此外，这些基因和蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列也都被报道过(GenBank accession J04039，Metzger，S.et al.，J.Biol.Chem.，1988，263(30)，15699-15704，GenBank accession AE000442U00096)。
RelA蛋白在细菌细胞中以与核糖体结合的形式存在，当它接受氨基酸损耗(depletion)的信号时，就将一个非氨酰化的tRNA结合到核糖体上，然后利用GTP和GDP来生产pppGpp。另一方面，已知SpoT蛋白是一种酶，该酶能够催化三种反应，如：从pppGpp到ppGpp的反应，从GTP到ppGpp的反应和从ppGpp到GTP的反应。在下文中ppGpp和pppGpp均称为是“ppGpp”，因为它们被认为在细胞中的生理学功能上是相同的。
已知当培养基内和细胞中的氨基酸突然损耗时，ppGpp就会通过RelA蛋白在细胞内积累，这些细胞通常表现出一系列的反应，包括核糖体合成的终止，核糖体蛋白的降解，不同氨基酸生物合成途径中的基因表达的增强等等。这些通常被认为是应急反应(stringent responses)，并且这些应急反应已被广泛认为对于细胞在由于氨基酸耗尽而导致的饥饿状态下的存活是必要的反应(Cashel，M，Gentry，D.R.，Hernadez，V J.，and Vinella，D.，The stringent response，In：Neidhardt，F.C.et al.(ed)Escherichia coli and Salmonella；Cellar and Molecular Biology，2nd edition，1458-1469(ASM Press，Washington d.c.，1996)。
到目前为止，分析实例将注意力放在ppGpp引起的物质的产生上，包括使用消除了产生ppGpp活性的重组大肠杆菌以提高蛋白的产量(Dedhia，N.et al.，Biotechnol.Bioeng.，1997，Vol.53，379-386)，通过修饰放线菌体内的核糖体蛋白和RNA聚合酶的ppGpp-结合位点来提高抗生素的生产能力(Hu，H.，and Ochi，K.，Appl.Environ.Microbiol.，2001，Vol.67，1885-18921，Hu，H.，Zhang，Q.，and Ochi，K.，J.Bacteriol.，2002，Vol.184，3984-3991)等等。
然而，至今仍没有有关氨基酸生物合成系统与ppGpp生产能力之间关系的研究报道，其中所述生物合成系统被公认为由ppGpp直接作用。
                            发明概述
本发明的一个目的是提高细菌生产L-氨基酸的能力，以及具有生产L-氨基酸能力被提高的细菌。
本发明的一个目的是提供一种生产L-氨基酸的方法，该方法包括在培养基上培养具有生产L-氨基酸能力的细菌，使L-氨基酸在培养物中积累，然后从培养物中收集L-氨基酸，其中所述的细菌被修饰过，从而使提高了合成ppGpp的活性。
本发明的进一步的目的是提供上面所述的方法，其中所述的细菌经过修饰从而合成ppGpp的酶的活性被提高了。
本发明的进一步的目的是提供上面所述的方法，其中所述的酶是RelA蛋白，或者是该蛋白的催化结构域。
本发明的进一步的目的是提供上面所述的方法，其中所述的RelA蛋白的活性通过提高relA基因的拷贝数或者是提高编码RelA蛋白催化结构域的relA基因的部分区域的拷贝数而被增强；或者通过修饰relA基因的表达调控序列，从而使细菌细胞内relA基因的表达或编码RelA蛋白催化结构域的relA基因的部分区域的表达得以增强。进一步目的是提供上面所述的方法，其中所述的RelA蛋白被定义为如下的(A)或(B)：
(A)  一种具有SEQ ID NO：20所示氨基酸序列的蛋白。
(B)  一种具有SEQ ID NO：20的包括其替换，缺失，插入，增加一个或几个氨基酸残基的氨基酸序列的蛋白，且所述的蛋白具有合成ppGpp的活性。并且所述蛋白质具有合成ppGpp的活性。
本发明的进一步的目的是提供一种上述的方法，其中所述的RelA蛋白是由如下(a)或(b)编码的：
(a)具有SEQ ID NO：19所示核苷酸序列的DNA。
(b)具有在严谨条件下能与SEQ ID NO.19核苷酸序列杂交的DNA，且所述的DNA编码具有合成ppGpp活性的蛋白。
本发明的进一步的目的是提供一种上面所述的方法，其中所述的L-氨基酸选自L-谷氨酸，L-苏氨酸，L-异亮氨酸，L-赖氨酸，L-组氨酸，L-缬氨酸，L-精氨酸，L-亮氨酸，L-苯丙氨酸和L-色氨酸。
本发明的进一步的目的是提供一种上面所述的方法，其中所述的L-氨基酸选自L-谷氨酸，L-苏氨酸，L-异亮氨酸和L-赖氨酸。
本发明的进一步的目的是提供一种上面所述的方法，其中所述的细菌属于埃希氏菌属。
本发明的更进一步的目的是提供一种具有生产L-氨基酸能力的和经过修饰，并增强细胞内RelA蛋白的活性的细菌。
根据本发明，细菌生产L-氨基酸的能力能被提高。
                        附图简要说明
图1显示质粒pM14和pM15的构建。
图2显示质粒pMD4041-cat-2Tfd的构建。
图3显示质粒pSTVrelA和pSTVrelA*的构建。
                      优选实施例的描述
本发明的发明人为了实现前述发明目的，进行了刻苦的研究。结果发现通过提高ppGpp的生产能力，特别是通过增强RelA蛋白合成ppGpp的活性，能够提高L-氨基酸的生产能力。因此，完成本发明。
接下来，对本发明进行详细描述。
本发明中所使用的细菌
本发明中的细菌具有生产L-氨基酸的能力，并且经过修饰使其在细胞内合成ppGpp的能力增强。
本发明中的细菌没有特别的限制，只要通过增强细胞内合成ppGpp的活性，其生产L-氨基酸的能力可被增强。细菌的实例，包括但不局限于，属于埃希氏菌属(Escherichia)的细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)，棒状杆菌如乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)，属于沙雷氏菌属(Serratia)的细菌如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，属于杆状菌属(Bacillus)的细菌如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等等。
本发明中所使用的术语“生产L-氨基酸的能力”是指，当本发明的细菌在培养基中培养时，能够促使L-氨基酸在培养基中积累的一种能力。这种生产L-氨基酸的能力可以是野生型细菌菌株内在固有的一种性质，也可以是通过繁殖(breeding)而赋予的或者增强的一种性质。
L-氨基酸的实例包括L-谷氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-缬氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸等等。在这些L-氨基酸中，L-谷氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-赖氨酸是优选的。
具有生产L-氨基酸能力的细菌的特殊的例子，包括但不局限于，下述的以L-谷氨酸作为目的氨基酸的大肠杆菌MG1655ΔsucA(见实施例部分)，大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853，见FR2680178)，大肠杆菌的L-缬氨酸抗性菌株例如大肠杆菌B11、大肠杆菌K-12(ATCC10798)、大肠杆菌B(ATCC11303)和大肠杆菌W(ATCC9637)，乳酸发酵短杆菌AJ12475(FERM BP-2922，见US5272067)等等；
以L-苏氨酸作为目的氨基酸的大肠杆菌VKPM B-3996(见US5175107)，大肠杆菌MG442菌株(VKPM B-1628，见Gusyatiner et al.，Genetika(in Russian)，14，pp.947-956，1978，US4278765)，嗜乙酰乙酸短杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)AJ12318(FERM BP-1172，见US5188949)等等；
以L-异亮氨酸作为目的氨基酸的大肠杆菌KX141(VKPM B-4781，见EP519113)，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)AJ12149(FERM BP-759，见US4656135)等等；
以L-赖氨酸作为目的氨基酸的大肠杆菌AJ11442(NRRL B-12185，FERMBP-1543，见US4346170)，大肠杆菌WC196菌株(FERM BP-5252，WO96/17930)，乳酸发酵短杆菌AJ3990(ATCC31269，见US4066501)等等；
以L-苯丙氨酸作为目的氨基酸的大肠杆菌AJ12604(FERM BP-3579，见EP488424)，乳酸发酵短杆菌AJ12637(FERM BP-4160，见FR2686898)等等；
以L-亮氨酸作为目的氨基酸的，具有β-2-噻吩丙氨酸抗性的菌株，具有β-2-噻吩丙氨酸抗性和β-羟基亮氨酸抗性的菌株(见JP62-34397，其针对前面两者)，具有4-氮亮氨酸(4-azaleucine)或者是5，5，5-三氟亮氨酸抗性的菌株(见JP8-70897)，大肠杆菌AJ11478(FERM P-5274，见JP62-34397)，乳酸发酵短杆菌AJ3718(FERM P-2516，见US3970519)等等。
以L-缬氨酸作为目的氨基酸的大肠杆菌VL1970(VKPM B-4411，见EP519113)，乳酸发酵短杆菌AJ12341(FERM BP-1763，见US5188948)等等，和
以L-高丝氨酸作为目的氨基酸的NZ10菌株，该菌株是一个大肠杆菌C600的Leu+回复突变型菌株(见Appleyard R.K.，Genetics，39，pp.440-452，1954)。
在上面所述的菌株中，大肠杆菌MG1655ΔsucA菌株是通过破坏MG1655菌株(得自大肠杆菌遗传繁殖中心(Yale University，Dept.Biology，OsbornMemorial Labs.，06511-7444 New Haven，Connecticut，U.S.A.，P.O.Box 6666)中编码aKGDH(a-酮戊二酸脱氢酶)E1亚基的一个基因(sucA)而获得的(见实施例部分)。因此核苷酸序列和编码的氨基酸序列是已知的(见，例如，GenBank收录号X00661)。此外，对于大肠杆菌染色体sucA基因的破坏也是已知的(见EP0670370B1)。
另外，大肠杆菌B-3996菌株缺乏thrC基因，利用蔗糖，并且在ilvA基因处有一个渗漏突变。此菌株在与对苏氨酸和高丝氨酸具有高耐受性有关的rht基因处有一个突变(FR2804971)。B-3996菌株含有pVIC40质粒，该质粒的获得是通过将一个thrA*BC操纵子插入到来自于RSF1010的载体上，其中的操纵子含有一个突变的、编码天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因，对于苏氨酸的反馈抑制是极不敏感的。B-3996菌株已于1987年4月7日保藏于俄罗斯国际工业微生物保藏中心(VKPM)(地址：Dorozhny proezd.1，Moscow113545，Russian Federation)，其保藏编号为：B-3996。
菌株B-3996/pMWD5(JP08-047397，US5998178)的获得是通过将质粒pMWD5导入到菌株B-3996中，其中所述质粒含有ilvGMEDA操纵子，该操纵子中除去了弱化作用(attenuation)所必需的区域(JP08-047397，WO96/26289)。
本发明中的细菌可通过修饰具有生产上面提及的L-氨基酸能力的细菌而获得，从而使细菌合成ppGpp的活性得以增强。本发明中的细菌也可通过给予被修饰的细菌生产L-氨基酸的能力，从而使细菌合成ppGpp的活性增强，或者是增强这种细菌生产L-氨基酸的能力。
“被修饰从而使合成ppGpp的活性得以增强”是指与未经修饰的菌株，例如野生型菌株相比，经修饰菌株的每个细胞合成ppGpp的活性被增强。这种野生型菌株的例子包括，但不局限于大肠杆菌中的大肠杆菌MG1655。
细菌合成ppGpp的活性可以通过修饰细菌被增强，从而合成ppGpp的酶的活性被增强。ppGpp合成酶的例子包括RelA蛋白和SpoT蛋白。其中RelA蛋白是优选的。此外，细菌也可以被修饰使RelA蛋白和SpoT蛋白的活性都被增强。
前面提及的细菌蛋白的活性可通过例如，提高编码RelA的基因(relA)和编码SpoT的基因(spoT)的表达而被增强。这些基因表达水平的提高可通过增加relA和spoT的拷贝数。例如，将含有relA或者spoT的基因片段连接到细菌中可发挥功能的载体上，优选的是多拷贝型载体，来制备重组DNA并将其用于细菌的转化。
relA基因和spoT基因的来源并没有被特别地限制，只要这些基因能在导入它们的寄主细菌中发挥功能。然而，来源于与寄主同种或者类似种的基因是优选的。
大肠杆菌relA基因和spoT基因核苷酸序列是已知的(relA：GenBank收录号AE000362，核苷酸片段1667-3901，spoT.GenBank收录号为AE000442U00096，核苷酸片段3791-5899)。这些基因可通过PCR(聚合酶链式反应，见White，T.J.et al.，Trends Genet.5，185(1989))获得，其PCR过程中所使用的引物是在属于埃希氏菌属的细菌的已知核苷酸序列和染色体DNA的基础上制备而成的。其它微生物中relA和spoT的同族物(homologues)也可通过类似的方法制备。
大肠杆菌relA基因的核苷酸序列和RelA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NOS：19和20所示。大肠杆菌spoT基因的核苷酸序列和SpoT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NOS：21和22所示
本发明中所使用的relA和spoT可编码RelA或者SpoT，包括其经过替换、缺失、插入、增加或者倒置一个或几个氨基酸残基，只要编码的RelA蛋白和SpoT蛋白合成ppGpp的活性没有被大幅降低就可。此处“几个”氨基酸残基的数目根据蛋白质三级结构或者氨基酸残基的类型而有所不同，它可以是2-500个，优选的是2-100个，更优选的是2-20个。
因此，如上面所描述的RelA或者SpoT的变化都是典型的保守性的变化，从而能够保持RelA或者SpoT的活性。替换变化，包括那些氨基酸序列中至少一个残基被去掉，又有不同的残基被插入到它的位置上。在RelA或者SpoT蛋白中，原始氨基酸可被替换，且又被认为是保守性替换的氨基酸的例子包括：Ser或Thr替换Ala；Gln、His或Lys替换Arg；Glu、Gln、Lys、His、Asp替换Asn；Asn、Glu或Gln替换Asp；Ser或Ala替换Cys；Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg替换Gln；Asn、Gln、Lys或Asp替换Glu；Pro替换Gly；Asn、Lys、Gln、Arg、Tyr替换His；Leu、Met、Val、Phe替换Ile；Ile、Met、Val、Phe替换Leu；Asn、Glu、Gln、His、Arg替换Lys；Ile、Leu、Val、Phe替换Met；Trp、Tyr、Met、Ile或Leu替换Phe；Thr、Ala替换Ser；Ser或Ala替换Thr；Phe、Tyr替换Trp；His、Phe、Trp替换Tyr；Met、Ile、Leu替换Val。
RelA蛋白由催化结构域和核糖体结合结构域组成。在本发明中RelA蛋白的核糖体结合结构域可被去除。在SEQ ID NO：20所示的RelA蛋白的氨基酸序列中，催化结构域对应的是氨基酸1-464。这样一种仅由催化结构域组成的RelA蛋白也落入本发明所指的RelA蛋白范围之内。在本发明说明书中，只编码仅由催化结构域组成的RelA蛋白的基因，也可被描述为“relA*”。
编码与RelA或SpoT基本一致的蛋白的DNA可通过修饰relA或spoT的核苷酸序列获得。例如，可使用定点诱变以在RelA或RpoT的特异性位点上替换、缺失、插入、添加或倒置氨基酸残基。此外，上面所描述的DNA修饰也可通过传统的已知的诱变处理来获得。这种诱变处理包括一种在体外诱变处理之前，使用羟胺或者其类似物处理DNA的方法，和一种在诱变处理之前，使用紫外辐射或者通常处理使用的诱变剂，如N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸对微生物，如含有DNA的埃希氏菌细菌，进行的处理的方法。
可在适当的细胞内表达上述突变的DNA，通过检测表达产物的活性来获得编码与RelA或SpoT基本一致的蛋白的DNA。编码含有突变的RelA或SpoT的DNA也可通过如下方式获得：分离能在严谨条件下与探针杂交的DNA，该探针包含如，核苷酸序列SEQ ID NO：19或21的核苷酸序列或者它们的一部分，并且所述DNA编码具有从含有编码带有突变的RelA或SpoT的DNA的细胞中合成ppGpp活性的蛋白。“严谨条件”在此指的是，包括那些可形成所谓特异性杂交，而不能形成非特异性杂交的条件。很难使用任何数值对该条件作出清楚的表达。然而，例如，严谨条件包括在此条件下DNA具有高度同源性，如至少50％同源性的DNA之间可彼此杂交，而低于此同源性的DNA之间则不能杂交。另外，严谨条件也体现为DNA彼此杂交的盐浓度条件，该盐浓度对应于Southern杂交的普通洗涤条件。例如，1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC，0.1％SDS，60℃。
SEQ ID NO：19或21的部分核苷酸序列也可被用来作为探针。探针的生成是使用寡核苷酸通过PCR合成的，其中的寡核苷酸是在以SEQ ID NO：19或20的核苷酸序列为引物，以含有SEQ ID NO：19或21的核苷酸序列的DNA片段作为模板的基础上生成的。当使用长度大约为300bp的DNA片段为探针时，杂交的洗涤条件可以是，例如50℃，2×SSC和0.1％SDS。
编码与RelA基本一致蛋白的DNA，其特殊实例包括：编码相对于SEQ IDNO：20所示的氨基酸序列，优选与其有70％同源性或更多，更优选为80％同源性或更多，更优选为90％同源性或更多，特别优选为95％同源性或更多，具有与RelA相似活性的蛋白的DNA。当RelA蛋白仅由催化结构域组成时，那么优选该催化结构域也应该具有前面所述程度的同源性。编码与SpoT基本一致蛋白的DNA，其特殊实例包括：相对于SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，优选与其有70％同源性或更多，更优选为80％同源性或更多，更优选为90％同源性或更多，特别优选为95％同源性或更多，且具有与SpoT相似活性的蛋白的DNA。
作为分离RelA或SpoT的材料的染色体DNA可通过，例如Saito和Miura方法(见H.Saito and K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)，Text forBioengineering Experiments，Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering，Japan，pp.97-98，Baifukan，1992)或者类似方法从细菌中制备，该细菌是染色体DNA的提供者。
用于relA扩增的引物的实例包括表格1中描述的relA5和relA6，用于relA*扩增的引物的实例包括relA5和relA7。此外，用于spoT扩增的引物的实例包括spoT1和spoT4。
若将PCR扩增的含有relA和spoT的DNA片段与可在大肠杆菌或类似细胞中自主复制的载体DNA相连接，那么后续的程序就变得更容易。在大肠杆菌细胞中能够自主复制的载体包括：pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pBR322、pACYC184、pMW219、pSTV29等等。
为了将relA和spoT连接到载体上，以制备重组DNA，需要使用与基因末端相应的限制性内切酶来消化该载体，并使用T4 DNA连接酶来连接。
为了将上述制备好的重组DNA导入到棒状杆菌中，可采用任何迄今已报道过的已知的转化方法。例如，这些方法包括用氯化钙处理受体细胞来增强DNA的渗透性，此法被报道用于大肠杆菌K-12，(Mandel，M And Higa，A.，J.Mol.Biol.53，159(1970))，以及一种从生长期的细胞中制备感受态细胞，然后将DNA导入其中的方法，此法被报道用于枯草芽孢杆菌(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Young，F.E.，Gene，1，153(1977))。此外，此种转化方法还包括将DNA受体细胞制备成很容易吸收重组DNA的原生质体或去壁细菌细胞，随后将重组DNA导入到细胞中，已知此法在枯草芽孢杆菌，放射菌类和酵母上是可行的(Chang，S.And Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci，USA，75，1929(1978))。转化也可以通过电脉冲的方法来完成(日本专利，公开号NO：2-207791)。
也可通过将基因的多个拷贝导入到细菌染色体DNA中，来增加基因的拷贝数。基因的多拷贝可以是通过同源重组导入到细菌的染色体DNA中的。这可通过标定(targeting)存在于染色体DNA上具有多拷贝数的序列来实施。存在于转座因子末端的重复DNA或反向重复DNA，可被用作存在于染色体DNA上具有多拷贝的序列。另外，正如在日本专利2-109985中所披露的，目的基因的众多拷贝可被融入到转座子(transposon)上，并将之转移，从而将其导入到染色体DNA上。
除了上面所述的基因扩增方法外，通过使用更强的表达调控序列来替换原来的表达调控序列，如替换染色体DNA或质粒上的relA或spoT启动子，来增强RelA或SpoT的活性。强启动子的例子包括lac启动子，trp启动子，trc启动子等等。此外，正如在WO00/18935中披露的，通过在基因启动子区域导入几个核苷酸替换，该启动子就可能被修饰成更强的启动子。这些启动子的替换或者修饰增强了relA或spoT基因的表达，因此，RelA和/或SpoT的活性被增强了。表达调控序列的修饰也可以和基因的多拷贝结合在一起。
表达调控序列的替换可以使用例如下述的温度敏感质粒，采用与基因替换同样的方式来进行。属于埃希氏菌属细菌的温度敏感质粒的例子包括：pMAN031(Yasueda，H.et al，Appl.Microbiol.Biotechnol.，36，211(1991))，pMAN997(WO99/03988)，pEL3(K.A.Armstrong et.al.，J.Mol.Biol.(1984)175，331-347)等等。pMAN997是通过替换pMAN031(J.Bacteriol.，162，1196(1985))和pUC19(Takara Shuzo)上的VspI-HindIII片段获得的。在大肠杆菌中，这些质粒至少在30℃下能自主复制，而在42℃却不能自主复制。
<2>根据本发明生产L-氨基酸的方法
将上述获得的本发明的细菌培养于培养基中，在培养物中生产并积累L-氨基酸，并从培养物中收集L-氨基酸，从而获得L-氨基酸。
本发明所使用的培养基可以是传统使用的已知的培养基，它们的选择是根据所利用的细菌和目标L-氨基酸的类型。也就是说，这种培养基可以是典型的含有碳源，氮源，无机离子，以及如果需要的话还有其它有机成分的培养基。本发明的实施不需要任何特别的培养基。
很多糖如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉水解产物，醇如丙三醇、山梨醇，有机酸如反丁烯二酸、柠檬酸、琥珀酸等等，都可作为碳源。
无机铵盐如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵，有机氮如大豆水解产物、氨气、水合氨等都可用作氮源。
还允许以适当的量加入一些必需的物质如维生素B1、L-高丝氨酸，L-酪氨酸，或者酵母提取物，作为有机营养物质，可达到令人满意的效果。除了上面所述之外，如果需要的话，还可加入少量的磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。
根据所使用的菌株，可选择传统使用的已知的条件来进行培养。例如，培养时间优选在需氧条件16-120个小时。培养温度优选控制在25℃-45℃，培养过程中的pH值优选控制在5-8。无机或有机的，酸性或碱性的物质，以及氨气或者类似的物质，可用来调节pH值。
对于培养结束后从培养基中收集L-氨基酸，在本发明中不需要任何特殊的方法。也就是说，根据目标L-氨基酸的类型，可采用将传统的已知的离子交换法、沉淀技术以及其它的技术相结合来收集目标L-氨基酸。
实施例
接下来，将采用以下非限制性的实施例来对本发明做以更详细的解释。
以下实施例中的氨基酸指的是L-氨基酸。所使用的PCR引物如表1所示。
表1：引物序列
  引物   SEQ ID NO：     序列
 sucA1     1  GCGAATTCCTGCCCCTGACACTAAGACA
 SucA2     2  CGAGGTAACGTTCAAGACCT
 SucA3     3  AGGTCTTGAACGTTACCTCGATCCATAACGGGCAGGGCGC
 SucA4     4  GCGAATTCCCACTTTGTCAGTTTCGATT
 RelA1     5  GCGAATTCTTGAACTGGTACAGGCAACC
 RelA2     6  TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGTGCGTCTGTTGCAGACAATAC
 RelA3     7  CCCATCCACTAAACTTAAACATAGCGACACCAAACAGCAAC
 RelA4     8  GCGAATTCAAGCACTTCACTACTGTTTTC
 RelA5     9  TTTAAGCTTGCGCGACTGGCGATGC
 RelA6     10  TTTTCTAGATCCGCACCGCCGGTG
 RelA7     11  TTTTCTAGATAATTTCAATCTGGTCGCC
 RelA8     12  GCGAATTCTACGCACTGGCTCAATAATT
 RelA9     13  GCAAGCTTTGTGACGTTTTATCACGAAA
 RelA10     14  GCGAATTCTAGATAATTTCAATCTGGTCGCC
 SpoT1     15  GCGAATTCCGCGGAGTATCTTTATTTTAC
 SpoT2     16  CCCATCCACTAAACTTAAACAGCTTTCAAACAGATACAA
 SpoT3     17  TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGACCCGAAACCGAAATTAA
 SpoT4     18  GCGAATTCTAAAGAATGAGGGCTGAGGC
实施例1
<1>过量生产谷氨酸的大肠杆菌菌株的获得
首先，构建一个野生型大肠杆菌菌株的sucA基因被破坏的菌株用于获得能超量生产谷氨酸的大肠杆菌菌株。通过交换(crossover)PCR来制备用于基因破坏的缺失型基因(见Link，A.J.，Phillips，D.，Chuich，GM.，J.Bacteriol.，179.Pp.6228-6237，1997)。使用sucA1至sucA4作为引物。sucA1和sucA4是用于扩增全长sucA基因的引物，其两端大约1000bp的旁侧区域，sucA2和sucA3则是组成用于删除该基因ORF内在部分序列的一套引物。
将引物sucA1和sucA2与引物sucA3和sucA4组合，以采用普通方法制备的野生型大肠杆菌菌株MG1655的基因组DNA为模板，进行第一次PCR。在此次PCR中，引物sucA1和sucA2与引物sucA3和sucA4的摩尔比为10∶1。使用第一次PCR获得的产物为模板，以sucA1和sucA4为引物，进行第二次PCR。此次PCR扩增的sucA基因的ORF内部序列被删除。用限制性内切酶EcoRl来消化扩增的DNA片段的两端。
应用同样的限制性内切酶EcoRI来消化具有温度敏感复制区域的质粒pMAN997，使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)纯化酶切产物并将其连接到前面提及的经扩增的DNA片段上。将上面的连接反应物转化到大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Shuzo)中，接种到含有25μg/ml氨苄青霉素(Ap，Sigma)(LB+Ap plate)的LB琼脂平板上，在30℃下培养，并挑选克隆。挑选出的克隆在30℃温度下被培养于含有25μg/ml Ap的LB培养基的试管中，使用Wizard Plus Miniprep(Promega)从细胞中抽提质粒。用EcoRI消化所抽提的质粒，含有目的长度片段的质粒被选择作为用于基因破坏的质粒(pMANΔsucA)。
将pMANΔsucA转化目的寄主，在30℃下，从LB+Ap的培养皿上挑选克隆。挑选出的克隆于在液体培养基中30℃培养过夜，将培养液稀释103倍，并接种到LB+Ap平板上，42℃的培养条件下挑选克隆。将挑选出的克隆涂布到LB+Ap平板上并在30℃下培养。然后将每个平板中相当于1/8的细胞悬浮于2mlLB培养基中，并于42℃下震荡培养4-5个小时。将培养液稀释105倍，并接种到LB平板上。将所获得的克隆中的几百个克隆接种到LB和LB+Ap平板上，通过检测它们的生长状况来证实其对Ap的敏感性或抗性。对几个Ap敏感性菌株进行克隆PCR来证实sucA基因的破坏。从而，获得了MG1655ΔsucA。
<2>从过量生产谷氨酸的大肠杆菌菌株中获得relA基因破坏菌株和spoT基因破坏菌株
基于<1>中获得的MG1655ΔsucA来构建菌株，其中relA基因，spoT基因或者两者都被破坏。通过交换PCR来对每一个基因进行破坏。采用relA1至relA4和spoT1至spoT4作为relA基因和spoT基因的引物。RelA1和relA4与spoT1和spoT4分别作为用于扩增全长relA和spoT基因的引物，并且其两端大约1000bp的旁侧区域。sucA2和sucA3与spoT2和spoT3则分别是构成用于删除上述两个基因ORF内部分序列的两套引物。
将引物sucA1和sucA2与引物sucA3和sucA4组合，以采用普通方法制备的野生型大肠杆菌菌株MG1655的基因组DNA为模板，进行第一次PCR。在此次PCR中，引物sucA1和sucA2与引物sucA3和sucA4的摩尔比为10∶1。使用第一次PCR获得的产物为模板，以sucA1和sucA4为引物，进行第二次PCR。
此外，也可以将引物spoT1和spoT2与引物spoT3和spoT4组合，以采用普通方法制备的野生型大肠杆菌菌株MG1655的基因组DNA为模板，进行第一次PCR。此次PCR中，引物引物spoT1和spoT2与引物spoT3和spoT4的摩尔比为10∶1。使用第一次PCR获得的产物为模板，以spoT1和spoT4为引物，进行第二次PCR。
通过第二次PCR扩增获得的relA基因和spoT基因均有ORF内部序列的缺失。
用同样的限制性内切酶EcoRI来消化具有温度敏感复制区域的质粒pMAN997，利用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)纯化酶切产物并将其连接到前面提及的被扩增的DNA片段上。将上面的连接反应物转化到大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Shuzo)中，接种到含有25μg/ml氨苄青霉素(Ap，Sigma)(LB+Ap plate)的LB琼脂平板上，在30℃下培养，并挑选克隆。将挑选出的克隆在30℃的温度下培养于含有25μg/ml Ap的LB培养基的试管中。使用Wizard Plus Miniprep(Promega)从细胞中抽提质粒DNA。用EcoRI消化这些质粒，含有目的长度片段的质粒被选择作为用于基因破坏的质粒(pMANΔrelA和pMANΔspoA)。
用pMANΔrelA或pMANΔspoA转化从<1>中获得的MG1655ΔsucA。30℃下，从LB+Ap的平板上挑选克隆。挑选出的克隆于30℃过夜培养于液体培养基中，将培养液稀释103倍，并接种到LB+Ap平板上，42℃的培养条件下挑选克隆。将挑选出的克隆涂布到LB+Ap平板上并培养于30℃。然后将每个平板中相当于1/8的细胞悬浮于2ml LB培养基中，并于42℃下震荡培养4-5个小时。将培养液稀释105倍，并接种到LB平板上。将获得的几百个克隆接种到LB和LB+Ap平板上，通过检测它们的生长状况来证实其对Ap的敏感性或抗性。对几个Ap敏感性菌株进行克隆PCR来证实sucA基因的破坏。从而，获得了MG1655ΔsucAΔrelA和MG1655ΔsucAΔspoT。
此外MG1655ΔsucAΔrelA的spoT基因也以和上面描述的相同的方式被破坏，从而获得MG1655ΔsucAΔrelAΔspoT。
评估每一个通过上面描述的方式获得的基因被破坏的菌株生产谷氨酸的能力。用含有40g/L的葡萄糖，1g/L MgSO4.7H2O，1g/L KH2PO4，16g/L(NH4)2SO4，10mg/L FeSO4.7H2O，10mg/L MnSO4.4-5H2O，2g/L酵母提取液和50g/L CaCO3的、装在体积为500mL的Sakaguchi烧瓶中的培养基培养这些菌株。培养起始时培养液的体积是20mL，并在37℃下以120rpm的往返频率震荡培养24小时。培养基，容器等在使用前均需经过高压灭菌。分别测量培养液中细胞的密度、葡萄糖的浓度和谷氨酸的积累量。用分光光度计(Beckman)在562nm下检测用0.1N的HCl稀释到适当浓度的培养液的浑浊度来确定细胞密度。用BiotechAnalyzer(Sakura Seiki)来检测离心去除细胞后并用水液稀释到适当的浓度上清液，来测定残留的葡萄糖和谷氨酸的浓度。结果见表2。
表2：不同的产谷氨酸的细菌产生谷氨酸的能力
菌株  MG1655ΔsucA  MG1655ΔsucAΔrel  MG1655ΔsucAΔrelΔspoT  MG1655ΔsucAΔspoT
OD562葡萄糖(g/L)谷氨酸(g/L)产量  16.60.013.834.5％  10.820.23.618.1％  8.622.63.218.4％  15.70.015.739.3％
正如表2所示，证实了在relA被破坏的菌株中，其生长，糖的消耗以及谷氨酸的产量都显著地降低了。另一方面，由于spoT基因缺失，没有显著观察到任何影响。
实施例2：超量生产ppGpp的质粒的构建
通过扩增relA基因的全部区域或者是编码relA催化结构域的区域的基因产物(relA*)的来构建过量生产ppGpp的菌株。根据扩增的引物，构建了四种不同的质粒(pMrelA，pMrelA*，pSTVrelA，pSTVrelA*)。
<1>pMrelA和pMrelA*的构建
pMrelA和pMrelA*质粒的构建如下。
用限制性内切酶PvuII消化质粒pMW119(Nippon Gene)，并自身环化获得pMW1质粒。然后，以传统的方式将mini-Mud4041载体(Miller，“A short cousein bacterial genetics”，Cold Springs Harbor Press(1992)385-400)合并到pMW1质粒中获得质粒pMu11。用限制性内切酶HindIII消化pMu11，并自身环化获得pM12质粒，从中基因A和来源于Mu噬菌体的编码转座酶的基因B，以及编码反向调控因子的ner基因被去除。然后，用限制性内切酶BamHI和HindIII消化pM12，并连接到含有ter和fd区域(2Tfd)的位置，从而构成质粒pM14，其中的2Tfd来自于限制性内切酶BamHI和HindIII消化的pMD4041-cat-2Tfd质粒(图1)。
前面提及的质粒pMD4041-cat-2Tfd是通过如下方式获得的。
用限制性内切酶BamHI和AccI消化质粒pML24(Trukhan et al.，Biotechnologiya(in Russian)4，No.3(1988)，325-334；EP1234883)，并用T4 DNA聚合酶钝化其末端。该产物与用限制性内切酶BglII和SmaI消化，用DNA聚合酶末端钝化的质粒pMD4041相连接，从而获得质粒pMD4041-cat-2Tfd(图2)。质粒pMD4041是用限制性内切酶HindIII消化pMu4041(mini-Mud4041，Faelen，M.，Useful Mu and mini-Mu derivatives，In：Phage Mu，Symonds et al.，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1987，pp.309-316)，以切除基因A和编码Mu噬菌体转移酶的基因B，以及编码反面调控因子的基因ner，并重新环获得的(EP1149911)。
用限制性内切酶AaIII和HindIII消化质粒pM14，并连接到一个用限制性内切酶AaIII和BglII消化质粒pM2(披露于日本专利2001-346578)而切下的，并含有来自于λ噬菌体的PR启动子的片段上。从而获得了质粒pM15(图1)。
用限制性内切酶HindIII和XbaI消化质粒pM15获得一个载体片段。此外，以大肠杆菌野生型菌株MG1655的基因组DNA为模板，relA5和relA6为引物进行PCR，将扩增产物用HindIII和XbalI消化获得含有relA基因的DNA片段。此DNA片段和前面提及的载体片段(pM15)用DNA连接试剂盒Kit Ver.2(Takara Shuzo)连接，从而获得质粒pMrelA。
另外，以MG1655的基因组DNA为模板，relA5和relA7为引物进行PCR，将扩增产用物限制性内切酶HindIII和XbaI消化，获得含有relA*基因的DNA片段。此DNA片段和前面提及的载体片段(pM15)用DNA连接试剂盒Kit Ver.2(Takara Shuzo)连接，从而获得质粒pMrelA*。
<2>pSTVrelA和pSTVrelA*的构建
质粒pSTVrelA和pSTVrelA*以如下的方式被构建。
用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化质粒pSTV29(Takara Shuzo)获得一个载体片段。此外，以MG1655的基因组DNA为模板，relA8和relA9为引物进行PCR，将扩增产物用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化以获得含有relA基因的DNA片段。将这些DNA片段连接起来得到质粒pSTVrelA。
另外，以MG1655的基因组DNA为模板，relA9和relA10为引物进行PCR，将扩增产用物限制性内切酶HindIII和XbaI消化，获得含有relA*基因的DNA片段。将此DNA片段和前面提及的载体片段(pSTV29)连接得到质粒pSTVrelA*(见图3)
实施例3：将relA基因导入超量生产谷氨酸的大肠杆菌菌株和其relA基因被破坏的菌株中，以及它们对谷氨酸产量的影响
将在实施例2中得到的质粒pM15，pMrelA和pMrelA*用于转化在实施例1中得到的MG1655ΔsucA和MG1655ΔsucAΔrelA。
评价每一个转化子生产谷氨酸的能力。用含有40g/L的葡萄糖、1g/LMgSO4.7H2O、1g/L KH2PO4、16g/L (NH)2SO4、10mg/L FeSO4.7H2O、10mg/LMnSO4.4-5H2O、2g/L酵母提取液、50g/L CaCO3和100μg/mL氨苄青霉素的、装在体积为500mL的Sakaguchi烧瓶中的培养基培养这些菌株。培养起始时培养液体积是20mL，并在37℃下以120rpm的往返频率震荡培养24小时。培养基、容器等在使用前均需经过高压灭菌。分别测量培养液中细胞的密度、葡萄糖的浓度和谷氨酸的积累量。用分光光度计(Beckman)在600nm下检测用0.1N的HCl稀释到适当浓度的培养液的浑浊度来确定细胞密度。用Biotech Analyzer(Sakura Seiki)检测离心去除细胞后，并用水稀释到适当的浓度的上清液，来测定残留的葡萄糖和谷氨酸的浓度。结果见表3。
表3：不同的生产谷氨酸的细菌生产谷氨酸的能力
菌株  MG1655ΔsucA/pM15  MG1655ΔsucA/pMrelA* MG1655ΔsucA/pMrelA  MG1655ΔsucAΔrelA/pM15  MG1655ΔsucAΔrelA/pMrelA*  MG1655ΔsucAΔrelA/pMrelA
OD562葡萄糖(g/L)谷氨酸(g/L)产量  17.80.015.839.5％  17.90.016.741.7％  17.50.019.248.1％  7.321.31.79.1％  7.223.22.716.1％  16.90.018.547.7％
在导入了pMrelA*的菌株中观察到，谷氨酸的产量有所提高，而对破坏了relA菌株的生长恢复的影响却没有被显著观察到。另一方面，在导入pMrelA的菌株中，relA缺失的菌株却完全恢复了生长，且谷氨酸的产量也得到了提高，而且该产量与对照(MG1655ΔsucA/pM15)相比有了显著的增加。这就证明了，谷氨酸产量的提高归因于relA基因多拷贝的存在。
实施例4：将relA基因和relA*基因导入超量生产苏氨酸的大肠杆菌菌株中，以及对苏氨酸产量的影响
将实施例2中获得的质粒pM15、pMrelA和pMrelA*转化生产苏氨酸的大肠杆菌菌株VKPM B-3996(日本专利JP2775948)。
用含有40g/L的葡萄糖，1g/L MgSO4.7H2O，1g/LKH2PO4，16g/L(NH4)SO4，10mg/L FeSO4.7H2O，10mg/L MnSO4.4-5H2O，2g/L酵母提取液和50g/L CaCO3和100μg/mL氨苄青霉素的、装在体积为500mL的Sakaguchi烧瓶中的培养基培养每个菌株。培养起始时培养液体积是20mL，并在37℃下以120rpm的往返频率震荡培养24小时。培养基、容器等等在使用前均需经过高压灭菌。分别测量培养液中细胞的密度和葡萄糖的浓度。用分光光度计(Beckman)在600nm下检测用0.1N的HCl稀释到适当浓度的培养液的浑浊度来确定细胞密度。用Biotech Analyzer(Sakura Seiki)检测离心去除细胞后，并用水稀释到适当的浓度的上清液来测定残留的葡萄糖的浓度。用氨基酸分析仪L-8500(Hitachi)检测离心去除细胞后，再用0.02N的HCl稀释到适当浓度的培养上清液，来测定苏氨酸的浓度。结果如表4所示。
表4：不同的生产苏氨酸的细菌生产苏氨酸的能力
    菌株   OD562 苏氨酸的积累(g/L) 葡萄糖的浓度(g/L)   苏氨酸产率
  B-3996/pM15   15.47     10.99     0.0     25.62％
  B-3996/pMrelA   16.21     12.17     0.0     29.60％
  B-3996/pMrelA*   16.21     11.28     0.0     26.29％
导入pMrelA*的菌株观察到，其苏氨酸产量提高了大约1％，而导入pMrelA的菌株，其苏氨酸的产量提高了大约4％。这就证明了苏氨酸的产量的提高是因为relA和relA*基因多拷贝的存在。
实施例5：将relA和relA*基因导入过量生产异亮氨酸的大肠杆菌菌株中以及它们对异亮氨酸产量的影响
将在实施例2中获得的质粒pSTV29，pSTVrelA和pSTVrelA*转化生产异亮氨酸的大肠杆菌菌株B-3996/pMWD5中(JP08-047397，US5998178)。
用含有：40g/L的葡萄糖，1g/L MgSO4.7H2O，1g/L KH2PO4，16g/L(NH4)2SO4，10mg/L FeSO4.7H2O，10mg/L MnSO4.4-5H2O，2g/L酵母提取液，50g/L CaCO3和100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL氯霉素的装在体积为500mL的Sakaguchi烧瓶中的培养基培养每个菌株。培养起始时培养液体积是20mL，并在37℃下以120rpm的往返频率震荡培养24小时。培养基、容器等在使用前均需经过高压灭菌。分别测量培养液中细胞的密度和葡萄糖的浓度。用分光光度计(Beckman)在600nm下检测用0.1N的HCl稀释到适当浓度的培养液的浑浊度来确定细胞密度。用Biotech Analyzer(Sakura Seiki)检测离心去除细胞后，并用水稀释到适当的浓度的上清液，来测定残留的葡萄糖的浓度。用氨基酸分析仪L-8500(Hitachi)检测离心去除细胞后，再用0.02N的HCl稀释到适当的浓度上清液，来测定异亮的浓度。结果如表5所示。
表5：不同的产异亮氨酸的细菌生产异亮氨酸的能力
菌株         OD562    异亮氨酸的积累(g/L)     葡萄糖的浓度(g/L)   异亮氨酸的产率
  24h   31h   24h   31h   24h   31h
  B-3996/pMWD5，pSTV29 15.65 14.41 6.42 8.16 4.3 0.3 19.2％
  B-3996/pMWD5，pSTVrelA 11.16 14.61 3.79 8.93 25.1 1.0 21.3％
  B-3996/pMWD5，PSTVrelA* 17.97 15.77 9.23 9.46 0.7 0.4 22.3％
导入pSTVrelA*的菌株观察到，其异亮氨酸的产量提高了大约3％，然而，导入pSTVrelA的菌株，其异亮氨酸的产量提高了大约2％。这就证明异亮氨酸的产量的提高是因为relA*和relA基因多拷贝的存在。
实施例6：relA和relA*基因导入超量生产赖氨酸的大肠杆菌菌株中以及对赖氨酸产量的影响
以WC196菌株作为生产L-赖氨酸的大肠杆菌菌株。该菌株是通过繁殖赋予分离自大肠杆菌K-12的W3110菌株AEC抗性而获得的。该菌株被命名为大肠杆菌AJ13069菌株，并于1994年12月6日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现在为独立行政法人产业技术综合研究所)，国际专利生物保藏机构，postal code：305-8566，Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，并获得保藏编号FERM P-14690.)然后根据布达佩斯条约的细则，此保藏于1995-09-29转移到国际保藏所，获得保藏编号FERM BP-5252(见WO96/17930)。此外，将pCAB1用作质粒来制备超量产生赖氨酸的菌株。该质粒携带有一个编码半胱氨酸激酶的lysC基因的突变体，因此对L-赖氨酸的反馈抑制不敏感；还携带有编码二氢双甲基吡啶合成酶的dapA基因突变体，因此对L-赖氨酸的反馈抑制不敏感；以及还携带有编码二氢双甲基吡啶还原酶的dapB基因(JP11-192088，US6040160)。将此质粒转化产赖氨酸的大肠杆菌菌株WC196，从而获得超量生产赖氨酸的菌株WC196/pCAB1。
此外，将在实施例2中获得的质粒pM15和pMrelA转化生产赖氨酸的大肠杆菌菌株WC196/pCAB1，并由此获得了WC196/pCAB1/pM15和WC196/pCAB1/pMrelA。
用含有：40g/L的葡萄糖，1g/L MgSO4.7H2O，1g/L KH2PO4，16g/L(NH4)2SO4，10mg/LFeSO4.7H2O，10mg/L MnSO4.4-5H2O，2g/L酵母提取液，50g/L CaCO3，100μg/mL氨苄青霉素和100μg/mL链霉素的、装入体积为500mL的Sakaguchi烧瓶中的培养基培养每个菌株。培养起始时培养液体积是20mL，并在37℃下以120rpm的往返频率震荡培养24小时。培养基，容器等在使用前均需经过高压灭菌。分别测量培养液中细胞的密度和葡萄糖的浓度。用分光光度计(Beckman)在600nm下检测用0.1N的HCl稀释到适当浓度的培养液的浑浊度来确定细胞密度。用Biotech Analyzer(Sakura Seiki)检测离心去除细胞后，并用水稀释到适当的浓度的上清液，来测量残留的葡萄糖的浓度和赖氨酸的浓度。当培养基中所有的葡萄糖被耗尽时(培养时间：42h)所获得的结果见表6所示。
表6：不同生产赖氨酸的细菌生产赖氨酸的能力(此结果是培养42h后获得的)
        菌株     OD562   赖氨酸积累(g/L)      赖氨酸产量
  WC196/pCAB1/pM165   12.49(0.037)     14.7(1.10)     36.69％(2.74)
    WC196/pCAB1/pMrelA   14.39(1.66)     15.8(0.17)     39.56％(0.44)
当n是3的时候，括号中的数值代表标准偏差。
尽管本发明用最优选的实施例加以详细说明，但对于本领域技术人员来讲，显然可以作出不同的改变，并采用等同手段替换，这些都包含在本发明的保护范围之内。本发明将前面提到的每篇文献合并为整体作为参考，其中包括外国优先权文本JP2003-166654。
                            序列表
<110>Ajinomoto Co.，Inc.
<120>L氨基酸的生产方法
<130>OP-C4046
<150>JP 2003-166654
<151>2003-06-11
<150>JP 2004-91708
<151>2004-03-26
<160>22
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物sucA1
<400>1
gcgaattcct gcccctgaca ctaagaca                                     28
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
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<400>2
cgaggtaacg ttcaagacct                                              20
<210>3
<211>40
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物sucA3
<400>3
aggtcttgaa cgttacctcg atccataacg ggcagggcgc                        40
<210>4
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
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<400>4
gcgaattccc actttgtcag tttcgatt                                     28
<210>5
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<212>DNA
<213>人工
<220>
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<400>5
gcgaattctt gaactggtac aggcaacc                                     28
<210>6
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物relA2
<400>6
tgtttaagtt tagtggatgg gtgcgtctgt tgcagacaat ac                     42
<210>7
<211>41
<212>DNA
<213>人工
<220>
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<400>7
cccatccact aaacttaaac atagcgacac caaacagcaa c                      41
<210>8
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<213>人工
<220>
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<400>8
gcgaattcaa gcacttcact actgttttc                                    29
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
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<400>9
tttaagcttg cgcgactggc gatgc                                        25
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
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<400>10
ttttctagat ccgcaccgcc ggtg                                         24
<210>11
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<212>DNA
<213>人工
<220>
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ttttctagat aatttcaatc tggtcgcc                                     28
<210>12
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<212>DNA
<213>人工
<220>
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<400>12
gcgaattcta cgcactggct caataatt                                     28
<210>13
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<212>DNA
<213>人工
<220>
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gcaagctttg tgacgtttta tcacgaaa                                     28
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<220>
<223>引物relA10
<400>14
gcgaattcta gataatttca atctggtcgc c                                 31
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<212>DNA
<213>人工
<220>
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<213>人工
<220>
<223>引物spoT2
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cccatccact aaacttaaac agctttcaaa cagatacaa                          39
<210>17
<211>39
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物spoT3
<400>17
tgtttaagtt tagtggatgg gacccgaaac cgaaattaa                          39
<210>18
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物spoT4
<400>18
gcgaattcta aagaatgagg gctgaggc                                      28
仸<210>19
<211>2235
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2235)
<400>19
atg gtt gcg gta aga agt gca cat atc aat aag gct ggt gaa ttt gat    48
Met Val Ala Val Arg Ser Ala His Ile Asn Lys Ala Gly Glu Phe Asp
1               5                   10                  15
ccg gaa aaa tgg atc gca agt ctg ggt att acc agc cag aag tcg tgt    96
Pro Glu Lys Trp Ile Ala Ser Leu Gly Ile Thr Ser Gln Lys Ser Cys
            20                  25                  30
gag tgc tta gcc gaa acc tgg gcg tat tgt ctg caa cag acg cag ggg    144
Glu Cys Leu Ala Glu Thr Trp Ala Tyr Cys Leu Gln Gln Thr Gln Gly
        35                  40                  45
cat ccg gat gcc agt ctg tta ttg tgg cgt ggt gtt gag atg gtg gag    192
His Pro Asp Ala Ser Leu Leu Leu Trp Arg Gly Val Glu Met Val Glu
    50                  55                  60
atc ctc tcg aca tta agt atg gac att gac acg ctg cgg gcg gcg ctg    240
Ile Leu Ser Thr Leu Ser Met Asp Ile Asp Thr Leu Arg Ala Ala Leu
65                  70                  75                  80
ctt ttc cct ctg gcg gat gcc aac gta gtc agc gaa gat gtg ctg cgt    288
Leu Phe Pro Leu Ala Asp Ala Asn Val Val Ser Glu Asp Val Leu Arg
                85                  90                  95
gag agc gtc ggt aag tcg gtc gtt aac ctt att cac ggc gtg cgt gat    336
Glu Ser Val Gly Lys Ser Val Val Asn Leu Ile His Gly Val Arg Asp
            100                 105                 110
atg gcg gcg atc cgc cag ctg aaa gcg acg cac act gat tct gtt tcc    384
Met Ala Ala Ile Arg Gln Leu Lys Ala Thr His Thr Asp Ser Val Ser
        115                 120                 125
tcc gaa cag gtc gat aac gtt cgc cgg atg tta ttg gcg atg gtc gat    432
Ser Glu Gln Val Asp Asn Val Arg Arg Met Leu Leu Ala Met Val Asp
    130                 135                 140
gat ttt cgc tgc gta gtc atc aaa ctg gcg gag cgt att gct cat ctg    480
Asp Phe Arg Cys Val Val Ile Lys Leu Ala Glu Arg Ile Ala His Leu
145                 150                 155                 160
cgc gaa gta aaa gat gcg ccg gaa gat gaa cgt gta ctg gcg gca aaa    528
Arg Glu Val Lys Asp Ala Pro Glu Asp Glu Arg Val Leu Ala Ala Lys
                165                 170                 175
gag tgt acc aac atc tac gca ccg ctg gct aac cgt ctc gga atc gga    576
Glu Cys Thr Asn Ile Tyr Ala Pro Leu Ala Asn Arg Leu Gly Ile Gly
            180                 185                 190
caa ctg aaa tgg gaa ctg gaa gat tac tgc ttc cgt tac ctc cat cca    624
Gln Leu Lys Trp Glu Leu Glu Asp Tyr Cys Phe Arg Tyr Leu His Pro
        195                 200                 205
acc gaa tac aaa cga att gcc aaa ctg ctg cat gaa cgg cgt ctc gac      672
Thr Glu Tyr Lys Arg Ile Ala Lys Leu Leu His Glu Arg Arg Leu Asp
    210                 215                 220
cgc gaa cac tac atc gaa gag ttc gtt ggt cat ctg cgc gct gag atg      720
Arg Glu His Tyr Ile Glu Glu Phe Val Gly His Leu Arg Ala Glu Met
225                 230                 235                 240
aaa gct gaa ggc gtt aaa gcg gaa gtg tat ggt cgt ccg aaa cac atc      768
Lys Ala Glu Gly Val Lys Ala Glu Val Tyr Gly Arg Pro Lys His Ile
                245                 250                 255
tac agc atc tgg cgt aaa atg cag aaa aag aac ctc gcc ttt gat gag      816
Tyr Ser Ile Trp Arg Lys Met Gln Lys Lys Asn Leu Ala Phe Asp Glu
            260                 265                 270
ctg ttt gat gtg cgt gcg gta cgt att gtc gcc gag cgt tta cag gat      864
Leu Phe Asp Val Arg Ala Val Arg Ile Val Ala Glu Arg Leu Gln Asp
        275                 280                 285
tgc tat gcc gca ctg ggg ata gtg cac act cac tat cgc cac ctg ccg      912
Cys Tyr Ala Ala Leu Gly Ile Val His Thr His Tyr Arg His Leu Pro
    290                 295                 300
gat gag ttt gac gat tac gtc gct aac ccg aaa cca aac ggt tat cag      960
Asp Glu Phe Asp Asp Tyr Val Ala Asn Pro Lys Pro Asn Gly Tyr Gln
305                 310                 315                 320
tct att cat acc gtg gtt ctg ggg ccg ggt gga aaa acc gtt gag atc     1008
Ser Ile His Thr Val Val Leu Gly Pro Gly Gly Lys Thr Val Glu Ile
                325                 330                 335
caa atc cgc acc aaa cag atg cat gaa gat gca gag ttg ggt gtt gct     1056
Gln Ile Arg Thr Lys Gln Met His Glu Asp Ala Glu Leu Gly Val Ala
            340                 345                 350
gcg cac tgg aaa tat aaa gag ggc gcg gct gct ggc ggc gca cgt tcg     1104
Ala His Trp Lys Tyr Lys Glu Gly Ala Ala Ala Gly Gly Ala Arg Ser
        355                 360                 365
gga cat gaa gac cgg att gcc tgg ctg cgt aaa ctg att gcg tgg cag     1152
Gly His Glu Asp Arg Ile Ala Trp Leu Arg Lys Leu Ile Ala Trp Gln
    370                 375                 380
gaa gag atg gct gat tcc ggc gaa atg ctc gac gaa gta cgt agt cag     1200
Glu Glu Met Ala Asp Ser Gly Glu Met Leu Asp Glu Val Arg Ser Gln
385                 390                 395                 400
gtc ttt gac gac cgg gtg tac gtc ttt acg ccg aaa ggt gat gtc gtt     1248
Val Phe Asp Asp Arg Val Tyr Val Phe Thr Pro Lys Gly Asp Val Val
                405                 410                 415
gat ttg cct gcg gga tca acg ccg ctg gac ttc gct tac cac atc cac     1296
Asp Leu Pro Ala Gly Ser Thr Pro Leu Asp Phe Ala Tyr His Ile His
            420                 425                 430
agt gat gtc gga cac cgc tgc atc ggg gca aaa att ggc ggg cgc att     1344
Ser Asp Val Gly His Arg Cys Ile Gly Ala Lys Ile Gly Gly Arg Ile
        435                 440                 445
gtg ccg ttc acc tac cag ctg cag atg ggc gac cag att gaa att atc     1392
Val Pro Phe Thr Tyr Gln Leu Gln Met Gly Asp Gln Ile Glu Ile Ile
    450                 455                 460
acc cag aaa cag ccg aac ccc agc cgt gac tgg tta aac cca aac ctc     1440
Thr Gln Lys Gln Pro Asn Pro Ser Arg Asp Trp Leu Asn Pro Asn Leu
465                 470                 475                 480
ggt tac gtc aca acc agc cgt ggg cgt tcg aaa att cac gcc tgg ttc     1488
Gly Tyr Val Thr Thr Ser Arg Gly Arg Ser Lys Ile His Ala Trp Phe
                485                 490                 495
cgt aaa cag gac cgt gac aaa aac att ctg gct ggg cgg caa atc ctt     1536
Arg Lys Gln Asp Arg Asp Lys Asn Ile Leu Ala Gly Arg Gln Ile Leu
            500                 505                 510
gac gac gag ctg gaa cat ctg ggg atc agc ctg aaa gaa gca gaa aaa     1584
Asp Asp Glu Leu Glu His Leu Gly Ile Ser Leu Lys Glu Ala Glu Lys
        515                 520                 525
cat ctg ctg ccg cgt tac aac ttc aat gat gtc gac gag ttg ctg gcg     1632
His Leu Leu Pro Arg Tyr Asn Phe Asn Asp Val Asp Glu Leu Leu Ala
    530                 535                 540
gcg att ggt ggc ggg gat atc cgt ctc aat cag atg gtg aac ttc ctg     1680
Ala Ile Gly Gly Gly Asp Ile Arg Leu Asn Gln Met Val Asn Phe Leu
545                 550                 555                 560
caa tcg caa ttt aat aag ccg agt gcc gaa gag cag gac gcc gcc gcg     1728
Gln Ser Gln Phe Asn Lys Pro Ser Ala Glu Glu Gln Asp Ala Ala Ala
                565                 570                 575
ctg aag caa ctt cag caa aaa agc tac acg ccg caa aac cgc agt aaa     1776
Leu Lys Gln Leu Gln Gln Lys Ser Tyr Thr Pro Gln Asn Arg Ser Lys
            580                 585                 590
gat aac ggt cgc gtg gta gtc gaa ggt gtt ggc aac ctg atg cac cac     1824
Asp Asn Gly Arg Val Val Val Glu Gly Val Gly Asn Leu Met His His
        595                 600                 605
atc gcg cgc tgc tgc cag ccg att cct gga gat gag att gtc ggc ttc     1872
Ile Ala Arg Cys Cys Gln Pro Ile Pro Gly Asp Glu Ile Val Gly Phe
    610                 615                 620
att acc cag ggg cgc ggt att tca gta cac cgc gcc gat tgc gaa caa     1920
Ile Thr Gln Gly Arg Gly Ile Ser Val His Arg Ala Asp Cys Glu Gln
625                 630                 635                 640
ctg gcg gaa ctg cgc tcc cat gcg cca gaa cgc att gtt gac gcg gta     1968
Leu Ala Glu Leu Arg Ser His Ala Pro Glu Arg Ile Val Asp Ala Val
                645                 650                 655
tgg ggt gag agc tac tcc gcc gga tat tcg ctg gtg gtc cgc gtg gta     2016
Trp Gly Glu Ser Tyr Ser Ala Gly Tyr Ser Leu Val Val Arg Val Val
            660                 665                 670
gct aat gat cgt agt ggg ttg tta cgt gat atc acg acc att ctc gcc     2064
Ala Asn Asp Arg Ser Gly Leu Leu Arg Asp Ile Thr Thr Ile Leu Ala
        675                 680                 685
aac gag aag gtg aac gtg ctt ggc gtt gcc agc cgt agc gac acc aaa     2112
Asn Glu Lys Val Asn Val Leu Gly Val Ala Ser Arg Ser Asp Thr Lys
    690                 695                 700
cag caa ctg gcg acc atc gac atg acc att gag att tac aac ctg caa     2160
Gln Gln Leu Ala Thr Ile Asp Met Thr Ile Glu Ile Tyr Asn Leu Gln
705                 710                 715                 720
gtg ctg ggg cgc gtg ctg ggt aaa ctc aac cag gtg ccg gat gtt atc     2208
Val Leu Gly Arg Val Leu Gly Lys Leu Asn Gln Val Pro Asp Val Ile
                725                 730                 735
gac gcg cgt cgg ttg cac ggg agt tag                                 2235
Asp Ala Arg Arg Leu His Gly Ser
            740
<210>20
<211>744
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>20
Met Val Ala Val Arg Ser Ala His Ile Asn Lys Ala Gly Glu Phe Asp
1               5                   10                  15
Pro Glu Lys Trp Ile Ala Ser Leu Gly Ile Thr Ser Gln Lys Ser Cys
            20                  25                  30
Glu Cys Leu Ala Glu Thr Trp Ala Tyr Cys Leu Gln Gln Thr Gln Gly
        35                  40                  45
His Pro Asp Ala Ser Leu Leu Leu Trp Arg Gly Val Glu Met Val Glu
    50                  55                  60
Ile Leu Ser Thr Leu Ser Met Asp Ile Asp Thr Leu Arg Ala Ala Leu
65                  70                  75                  80
Leu Phe Pro Leu Ala Asp Ala Asn Val Val Ser Glu Asp Val Leu Arg
                85                  90                  95
Glu Ser Val Gly Lys Ser Val Val Asn Leu Ile His Gly Val Arg Asp
            100                 105                 110
Met Ala Ala Ile Arg Gln Leu Lys Ala Thr His Thr Asp Ser Val Ser
        115                 120                 125
Ser Glu Gln Val Asp Asn Val Arg Arg Met Leu Leu Ala Met Val Asp
    130                 135                 140
Asp Phe Arg Cys Val Val Ile Lys Leu Ala Glu Arg Ile Ala His Leu
145                 150                 155                 160
Arg Glu Val Lys Asp Ala Pro Glu Asp Glu Arg Val Leu Ala Ala Lys
                165                 170                 175
Glu Cys Thr Asn Ile Tyr Ala Pro Leu Ala Asn Arg Leu Gly Ile Gly
            180                 185                 190
Gln Leu Lys Trp Glu Leu Glu Asp Tyr Cys Phe Arg Tyr Leu His Pro
        195                 200                 205
Thr Glu Tyr Lys Arg Ile Ala Lys Leu Leu His Glu Arg Arg Leu Asp
    210                 215                 220
Arg Glu His Tyr Ile Glu Glu Phe Val Gly His Leu Arg Ala Glu Met
225                 230                 235                 240
Lys Ala Glu Gly Val Lys Ala Glu Val Tyr Gly Arg Pro Lys His Ile
                245                 250                 255
Tyr Ser Ile Trp Arg Lys Met Gln Lys Lys Asn Leu Ala Phe Asp Glu
            260                 265                 270
Leu Phe Asp Val Arg Ala Val Arg Ile Val Ala Glu Arg Leu Gln Asp
        275                 280                 285
Cys Tyr Ala Ala Leu Gly Ile Val His Thr His Tyr Arg His Leu Pro
    290                 295                 300
Asp Glu Phe Asp Asp Tyr Val Ala Asn Pro Lys Pro Asn Gly Tyr Gln
305                 310                 315                 320
Ser Ile His Thr Val Val Leu Gly Pro Gly Gly Lys Thr Val Glu Ile
                325                 330                 335
Gln Ile Arg Thr Lys Gln Met His Glu Asp Ala Glu Leu Gly Val Ala
            340                 345                 350
Ala His Trp Lys Tyr Lys Glu Gly Ala Ala Ala Gly Gly Ala Arg Ser
        355                 360                 365
Gly His Glu Asp Arg Ile Ala Trp Leu Arg Lys Leu Ile Ala Trp Gln
    370                 375                 380
Glu Glu Met Ala Asp Ser Gly Glu Met Leu Asp Glu Val Arg Ser Gln
385                 390                 395                400
Val Phe Asp Asp Arg Val Tyr Val Phe Thr Pro Lys Gly Asp Val Val
                405                 410                 415
Asp Leu Pro Ala Gly Ser Thr Pro Leu Asp Phe Ala Tyr His Ile His
            420                 425                 430
Ser Asp Val Gly His Arg Cys Ile Gly Ala Lys Ile Gly Gly Arg Ile
        435                 440                 445
Val Pro Phe Thr Tyr Gln Leu Gln Met Gly Asp Gln Ile Glu Ile Ile
    450                 455                 460
Thr Gln Lys Gln Pro Asn Pro Ser Arg Asp Trp Leu Asn Pro Asn Leu
465                 470                 475                 480
Gly Tyr Val Thr Thr Ser Arg Gly Arg Ser Lys Ile His Ala Trp Phe
                485                 490                 495
Arg Lys Gln Asp Arg Asp Lys Asn Ile Leu Ala Gly Arg Gln Ile Leu
            500                 505                 510
Asp Asp Glu Leu Glu His Leu Gly Ile Ser Leu Lys Glu Ala Glu Lys
        515                 520                 525
His Leu Leu Pro Arg Tyr Asn Phe Asn Asp Val Asp Glu Leu Leu Ala
    530                 535                 540
Ala Ile Gly Gly Gly Asp Ile Arg Leu Asn Gln Met Val Asn Phe Leu
545                 550                 555                 560
Gln Ser Gln Phe Asn Lys Pro Ser Ala Glu Glu Gln Asp Ala Ala Ala
                565                 570                 575
Leu Lys Gln Leu Gln Gln Lys Ser Tyr Thr Pro Gln Asn Arg Ser Lys
            580                 585                 590
Asp Asn Gly Arg Val Val Val Glu Gly Val Gly Asn Leu Met His His
        595                 600                 605
Ile Ala Arg Cys Cys Gln Pro Ile Pro Gly Asp Glu Ile Val Gly Phe
    610                 615                 620
Ile Thr Gln Gly Arg Gly Ile Ser Val His Arg Ala Asp Cys Glu Gln
625                 630                 635                 640
Leu Ala Glu Leu Arg Ser His Ala Pro Glu Arg Ile Val Asp Ala Val
                645                 650                 655
Trp Gly Glu Ser Tyr Ser Ala Gly Tyr Ser Leu Val Val Arg Val Val
            660                 665                 670
Ala Asn Asp Arg Ser Gly Leu Leu Arg Asp Ile Thr Thr Ile Leu Ala
        675                 680                 685
Asn Glu Lys Val Asn Val Leu Gly Val Ala Ser Arg Ser Asp Thr Lys
    690                 695                 700
Gln Gln Leu Ala Thr Ile Asp Met Thr Ile Glu Ile Tyr Asn Leu Gln
705                 710                 715                 720
Val Leu Gly Arg Val Leu Gly Lys Leu Asn Gln Val Pro Asp Val Ile
                725                 730                 735
Asp Ala Arg Arg Leu His Gly Ser
            740
仸<210>21
<211>2109
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2109)
<400>21
ttg tat ctg ttt gaa agc ctg aat caa ctg att caa acc tac ctg ccg       48
Leu Tyr Leu Phe Glu Ser Leu Asn Gln Leu Ile Gln Thr Tyr Leu Pro
1               5                   l0                  15
gaa gac caa atc aag cgt ctg cgg cag gcg tat ctc gtt gca cgt gat       96
Glu Asp Gln Ile Lys Arg Leu Arg Gln Ala Tyr Leu Val Ala Arg Asp
            20                  25                  30
gct cac gag ggg caa aca cgt tca agc ggt gaa ccc tat atc acg cac      144
Ala His Glu Gly Gln Thr Arg Ser Ser Gly Glu Pro Tyr Ile Thr His
        35                  40                  45
ccg gta gcg gtt gcc tgc att ctg gcc gag atg aaa ctc gac tat gaa      192
Pro Val Ala Val Ala Cys Ile Leu Ala Glu Met Lys Leu Asp Tyr Glu
    50                  55                  60
acg ctg atg gcg gcg ctg ctg cat gac gtg att gaa gat act ccc gcc      240
Thr Leu Met Ala Ala Leu Leu His Asp Val Ile Glu Asp Thr Pro Ala
65                  70                  75                  80
acc tac cag gat atg gaa cag ctt ttt ggt aaa agc gtc gcc gag ctg      288
Thr Tyr Gln Asp Met Glu Gln Leu Phe Gly Lys Ser Val Ala Glu Leu
                85                  90                  95
gta gag ggg gtg tcg aaa ctt gat aaa ctc aag ttc cgc gat aag aaa      336
Val Glu Gly Val Ser Lys Leu Asp Lys Leu Lys Phe Arg Asp Lys Lys
            100                 105                 110
gag gcg cag gcc gaa aac ttt cgc aag atg att atg gcg atg gtg cag      384
Glu Ala Gln Ala Glu Asn Phe Arg Lys Met Ile Met Ala Met Val Gln
        115                 120                 125
gat atc cgc gtc atc ctc atc aaa ctt gcc gac cgt acc cac aac atg      432
Asp Ile Arg Val Ile Leu Ile Lys Leu Ala Asp Arg Thr His Asn Met
    130                 135                 140
cgc acg ctg ggc tca ctt cgc ccg gac aaa cgt cgc cgc atc gcc cgt      480
Arg Thr Leu Gly Ser Leu Arg Pro Asp Lys Arg Arg Arg Ile Ala Arg
145                 150                 155                 160
gaa act ctc gaa att tat agc ccg ctg gcg cac cgt tta ggt atc cac      528
Glu Thr Leu Glu Ile Tyr Ser Pro Leu Ala His Arg Leu Gly Ile His
                165                 170                 175
cac att aaa acc gaa ctc gaa gag ctg ggt ttt gag gcg ctg tat ccc      576
His Ile Lys Thr Glu Leu Glu Glu Leu Gly Phe Glu Ala Leu Tyr Pro
            180                 185                 190
aac cgt tat cgc gta atc aaa gaa gtg gtg aaa gcc gcg cgc ggc aac      624
Asn Arg Tyr Arg Val Ile Lys Glu Val Val Lys Ala Ala Arg Gly Asn
        195                 200                 205
cgt aaa gag atg atc cag aag att ctt tct gaa atc gaa ggg cgt ttg      672
Arg Lys Glu Met Ile Gln Lys Ile Leu Ser Glu Ile Glu Gly Arg Leu
    210                 215                 220
cag gaa gcg gga ata ccg tgc cgc gtc agt ggt cgc gag aag cat ctt      720
Gln Glu Ala Gly Ile Pro Cys Arg Val Ser Gly Arg Glu Lys His Leu
225                 230                 235                 240
tat teg att tac tgc aaa atg gtg ctc aaa gag cag cgt ttt cac tcg      768
Tyr Ser Ile Tyr Cys Lys Met Val Leu Lys Glu Gln Arg Phe His Ser
                245                 250                 255
atc atg gac atc tac gct ttc cgc gtg atc gtc aat gat tct gac acc      816
Ile Met Asp Ile Tyr Ala Phe Arg Val Ile Val Asn Asp Ser Asp Thr
            260                 265                 270
tgt tat cgc gtg ctg ggc cag atg cac agc ctg tac aag ccg cgt ccg      864
Cys Tyr Arg Val Leu Gly Gln Met His Ser Leu Tyr Lys Pro Arg Pro
        275                 280                 285
ggc cgc gtg aaa gac tat atc gcc att cca aaa gcg aac ggc tat cag      912
Gly Arg Val Lys Asp Tyr Ile Ala Ile Pro Lys Ala Asn Gly Tyr Gln
    290                 295                 300
tct ttg cac acc tcg atg atc ggc ccg cac ggt gtg ccg gtt gag gtc      960
Ser Leu His Thr Ser Met Ile Gly Pro His Gly Val Pro Val Glu Val
305                 310                 315                 320
cag atc cgt acc gaa gat atg gac cag atg gcg gag atg ggt gtt gcc     1008
Gln Ile Arg Thr Glu Asp Met Asp Gln Met Ala Glu Met Gly Val Ala
                325                 330                 335
gcg cac tgg gct tat aaa gag cac ggc gaa acc agt act acc gca caa     1056
Ala His Trp Ala Tyr Lys Glu His Gly Glu Thr Ser Thr Thr Ala Gln
            340                 345                 350
atc cgc gcc cag cgc tgg atg caa agc ctg ctg gag ctg caa cag agc     1104
Ile Arg Ala Gln Arg Trp Met Gln Ser Leu Leu Glu Leu Gln Gln Ser
        355                 360                 365
gcc ggt agt tcg ttt gaa ttt atc gag agc gtt aaa tcc gat ctc ttc     1152
Ala Gly Ser Ser Phe Glu Phe Ile Glu Ser Val Lys Ser Asp Leu Phe
    370                 375                 380
ccg gat gag att tac gtt ttc aca ccg gaa ggg cgc att gtc gag ctg     1200
Pro Asp Glu Ile Tyr Val Phe Thr Pro Glu Gly Arg Ile Val Glu Leu
385                 390                 395                 400
cct gcc ggt gca acg ccc gtc gac ttc gct tat gca gtg cat acc gat     1248
Pro Ala Gly Ala Thr Pro Val Asp Phe Ala Tyr Ala Val His Thr Asp
                405                 410                 415
atc ggt cat gcc tgc gtg ggc gca cgc gtt gac cgc cag cct tac ccg     1296
Ile Gly His Ala Cys Val Gly Ala Arg Val Asp Arg Gln Pro Tyr Pro
            420                 425                 430
ctg tcg cag ccg ctt acc agc ggt caa acc gtt gaa atc att acc gct     1344
Leu Ser Gln Pro Leu Thr Ser Gly Gln Thr Val Glu Ile Ile Thr Ala
        435                 440                 445
ccg ggc gct cgc ccg aat gcc gct tgg ctg aac ttt gtc gtt agc tcg     1392
Pro Gly Ala Arg Pro Asn Ala Ala Trp Leu Asn Phe Val Val Ser Ser
    450                 455                 460
aaa gcg cgc gcc aaa att cgt cag ttg ctg aaa aac ctc aag cgt gat     1440
Lys Ala Arg Ala Lys Ile Arg Gln Leu Leu Lys Asn Leu Lys Arg Asp
465                 470                 475                 480
gat tct gta agc ctg ggc cgt cgt ctg ctc aac cat gct ttg ggt ggt     1488
Asp Ser Val Ser Leu Gly Arg Arg Leu Leu Asn His Ala Leu Gly Gly
                485                 490                 495
agc cgt aag ctg aat gaa atc ccg cag gaa aat att cag cgc gag ctg     1536
Ser Arg Lys Leu Asn Glu Ile Pro Gln Glu Asn Ile Gln Arg Glu Leu
            500                 505                 510
gat cgc atg aag ctg gca acg ctt gac gat ctg ctg gca gaa atc gga     1584
Asp Arg Met Lys Leu Ala Thr Leu Asp Asp Leu Leu Ala Glu Ile Gly
        515                 520                 525
ctt ggt aac gca atg agc gtg gtg gtc gcg aaa aat ctg caa cat ggg     1632
Leu Gly Asn Ala Met Ser Val Val Val Ala Lys Asn Leu Gln His Gly
    530                 535                 540
gac gcc tcc att cca ccg gca acc caa agc cac gga cat ctg ccc att     1680
Asp Ala Ser Ile Pro Pro Ala Thr Gln Ser His Gly His Leu Pro Ile
545                 550                 555                 560
aaa ggt gcc gat ggc gtg ctg atc acc ttt gcg aaa tgc tgc cgc cct     1728
Lys Gly Ala Asp Gly Val Leu Ile Thr Phe Ala Lys Cys Cys Arg Pro
                565                 570                 575
att cct ggc gac ccg att atc gcc cac gtc agc ccc ggt aaa ggt ctg     1776
Ile Pro Gly Asp Pro Ile Ile Ala His Val Ser Pro Gly Lys Gly Leu
            580                 585                 590
gtg atc cac cat gaa tcc tgc cgt aat atc cgt ggc tac cag aaa gag     1824
Val Ile His His Glu Ser Cys Arg Asn Ile Arg Gly Tyr Gln Lys Glu
        595                 600                 605
cca gag aag ttt atg gct gtg gaa tgg gat aaa gag acg gcg cag gag     1872
Pro Glu Lys Phe Met Ala Val Glu Trp Asp Lys Glu Thr Ala Gln Glu
    610                 615                 620
ttc atc acc gaa atc aag gtg gag atg ttc aat cat cag ggt gcg ctg     1920
Phe Ile Thr Glu Ile Lys Val Glu Met Phe Asn His Gln Gly Ala Leu
625                 630                 635                 640
gca aac ctg acg gcg gca att aac acc acg act tcg aat att caa agt     1968
Ala Asn Leu Thr Ala Ala Ile Asn Thr Thr Thr Ser Asn Ile Gln Ser
                645                 650                 655
ttg aat acg gaa gag aaa gat ggt cgc gtc tac agc gcc ttt att cgt     2016
Leu Asn Thr Glu Glu Lys Asp Gly Arg Val Tyr Ser Ala Phe Ile Arg
            660                 665                 670
ctg acc gct cgt gac cgt gtg cat ctg gcg aat atc atg cgc aaa atc     2064
Leu Thr Ala Arg Asp Arg Val His Leu Ala Asn Ile Met Arg Lys Ile
        675                 680                 685
cgc gtg atg cca gac gtg att aaa gtc acc cga aac cga aat taa         2109
Arg Val Met Pro Asp Val Ile Lys Val Thr Arg Asn Arg Asn
    690                 695                 700
<210>22
<211>702
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>22
Leu Tyr Leu Phe Glu Ser Leu Asn Gln Leu Ile Gln Thr Tyr Leu Pro
1               5                   10                  15
Glu Asp Gln Ile Lys Arg Leu Arg Gln Ala Tyr Leu Val Ala Arg Asp
            20                  25                  30
Ala His Glu Gly Gln Thr Arg Ser Ser Gly Glu Pro Tyr Ile Thr His
        35                  40                  45
Pro Val Ala Val Ala Cys Ile Leu Ala Glu Met Lys Leu Asp Tyr Glu
    50                  55                  60
Thr Leu Met Ala Ala Leu Leu His Asp Val Ile Glu Asp Thr Pro Ala
65                  70                  75                  80
Thr Tyr Gln Asp Met Glu Gln Leu Phe Gly Lys Ser Val Ala Glu Leu
                85                  90                  95
Val Glu Gly Val Ser Lys Leu Asp Lys Leu Lys Phe Arg Asp Lys Lys
            100                 105                 110
Glu Ala Gln Ala Glu Asn Phe Arg Lys Met Ile Met Ala Met Val Gln
        115                 120                 125
Asp Ile Arg Val Ile Leu Ile Lys Leu Ala Asp Arg Thr His Asn Met
    130                 135                 140
Arg Thr Leu Gly Ser Leu Arg Pro Asp Lys Arg Arg Arg Ile Ala Arg
145                 150                 155                 160
Glu Thr Leu Glu Ile Tyr Ser Pro Leu Ala His Arg Leu Gly Ile His
                165                 170                 175
His Ile Lys Thr Glu Leu Glu Glu Leu Gly Phe Glu Ala Leu Tyr Pro
            180                 185                 190
Asn Arg Tyr Arg Val Ile Lys Glu Val Val Lys Ala Ala Arg Gly Asn
        195                 200                 205
Arg Lys Glu Met Ile Gln Lys Ile Leu Ser Glu Ile Glu Gly Arg Leu
    210                 215                 220
Gln Glu Ala Gly Ile Pro Cys Arg Val Ser Gly Arg Glu Lys His Leu
225                 230                 235                 240
Tyr Ser Ile Tyr Cys Lys Met Val Leu Lys Glu Gln Arg Phe His Ser
                245                 250                 255
Ile Met Asp Ile Tyr Ala Phe Arg Val Ile Val Asn Asp Ser Asp Thr
            260                 265                 270
Cys Tyr Arg Val Leu Gly Gln Met His Ser Leu Tyr Lys Pro Arg Pro
        275                 280                 285
Gly Arg Val Lys Asp Tyr Ile Ala Ile Pro Lys Ala Asn Gly Tyr Gln
    290                 295                 300
Ser Leu His Thr Ser Met Ile Gly Pro His Gly Val Pro Val Glu Val
305                 310                 315                 320
Gln Ile Arg Thr Glu Asp Met Asp Gln Met Ala Glu Met Gly Val Ala
                325                 330                 335
Ala His Trp Ala Tyr Lys Glu His Gly Glu Thr Ser Thr Thr Ala Gln
            340                 345                 350
Ile Arg Ala Gln Arg Trp Met Gln Ser Leu Leu Glu Leu Gln Gln Ser
        355                 360                 365
Ala Gly Ser Ser Phe Glu Phe Ile Glu Ser Val Lys Ser Asp Leu Phe
    370                 375                 380
Pro Asp Glu Ile Tyr Val Phe Thr Pro Glu Gly Arg Ile Val Glu Leu
385                 390                 395                 400
Pro Ala Gly Ala Thr Pro Val Asp Phe Ala Tyr Ala Val His Thr Asp
                405                 410                 415
Ile Gly His Ala Cys Val Gly Ala Arg Val Asp Arg Gln Pro Tyr Pro
            420                 425                 430
Leu Ser Gln Pro Leu Thr Ser Gly Gln Thr Val Glu Ile Ile Thr Ala
        435                 440                 445
Pro Gly Ala Arg Pro Asn Ala Ala Trp Leu Asn Phe Val Val Ser Ser
    450                 455                 460
Lys Ala Arg Ala Lys Ile Arg Gln Leu Leu Lys Asn Leu Lys Arg Asp
465                 470                 475                 480
Asp Ser Val Ser Leu Gly Arg Arg Leu Leu Asn His Ala Leu Gly Gly
                485                 490                 495
Ser Arg Lys Leu Asn Glu Ile Pro Gln Glu Asn Ile Gln Arg Glu Leu
            500                 505                 510
Asp Arg Met Lys Leu Ala Thr Leu Asp Asp Leu Leu Ala Glu Ile Gly
        515                 520                 525
Leu Gly Asn Ala Met Ser Val ValVal Ala Lys Asn Leu Gln His Gly
    530                 535                540
Asp Ala Ser Ile Pro Pro Ala Thr Gln Ser His Gly His Leu Pro Ile
545                 550                 555                 560
Lys Gly Ala Asp Gly Val Leu Ile Thr Phe Ala Lys Cys Cys Arg Pro
                565                 570                 575
Ile Pro Gly Asp Pro Ile Ile Ala His Val Ser Pro Gly Lys Gly Leu
            580                 585                 590
Val Ile His His Glu Ser Cys Arg Asn Ile Arg Gly Tyr Gln Lys Glu
        595                 600                 605
Pro Glu Lys Phe Met Ala Val Glu Trp Asp Lys Glu Thr Ala Gln Glu
    610                 615                 620
Phe Ile Thr Glu Ile Lys Val Glu Met Phe Asn His Gln Gly Ala Leu
625                 630                 635                 640
Ala Asn Leu Thr Ala Ala Ile Asn Thr Thr Thr Ser Asn Ile Gln Ser
                645                 650                  655
Leu Asn Thr Glu Glu Lys Asp Gly Arg Val Tyr Ser Ala Phe Ile Arg
            660                 665                 670
Leu Thr Ala Arg Asp Arg Val His Leu Ala Asn Ile Met Arg Lys Ile
        675                 680                 685
Arg Val Met Pro Asp Val Ile Lys Val Thr Arg Asn Arg Asn
    690                 695                 700

Claims (10)

1.一种生产L-氨基酸的方法，其包括：
a)在培养基中培养具有生产L-氨基酸能力的细菌，以使L-氨基酸在培养物中积累，和
b)从培养物中收集L-氨基酸，其中所述的细菌被修饰过，从而提高了合成ppGpp的活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的细菌被修饰过，从而合成ppGpp的酶的活性被提高了。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的酶是RelA蛋白或者是RelA蛋白的催化结构域。
4.根据权利要求3所述的方法，其中RelA蛋白的活性被提高是通过：
a)增加relA基因，或者编码RelA蛋白催化结构域的relA基因部分区域的拷贝数，或者
b)修饰relA基因的表达调控序列，从而增强该细菌的relA基因或者编码RelA蛋白催化结构域的relA基因的部分区域的细胞内表达。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述RelA蛋白是一种定义为如下(A)或(B)的蛋白：
(A)一种具有SEQ ID NO：20所示氨基酸序列的蛋白；
(B)一种具有SEQ ID NO：20的包括替换、缺失、插入、增加一个或几个氨基酸残基的氨基酸序列的蛋白，且所述的蛋白具有合成ppGpp的活性。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述的RelA蛋白是由如下(a)或(b)定义的DNA编码的：
(a)一种具有SEQ ID NO：19所示核苷酸序列的DNA。
(b)一种具有在严谨条件下与SEQ ID NO：19的核苷酸序列杂交的DNA，且所述的DNA编码具有合成ppGpp活性的蛋白。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述的L-氨基酸选自L-谷氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-缬氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的L-氨基酸选自L-谷氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-赖氨酸。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述的细菌属于埃希氏菌属。
10.一种具有生产L-氨基酸能力的细菌，它被修饰，从而细胞内RelA蛋白的活性增强。
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