CN104583388A - 具有降低的ppGppase活性的细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及相对于其野生型经遗传学修饰的细胞，由此相对于其野生型其具有降低的ppGppase活性，并且优选地过量产生必需氨基酸、更优选衍生自丝氨酸的必需氨基酸、最优选甲硫氨酸或色氨酸，涉及包含这种细胞的饲料添加剂，涉及制备过量产生必需氨基酸、优选衍生自丝氨酸的必需氨基酸、最优选甲硫氨酸或色氨酸的细胞的方法，所述方法包括制备具有编码ppGppase的基因敲除的细胞，还涉及制备必需氨基酸、优选衍生自丝氨酸的必需氨基酸、最优选甲硫氨酸或色氨酸的方法，包括步骤a)培养根据本发明的第一方面或任何其实施方案的细胞，及b)任选纯化所述氨基酸。

Description

具有降低的ppGppase活性的细胞
本发明涉及相对于其野生型进行了遗传学修饰的细胞，由此相对于其野生型其具有降低的ppGppase活性并且过量产生必需氨基酸、优选衍生自丝氨酸的必需氨基酸、最优选甲硫氨酸或色氨酸，还涉及包含这种细胞的饲料添加剂，以及涉及制备细胞的方法，所述细胞过量产生衍生自丝氨酸的必需氨基酸、优选甲硫氨酸或者芳族必需氨基酸、特别是色氨酸，包括制备具有编码ppGppase的基因敲除的细胞，还涉及制备衍生自丝氨酸的必需氨基酸的方法，包括步骤a)培养根据本发明第一方面及其任何实施方案的细胞，及b)任选纯化所述氨基酸。
含硫L-氨基酸和芳族L-氨基酸是具有重大经济效益的氨基酸。L-半胱氨酸用作食物添加剂，作为药物活性化合物(例如N-乙酰半胱氨酸)及化妆品的起始物质。氨基酸L-甲硫氨酸和L-色氨酸在动物营养中起非常重要作用。其属于必需氨基酸，在脊椎动物代谢中不可以通过生物合成方式产生。在畜牧业中，因此必须确保在饲料中有足够量的特定氨基酸被摄取。然而，由于例如L-甲硫氨酸通常以太低的量存在于常规的饲料植物(如大豆或谷物)中，以致于不能保证最佳动物营养，特别是对于猪和禽类，在动物的饲料中加入甲硫氨酸作为添加剂是有益的。D-甲硫氨酸可以由脊椎动物转变为生物活性L-甲硫氨酸。因此D-和L-甲硫氨酸的外消旋物通常加入动物饲料中。在动物中，L-高半胱氨酸可以通过转甲基化而被转化成L-甲硫氨酸并因此替代L-甲硫氨酸。
在现有技术领域中，氨基酸如甲硫氨酸是通过化学合成制备的。这包括首先丙烯醛与甲硫醇反应生成3-甲硫基丙醛，其随之与氰化物、氨水和一氧化碳反应生成乙内酰脲。后者可最终被水解产生外消旋物，两个立体异构体D-和L-甲硫氨酸的等摩尔混合物。由于仅L形式组成分子的生物活性形式，因此饲料中存在的D形式必须首先通过脱氨和转氨作用经代谢转化为L形式。
与甲硫氨酸相反，大多数其它天然的、蛋白质氨基酸如色氨酸主要是利用微生物具有合成天然氨基酸的合适生物合成途径的事实通过微生物发酵制备的。此外，许多发酵过程实现了非常有利的生产成本及廉价的反应物如葡萄糖和矿物盐，以及同时输送特定氨基酸的生物活性L形式。
这种类型的氨基酸已知是通过发酵肠杆菌科菌株产生的，特别是大肠杆菌和粘质沙雷氏菌。由于其重要性，不断地进行改良制备方法的研究工作。所述方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或者营养培养基的组成，例如在发酵期间使用的糖及糖的浓度的选择，或者涉及产物形式的制作，例如通过离子交换层析，或者涉及微生物自身的固有输出性质。
在野生型菌株中，对氨基酸的生物合成途径进行严格代谢控制，这样保证氨基酸仅生产至细胞自身需要的程度。有效的生产方法的一个重要前提是合适微生物的可利用性，其与野生型相反，具有超过其自身需要的明显增加的生产输出量(过量产生)从而制备希望的氨基酸。
这种过量产生氨基酸的微生物可以通过常规突变/选择方法或者通过现代特定重组技术(代谢工程化)产生。后者包括首先鉴别通过对其修饰、激活或失活可实现氨基酸过量产生的基因或等位基因。然后使用分子生物学技术将这些基因/等位基因导入微生物菌株中或使其失活，以优化过量生产。然而，通常仅一些不同措施的组合才导致真实有效的生产。所述基因或等位基因可编码酶、转录因子、转运蛋白及能影响感兴趣的氨基酸合成的其它多肽、辅因子或辅因子合成多肽或成分。在一个优选的实施方案中，如在本文所理解，术语“成分”是指这种多肽的亚基，其影响感兴趣的氨基酸的合成，所述亚基尽管小于由所述基因或操纵子编码的整个系统，但是例如多肽的亚基或结构域与整个系统的工作功能相关。
L-甲硫氨酸衍生自天冬氨酸和丝氨酸。在大肠杆菌中，硫是通过L-半胱氨酸(通过胱硫醚作为中间物)转硫化导入L-甲硫氨酸中。L-甲硫氨酸的CH3基团源自C1代谢物，其通过MetE或MetH甲硫氨酸合酶转移至L-高半胱氨酸(参见Greene RC(1996)in Neidhardt FC et al.(eds)“Escherichiacoli and Salmonella“,2nd edition,pp 542-560)。发酵产生L-甲硫氨酸的菌株和方法已经针对大肠杆菌描述，例如在WO2006/001616或WO2009/043803中描述。
合成例如分支酸、肠菌素、甲基萘醌、四氢叶酸、泛醌及芳族氨基酸的莽草酸途径脱氧同样被紧密调节。在大肠杆菌中芳族氨基酸的生物合成在遗传学水平通过弱化和阻抑及通过酶的反馈抑制而被调节(Frost andDraths,Annual review of microbiology,49:557-79(1995)；Pittard,Genes toCells 1(8):717-25(1996))。这个途径使芳族代谢物的产生与细胞的需求精确匹配。莽草酸途径尤其是通过控制由3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAHP合酶，由aroF、aroG和aroH基因编码)的三种不同的同工酶催化的初始反应而调节的。AroG基因产物组成大肠杆菌中所有DAHP合酶总活性的80％(Tribe et al.,Journal of Bacteriology 127(3)：1085–1097(1976)；Pittard,Genes to Cells 1(8):717-25(1996))；AroG通过芳族氨基酸L-苯丙氨酸被抑制95％。在遗传水平，TyrR调节物在存在苯丙氨酸和色氨酸的条件下抑制aroG转录(Baseggio et al.,Journal of Bacteriology 172(5):2547-57(1990)；Davies et al.,Gene 33(3):323-31(1985))。专利申请EP 1 270 721和EP 2 147 972描述了应用aroG等位基因在使用肠杆菌属菌株产生和制备芳族氨基酸L-苯丙氨酸和L-色氨酸中的有益作用。
针对这个背景，本发明的目的是提供对现有技术描述的细胞进行改良的细胞、制备这种细胞的方法及使用这种细胞过量生产衍生自丝氨酸的必需氨基酸、优选甲硫氨酸或者芳族必需氨基酸、特别是色氨酸的方法，所述改良涉及如下因素，如过量产生的氨基酸达到的细胞内浓度、在处理所述培养物之后过量产生的氨基酸的产量、所述细胞的生长性质及过量产生和处理所述氨基酸需要的时间和方法步骤数，以及所述处理方法需要的资源，例如关于时间、菌株的活力和量及使用的反应物。
这个目的及进一步的目的通过本申请的主题且特别是通过所附独立权利要求的主题及继而从属权利要求的实施方案而实现。
第一方面，本申请的目的是由一种细胞实现的，所述细胞是相对于其野生型经遗传学修饰的细胞，由此相对于其野生型其具有降低的ppGppase活性且优选过量产生必需氨基酸，更优选衍生自丝氨酸的必需氨基酸，最优选甲硫氨酸或色氨酸。
在第一方面的第一个实施方案中，问题通过具有相对于其野生型基本无变化的(p)ppGpp-合成酶活性的细胞而解决。
在本发明的范围内，“具有相对于野生型基本无变化的(p)ppGpp-合成酶活性的细胞”是指所述细胞在相应条件下具有野生型细胞的至少90、95、99、101、105、110％的活性，所述活性通过每单位时间合成的(p)ppGpp分子数测量。
在第一方面的第二个实施方案中，这也是第一个实施方案的一个实施方案，问题通过相对于其野生型经遗传学修饰的细胞解决，由此所述细胞相对于野生型具有至少一种ppGppase的降低的活性，所述ppGppase选自包含氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6及其变体的一组，优选SEQ ID NO:2或其变体。
在第一方面的第三个实施方案中，这也是第一至第二个实施方案的实施方案，问题通过细胞解决，其中选自包含氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQID NO:4和SEQ ID NO:6及其变体、优选SEQ ID NO:2或其变体的一组的至少一种ppGppase的活性由于所述ppGppase具有至少一种如下修饰而降低：
a)Gly174或其同源氨基酸由不同的氨基酸取代，优选非保守取代，
b)Leu529或其同源氨基酸由不同的氨基酸取代，优选非保守取代，
c)在Asp84与Met85或其同源氨基酸之间插入至少一个氨基酸、优选至少两个氨基酸、优选插入His和Asn，
优选所有三种突变均存在。
在第一方面的第四个实施方案中，其也是第三个实施方案的实施方案，问题通过细胞解决，其中所述ppGppase另外具有选自如下一组的至少一个修饰，包括在氨基酸Gln9、Thr13、Tyr63、Arg109、Gln225、Cys245、Val248、Asn268、Ser270、Met280、His344、Pro436、Asn501、Gln505、His543、Ala546、Ser547、Ile548、His555、Gly556、His557、Pro559、Lys619、Thr621、Ala622、Thr627、Thr651、Ala669、Ala675、Thr698或在每种情况中其同源氨基酸的取代，优选非保守取代，及在Glu343与His344或在每种情况中其同源氨基酸之间的一个插入。
在第一方面的第五个实施方案中，其也是第三和第四个实施方案的实施方案，问题通过细胞解决，其中所述ppGppase具有来自如下一组的至少一个修饰，所述的组包括如下取代或对与被取代的氨基酸同源的氨基酸进行相同的氨基酸取代：
1)由选自Leu、Ile和Val、优选Leu的氨基酸取代Gln9，
2)由选自Lys、Arg、His、Gln和Asn、优选Arg或Asn的氨基酸取代Thr13，
3)由选自Lys、Arg和His、优选His的氨基酸取代Tyr63，
4)由选自Gln和Asn、优选Gln的氨基酸取代Arg109，
5)由选自Ser、Ala和Thr、优选Thr的氨基酸取代Gln225，
6)由选自Leu、Ile和Val、优选Leu的氨基酸取代Cys245，
7)用选自Lys、Arg和His、优选His的氨基酸取代Val248，
8)用选自Lys、Arg和His、优选L-His或Lys的氨基酸取代Asn268，
9)用选自Ala、Leu、Ile和Val、优选Ala或Val的氨基酸取代Ser270，
10)用选自Ser、Thr和Ala、优选Ala的氨基酸取代Met280，
11)在氨基酸Glu343与His344之间插入氨基酸Lys和Glu，
12)用选自Gln和Asn、优选Gln的氨基酸取代His344，
13)用选自Ser、Ala和Thr、优选Ser的氨基酸取代Pro436，
14)用选自Ser、Ala和Thr、优选L-丙氨酸的氨基酸取代Asn501，
15)用选自Pro、Ser、Ala和Thr、优选Pro或Ala的氨基酸取代Gln505，
16)用选自Asn和Gln、优选Gln的氨基酸取代His543，
17)用选自Asn和Gln、优选Gln的氨基酸取代Ala546，
18)用选自Ala、Leu、Ile和Val、优选Ala或Val的氨基酸取代Ser547，
19)用选自Asn和Gln、优选Asn的氨基酸取代Ile548，
20)用选自Leu、Ile和Val、优选Val的氨基酸取代His555，
21)用Lys、Arg和His、优选Arg取代在位置556的甘氨酸，
22)用选自Asn和Gln、优选Gln的氨基酸取代His557，
23)用选自Ser、Ala和Thr、优选Ala的氨基酸取代Pro559，
24)用选自Asn和Gln、优选Gln的氨基酸取代Lys619，
25)用选自Leu、Ile和Val、优选Ile的氨基酸取代Thr621，
26)用选自Glu和Asp、优选Asp的氨基酸取代Ala622，
27)用选自Ala和Gly、优选Ala的氨基酸取代Thr627，
28)用选自Glu和Asp、优选Glu的氨基酸取代Thr651，
29)用Thr取代Ala669和/或Ala675，
30)用选自Gln和Asn、优选Asn的氨基酸取代Thr698。
在第一方面的第六个实施方案中，这也是第一至第五个实施方案的实施方案，问题由相对于其野生型经遗传学修饰的细胞解决，由此相对于其野生型所述细胞过表达编码如下任一酶、其成分或者所述酶或其成分的变体的至少一种核酸序列或其变体：
1)硫代硫酸/硫酸转运系统CysPUWA(EC 3.6.3.25)，
2)3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸还原酶CysH(EC 1.8.4.8)，
3)亚硫酸还原酶CysJI(EC 1.8.1.2)，
4)半胱氨酸合酶A CysK(EC 2.5.1.47)，
5)半胱氨酸合酶B CysM(EC 2.5.1.47)，
6)丝氨酸乙酰转移酶CysE(EC 2.3.1.30)，
7)甘氨酸裂解系统GcvTHP-Lpd(EC 2.1.2.10，EC 1.4.4.2，EC 1.8.1.4)，
8)硫辛酰合酶LipA(EC 2.8.1.8)，
9)硫辛酰-蛋白质连接酶LipB(EC 2.3.1.181)，
10)磷酸甘油酸脱氢酶SerA(EC 1.1.1.95)，
11)3-磷酸丝氨酸磷酸酶SerB(EC 3.1.3.3)，
12)3-磷酸丝氨酸/磷酸羟基苏氨酸转氨酶SerC(EC 2.6.1.52)，
13)丝氨酸羟基甲基转移酶GlyA(EC 2.1.2.1)，
14)天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶I ThrA(EC 2.7.2.4,EC 1.1.1.3)，
15)天冬氨酸激酶LysC(EC 2.7.2.4)，
16)高丝氨酸脱氢酶Hom(EC 1.1.1.3)，
17)高丝氨酸O-乙酰转移酶MetX(EC 2.3.1.31)，
18)高丝氨酸O-琥珀酰转移酶MetA(EC 2.3.1.46)，
19)胱硫醚γ-合酶MetB(EC 2.5.1.48)，
20)βC-S裂解酶AecD(EC 4.4.1.8，也称作β-裂解酶)，
21)胱硫醚β-裂解酶MetC(EC 4.4.1.8)，
22)B12-非依赖性高半胱氨酸S-甲基转移酶MetE(EC 2.1.1.14)，
23)B12-依赖性高半胱氨酸S-甲基转移酶MetH(EC 2.1.1.13)，
24)亚甲基四氢叶酸还原酶MetF(EC 1.5.1.20)，
25)来自谷氨酸棒杆菌的L-甲硫氨酸输出蛋白(exporter)BrnFE，
26)来自大肠杆菌的缬氨酸输出蛋白YgaZH(b2682，b2683)，
27)来自大肠杆菌的推定的转运蛋白YjeH(b4141)，
28)吡啶核苷酸转氢酶PntAB(EC 1.6.1.2)，
29)O-琥珀酰高丝氨酸硫解酶(sulphhydrylase)MetZ(EC 2.5.1.48)，
30)磷酸烯醇丙酮酸羧基酶Pyc(EC 4.1.1.31)，
31)硫代硫酸硫转移酶RDL2p(EC 2.8.1.1)，
32)硫代硫酸-硫醇硫转移酶(EC 2.8.1.3)，
33)硫代硫酸-二硫醇硫转移酶(EC 2.8.1.5)。
在第一方面的第七个实施方案中，这也是第一至第六个实施方案的一个实施方案，问题由相对于其野生型经遗传学修饰的细胞解决，由此相对于其野生型所述细胞以降低的规模表达编码如下任一酶、其成分或者所述酶或其成分的变体的至少一种核酸序列或其变体：
1)L-甲硫氨酸生物合成的转录调节物(MetJ)，优选由数据库代码b3938，ECK3930表示的，或者其变体，
2)葡萄糖-6-磷酸异构酶(Pgi，EC 5.3.1.9)，优选由数据库代码b4025，ECK4017表示的，或者其变体
3)高丝氨酸激酶(ThrB，EC 2.7.1.39)，优选以数据库代码b0003，ECK0003表示的，或者其变体，
4)S-腺苷甲硫氨酸合酶(MetK，EC 2.5.1.6)，优选以数据库代码b2942，ECK2937表示的，或者其变体，
5)二氢甲基吡啶酸合酶(DapA，EC 4.2.1.52)，优选以数据库代码b2478，ECK2474表示的，或者其变体，
6)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(Pck，EC 4.1.1.49)，优选以数据库代码b3403，ECK3390表示的，或者其变体，
7)甲酰四氢叶酸水解酶(PurU，EC 3.5.1.10)，优选以数据库代码b1232，ECK1227表示的，或者其变体，
8)丙酮酸激酶II(PykA，EC 2.7.1.40)，优选以数据库代码b1854，ECK1855表示的，或者其变体
9)丙酮酸激酶I(PykF，EC 2.7.1.40)，优选以数据库代码b1676,ECK1672表示的，或者其变体，
10)L-甲硫氨酸转运蛋白的亚基(MetQNI)，优选以数据库代码b0197，ECK0197表示的，或者其变体，
11)L-甲硫氨酸转运蛋白的亚基(MetQNI)，优选以数据库代码b0198，ECK0198表示的，或者其变体，
12)L-甲硫氨酸转运蛋白的亚基(MetQNI)，优选以数据库代码b0199，ECK0199表示的，或者其变体，
13)脱氧胞苷5'-三磷酸脱氨酶(Dcd，EC 3.5.4.13)，优选以数据库代码b2065，ECK2059表示的，或者其变体，
14)推定的N-脂肪酰转移酶(YncA)，优选以数据库代码b1448，ECK1442表示的，或者其变体，
15)调节性sRNA FnrS，优选以数据库代码b4699，ECK4511表示的，或者其变体，
16)σ因子RpoS，优选以数据库代码b2741，ECK2736表示的，或者其变体。
在第一方面的第八个实施方案中，这也是第一至第五个实施方案的一个实施方案，问题由相对于其野生型经遗传学修饰的细胞解决，由此相对于其野生型所述细胞过表达编码如下任一酶、其成分或者所述酶或其成分的变体的至少一种核酸序列或其变体：
1)邻氨基苯甲酸合酶(trpDE，EC 4.1.3.27)，邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶(trpD，EC 2.4.2.18)，磷酸核糖基邻氨基苯甲酸异构酶(trpC，EC 5.3.1.24)，吲哚-3-磷酸甘油合酶(trpC，EC 4.1.1.48)和色氨酸合酶(trpAB，EC 4.1.2.8和4.2.1.122)，
2)磷酸甘油酸脱氢酶SerA(EC 1.1.1.95)，
3)3-磷酸丝氨酸磷酸酶SerB(EC 3.1.3.3)，
4)3-磷酸丝氨酸/磷酸羟基苏氨酸转氨酶SerC(EC 2.6.1.52)，
5)L-酪氨酸-敏感性DHAP合酶(aroF，EC 2.5.1.54)，
6)L-苯丙氨酸反馈-抗性DHAP合酶(aroG，EC 2.5.1.54)，
7)L-色氨酸-敏感性DHAP合酶(aroH，EC 2.5.1.54)，
8)磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA(EC 2.7.9.2)，
9)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶pck(EC 4.1.1.49)，
10)转酮醇酶A tktA(EC 2.2.1.1)，
11)转酮醇酶B tktB(EC 2.2.1.1)，
12)大肠杆菌开放读框(ORF)的基因产物yddG，优选以数据库代码b1473，ECK1467表示，或者其变体。
在第一方面的第九个实施方案中，这也是第一至第五个实施方案的一个实施方案，问题由相对于其野生型经遗传学修饰的细胞解决，由此相对于其野生型所述细胞以降低规模表达编码如下任一酶、其成分或者所述酶或其成分的变体的至少一种核酸序列或者其变体：
1)色氨酸酶(tnaA，EC 4.1.99.1)，
2)trp操纵子的阻抑物(trpR)，优选以数据库代码b4393，ECK4385表示，或者其变体，
3)分支酸变位酶T或预苯酸脱氢酶(tyrA,EC 1.3.1.12)，
4)分支酸变位酶P或预苯酸脱氢酶(pheA,EC 4.2.1.51)，
5)色氨酸-特异性转运蛋白(mtr)，优选以数据库代码b3161，ECK3149表示，或者其变体，
6)色氨酸透性酶(tnaB)，优选以数据库代码b3709，ECK3702表示，或者其变体，
7)芳族氨基酸的转运蛋白(aroP)，优选以数据库代码b0112，ECK0111表示，或者其变体，
8)L-丝氨酸脱氨酶(sdaA，EC 4.3.1.17)，
9)葡萄糖-6-磷酸异构酶(pgi，EC 5.3.1.9)，
10)酪氨酸转氨酶(tyrB)，优选以数据库代码b4054，ECK4046表示，或者其变体，
11)glp调节子的阻抑物(glpR)，优选以数据库代码b3423，ECK3409表示，或者其变体，
12)σ因子RpoS(rpoS)，优选以数据库代码b2741，ECK2736表示，或者其变体。
在第一方面的第十个实施方案中，这也是第一至第九个实施方案的一个实施方案，问题通过细胞解决，所述细胞过量产生衍生自丝氨酸的必需氨基酸、优选甲硫氨酸，或者芳族必需氨基酸，特别是色氨酸。
在第二方面中，本发明专注于解决的问题通过饲料添加剂解决，其包含根据本发明第一方面或者其实施方案的细胞。
在第三方面中，本发明专注于解决的问题通过制备必需氨基酸的方法解决，优选过量产生衍生自丝氨酸的必需氨基酸、最优选甲硫氨酸或色氨酸，所述方法包括制备具有编码ppGppase的基因敲除的细胞，优选相对于野生型不具有降低的(p)ppGpp-合成酶活性，其中所述ppGppase优选选自包含氨基酸序列SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6及其变体的一组，更优选是SEQ ID NO:2，以及培养所述细胞，任选纯化所述氨基酸。
在第四方面中，本发明专注于解决的问题由制备衍生自丝氨酸的必需氨基酸的方法解决，所述方法包括如下步骤：
a)培养根据本发明第一方面或者其任何实施方案的细胞，
b)任选纯化所述氨基酸。
在第四方面的第一个实施方案中，所述问题通过使用根据本发明第一方面或其任何实施方案的细胞解决，所述方法是制备甲硫氨酸的方法。
在第四方面的第二个实施方案中，这也是第一个实施方案的一个实施方案，所述问题通过一种方法解决，其中使用根据本发明第一方面或其第二至第六个或第九至第十个实施方案的细胞，所述方法是用于制备芳族必需氨基酸，优选色氨酸的方法。
在第四方面的第三个实施方案中，这也是第一至第二个实施方案的一个实施方案，问题通过一种方法解决，其中微生物是分批、补料分批、重复补料分批或者持续方法培养的。
在第一、第二、第三和第四个方面的进一步的实施方案中，这也是第一至第四方面所有实施方案的一个实施方案，问题通过细胞/饲料添加剂/方法解决，其中所述细胞是来自肠杆菌属的细菌细胞。
在第一、第二、第三和第四方面的进一步的实施方案中，这也是第一至第四方面所有实施方案的一个实施方案，问题通过细胞/饲料添加剂或方法解决，其中所述细胞选自埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、普罗威登斯菌属和沙雷氏菌属，其中所述细胞优选是来自埃希氏菌属、更优选大肠杆菌的细胞。
在第五方面，本发明的问题通过包含编码ppGppase的一部分的分离的或重组的核酸分子解决，其相对于野生型经遗传学修饰，由此相对于其野生型其具有降低的ppGppase活性。
在第五方面的第一个实施方案中，由所述分离的或重组的核酸分子编码的ppGppase具有与野生型相比基本无变化的(p)ppGpp-合成酶活性。
在第五方面的第二个实施方案中，这也是第一个实施方案的一个实施方案，由所述分离的或重组的核酸分子编码的ppGppase选自包含氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6及其变体的一组，优选SEQID NO:2或其变体。
在第五方面的第三个实施方案中，这也是第二个实施方案的一个实施方案，由所述分离的或重组的核酸分子编码的ppGppase活性由于编码ppGppase的所述核酸分子相对于相应野生型序列具有至少一个如下修饰而降低：
a)Gly174或与其同源的氨基酸由不同氨基酸取代，优选非保守取代，
b)Leu529或与其同源的氨基酸由不同氨基酸取代，优选非保守取代，
c)在Asp84与Met85或与其同源的氨基酸之间插入至少一个氨基酸，优选至少两个氨基酸，优选His和Asn，
优选所有三种突变均存在。
在第五方面的第四个实施方案中，这也是第一至第三个实施方案的一个实施方案，由所述分离的或重组的核酸分子编码的ppGppase的活性由于编码ppGppase的所述分离的或重组的核酸分子与相应野生型序列相比具有至少一个如下修饰而降低，包括氨基酸Gln9、Thr13、Tyr63、Arg109、Gln225、Cys245、Val248、Asn268、Ser270、Met280、His344、Pro436、Asn501、Gln505、His543、Ala546、Ser547、Ile548、His555、Gly556、His557、Pro559、Lys619、Thr621、Ala622、Thr627、Thr651、Ala669、Ala675、Thr698或在每种情况中与其同源的氨基酸的取代，优选非保守取代，以及在Glu343与His344或在每种情况中与其同源的氨基酸之间的一个插入。
在第五方面的第五个实施方案中，这也是第一至第四个实施方案的一个实施方案，由所述分离的或重组的核酸分子编码的ppGppase的活性由于编码ppGppase的所述分离的或重组的核酸分子与相应野生型序列相比具有至少一个如下取代而降低：
1)由选自Leu、Ile和Val、优选Leu的氨基酸取代Gln9，
2)由选自Lys、Arg、His、Gln和Asn、优选Arg或Asn的氨基酸取代Thr13，
3)由选自Lys、Arg和His、优选His的氨基酸取代Tyr63，
4)由选自Gln和Asn、优选Gln的氨基酸取代Arg109，
5)由选自Ser、Ala和Thr、优选Thr的氨基酸取代Gln225，
6)由选自Leu、Ile和Val、优选Leu的氨基酸取代Cys245，
7)用选自Lys、Arg和His、优选His的氨基酸取代Val248，
8)用选自Lys、Arg和His、优选L-His或Lys的氨基酸取代Asn268，
9)用选自Ala、Leu、Ile和Val、优选Ala或Val的氨基酸取代Ser270，
10)用选自Ser、Thr和Ala、优选Ala的氨基酸取代Met280，
11)在氨基酸Glu343与His344之间插入氨基酸Lys和Glu，
12)用选自Gln和Asn、优选Gln的氨基酸取代His344，
13)用选自Ser、Ala和Thr、优选Ser的氨基酸取代Pro436，
14)用选自Ser、Ala和Thr、优选L-丙氨酸的氨基酸取代Asn501，
15)用选自Pro、Ser、Ala和Thr、优选Pro或Ala的氨基酸取代Gln505，
16)用选自Asn和Gln、优选Gln的氨基酸取代His543，
17)用选自Asn和Gln、优选Gln的氨基酸取代Ala546，
18)用选自Ala、Leu、Ile和Val、优选Ala或Val的氨基酸取代Ser547，
19)用选自Asn和Gln、优选Asn的氨基酸取代Ile548，
20)用选自Leu、Ile和Val、优选Val的氨基酸取代His555，
21)用Lys、Arg和His、优选Arg取代在位置556的甘氨酸，
22)用选自Asn和Gln、优选Gln的氨基酸取代His557，
23)用选自Ser、Ala和Thr、优选Ala的氨基酸取代Pro559，
24)用选自Asn和Gln、优选Gln的氨基酸取代Lys619，
25)用选自Leu、Ile和Val、优选Ile的氨基酸取代Thr621，
26)用选自Glu和Asp、优选Asp的氨基酸取代Ala622，
27)用选自Ala和Gly、优选Ala的氨基酸取代Thr627，
28)用选自Glu和Asp、优选Glu的氨基酸取代Thr651，
29)用Thr取代Ala669和/或Ala675，
30)用选自Gln和Asn、优选Asn的氨基酸取代Thr698。
在第五方面的第六个实施方案中，这也是第一至第五个实施方案的一个实施方案，问题通过编码序列SEQ ID NO:8或其变体的分离的或重组的核酸分子解决。
在第五方面的第七个实施方案中，这也是第一至第五个实施方案的一个实施方案，问题通过包含序列SEQ ID NO:7或其变体的分离的或重组的核酸序列解决。
在第六方面中，本发明专注于的问题通过载体解决，其包含根据本发明第五方面或其任何实施方案的核酸分子。
本发明人已经发现过量产生必需氨基酸、优选衍生自丝氨酸的必需氨基酸、最优选甲硫氨酸或色氨酸的细胞的生产输出通过这样的情况而显著增加，其中所述细胞与其野生型相比具有降低的ppGppase活性。令人惊奇地，如果细胞的(p)ppGpp-合成酶相对于其野生型基本无变化，情况尤其如此。
本发明的细胞的基本性质是根据野生型已经遗传学修饰，由此相对于其野生型其具有降低的ppGppase活性。在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语“ppGppase活性”是指鸟苷-3',5'-双(二磷酸)3'-二磷酸酶(EC 3.1.7.2)的酶活性，即催化鸟苷-3',5'-双(二磷酸)(＝ppGpp)分解产生GDP和焦磷酸的能力。在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语“ppGppase”是指具有ppGppase活性的酶，这种酶可以仅具有ppGppase活性，或者具有包括ppGppase活性在内的多种活性。ppGpp是通过鸟苷-5'-三磷酸，3'-二磷酸焦磷酸酶(EC 3.6.1.40)的作用由鸟苷3'-二磷酸5'-三磷酸(＝pppGpp)产生，后者是通过GTP二磷酸激酶(EC 2.7.6.5，通常在文献中缩写为PSI和PSII)从ATP和GTP中产生的化合物。在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语“(p)ppGpp-合成酶活性”包括产生至少一种、优选这两种化合物pppGpp和ppGpp的能力，优选随着ATP水解。现有技术描述了许多ppGppases和编码ppGppases的基因，例如Blattner et al.(Science 277：1453–1462(1997))及在数据库如NC_003197(REGION：3934070-3936181)、NC_009832(REGION：(5391421-5393532)、NC_007613、NC_004741、NC_013971和NC_009648所述。在一个优选的实施方案中，如本文所用，根据其野生型已经遗传学修饰的细胞，由此其相对于野生型具有降低的ppGppase活性，及术语“优选地过量产生必需氨基酸、更优选衍生自丝氨酸的必需氨基酸、最优选甲硫氨酸或色氨酸”，是指细胞基于的起始菌株相对于其原始野生型菌株已经产生增加量的相关氨基酸，甚至先于或不依赖于ppGppase活性降低。
本领域技术人员基于活性测定可以确定酶如ppGppase或(p)ppGpp合成酶的活性，例如结合专门评估和解释使用现有技术中这种确定获得的动力学参数的方法已经描述的那些测定法，例如Cornish-Bowden,Fundamentals of Enzym Kinetics,Portland Press Limited,1995所述。现有技术进一步描述了确定(p)ppGpp合成酶(Mechold et al.,1996,J.Bact.178,1401-1411)和ppGppase(Gallant et al.,1970,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.35,397)的活性的具体测定法。简而言之，这种方法包括用放射性标记的核酸标记具有待确定活性的细胞，通过加入400μg/ml缬氨酸而造成细胞对异亮氨酸的饥饿，随后在0.66N甲酸中抑制缬氨酸15分钟后提取细胞的核酸集合，接着通过在PEI-纤维素平板上在1.5M磷酸二氢钾中经薄层层析分级分离pppGpp、ppGpp、pppG和pppA，使用放射自显影术观测。在一个优选的实施方案中，“根据其野生型已经遗传学修饰的细胞，由此其相对于野生型具有降低的ppGppase活性”是指这样的细胞，其在相应条件下具有较野生型细胞低的ppGppase活性，如下顺序的优选性逐渐增加，低于野生型细胞活性的70、60、40、20、10或5％，所述活性通过每单位时间水解的ppGpp分子数测量。在一个进一步优选的实施方案中，“相对于其野生型(p)ppGpp-合成酶活性基本无变化的细胞”是指所述细胞在相应条件下具有野生型的至少90、95、99、101、105、110％的活性，所述活性通过每单位时间合成的(p)ppGpp分子数测量。在一特别优选的实施方案中，所述细胞是大肠杆菌菌株，序列SEQ ID NO:2或其变体的ppGppase活性降低，而所述细胞的(p)ppGpp合成酶活性基本无变化。
本发明的教导不限于其中使用的生物的分子的氨基酸或核酸序列与本申请中描述的序列或者与本文中指出或引用的现有技术的序列是相同的，但是本发明的教导还包括这种的分子的通过缺失、添加或取代一或多个氨基酸或核酸而获得的变体，以及包含这种的分子或其变体的融合体。在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语核酸序列或氨基酸序列的“变体”在下文与术语“同源物”是同义及可互换使用，是指关于相应的原始野生型核酸或氨基酸序列而不同的核酸或氨基酸序列，其具有70、75、80、85、90、92、94、96、98、99％或更高百分比的同源性(在此与相同性同义使用)，优选为形成催化活性位点或者对于结构或折叠而言必需的氨基酸以外的那些氨基酸被缺失或取代，或者是形成催化活性位点或者对于结构或折叠而言必需的氨基酸仅被保守取代。现有技术领域教导了氨基酸的保守和非保守取代的类型及如何产生，见例如Berg,Jeremy M.,Tymoczko,John L.,andStryer,Lubert.Biochemistry.6th ed.New York,N.Y.：W.H.Freeman andCompany,2007所述，并描述了可用于计算两个序列同源性程度的算法，例如Arthur Lesk(2008),Introduction to bioinformatics,3rd edition所述。在本发明的进一步更优选的实施方案中，氨基酸或核酸序列的变体，优选除了上述序列同源性之外，具有与野生型分子或原始分子基本相同的酶活性。例如，作为蛋白酶是酶活性的多肽变体具有与所述多肽酶相同的蛋白酶解活性，即催化肽键水解的能力。在一个进一步优选的实施方案中，术语核酸或氨基酸序列的“变体”包含所述核酸或氨基酸序列的至少一个活性部分/或者片段。在一个进一步优选的实施方案中，如本文所用，术语“活性部分”是指氨基酸序列或核酸序列，其长度小于氨基酸序列的全长，或者其编码小于全长的氨基酸序列，长度比野生型氨基酸序列短的所述氨基酸序列或编码的氨基酸序列具有与野生型多肽或其变体如(p)ppGpp合成酶相同的酶活性。在特别的实施方案中，术语核酸的“变体”包含这样的核酸，其互补链结合野生型核酸，优选在严格条件下。杂交反应的严格性可易于由本领域技术人员确定，通常依赖于探针的长度、洗涤期间的温度以及盐浓度。通常地，较长的探针需要较高的温度以杂交，而较低的温度适合较短的探针。杂交是否发生通常依赖于变性的DNA在其周围温度、特别是低于解链温度下退火为互补链的能力。杂交反应的严格性和相应条件在F.M.Ausubel(1995),Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley&Sons,Inc.中更详细描述。通过杂交鉴别DNA序列的指导由本领域技术人员参见"The DIG System Users Guide for Filter Hybridization"of BoehringerMannheim GmbH(Mannheim,Germany,1993)和Liebl et al.(InternationalJournal of Systematic Bacteriology 41：255-260(1991))。在一个优选的实施方案中，杂交在严格条件下发生，即只有杂交体形成，其中探针和靶序列(即由探针处理的多核苷酸)是至少70％相同的。已知杂交、包括洗涤步骤的严格性受缓冲液成分、温度和盐浓度的改变的影响或者通过其确定。杂交反应通常在与洗涤步骤相比相对低严格条件下进行(Hybaid HybridisationGuide,Hybaid Limited,Teddington,UK,1996)。对于杂交反应，可以例如使用相应于5x SSC缓冲液的缓冲液，在大约50℃-68℃温度进行。在此，探针也可以与和探针序列具有低于70％相同性的多核苷酸杂交。这种杂交体不太稳定，通过在严格条件下洗涤而除去。这可以通过例如降低盐浓度至2x SSC及任选随后0.5x SSC而实现(The DIG System User's Guide forFilter Hybridisation,Boehringer Mannheim,Mannheim,Germany,1995)，其中优选(越来越优选)温度调节为大约50℃-68℃、大约52℃-68℃、大约54℃-68℃、大约56℃-68℃、大约58℃-68℃、大约60℃-68℃、大约62℃-68℃、大约64℃-68℃、大约66℃-68℃。优选大约64℃-68℃或大约66℃-68℃的温度。任选可以降低盐浓度至相应于0.2x SSC或0.1x SSC的浓度。通过以大约1-2℃梯度将杂交温度从50℃逐步提高至68℃，可以分离与应用的探针序列或者与SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示核酸序列具有至少70％或至少80％或至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的多核苷酸片段。关于杂交的进一步指导可在市场上以“试剂盒”形式获得(例如DIG Easy Hyb from Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany,catalogue no.1603558)。在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语核酸的“变体”包含编码与原始核酸相同的氨基酸序列或者在遗传密码简并界限内的这个氨基酸序列的变体的任何核酸序列。
在核酸和氨基酸水平在生物大分子中导入特定突变是目前常规使用的分子生物学、微生物学和生物化学标准方法的一部分。例如，可以使用利用诱导突变的寡核苷酸的定向诱变方法(T.A.Brown：Gentechnologie fürEinsteiger[Genetic engineering for beginners],Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg,Germany,1993)，或者聚合酶链反应(PCR)，如Gait：Oligonucleotide synthesis：A Practical Approach(IRL Press,Oxford,UK,1984)或者Newton and Graham(PCR,Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg,1994)所述。为了设计突变，可以使用来自Stratagene(Amsterdam,Netherlands)的Quick Change定向诱变试剂盒。使用这些方法，包括扩增起始序列，例如现有技术中描述的ppGppase编码序列，借助于聚合酶链反应(PCR)从野生型菌株的分离的总DNA开始，将所述序列克隆进合适的质粒载体中，然后对所述DNA进行诱变程序。利用“GeneSOEing”(Gene Splicing by OverlapExtension,Horton,Molecular Biotechnology 3：93-98(1995))，通过PCR甚至可获得点突变。也可以使用核苷酸序列的de novo基因合成(例如通过GENEART AG,Regensburg,Germany)，以在spoT基因中产生突变。产生的突变可以通过DNA测序确定和复核，例如通过Sanger et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.74(12)：5463-5467,1977)所述方法。产生的等位基因可以掺入合适菌株的染色体中，例如通过转化及基因或等位基因置换方法。
由Hamilton et al.(Journal of Bacteriology 171,4617–4622(1989))描述的一种常规方法是借助于条件性复制pSC101衍生的pMAK705或者用pKO3(Link et al.,Journal of Bacteriology 179：6228-6237)的基因置换方法。也可以利用现有技术描述的其它方法，例如Martinez-Morales et al.(Journalof Bacteriology 1999,7143-7148(1999))或Boyd et al.(Journal of Bacteriology182,842-847(2000))所述。
另一常规方法包括通过短的同源侧翼序列将通过PCR或者基因合成产生的DNA片段借助于Lambda Red重组酶直接掺入染色体中，或者进行置换(Proc.Natl.Acad.Sci.97(12),6640-6645(2000)；Nature Genetics 20,123–128,1998)。
也可以通过缀合或转导将产生的等位基因转移进各种菌株中。
尽管据教导例如在完全化学合成过程中或通过改变细胞翻译机构将在核酸或氨基酸序列中不是天然发生的众多的人工核苷酸或氨基酸导入生物大分子中是可行的，但是在一个优选的实施方案中，本发明仅提供了对于蛋白质L-氨基酸的取代以置换在特定多肽中原始存在的一或多个氨基酸。在一个优选的实施方案中，术语“蛋白质”氨基酸是指得自所有L形式氨基酸丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸的任何氨基酸。在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语与野生型多肽序列中的氨基酸“同源”的氨基酸是指在不同的氨基酸序列中鉴别的氨基酸，然而基于两个序列的排列，其与野生型序列在一级结构方面是相关的，是相应于野生型序列中的氨基酸的氨基酸或者在相关氨基酸序列中占据其相应位置。进行两或多个氨基酸序列排列对比的方法已经在现有技术描述，例如在ArthurLesk(2008),Introduction to bioinformatics,3rd edition中描述，包括使用软件包如Clustal W(Thompson et al.,Nucleic Acids Research 22,4637-4680,1994)或MAFFT(Katoh et al.,Genome Information,16(1),22-33,2005)。例如，由人Pax6基因编码的多肽中的Arg26与果蝇基因的Arg59是同源的，参见Lesk(2008),p.36。
制备根据本发明的突变体的遗传方法除了遗传工程方法之外还包括传统的遗传方法，如体内诱变方法，使用肠杆菌科菌株的细胞群和诱变剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)、5-溴尿嘧啶或者紫外线。诱变方法例如在Manual of Methods for General Bacteriology(Gerhard et al.(Eds.),American Society for Microbiology,Washington,DC,USA,1981)或者在Tosaka et al.(Agricultural and Biological Chemistry 42(4),745-752(1978))或者在Konicek et al.(Folia Microbiologica 33,337-343(1988))中描述。使用MNNG的典型的诱变反应包含浓度为50-500mg/l或更高浓度，直至不超过1g/l，保温时间为1-30分钟，pH 5.5-7.5。在这些条件下，存活细胞的数目降低大约50％-90％或者大约50％-99％或者大约50％-99.9％或更多。
从诱变的细胞群中除去突变体或细胞并使其增殖。在进一步的步骤中，优选研究在使用合适的营养培养基分批培养中其分泌氨基酸、优选甲硫氨酸或色氨酸的能力。在使用合适的自动系统的情况中，如在Zimmermann etal.(VDI Berichte No.1841,VDI-Verlag,Düsseldorf,Germany 2004,439-443)或Zimmermann(Chemie Ingenenieur Technik 77(4),426-428(2005))中所述，可以在短时间内研究众多的突变体。通常地，研究不超过3000、不超过10,000、不超过30,000或者不超过60,000个及在适当时更多的突变体。以此方式鉴别出与亲代菌株或者未诱变的菌株相比，所述突变体呈现出增加的氨基酸分泌进营养培养基中或者分泌进细胞内部。这些包括例如其氨基酸分泌增加至少0.5％的突变体。
然后从所述突变体制备或分离DNA，使用引物对借助于聚合酶链反应合成相应的多核苷酸，这使得本发明的spoT基因或者spoT等位基因或者本发明的突变扩增。所述DNA优选分离自以增加程度分泌氨基酸的突变体。
在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语“基因”是指脱氧核糖核酸(DNA)上的一个节段，其含有首先关于核糖核酸(RNA)产生的信息，其次含有关于蛋白质(多肽)的产生(翻译)的信息，在这种情况中是具有(p)ppGpp合成酶II活性的多肽。基因或多核苷酸含有关于产生蛋白质的信息的事实也称作所述基因或RNA对蛋白质或多肽的编码。基因表达表示RNA和蛋白质从所述DNA和基因中包含的遗传信息中的生物合成。内源基因或多核苷酸被理解为是指在一个物种群中存在的开放读框(ORFs)、基因或等位基因或者其多核苷酸。术语“基因”和“ORF(开放读框)”在本发明中可同义使用。
在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语“多核苷酸”是指多核糖核苷酸和多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA，术语多核苷酸与术语“核酸”可同义及可互换使用。
在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语“多肽”是指包含通过肽键连接的两或多个氨基酸的肽或蛋白质。术语多肽和蛋白质是同义使用的。蛋白质是所有细胞的基本构建模块之一。其不仅为细胞提供结构，而且还是转运物质、催化化学反应和识别信号物质的“机构”。
本领域技术人员已知当设计多肽或编码基因的变体或突变体时，如果以保守方式用一个氨基酸取代野生型序列中的一个氨基酸，非常可能获得具有相似或者甚至相同性质的多肽。在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语“保守”取代是指氨基酸由具有相似物理化学结构性质的蛋白质氨基酸取代。在一个更优选的实施方案中，这是指如下任何一组的氨基酸仅由来自相同组的另一氨基酸取代，所述组包括小氨基酸组(包含Gly、Ala、Ser和Thr)，中等大小的非极性氨基酸组(包含Cys、Val、Ile和Leu)，大的非极性氨基酸组(包含Phe、Tyr、Met和Trp)，侧链无电荷的极性氨基酸组(包含His、Gln和Asn)，正电荷氨基酸组(包含Lys和Arg)，以及负电荷氨基酸组(包含Glu和Asp)。
本发明的教导可用于实施制备任何氨基酸。在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语“氨基酸”应理解为是指有机酸，其包含至少一个氨基基团和一个羧基基团，优选通过同一碳原子共价连接，最优选是L形式氨基酸。在一个优选的实施方案中，本发明的细胞或方法用于制备必需氨基酸和/或丝氨酸衍生的氨基酸和/或芳族氨基酸。在一个优选的实施方案中，术语“必需”氨基酸是指不能由高等真核细胞、优选温血高等真核细胞、根更优选鸟或哺乳动物独立产生的氨基酸。在一个更优选的实施方案中，这也包括生物体可自身产生，但是仅是由食物中摄取的合适前体、最优选另一氨基酸。在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语“衍生自丝氨酸的氨基酸”是指通过包括消耗丝氨酸作为反应物的至少一个反应的生物合成途径产生的氨基酸，所述生物合成途径优选仅包括直接有助于产生的氨基酸结构的那些反应，而不是只是再生辅因子的反应。
本发明的细胞或者应用本发明的方法产生或应用的细胞可以是可用于生物技术中的众多生物体的细胞。在一个优选的实施方案中，其是原核细胞或者低等真核细胞。在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语“低等真核细胞”是指单细胞的真核细胞，优选酵母细胞。低等真核细胞例如包括酵母属、裂殖酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属和亚罗酵母属细胞。在另一优选的实施方案中，细胞是原核细胞，更优选是革兰氏阴性细菌细胞，更优选是选自埃希氏菌属、欧文氏菌属、普罗威登菌属和沙雷氏菌属的细胞，更优选埃希氏菌属细胞，最优选大肠杆菌细胞。在一个优选的实施方案中，其是通过纯培养维持的分离的细胞。进一步的实施方案使用培养混合物。在最优选的实施方案中，细胞是细菌菌株EMC1_spoT1849，见实施例4所述。
制备至少一种氨基酸的本发明的细胞优选是完好的，具有未损伤的代谢活性。然而，根据本发明的教导也可以通过使用部分裂解的和部分纯化的细胞实施，其代谢仍能产生感兴趣的氨基酸。如果本发明的细胞用作饲料添加剂的一部分，任何细胞纯化阶段均是可能的，从完好的细胞至部分或完全裂解的细胞至纯氨基酸。
根据本发明特别优选的是产生衍生自丝氨酸的必需氨基酸、优选甲硫氨酸或色氨酸或者芳族氨基酸、特别是色氨酸的那些细胞，所述氨基酸的量相对于取自自然的野生型甚至在遗传学修饰之前增加，导致降低的ppGppase活性，即相应起始菌株的形式。在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语“起始菌株”与术语“亲代菌株”可互换使用，是指对于实施增加一或多种氨基酸、肽或蛋白质的生产率或者增加一或多种酶的活性的措施的微生物菌株，例如实施导致过表达的措施。起始菌株可以是野生型菌株，但是也可以是先前修饰的菌株，例如过量产生至少一种L-氨基酸的菌株，其可用作生产菌株。
现有技术已经揭示了许多过量产生相关氨基酸的菌株，以及可以实现这种过量产生的措施和修饰。在一个优选的实施方案中，分泌或产生L-甲硫氨酸的大肠杆菌菌株优选具有增强的天冬氨酸激酶(EC 2.7.2.4)酶活性，优选反馈抗性等位基因。在大肠杆菌中，有三种不同的天冬氨酸激酶，由thrA、metL和lysC基因编码。在另一优选的实施方案中，L-甲硫氨酸生物合成由于弱化或缺失由metJ基因编码的调节性蛋白质MetJ的原因而增加。MetJ是大肠杆菌中L-甲硫氨酸生物合成的主要阻抑物。
在一个进一步优选的实施方案中，细胞的起始菌株衍生自大肠杆菌MG1655、大肠杆菌W3110、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌DH10B、大肠杆菌BW2952、大肠杆菌REL606。
在本申请书中用于列举现有技术中核酸序列和氨基酸序列的所有登录号和登录码均是来自ISR、CA、USA的BioCyc数据库的登录号和登录码，2011年12月1日在线可获得形式。
在一个进一步优选的实施方案中，细胞衍生自过量产生甲硫氨酸的大肠杆菌生产菌株MG1655 ΔmetJ metA*11 Ptrc-metH Ptrc-metFPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykF ΔpykA Ptrc09-gcvTHP ΔpurUPtrc36-ARNmst17-metF，包含生产质粒pME101-thrA*1-cysE-Pgap-metA*11和pCC1BAC-serB-glyA-serA-serC(WO2009/043803)。
在一个进一步优选的实施方案中，细胞衍生自过量生产甲硫氨酸的大肠杆菌生产菌株MG1655 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP，包含生产质粒pME101-thrA*1-cysE-Pgap-metA*11。这个菌株可以通过若干P1转导和处理(curing)而克隆，如在发明申请WO2009/043803中描述。所述菌株基于野生型菌株大肠杆菌K12MG1655。在这个菌株的基因组中导入如下修饰：缺失L-甲硫氨酸生物合成阻抑物的基因metJ；在编码钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶的metH基因上游插入强trc启动子；在编码5,10-亚甲基四氢叶酸脱氢酶的metF基因上游插入强trc启动子；在cysPUWAM操纵子、编码硫酸/硫代硫酸-摄取转运子的cysPUWA及编码半胱氨酸合酶B的cysM的上游插入强trc启动子；在cysJIH操纵子、编码亚硫酸还原酶的cysJI及编码3'-磷酸-腺嘌呤基-硫酸还原酶的cysH上游插入强trc启动子；在gcvTHP操纵子、编码甘氨酸裂解系统的三种成分的gcvT、gcvH和gcv P的上游插入强trc09启动子。
大肠杆菌生产质粒pME101-thrA*1-cysE-Pgap-metA*11的克隆在发明申请WO2007/077041和WO2009/043803中描述。这是基于载体pCL1920的低拷贝质粒(Lerner,C.G.and Inouye,M.,Nucl.Acids Res.(1990)18:4631[PMID：2201955])。空白质粒pME101携带编码lac阻抑物的强表达的等位基因的lacIq基因。将thrA*1基因克隆在可以由Lac阻抑物抑制的强trc启动子下游。其编码大肠杆菌ThrA天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的反馈抗性变体。将cysE基因包括其天然启动子以相同方向定位于其下游。其编码大肠杆菌丝氨酸乙酰转移酶。在cysE下游之后是强大肠杆菌gapA启动子，其控制metA*11基因的表达。metA*11编码大肠杆菌高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的反馈抗性变体。
可以提及的其它分泌和产生L-甲硫氨酸的微生物实例是如下菌株：大肠杆菌TF4076BJF metA#10+metYX(Lm)(WO2008/127240)；大肠杆菌W3110ΔJ/pKP451(EP 1445310B1，第7页，实施例4)；大肠杆菌WΔthrBCΔmetJmetK32pMWPthrmetA4Δ5Δ9(Yoshihiro Usuda and OsamuKurahashi,2005,Applied and Environmental Microbiology,Vol.71,No.6,p.3228-3234)；和W3110/pHC34(WO01/27307，地13页，实施例3)。各种合适微生物的进一步实例在Gomes et al.(Enzyme and Microbial Technology 37,2005,3-18)中描述。
现有技术还描述了过量产生色氨酸的菌株以及由此可以实现这种氨基酸过量生产的措施和修饰，例如大肠杆菌JP4735/pMU3028(US5,756,345)、大肠杆菌JP6015/pMU91(US5,756,345)、大肠杆菌SV164(pGH5)(WO94/08031)、大肠杆菌AGX17(pGX44)(NRRL B-12263)(US4,371,614)、大肠杆菌AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)(US4,371,614)、大肠杆菌AGX17/pGX50,pACKG4-pps(WO97/08333)、大肠杆菌ATCC 31743(CA1182409)、大肠杆菌C534/pD2310,pDM136(ATCC 39795)(WO87/01130)、大肠杆菌JB102/p5LRPS2(US5,939,295)。
在一个优选的实施方案中，过量产生L-色氨酸的肠杆菌家族菌株具有选自如下一组的一或多个遗传表型特征，包括5-甲基-DL-色氨酸抗性，5-氟色氨酸抗性，4-甲基-DL-色氨酸抗性，6-甲基-DL-色氨酸抗性，4-氟色氨酸抗性，6-氟色氨酸抗性，邻氨基苯甲酸抗性，吲唑氨丙酸(tryptazan)抗性，吲哚抗性，吲哚丙烯酸抗性，需要苯丙氨酸，需要酪氨酸，任选利用蔗糖的能力，增强色氨酸操纵子，优选邻氨基苯甲酸合酶，优选反馈抗性形式，部分缺陷的色氨酸-tRNA合酶，弱化的色氨酸摄取，缺陷的色氨酸酶，失活的阻抑物蛋白，增强丝氨酸生物合成，增强磷酸烯醇丙酮酸合成，增强D-赤藓糖-4-磷酸合成，增强3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸(DHAP)合成，及增强分支酸生物合成。
除了导致ppGppase活性降低的至少一个遗传学修饰之外，本发明的细胞可具有对起始菌株的进一步的修饰，导致感兴趣的氨基酸的生产增加，特别是通过改变基因表达而进行。在一个优选的实施方案中，如本文所用，细胞根据其野生型被遗传学修饰，由此相对于其野生型其“表达降低程度的或过表达至少一种核酸序列或其变体”，意味着所述遗传学修饰的细胞较未遗传学修饰的细胞在相似条件下(如温度、营养素提供和细胞密度)产生较低或较高量的所述核酸序列的转录和/或翻译产物。
核酸的表达可以例如通过增加相应多核苷酸的拷贝数而增加，通过染色体或染色体外增加至少一个拷贝。增加拷贝数的广泛应用的方法包括将相关多核苷酸插入载体、优选质粒中，其通过细菌复制。举例的适于肠杆菌科细菌的质粒载体是pACYC184-衍生的克隆载体(Bartolomé et al.；Gene102：75-78(1991))、pTrc99A(Amann et al.；Gene 69：301-315,1988)或者pSC101衍生物(Vocke and Bastia；Proc.Natl.Acad.Sci.80(21)：6557-6561,1983)。衍生自pCL1920的质粒(Lerner,C.G.and Inouye,M.,Nucl.Acids Res.,1990,18:4631[PMID：2201955])也是特别适合的。衍生自“细菌人工染色体(BACs)”的质粒载体例如pCC1BAC(EPICENTRE Biotechnologies,Madison,U.S.A.)同样适于在大肠杆菌中增加相关多核苷酸的拷贝数。
可进一步应用的载体是转座子、插入元件(IS元件)或者噬菌体。这些类型遗传系统在例如专利US 4,822,738、US 5,804,414和US 5,804414中说明。相似地，可以使用在WO 92/02627中描述的IS元件ISaBl或者质粒pXZ10142的Tn 45转座子(参见“Handbook of Corynebacterium glutamicum”(editors：L.Eggeling and M.Bott))。
增加表达的另一常用方法是染色体基因扩增方法。这个方法包括将感兴趣的多核苷酸的至少一个另外的拷贝插入细胞染色体中。这种类型的扩增方法在WO 03/014330或WO 03/040373中描述。
增加表达的另一方法包括将相关基因或等位基因与启动子功能性连接(可操纵地连接)。适于大肠杆菌的启动子是例如Amann et al.(Gene 69(2),301-315,1988)和Amann and Brosius(Gene 40(2-3),183-190,1985)所述启动子，T3、T7、SP6、M13、lac、tac和trc。这种类型启动子可以插入例如所述基因上游，典型与起始密码子距离大约1-500个核苷酸碱基。US 5,939,307报道了将表达盒或启动子如tac启动子、trp启动子、lpp启动子或者λ噬菌体的PL启动子和PR启动子掺入例如染色体苏氨酸操纵子上游，实现表达增加。可以相似方式使用T7-树军体启动子、gear-box启动子、nar启动子或者基因rrsG、rnpB、csrA、csrB、ompA、fusA、pepQ、rplX和rpsG的启动子。也可以使用这些类型的表达盒或启动子以过表达质粒结合的基因，如在EP 0 593 792中描述。通过使用lacIQ等位基因，可以相应控制基因的表达(Glascock and Weickert,Gene 223,221-231,1998)。本领域技术人员可通过一或多个核苷酸取代、插入和/或缺失修饰其序列而进一步增加所述启动子的活性。
核酸或其变体的表达程度可以通过合适的培养管理、基因表达的信号结构的遗传学修饰(突变)或者通过反义-RNA技术而降低。基因表达的信号结构是例如阻抑物基因、激活物基因、操纵子、启动子、弱化子、核糖体结合位点、起始密码子和终止子。本领域技术人员在如下文献中发现关于这些的信息，例如Jensen and Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58：191-195,1998)，Carrier and Keasling(Biotechnology Progress 15：58-64,1999)，Franch and Gerdes(Current Opinion in Microbiology 3：159-164,2000)，Kawano et al.(Nucleic Acids Research 33(19),6268-6276,2005)及在已知的遗传和分子生物学教科书如Knippers(“Molekulare Genetik”[MolecularGenetics],6th edition,Georg Thieme Verlag,Stuttgart,Germany,1995)或者Winnacker(“Gene und Klone”[Genes and Clones],VCH Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany,1990)。在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语基因的“敲除”是指为其表达需要的基因或细胞机构或者需要的核酸或其一部分如启动子已经遗传学修饰，例如通过突变、缺失或者插入修饰，由此表达被降低优选50、75、80、85、90、95或99％。可以例如将基因的表达置于启动子控制下，导致与起始菌株相比在用于所述方法的微生物中表达降低。表达可通过缺失用于所述方法中的微生物中的基因或其一部分而进一步降低。也可以使用转换、颠换或插入，导致错义突变或无义突变。表达可通过使用核糖体结合位点而进一步降低，其使得用于所述方法中的微生物中与起始菌株相比翻译降低。本领域技术人员可通过恶化用于所述方法的微生物的密码子使用而进一步降低基因的表达。最后基因表达可通过合适的t-RNA阻抑物抑制基因编码区中终止子-密码子突变而降低。
本发明的细胞或本发明使用的细胞与应用的起始菌株以亲代菌株相比呈现出在发酵方法中增加的希望的氨基酸的分泌或产生，氨基酸释放进周围培养基或在细胞内部积聚。
本发明的细胞或使用所述细胞的发酵方法的性能在一或多个参数方面基于起始菌株或亲代菌株或是使用所述起始菌株或亲代菌株的发酵方法改良至少0.5％、至少1％、至少1.5％或至少2％，所述参数选自产物浓度(产物/体积)、产物产量(每个消耗的碳源形成的产物)及产物形成(每个体积和时间形成的产物)或者其它参数或参数组合。
所述细胞可以在本发明的方法中连续培养，例如在PCT/EP2004/008882中所述，或者分批不连续培养(分批培养)或者补料分批培养或者重复补料分批培养，以产生L-氨基酸。已知的培养方法的一般概述可见于教科书Chmiel(Bioprozesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik[BioprocessTechnology 1.Introduction to Bioprocess Technology](Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991))或者教科书Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[Bioreactors and Peripheral Equipment](Vieweg Verlag,Brunswick/Wiesbaden,1994))。
使用的培养基或发酵培养基必须合适地满足特定菌株的需求。培养不同微生物的培养基的描述在美国细菌学会手册“Manual of Methods forGeneral Bacteriology”中提供(Washington D.C.,USA,1981)。术语培养基、发酵培养基和培养基在本文可互换使用。
应用的碳源可以是糖和碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，衍生自糖用甜菜或甘蔗生产的含有蔗糖的溶液，淀粉，淀粉水解产物和纤维素，油和脂肪例如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸、醇如甘油、甲醇和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可以单独使用或者作为混合物使用。
应用的氮源可以是有机含氮的化合物，如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素，或者无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵、氨水和硫代硫酸铵。氮源可以单独使用或者作为混合物使用。
应用的磷源可以是磷酸、磷酸二氢钾或者磷酸氢二钾，或者相应含钠的盐。
应用的硫源可以是二硫代硫酸的盐(硫代硫酸盐)，单独或者与其它硫源如硫酸盐、亚硫酸盐、硫化物、硫化氢、甲基硫醇盐或连二亚硫酸盐一起应用，也见EP application 11151526.8所述。
所述培养基必须进一步含有盐，例如金属氯化物形式，如钠、钾、镁钙和铁，例如硫酸镁或硫酸铁，其是生长必需的。最后，除了上述物质之外可以使用生长物质如氨基酸如高丝氨酸和维生素如维生素B12、维生素B1、生物素或泛酸。
除此之外，在培养基中可以加入特定氨基酸的合适前体。
提及的应用的物质可以以一次性混合物(once-only mixture)形式或者以合适方式补料加入培养基中。
以合适方式应用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水或者酸性化合物如磷酸或硫酸，以控制培养物的pH。通常地，将pH调节为6.0-9.0，优选6.5-8。可以使用抗泡沫剂，如脂肪酸聚乙二醇酯，以控制泡沫形成。选择性作用的合适物质如抗生素可以加入培养基中，以维持质粒的稳定性。为了维持需氧条件，在培养物中通入氧气或含氧气体混合物如空气。也可以使用富集过氧化氢的液体。在适当情况中，在正压下进行发酵，例如在0.03-0.2MPa压力下进行。培养温度通常为20℃-45℃，优选25℃-40℃。在分批培养方法中，连续培养直至已经产生最大量的希望的氨基酸。这个目的通常在10-160个小时内实现。在连续培养方法中，较长的培养时间是可能的。
合适的发酵培养基在例如US 6,221,636、US 5,840,551、US 5,770,409、US 5,605,818、US 5,275,940和US 4,224,409中描述。
然后对以这种方式制备的发酵肉汤进行进一步加工为固体或液体产物。
在一个优选的实施方案中，如本文所用，“发酵肉汤”应理解为这样的发酵培养基，其中微生物已经在一定温度培养一定时间。所述发酵培养基或者在发酵期间应用的培养基含有为微生物增殖和希望的氨基酸形成需要的所有物质或成分。
在发酵完结时，所得的发酵肉汤因此含有a)由于所述微生物的细胞增殖产生的微生物的生物量，b)在发酵期间形成的希望的氨基酸，c)在发酵期间形成的副产物，及d)应用的发酵培养基或应用的物质的组成成分，例如维生素如生物素、氨基酸如高丝氨酸或者盐如硫酸镁，这种组成成分不被发酵消耗。
所述副产物包括除了L-氨基酸之外在发酵中应用的微生物产生的物质，其可以是分泌的。其包括L-氨基酸，其量与希望的氨基酸相比低于30％、20％或10％，具有1-3个羧基基团的进一步的有机酸如乙酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸或反丁烯二酸，及糖如海藻糖。
适于工业目的的典型的发酵肉汤具有氨基酸含量为40g/kg-180g/kg或者50g/kg-150g/kg。通常地，生物素含量(干生物量)为20-50g/kg。
现有技术已经描述了从培养肉汤中或产生的发酵肉汤中纯化氨基酸的许多方法，包括离子交换层析、结晶化、提取及用活性碳处理。这样获得大量纯的L-氨基酸，含量为≥90％重量、≥95％重量、≥96％重量、≥97％重量、≥98％重量或者≥99％重量。
也可以从产生的发酵肉汤中纯化氨基酸，通过完全或几乎完全除去发酵肉汤中含有的细菌生物量，及多于或大于(>)90％、>95％、>97％、>99％，并剩余发酵肉汤的其它组成成分，即其30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％或者90％-100％，优选大于或等于(≥)50％、≥60％、≥70％、≥80％、≥90％或≥95％，或者完全(100％)。
可以应用分离方法如离心、过滤、倾析、絮凝或者这些方法的组合，以除去或分离出生物量。
然后使用已知方法使获得的肉汤稠厚或浓缩，例如借助于旋转蒸发器、薄层蒸发器、降膜蒸发器、通过反渗透、通过纳米过滤或者这些方法的组合。
然后将这个浓缩的肉汤通过冻干、喷雾干燥、喷雾颗粒化或者通过其它方法制作以提供优选可倾倒的精细磨碎的粉末。然后这种可倾倒的精细磨碎的粉末通过合适的压紧或颗粒化方法转变为粗粒的易于倾倒的可贮存的及无粉尘的产物。这种方法包括除去大致90％以上的水，由此产物中水含量低于10％(重量)、低于5％(重量)、低于4％(重量)或者低于3％(重量)。
可以进行确定在发酵期间一或多倍浓缩的L-氨基酸分析，通过离子交换层析、优选阳离子交换层析及随后使用茚三酮柱后衍生化而分离L-氨基酸，如Spackman et al.(Analytical Chemistry 30：1190-1206(1958))所述。也可以应用邻苯二甲醛而不是茚三酮进行柱后衍生化。关于离子交换层析的综述可见于Pickering(LC·GC(Magazine of Chromatographic Science)7(6),484-487(1989))。
同样也可以进行柱前衍生化，例如通过使用邻苯二甲醛或异硫氰酸苯酯进行，及通过反相层析(RP)、优选高效液相层析(HPLC)形式分级分离所得氨基酸衍生物。这种类型的方法在例如Lindroth et al.(AnalyticalChemistry 51：1167-1174(1979))中描述。
通过光度测定(吸光度、荧光)进行检测。
关于氨基酸分析的回顾可见于教科书“Bioanalytik”by Lottspeich andZorbas(Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg,Germany 1998)。
本发明进一步通过如下图表和非限制性实施例进一步说明，从中可以描绘本发明的进一步的特征、实施方案、方面和优势。
图1示出质粒pMAK-ligB的图，其含有ligB基因的一部分。
图2示出质粒pCC3的图。
图3示出质粒pME-RDL2a的图。
长度信息可以是近似值。使用的缩写和参考名称具有如下含义：
·aadA1：链霉素/壮观霉素抗性基因
·lacIq：trc-启动子阻抑蛋白基因
·repAts：质粒复制蛋白(ts)；也称作repA
·oriV：复制起点
·ori2：复制起点
·cam/Cm：氯霉素抗性基因
·ligB insert：ligB基因编码区的一部分
·serC：serC基因的编码区
·serA：serA基因的编码区
·glyA：glyA基因的编码区
·serB：serB基因的编码区
·thrA*1：thrA基因的编码区(反馈抗性等位基因)
·cysE：cysE基因的编码区
·PgapA：gap启动子
·metA*11：metA基因的编码区(反馈抗性等位基因)
·RDL2a：编码硫代硫酸硫转移酶的RDL2等位基因的编码区
限制酶的缩写如下文定义：
·AgeI：Ruegeria gelatinovora的限制性核酸内切酶
·HindIII：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)Rd的限制性核酸内切酶
·XbaI：Xanthomonas campestris的限制性核酸内切酶
·KpnI：肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的限制性核酸内切酶
本发明基于下文举例的实施方案得以更详细地阐明。
用于大肠杆菌的基本培养基(M9)和完全培养基(LB)由J.H.Miller(Ashort course in Bacteriol genetics(1992),Cold Spring Harbor Laboratory Press)描述。除非特别指出，从大肠杆菌中分离质粒DNA及关于限制、连接、Klenow-和碱性磷酸酶处理的所有技术均根据Sambrook et al.(Molecularcloning-A laboratory manual(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press)所述进行。除非特别指出，大肠杆菌的转化根据Chung et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.86：2172-2175,1989)所述进行。
除非特别指出，菌株和转化体生产的保温温度为37℃。
实施例1：pMAK-ligB的克隆
将质粒pMAK-ligB作为spoT等位基因转导的选择标记而克隆，并插入大肠杆菌DM1849染色体中的ligB基因中。所述ligB基因位于染色体中spoT上游大约1.2kbp处。大肠杆菌DM1849菌株具有本发明的spoT等位基因。
PCR引物ligB-up和ligB-down各自在其5’末端具有6个随机选择的核苷酸，随后分别是限制性核酸内切酶XbaI(tctaga)和KpnI(ggtacc)的识别序列。ligB-up的核苷酸13-32结合大肠杆菌MG1655基因组中的位置3817496-3817516。ligB-down的核苷酸13-32结合大肠杆菌MG1655基因组中的位置3818519-3818498。
ligB-up(SEQ ID NO:9)
5'CAGTACtctagaAGCCACGAAGGACACTAAGG 3'
ligB-down(SEQ ID NO:10)
5'TTAGTTggtaccCGGATGGACCGCAGTTAATG 3'
这两个引物和作为模板的大肠杆菌MG1655的基因组DNA用于进行PCR。PCR产物长度为1045bp，包括从MG1655基因组的位置3817496至3818519的序列(SEQ ID NO:11)。
使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)，通过XbaI和KpnI限制酶裂解并再次纯化而纯化所述PCR产物。质粒pMAK705(Hamilton CM,Aldea M,Washburn BK,Babitzke P,Kushner SR(1989)；J Bacteriol.；171(9)：4617-4622)通过XbaI和KpnI限制酶裂解，通过碱性磷酸酶去磷酸化(碱性磷酸酶，小牛肠道，New England Biolabs,Frankfurt a.M.,Germany)及使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Hilden)纯化。然后将PCR产物与pMAK705连接，并将连接混合物转化进大肠杆菌DH5α中。通过20mg/l氯霉素选择适当的质粒克隆，并通过限制性裂解鉴别，随后对插入物测序。以此方式获得的质粒称作pMAK-ligB。
实施例2：将pMAK-ligB整合进供体菌株DM1849中
大肠杆菌菌株DM1849在编码的ppGppase的spoT基因中携带三个突变：在核苷酸位置252(相应于MG1655基因组中位置3820674)下游的6个核苷酸CATGAT的插入，取代g520t(基于野生型spoT基因，相应于MG1655基因组中位置3820942)及取代c1585t(基于野生型spoT基因，相应于MG1655基因组中位置3822007)。
将DM1849菌株用质粒pMAK-ligB通过电穿孔转化。pMAK-ligB具有一个氯霉素抗性基因和一个温度敏感的复制起点。所述质粒通过大肠杆菌在30℃而非44℃复制。将转化混合物铺板于含有20mg/l氯霉素的LB琼脂上，在30℃保温40小时。然后使用接种环挑取细胞，重悬浮于LB培养基中并用LB培养基1:10,000稀释。将100μl稀释液铺板于含有20mg/l氯霉素的LB琼脂中，在44℃保温另外24小时。结果，选择其中pMAK-ligB质粒经染色体整合进ligB基因中的菌落。使用接种环将这些菌落之一在含有20mg/l氯霉素的LB琼脂上稀释，在44℃保温24小时。所得菌株称作DM1849::pMAK-ligB。
实施例3：从DM1849::pMAK-ligB中产生P1-噬菌体文库
首先，用DM1849::pMAK-ligB菌株接种10ml的LB培养基，并在44℃保温18小时。随后，将100μl培养物移至10ml的LB培养基中并在44℃培养培养至光密度(600nm)为0.5。然后加入直至终浓度为5mM的氯化钙和直至终浓度为2g/l的葡萄糖。随后加入100μl的P1-噬菌体悬浮液，将细胞在37℃保温。4小时后，离心培养物，将上清无菌过滤2次。
实施例4：用来自DM1849::pMAK-ligB的P1-噬菌体文库转导甲硫氨酸生 产菌大肠杆菌ECM1以转移DM1849的三个突变
L-甲硫氨酸-生产菌大肠杆菌菌株ECM1在metH、metF、cysP和cysJ各自基因上游携带反馈抗性metA等位基因、metJ基因的缺失和强trc启动子的一个拷贝。其基于野生型K12菌株MG1655。
将受体菌株ECM1接种于10ml的LB培养基，并在37℃保温18小时。随后通过离心取出2ml培养物，将细胞沉淀重悬浮于1ml的含有10mMMgSO4和5mM CaCl2的LB培养基中。在300μl细胞悬浮液中加入100μl来自DM1849::pMAK-ligB的P1-噬菌体文库，将混合物在37℃保温30分钟。随后加入200μl的1M柠檬酸三钠，短暂涡旋。然后加入1ml的LB培养基，使细胞在44℃生长1小时。随后，将细胞用含有100mM柠檬酸三钠的1ml的LB培养基洗涤2次，最后重悬浮于含有100mM柠檬酸三钠的100μl的LB培养基中。将其划线在含有20mg/l氯霉素的LB琼脂上，在44℃保温48小时。将10个菌落薄层铺板于含有20mg/l氯霉素的LB琼脂上，在44℃再次保温48小时。在这些克隆中，基因组片段已经被转导，其包含具有整合的pMAK-ligB质粒的ligB区。随后对spoT基因的相关部分进行DNA测序，鉴别5个克隆，其中来自DM1849的spoT等位基因已经被共转导。
从染色体中切下pMAK-ligB质粒并处理(curing)，如Hamilton et al.(CMHamilton,Aldea M,Washburn BK,Babitzke P,Kushner SR(1989)；JBacteriol.；171(9)：4617-4622)所述进行。以此方式获得的无质粒克隆之一称作ECM1_spoT1849。
菌株ECM1和ECM1_spoT1849在2011年8月3日根据布达佩斯条约保藏在DSMZ(德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstraβe 7B,38124Brunswick,Germany))，DSM编号为DSM 25066(＝ECM1)和DSM 25067(＝EMC1_spoT1849)。
实施例5：将serC基因克隆进质粒pUC18中
将大肠杆菌MG1655 serC基因借助于聚合酶链反应(PCR)扩增，随后克隆进pUC18质粒中(Fermentas GmbH,St.Leon-Rot,Germany)。
PCR引物serCF(XbaI)和serCR(HindIII)各自在其5’末端具有随机选择的核苷酸，随后是限制性核酸内切酶XbaI(TCTAGA)和HindIII(AAGCTT)的识别序列。serCF(XbaI)的核苷酸13-38结合大肠杆菌MG1655基因组中位置956619-956644。serCR(HindIII)的核苷酸13-37结合大肠杆菌MG1655基因组中位置958028-958004。
serCF(XbaI)(SEQ ID NO:12)
5'AGGTGCTCTAGAGTCCGCGCTGTGCAAATCCAGAATGG 3'
serCR(HindIII)(SEQ ID NO:13)
5'TACACCAAGCTTAACTCTCTACAACAGAAATAAAAAC 3'
所述serC基因通过聚合酶链反应(PCR)扩增，使用serCF(XbaI)和serCR(HindIII)引物及Phusion DNA聚合酶(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)。大肠杆菌MG1655的基因组DNA作为模板。所得DNA片段大小为1434bp。将其通过XbaI和HindIII限制性核酸内切酶裂解，并借助于QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)纯化。非甲基化的pUC18质粒DNA通过XbaI和HindIII限制性核酸内切酶裂解，并借助于QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)纯化。然后将裂解的质粒与PCR产物连接，并转化进大肠杆菌DH5α中。含有serC基因的质粒克隆通过限制性裂解和DNA测序而鉴别。所得质粒称作pUC18-serC。
实施例6：将serA基因克隆进质粒pUC18-serC中
大肠杆菌MG1655serA基因借助于聚合酶链反应(PCR)扩增，随后克隆进pUC18-serC质粒中。
PCR引物serAF(XbaI)在其5’末端具有6个随机选择的核苷酸，随后是限制性核酸内切酶XbaI(TCTAGA)的识别序列。核苷酸12-33结合大肠杆菌MG1655基因组中位置3055199-3055220。PCR引物serAR(SHSSNB)在其5’末端具有6个随机选择的核苷酸，随后是限制性核酸内切酶SacI、HindIII、SphI、SmaI、NotI和BglII的识别序列。核苷酸49-58结合大肠杆菌MG1655基因组中的位置3056880-3056861。
serAF(XbaI)(SEQ ID NO:14)
5'CTGTAGTCTAGATTAGTACAGCAGACGGGCGCG 3'
serAR(SHSSNB)(SEQ ID NO:15)
5'CAAGAGCTCAAGCTTGCATGCGATTCCCGGGCGGCCGCAATAAGATCTCCGTCAGGGCGTGGTGACCG 3'
所述serA基因通过聚合酶链反应(PCR)扩增，使用serAF(XbaI)和serAR(SHSSNB)引物和Phusion DNA聚合酶(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)。大肠杆菌MG1655的基因组DNA作为模板。所得DNA片段的大小为1731bp。
将其通过XbaI和SacI限制性核酸内切酶裂解，并借助于QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)纯化。将pUC18-serC质粒同样通过XbaI和SacI限制性核酸内切酶裂解，并借助于QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)纯化。然后将裂解的质粒与PCR产物连接，并转化进大肠杆菌DH5α中。含有serA基因的质粒克隆通过限制性裂解和DNA测序鉴别。所得质粒称作pUC18-serAC。
实施例7：将serB基因克隆进质粒pUC18-serAC中
大肠杆菌MG1655serB基因借助于聚合酶链反应(PCR)扩增，随后克隆进pUC18-serAC质粒中。
PCR引物serB(SphI)在其5’末端具有6个随机选择的核苷酸，随后是限制性核酸内切酶SphI(GCATGC)的识别序列。核苷酸13-34结合大肠杆菌MG1655基因组中的位置4622816-4622837。
PCR引物serB(SmaI)在其5’末端具有6个随机选择的核苷酸，随后是限制性核酸内切酶SalI(GTCGAC)和SmaI(CCCGGG)的识别序列。核苷酸54-75结合大肠杆菌MG1655基因组中位置4623887-4623866。
serB(SphI)(SEQ ID NO:16)
5'CCATGCGCATGCCCACCCTTTGAAAATTTGAGAC 3'
serB(SmaI)(SEQ ID NO:17)
5'CCGCATGTCGACATCCCGGGGCAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGTGTGATTACTTCTGATTCAGGCTGCC 3'
serB基因通过聚合酶链反应(PCR)扩增，使用serB(SphI)和serB(SmaI)引物和Phusion DNA聚合酶(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)。大肠杆菌MG1655的基因组DNA作为模板。所得DNA片段的大小为1137bp。
将其通过SphI和SmaI限制性核酸内切酶裂解，并借助于QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)纯化。pUC18-serAC质粒同样通过SphI和SmaI限制性核酸内切酶裂解，通过碱性磷酸酶去磷酸化，并借助于QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)纯化。然后将裂解的质粒与PCR产物连接并转化进大肠杆菌DH5α中。含有serB基因的质粒克隆通过限制性裂解和DNA测序而鉴别。所得质粒称作pUC18-serBAC。
实施例8：将glyA基因克隆进质粒pUC18-serBAC中
大肠杆菌MG1655glyA基因借助于聚合酶链反应(PCR)扩增，随后克隆进pUC18-serBAC质粒中。
PCR引物glyA-downstream在其5’末端具有6个随机选择的核苷酸，随后是限制性核酸内切酶BglII(AGATCT)的识别序列。核苷酸13-35结合大肠杆菌MG1655基因组中位置2682063-2682085。
PCR引物glyA-upstream在其5’末端具有随机选择的核苷酸，随后是限制性核酸内切酶NotI(GCGGCCGC)的识别序列。核苷酸15-33结合大肠杆菌MG1655基因组中位置2683762-2683744。
glyA-downstream(SEQ ID NO:18)
5'ATCTAAAGATCTGTTACGACAGATTTGATGGCGCG 3'
glyA-upstream(SEQ ID NO:19)
5'TTCATCGCGGCCGCGAAAGAATGTGATGAAGTG 3'
glyA基因通过聚合酶链反应(PCR)扩增，使用glyA-downstream和glyA-upstream引物及Phusion DNA聚合酶(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)。大肠杆菌MG1655的基因组DNA作为模板。所得DNA片段大小为1726bp。
将其通过BglII和NotI限制性核酸内切酶裂解，并借助于QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)纯化。pUC18-serBAC质粒同样通过BglII和NotI限制性核酸内切酶裂解，并借助于QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)纯化。然后将裂解的质粒与PCR产物连接，并转化进大肠杆菌DH5α中。含有glyA基因的质粒克隆通过限制性裂解和DNA测序而鉴别。所得质粒称作pUC18-serB-glyA-serAC。
实施例9：将来自pUC18-serB-glyA-serAC的基因serB-glyA-serAC克隆进 pCC1-BAC
将pUC18-serB-glyA-serAC质粒通过HindIII限制性核酸内切酶裂解，并通过琼脂糖凝胶电泳分级分离DNA片段。从凝胶中分离含有serB、glyA、serA和serC的5.9kb DNA片段。将该片段与得自Epicentre/Madison,USA的预先已经通过HindIII裂解的质粒pCC1BAC Cloning-Ready载体(Hind III)连接，并转化进大肠杆菌EPI300中。含有serB、glyA、serA和serC的DNA片段的质粒克隆通过限制性裂解和DNA测序而鉴别。所得生产质粒称作pCC3。
实施例10：生产质粒pME-RDL2a的克隆
如EP申请11151526.8所述进行pME-RDL2a生产质粒的克隆。其包括大肠杆菌cysE基因、大肠杆菌thrA和metA基因的反馈抗性等位基因及编码酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)硫代硫酸硫转移酶RDL2p的RDL2a基因。此外，其包括链霉素抗性基因。
实施例11：使用生产质粒转化菌株ECM1和ECM1spoT1849
将菌株ECM1和ECM1_spoT1849用实施例9的生产载体pCC3转化，使用20mg/l氯霉素选择转化体。然后将细胞用实施例10的质粒pME-RDL2a转化，所得转化体使用20mg/l氯霉素+100mg/l链霉素选择。所得菌株称作ECM1/pCC3/pME-RDL2a和ECM1_spoT1849/pCC3/pME-RDL2a。
实施例12：在摇瓶实验中的性能测定
在100ml锥形瓶中通过生产测试评估大肠杆菌L-甲硫氨酸生产菌株的性能。在每种情况的预培养中，将接种了100μl细胞培养物的10ml预培养培养基(含有2.5g/l葡萄糖的10％LB和90％PC1基本培养基)在37℃生长10小时。然后在每种情况中将这些培养物用于接种10ml的PC1基本培养基(表1)至OD 600nm为0.2(Eppendorf Bio-Photometer；Eppendorf AG,Hamburg,Germany)，并使培养物在37℃生长24小时。细胞外L-甲硫氨酸浓度使用氨基酸分析仪(Sykam GmbH,Eresing,Germany)通过离子交换层析和茚三酮柱后衍生化确定。细胞外葡萄糖浓度使用YSI 2700 Select葡萄糖分析仪(YSI Life Sciences,Yellow Springs,Ohio,USA)确定。结果示于表2。在24小时后，在这两个培养中葡萄糖均已经完全用光。ECM1_spoT1849/pCC3/pME-RDL2a的培养上清中甲硫氨酸浓度为1.56g/l，明显高于对比菌株(1.01g/l)。通过导入突变Gly174、Leu529及在Asp84与Met85之间的插入而对编码ppGppase的基因进行的修饰使得甲硫氨酸产量与起始菌株相比增加10.1％(甲硫氨酸克数/每克葡萄糖)-15.6％。
表1：基本培养基PC1
物质 浓度
ZnSO4*7H2O 4mg/l
CuCl2*2H2O 2mg/l
MnSO4*H2O 20mg/l
H3BO3 1mg/l
Na2MoO4*2H2O 0.4mg/l
MgSO4*7H2O 1g/l
柠檬酸*1H2O 6.56g/l
CaCl2*2H2O 40mg/l
K2HPO4 8.02g/l
Na2HPO4 2g/l
(NH4)2HPO4 8g/l
NH4Cl 0.13g/l
(NH4)2SO3 5.6g/l
MOPS 5g/l
NaOH 10M 调节为pH 6.8
FeSO4*7H2O 40mg/l
盐酸硫胺素 10mg/l
维生素B12 10mg/l
葡萄糖 10g/l
异丙基-硫代-β-半乳糖苷(IPTG) 2.4mg/l
壮观霉素 50mg/l
氯霉素 20mg/l
表2：大肠杆菌菌株ECM1/pCC3/pME-RDL2a和ECM1_spoT1849/pCC3/pME-RDL2a的发酵肉汤中L-甲硫氨酸浓度
菌株 OD(600nm) L-甲硫氨酸(g/l)
ECM1/pCC3/pME-RDL2a 6.36 1.01
ECM1_spoT1849/pCC3/pME-RDL2a 7.46 1.56
在前文和权利要求书中描述的本发明的特征可以为实施本发明各个实施方案中单独或以任意组合所需。
PCT

Claims (19)

1.细胞，所述细胞相对于其野生型经遗传学修饰，由此相对于其野生型其具有降低的ppGppase活性，并且优选地过量产生必需氨基酸，更优选衍生自丝氨酸的必需氨基酸，最优选甲硫氨酸或色氨酸。
2.权利要求1的细胞，其中所述细胞具有与野生型相比基本无变化的(p)ppGpp-合成酶活性。
3.权利要求1或2的细胞，其中所述细胞相对于其野生型经遗传学修饰，由此相对于其野生型其具有至少一种ppGppase的降低的活性，所述ppGppase选自包含氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6及其变体的一组，优选SEQ ID NO:2或其变体。
4.权利要求3的细胞，其中选自包含氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:6及其变体的组、优选SEQ ID NO:2或者其变体的至少一种ppGppase的活性由于所述ppGppase具有至少一个如下修饰而降低：
a)Gly174或与其同源的氨基酸已经由不同的氨基酸取代，优选非保守取代，
b)Leu529或与其同源的氨基酸已经由不同的氨基酸取代，优选非保守取代，
c)在Asp84与Met85或者其同源氨基酸之间存在至少一个氨基酸的插入，优选至少两个氨基酸的插入，优选His和Asn的插入，
优选所有这三种突变均存在。
5.权利要求4的细胞，其中ppGppase另外具有选自如下一组的至少一个修饰，所述的组包括在氨基酸Gln9、Thr13、Tyr63、Arg109、Gln225、Cys245、Val248、Asn268、Ser270、Met280、His344、Pro436、Asn501、Gln505、His543、Ala546、Ser547、Ile548、His555、Gly556、His557、Pro559、Lys619、Thr621、Ala622、Thr627、Thr651、Ala669、Ala675、Thr698或其各自同源氨基酸处的取代、优选非保守取代，以及在Glu343与His344或其各自同源氨基酸之间的插入。
6.权利要求4和5任一项的细胞，其中ppGppase具有选自如下一组的至少一个修饰，所述的组包括如下取代或者对与被取代氨基酸同源的氨基酸进行的相同氨基酸取代：
1)由选自Leu、Ile和Val、优选Leu的氨基酸取代Gln9，
2)由选自Lys、Arg、His、Gln和Asn、优选Arg或Asn的氨基酸取代Thr13，
3)由选自Lys、Arg和His、优选His的氨基酸取代Tyr63，
4)由选自Gln和Asn、优选Gln的氨基酸取代Arg109，
5)由选自Ser、Ala和Thr、优选Thr的氨基酸取代Gln225，
6)由选自Leu、Ile和Val、优选Leu的氨基酸取代Cys245，
7)用选自Lys、Arg和His、优选His的氨基酸取代Val248，
8)用选自Lys、Arg和His、优选L-His或Lys的氨基酸取代Asn268，
9)用选自Ala、Leu、Ile和Val、优选Ala或Val的氨基酸取代Ser270，
10)用选自Ser、Thr和Ala、优选Ala的氨基酸取代Met280，
11)在氨基酸Glu343与His344之间插入氨基酸Lys和Glu，
12)用选自Gln和Asn、优选Gln的氨基酸取代His344，
13)用选自Ser、Ala和Thr、优选Ser的氨基酸取代Pro436，
14)用选自Ser、Ala和Thr、优选L-丙氨酸的氨基酸取代Asn501，
15)用选自Pro、Ser、Ala和Thr、优选Pro或Ala的氨基酸取代Gln505，
16)用选自Asn和Gln、优选Gln的氨基酸取代His543，
17)用选自Asn和Gln、优选Gln的氨基酸取代Ala546，
18)用选自Ala、Leu、Ile和Val、优选Ala或Val的氨基酸取代Ser547，
19)用选自Asn和Gln、优选Asn的氨基酸取代Ile548，
20)用选自Leu、Ile和Val、优选Val的氨基酸取代His555，
21)用Lys、Arg和His、优选Arg取代在位置556的甘氨酸，
22)用选自Asn和Gln、优选Gln的氨基酸取代His557，
23)用选自Ser、Ala和Thr、优选Ala的氨基酸取代Pro559，
24)用选自Asn和Gln、优选Gln的氨基酸取代Lys619，
25)用选自Leu、Ile和Val、优选Ile的氨基酸取代Thr621，
26)用选自Glu和Asp、优选Asp的氨基酸取代Ala622，
27)用选自Ala和Gly、优选Ala的氨基酸取代Thr627，
28)用选自Glu和Asp、优选Glu的氨基酸取代Thr651，
29)用Thr取代Ala669和/或Ala675，
30)用选自Gln和Asn、优选Asn的氨基酸取代Thr698。
7.权利要求1-6任一项的细胞，其中所述细胞相对于其野生型经遗传学修饰，由此相对于其野生型其过表达编码如下任何酶、其成分或者所述酶或其成分的变体的至少一种核酸序列或其变体：
1)硫代硫酸/硫酸转运系统CysPUWA(EC 3.6.3.25)，
2)3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸还原酶CysH(EC 1.8.4.8)，
3)亚硫酸还原酶CysJI(EC 1.8.1.2)，
4)半胱氨酸合酶A CysK(EC 2.5.1.47)，
5)半胱氨酸合酶B CysM(EC 2.5.1.47)，
6)丝氨酸乙酰转移酶CysE(EC 2.3.1.30)，
7)甘氨酸裂解系统GcvTHP-Lpd(EC 2.1.2.10，EC 1.4.4.2，EC 1.8.1.4)，
8)硫辛酰合酶LipA(EC 2.8.1.8)，
9)硫辛酰-蛋白质连接酶LipB(EC 2.3.1.181)，
10)磷酸甘油酸脱氢酶SerA(EC 1.1.1.95)，
11)3-磷酸丝氨酸磷酸酶SerB(EC 3.1.3.3)，
12)3-磷酸丝氨酸/磷酸羟基苏氨酸转氨酶SerC(EC 2.6.1.52)，
13)丝氨酸羟基甲基转移酶GlyA(EC 2.1.2.1)，
14)天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶I ThrA(EC 2.7.2.4,EC 1.1.1.3)，
15)天冬氨酸激酶LysC(EC 2.7.2.4)，
16)高丝氨酸脱氢酶Hom(EC 1.1.1.3)，
17)高丝氨酸O-乙酰转移酶MetX(EC 2.3.1.31)，
18)高丝氨酸O-琥珀酰转移酶MetA(EC 2.3.1.46)，
19)胱硫醚γ-合酶MetB(EC 2.5.1.48)，
20)βC-S裂解酶AecD(EC 4.4.1.8，也称作β-裂解酶)，
21)胱硫醚β-裂解酶MetC(EC 4.4.1.8)，
22)B12-非依赖性高半胱氨酸S-甲基转移酶MetE(EC 2.1.1.14)，
23)B12-依赖性高半胱氨酸S-甲基转移酶MetH(EC 2.1.1.13)，
24)亚甲基四氢叶酸还原酶MetF(EC 1.5.1.20)，
25)来自谷氨酸棒杆菌的L-甲硫氨酸输出蛋白BrnFE，
26)来自大肠杆菌的缬氨酸输出蛋白YgaZH(b2682，b2683)，
27)来自大肠杆菌的推定的转运蛋白YjeH(b4141)，
28)吡啶核苷酸转氢酶PntAB(EC 1.6.1.2)，
29)O-琥珀酰高丝氨酸硫解酶(sulphhydrylase)MetZ(EC 2.5.1.48)，
30)磷酸烯醇丙酮酸羧基酶Pyc(EC 4.1.1.31)，
31)硫代硫酸硫转移酶RDL2p(EC 2.8.1.1)，
32)硫代硫酸-硫醇硫转移酶(EC 2.8.1.3)，
33)硫代硫酸-二硫醇硫转移酶(EC 2.8.1.5)。
8.权利要求1-7任一项的细胞，其中所述细胞相对于其野生型经遗传学修饰，由此相对于其野生型其以降低的规模表达编码如下任何酶、其成分或者所述酶或其成分的变体的至少一种核酸序列或其变体：
1)L-甲硫氨酸生物合成的转录调节物(MetJ)(b3938，ECK3930)，
2)葡萄糖-6-磷酸异构酶(Pgi，EC 5.3.1.9)(b4025，ECK4017)，
3)高丝氨酸激酶(ThrB，EC 2.7.1.39)(b0003，ECK0003)，
4)S-腺苷甲硫氨酸合酶(MetK，EC 2.5.1.6)(b2942，ECK2937)，
5)二氢甲基吡啶酸合酶(DapA，EC 4.2.1.52)(b2478，ECK2474)，
6)烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(Pck，EC 4.1.1.49)(b3403，ECK3390)，
7)甲酰四氢叶酸水解酶(PurU，EC 3.5.1.10)(b1232，ECK1227)，
8)丙酮酸激酶II(PykA，EC 2.7.1.40)(b1854，ECK1855)，
9)丙酮酸激酶I(PykF，EC 2.7.1.40)(b1676,ECK1672)，
10)L-甲硫氨酸转运蛋白的亚基(MetQNI)(b0197，ECK0197)，
11)L-甲硫氨酸转运蛋白的亚基(MetQNI)(b0198，ECK0198)，
12)L-甲硫氨酸转运蛋白的亚基(MetQNI)(b0199，ECK0199)，
13)脱氧胞苷5′-三磷酸脱氨酶(Dcd，EC 3.5.4.13)(b2065，ECK2059)，
14)推定的N-脂肪酰转移酶(YncA)，
15)调节性sRNA FnrS，
16)σ因子RpoS。
9.权利要求1-6任一项的细胞，其中所述细胞相对于其野生型经遗传学修饰，由此相对于其野生型其过表达编码如下任何酶、其成分或者所述酶或其成分的变体的至少一种核酸序列或其变体：
1)邻氨基苯甲酸合酶(trpDE，EC 4.1.3.27)，邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶(trpD，EC 2.4.2.18)，磷酸核糖基邻氨基苯甲酸异构酶(trpC，EC 5.3.1.24)，吲哚-3-磷酸甘油合酶(trpC，EC 4.1.1.48)和色氨酸合酶(trpAB，EC 4.1.2.8和4.2.1.122)，
2)磷酸甘油酸脱氢酶SerA(EC 1.1.1.95)，
3)3-磷酸丝氨酸磷酸酶SerB(EC 3.1.3.3)，
4)3-磷酸丝氨酸/磷酸羟基苏氨酸转氨酶SerC(EC 2.6.1.52)，
5)L-酪氨酸-敏感性DHAP合酶(aroF，EC 2.5.1.54)，
6)L-苯丙氨酸反馈-抗性DHAP合酶(aroG，EC 2.5.1.54)，
7)L-色氨酸-敏感性DHAP合酶(aroH，EC 2.5.1.54)，
8)磷酸烯醇丙酮酸合酶ppsA(EC 2.7.9.2)，
9)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶pck(EC 4.1.1.49)，
10)转酮醇酶A tktA(EC 2.2.1.1)，
11)转酮醇酶B tktB(EC 2.2.1.1)，
12)大肠杆菌开放读框(ORF)的基因产物yddG。
10.权利要求1-6任一项的细胞，其中所述细胞相对于其野生型经遗传学修饰，由此相对于其野生型其以降低的规模表达编码如下任何酶、其成分或者所述酶或其成分的变体的至少一种核酸序列或其变体：
1)色氨酸酶(tnaA，EC 4.1.99.1)，
2)trp操纵子的阻抑物(trpR)，
3)分支酸变位酶T或预苯酸脱氢酶(tyrA,EC 1.3.1.12)，
4)分支酸变位酶P或预苯酸脱氢酶(pheA,EC 4.2.1.51)，
5)色氨酸-特异性转运蛋白(mtr)，
6)色氨酸透性酶(tnaB)，
7)芳族氨基酸的转运蛋白(aroP)，
8)L-丝氨酸脱氨酶(sdaA，EC 4.3.1.17)，
9)葡萄糖-6-磷酸异构酶(pgi，EC 5.3.1.9)，
10)酪氨酸转氨酶(tyrB)，
11)glp调节子的阻抑物(glpR)，
12)σ因子RpoS(rpoS)。
11.权利要求1-10任一项的细胞，其中所述细胞是过量产生必需氨基酸、优选衍生自丝氨酸的必需氨基酸、最优选甲硫氨酸或色氨酸的细胞。
12.包含权利要求1-11的细胞的饲料添加剂。
13.制备过量产生必需氨基酸、优选衍生自丝氨酸的必需氨基酸、最优选甲硫氨酸或色氨酸的细胞的方法，包括制备具有编码ppGppase的基因敲除、优选相对于野生型不具有降低的(p)ppGpp-合成酶活性的细胞，其中所述ppGppase优选选自包含氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQID NO:6及其变体的一组、更优选SEQ ID NO:2，及培养所述细胞，任选纯化所述氨基酸。
14.制备衍生自丝氨酸的必需氨基酸的方法，包括如下步骤：
a)培养权利要求1-11任一项的细胞，
b)任选纯化所述氨基酸。
15.权利要求14的方法，其中使用权利要求1-11任一项的细胞，并且其是制备甲硫氨酸的方法。
16.权利要求14的方法，其中使用权利要求1-7或者10和11任一项的细胞，并且其是制备芳族氨基酸、优选色氨酸的方法。
17.权利要求13-16任一项的方法，其中将微生物分批培养、补料分批培养、重复补料分批培养或者连续培养。
18.权利要求1-12任一项的细胞/饲料添加剂或者权利要求13-17任一项的方法，其中所述细胞是来自肠杆菌属的细菌细胞。
19.权利要求1-12任一项的细胞/饲料添加剂或者权利要求13-18任一项的方法，其中所述细胞选自埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、普罗维登斯菌属(Providencia)和沙雷氏菌属(Serratia)，其中所述细胞优选是来自埃希氏菌属、更优选大肠杆菌的细胞。
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