KR20050100389A

KR20050100389A - 박테리아 및 상기 박테리아에 의한 화학적 화합물 제조방법

Info

Publication number: KR20050100389A
Application number: KR1020057014535A
Authority: KR
Inventors: 브리히테 바테; 카롤리네 레이넨; 베티나 헤드리흐; 게오르크 티르바흐
Original assignee: 데구사 악티엔게젤샤프트
Priority date: 2003-02-05
Filing date: 2004-01-29
Publication date: 2005-10-18
Also published as: WO2004069996A3; US20030219881A1; US20100159523A1; CN1748031A; EP1590463A2; WO2004069996A2; US7160711B2; US20070111291A1; BRPI0407284A

Abstract

본 발명은, 본래 부위 (유전자좌)에 존재하고 단백질 또는 RNA의 합성을 코딩하는, 하나 이상의 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자의 하나 이상의 복제본에 더해, 각 경우에서, 상기 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립 유전자의 2번째, 임의로 3번째 또는 4번째 복제본을, 각 경우에서 2번째, 임의로 3번째 또는 4번째 부위에 염색체 내에 통합된 형태로 가지는 코리네형 박테리아 및 상기 박테리아의 발효에 의한 화학적 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

박테리아 및 상기 박테리아에 의한 화학적 화합물 제조 방법 {BACTERIA AND PROCESS FOR PRODUCING CHEMICAL COMPOUNDS BY SAID BACTERIA}

화학적 화합물은, 이것은 특히, L-아미노산, 비타민, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 및 D-아미노산을 의미하는데, 인간 의약, 제약 산업, 화장품, 사료 산업 및 동물 영양학에서 사용된다.

수 많은 상기 화합물은 코리네형(coryneform) 박테리아, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(corynebacterium glutamicum)의 균주로부터 발효에 의해 제조된다. 이들의 중요성이 크기때문에, 제조 방법을 개선하기 위해 작업이 끊임없이 시행된다. 방법에 개선은 예를 들면, 교반 및 산소의 공급과 같은 발효 측정, 또는 예를 들면, 발효 동안 당의 농도와 같은 영양 배지의 조성물, 또는 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 생성물 형태에 작업, 또는 미생물 그 자체의 고유의 산출 특성에 관한 것이다.

돌연변이 유발, 선별 및 돌연변이체 선별 방법이 이들 미생물의 산출 특성을 개선하기 위해 사용된다. 항대사에 대해 저항성이거나, 조절 중요성의 대사에 대해 영양 요구성이고, 특정 화합물을 생성하는 균주가 상기 방법으로 생성된다.

재조합 DNA 기술 방법은 코리네박테리움 균주의 품종을 개량하기 위해, 개개의 생합성 유전자를 증폭하고, 생산 효과를 조사함으로써 수년간 사용되어 왔다.

통상적인 방법은 특정 미생물에서, 에피솜으로 복제되는 플라스미드에 의해서 특정 생합성 유전자의 증폭을 포함한다. 본 과정은 산업 공정이 일반적으로 수많은 세대와 연관되는 발효동안에, 플라스미드를 자연적으로 잃어버리는 불이익을 가진다 (분리 불안정성).

다른 방법은 특정 미생물에서 복제되지 않는 플라스미드에 의해 특정 생합성 유전자를 이중복제(duplicating)하는 것을 포함한다. 본 방법에서, 클론된 생합성 유전자를 포함하는 플라스미드는, 미생물의 염색체 생합성 유전자 내에 통합된다 (Reinscheid 등., Applied and Environmental Microbiology 60(1), 126-132 (1994); Jetten 등., Applied Microbiology and Biotechnology 43(1):76-82 (1995)). 본 방법의 단점은 미생물에서 선별에 필수적인 플라스미드 및 항생제 저항성 유전자의 뉴클레오티드 서열이 남아있는 것이다. 이것은 예를 들면, 생물자원의 처분 및 사용에 불리하다. 더욱이, 전문가는 이들 균주는 예컨대, 산업 발효에서 흔한 상응하는 수많은 세대에서 "캠벨 유형 교차(Campbell type cross over)"에 의한 분열의 결과로 불안정할 것이라고 예상한다.

본 발명의 목적

본 발명은 코리네형 박테리아를 이용하는 개선된 발효성의 화학적 화합물 제조를 위한 신규 방법을 제공하려는 목적을 가진다.

본 발명의 개요

본 발명은 본래 부위(유전자좌)에 존재하는 1개 복제본에 더해, 상기 화학적 화합물의 합성을 위한 단백질 또는 RNA의 합성을 코딩하는, 하나 이상의 외래전사 해독 프레임 (open reading frame; ORF), 유전자 또는 대립유전자(allele)를 하나 이상, 특히 2번째, 임의로 3번째 또는 4번째의 상기 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자의 복제본을, 1번째 또는 부가적인, 바람직하게는 2번째, 임의로 3번째 또는 4번째 부위에 염색체내에 통합된 형태로 (여기서 하나 이상의 상기 부위가 유전자내부 영역, 프로파지(prophage), 결손파지 또는 파지 성분 또는 상기 프로파지, 결손파지 또는 파지 성분을 코딩하는 DNA로 이루어진 군으로부터 선택됨) 포함하는, 화학적 화합물을 생산하는 코리네형 박테리아를 제공한다.

미생물에서 에피좀의 복제 또는 전위가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드가 없고, 항생제 저항성을 부여하는 뉴클레오티드 서열이 2번째, 임의로 3번째 또는 4번째 부위에 존재하고, 2번째, 임의로 3번째 또는 4번째 부위가 박테리아의 생장 및 목적하는 화학적 화합물의 생산에 필수적인 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자에 관련되지 않는다.

본 발명은 또한 하기 단계를 수행하는 하나 이상의 화학적 화합물의 제조 방법을 제공한다:

a) 본래 부위 (유전자좌)에 존재하고 화학적 화합물의 합성을 위한 단백질 또는 RNA를 코딩하는, 하나 이상의 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자를 추가로 포함하는 코리네형 박테리아의 발효,

b) 상기 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자로부터 하나 이상의 특히 2번째, 임의로 3번째 또는 4번째 복제본이 염색체내에 통합됨, 이에 따라

c) 하나 이상의 상기 부위가 유전자내부 영역, 프로파지, 결손파지 또는 파지 성분 또는 상기 프로파지, 결손파지 또는 파지 성분을 암호화하는 DNA로 이루어진 군으로부터 선택됨,

d) 미생물에서 복제가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드가 없고, 상기 부위에 존재하는 항생제 저항성을 부여하는 뉴클레오티드가 없음,

e) 상기 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자의 발현을 허용하는 조건하에서 과발현된, 박테리아의 발효 브로스 및/또는　세포내에서 화학적 화합물의 농도,

f) 임의로 화학적 화합물의 단리,

g) 발효 브로스 및/또는 생물자원으로부터 0 내지 100 중량% 초과까지의 성분을 가짐.

상응하는 단백질의 세포내 활성 또는 농도가 증가하면, 출발 박테리아 (모(parent) 박테리아 또는 야생형)에서 활성 또는 농도에 비해, 특히 상기 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 과발현된다. 일반적으로 상기 증가는 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500%이상으로, 최대치 1000% 또는 2000%이다.

본 발명은 또한, 바람직하게는 직렬식 배열에서 본래 부위에 존재하고, 특히 WO 03/014330에 기재된 바와 같이 화학적 화합물, 아미노산의 합성을 위한 단백질 또는 RNA를 암호화하는 ORF, 유전자 또는 대립유전자에 직접적으로 인접한, 상기 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자의 3번째 또는 4번째 복제본을 함유하는 코리네형 박테리아를 제공한다.

"직렬식 배열"은 열에서 서로 직접 인접하고 동일 방향을 가진 2개 이상의 ORF, 유전자 또는 대립유전자의 배열을 의미하는 것으로 이해된다. 다른 유형의 2개 이상의 직접 인접한 ORF, 유전자 또는 대립유전자는 반대 방향이라 언급될 수 있다.

상기 코리네형 박테리아는 유전자내부 영역, 프로파지, 결손파지 또는 파지 성분으로 이루어진 군으로부터 선택된 부위에서 복제본에 상기 "직렬식 배열"을 부가적으로 함유한다.

본 발명은 또한 기재된 상기 코리네형 박테리아의 발효 방법을 제공한다.

언급된 염기쌍 번호는 측정의 재형성의 문맥에서 수득된 대략적인 값이다.

도 1: 플라스미드 pK18mobsacBglu1_1의 지도.

사용된 약어 및 명칭은 하기 뜻을 갖는다:

KanR: 카나마이신 저항성 유전자

HindIII: 제한 효소 HindIII의 절단 부위

BamHI: 제한 효소 BamHI의 절단 부위

lysC: lysC^FBR 대립유전자, lysC T311I

'gluA: gluA 유전자의 3' 말단 조각

gluB': gluB 유전자의 5' 말단 조각

'gluB: gluB 유전자의 3' 말단 조각

gluC': gluC 유전자의 5' 말단 조각

sacB: sacB 유전자

RP4mob: 수송체 (oriT)의 복제 개시점을 가진 mob 영역

oriV: 복제 개시점 V

도 2: 플라스미드 pK18mobsacBaecD1_1의 지도.

사용된 약어 및 명칭은 하기 뜻을 갖는다:

KanR: 카나마이신 저항성 유전자

SalI: 제한 효소 SalI의 절단 부위

lysC: lysC^FBR 대립유전자, lysC T311I

aecD': aecD 유전자의 5' 말단 조각

'aecD: aecD 유전자의 3' 말단 조각

sacB: sacB 유전자

RP4mob: 수송체 (oriT)의 복제 개시점을 가진 mob 영역

oriV: 복제 개시점 V

도 3: 플라스미드 pK18mobsacBpck1_1의 지도.

사용된 약어 및 명칭은 하기 뜻을 갖는다:

KanR: 카나마이신 저항성 유전자

BamHI: 제한 효소 BamHI의 절단 부위

lysC: lysC^FBR 대립유전자, lysC T311I

pck': pck 유전자의 5' 말단 조각

'pck: pck 유전자의 3' 말단 조각

sacB: sacB 유전자

RP4mob: 수송체 (oriT)의 복제 개시점을 가진 mob 영역

oriV: 복제 개시점 V

도 4: 플라스미드 pK18mobsacBgluB2_1의 지도.

사용된 약어 및 명칭은 하기 뜻을 갖는다:

KanR: 카나마이신 저항성 유전자

SalI: 제한 효소 SalI의 절단 부위

EcoRI: 제한 효소 EcoRI의 절단 부위

BamHI: 제한 효소 BamHI의 절단 부위

ddh: ddh 유전자

gluA: gluA 유전자

gluB': gluB 유전자의 5' 말단 조각

'gluB: gluB 유전자의 3' 말단 조각

gluC: gluC 유전자

gluD': gluD 유전자의 5' 말단 조각

sacB: sacB 유전자

RP4mob: 수송체 (oriT)의 복제 개시점을 가진 mob 영역

oriV: 복제 개시점 V

도 5: 플라스미드 pK18mobsacBaecD2_1의 지도.

사용된 약어 및 명칭은 하기 뜻을 갖는다:

KanR: 카나마이신 저항성 유전자

EcoRI: 제한 효소 EcoRI의 절단 부위

SalI: 제한 효소 SalI의 절단 부위

dapA: dapA 유전자

aecD': aecD 유전자의 5' 말단 조각

'aecD: aecD 유전자의 3' 말단 조각

sacB: sacB 유전자

RP4mob: 수송체 (oriT)의 복제 개시점을 가진 mob 영역

oriV: 복제 개시점 V

도 6: 플라스미드 pK18mobsacBpck1_3의 지도.

사용된 약어 및 명칭은 하기 뜻을 갖는다:

KanR: 카나마이신 저항성 유전자

pyc: pyc 대립유전자, pyc P458S

pck': pck 유전자의 5' 말단 조각

'pck: pck 유전자의 3' 말단 조각

sacB: sacB 유전자

RP4mob: 수송체 (oriT)의 복제 개시점을 가진 mob 영역

oriV: 복제 개시점 V

도 7: 플라스미드 pK18mobsacBnc::lysC의 지도

사용된 약어 및 명칭은 하기 뜻을 갖는다:

KanR: 카나마이신 저항성 유전자

BamHI: 제한 효소 BamHI의 절단 부위

HindIII: 제한 효소 HindIII의 절단 부위

XbaI: 제한 효소 XbaI의 절단 부위

lysC: lysC^FBR 대립유전자, lysC T311I

sacB: sacB 유전자

RP4mob: 수송체 (oriT)의 복제 개시점을 가진 mob 영역

oriV: 복제 개시점 V

도 8: 플라스미드 pK18mobsacBddh::ilvD의 지도

사용된 약어 및 명칭은 하기 뜻을 갖는다:

KanR: 카나마이신 저항성 유전자

XbaI: 제한 효소 XbaI의 절단 부위

NheI: 제한 효소 NheI의 절단 부위

ddh int' ddh 유전자의 5' 말단 조각

'ddh int ddh 유전자의 3' 말단 조각

ilvD: ilvD 유전자

sacB: sacB 유전자

RP4mob: 수송체 (oriT)의 복제 개시점을 가진 mob 영역

oriV: 복제 개시점 V

도 9: 플라스미드 pK18mobsacBnc::trp의 지도

사용된 약어 및 명칭은 하기 뜻을 갖는다:

KanR: 카나마이신 저항성 유전자

BamHI: 제한 효소 BamHI의 절단 부위

HindIII: 제한 효소 HindIII의 절단 부위

nc' ncode1 영역의 5' 말단 조각

'nc ncode1 영역의 3' 말단 조각

trpL trpL 유전자

trpE trpE 유전자

trpG trpG 유전자

trpD trpD 유전자

trpC trpC 유전자

trpB trpB 유전자

trpA trpA 유전자

sacB: sacB 유전자

RP4mob: 수송체 (oriT)의 복제 개시점을 가진 mob 영역

oriV: 복제 개시점 V

도 10: 플라스미드 pK18mobsacBpha1::trp의 지도

사용된 약어 및 명칭은 하기 뜻을 갖는다:

KanR: 카나마이신 저항성 유전자

BamHI: 제한 효소 BamHI의 절단 부위

EcoRI: 제한 효소 EcoRI의 절단 부위

SalI: 제한 효소 SalI의 절단 부위

phage' 파지 영역 pha1의 5' 말단 조각

'phage 파지 영역 pha1의 3' 말단 조각

trpL trpL 유전자

trpE trpE 유전자

trpG trpG 유전자

trpD trpD 유전자

trpC trpC 유전자

trpB trpB 유전자

trpA trpA 유전자

sacB: sacB 유전자

RP4mob: 수송체 (oriT)의 복제 개시점을 가진 mob 영역

oriV: 복제 개시점 V

화학적 화합물은, 특히, 아미노산, 비타민, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드를 의미하는 것으로 이해된다. 이들 화합물의 생합성 경로는 공지되고, 당업계에 유효하다.

아미노산은 바람직하게는 L-아미노산, 특히, L-아스파르트산, L-아스파라진, L-트레오닌, L-세린, L-글루탐산, L-글루타민, 글리신, L-알라닌, L-시스테인, L-발린, L-메티오닌, L-이소루신, L-루신, L-티로신, L-페닐알라닌, L-히스티딘, L-리신, L-트립토판, L-프롤린 및 L-아르기닌 및 이들의 염, 특히 L-리신, L-메티오닌 및 L-트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질로부터의(proteinogenic) L-아미노산을 의미한다. L-리신이 매우 특히 바람직하다.

단백질로부터의 아미노산은 천연 단백질에서, 즉 미생물, 식물, 동물 및 인간의 단백질에서 발생하는 아미노산을 의미하는 것으로 이해된다.

비타민은 특히, 비타민 B1 (티아민), 비타민 B2 (리보플라빈), 비타민 B5 (판토텐산), 비타민 B6 (피리독신), 비타민 B12 (시아노코발라민), 니코틴산/니코틴아미드, 비타민 M (엽산) 및 비타민 E (토코페롤) 및 이들의 염 (판토텐산이 바람직함)을 의미한다.

뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 특히, S-아데노실-메티오닌, 이노신-5'-모노인산 및 구아노신-5'-모노인산 및 이의 염을 의미한다.

코리네형 박테리아는 특히, 코리네박테리움 속의 박테리아이다. 코리네박테리움 속 중에서, 코리네박테리움 글루타미쿰 종, 코리네박테리움 암모니아진(Ammoniagenes) 및 코리네박테리움 테르모아미노진이 바람직하다. 상기 박테리아군의 균주의 분류학적 분류에 대한 정보는 특히, Kampfer 및 Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)) 및 US-A-5,250,434 에서 발견된다.

코리네박테리움 속의 적합한 균주는, 특히, 공지된 야생형 균주

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032

코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC15806

코리네박테리움 아세토에시도필룸 ATCC13870

코리네박테리움 릴륨 ATCC15990

코리네박테리움 멜라스세콜라 ATCC17965

코리네박테리움 헤르쿨리스 ATCC13868

아르트로박테르 sp. ATCC243

브레비박테리움 창-푸아 ATCC14017

브레비박테리움 플라붐 ATCC14067

브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC13869

브레비박테리움 디바리카툼 ATCC14020

브레비박테리움 타이페이 ATCC13744 및

마이크로박테리움 암모니아필룸 ATCC21645

및 이전 기술로부터 공지된 것과 같은, 화학적 화합물을 생성하는 것으로부터 유도된 돌연변이체 또는 균주이다.

코리네박테리움 암모니아진 종 (C. 암모니아진)의 적합한 균주는, 특히, 공지된 야생형 균주

브레비박테리움 암모니아진 ATCC6871

브레비박테리움 암모니아진 ATCC15137 및

코리네박테리움 sp. ATCC21084

코리네박테리움 테르모아미노진 종 (C. 테르모아미노진)의 적합한 균주는, 특히, 공지된 야생형 균주

코리네박테리움 테르모아미노진 FERM BP-1539

코리네박테리움 테르모아미노진 FERM BP-1540

코리네박테리움 테르모아미노진 FERM BP-1541 및

코리네박테리움 테르모아미노진 FERM BP-1542

및 이전 기술로부터 공지된 것과 같은, 화합물을 생성하는 것으로부터 유도된 돌연변이체 또는 균주이다.

명칭 "ATCC"를 가진 균주는 「American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)」로부터 획득할 수 있다. 명칭 "FERM"을 가진 균주는 「National Institute of Advanced Industrial Science and Technology」 (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan)으로부터 획득할 수 있다. 언급된 코리네박테리움 테르모아미노진의 균주는 (FERM BP-1539, FERM BP-1540, FERM BP-1541 및 FERM BP-1542) US-A 5,250,434 에서 기재된다.

외래전사 해독 프레임 (ORF)은 기능이 이전 기술에 따라 지정될 수 없는 단백질 또는 폴리펩티드 또는 리보핵산을 코딩할 수 있거나 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 구획을 설명한다.

문제의 뉴클레오티드 서열 구획에 대한 기능의 지정 후, 그것은 일반적으로 유전자로 언급된다.

대립유전자는 일반적으로, 주어진 유전자의 대체 형태를 의미하는 것으로 이해된다. 형태는 뉴클레오티드 서열내의 차이에 의해 구별된다.

본 발명의 문맥에서, 내생의 즉, 종-특이적인, 외래전사 해독 프레임, 유전자 또는 대립유전자가 바람직하게 사용된다. 이들은, 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 종의 개체군에 존재하는 외래전사 해독 프레임, 유전자 또는 대립유전자 또는 이의 뉴클레오티드 서열을 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명의 문맥에서 "본래 부위(유전자좌)에 존재하는 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자의 복제본"은 상응하는 야생형 또는 상응하는 모 유기체 또는 출발 유기체내에 존재하는 것과 같은 인접한 ORF 또는 유전자 또는 대립유전자에 관해서, ORF 또는 유전자 또는 대립유전자의 위치 또는 상태를 의미하는 것으로 이해된다.

그러므로, 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 "피드백" 저항성 아스파테이트 키나아제를 코딩하는 lysC 유전자 또는 lysC^FBR 대립유전자의 본래 부위는, 한쪽 측면에 직접 인접한 유전자 또는 외래전사 해독 프레임 orfX 및 leuA 및 다른 쪽 측면에 asd 유전자를 가진, lysC 부위 또는 lysC 유전자좌 또는 lysC 유전자 부위이다.

"피드백" 저항성 아스파테이트 키나아제는 야생형 형태와 비교해서, 리신과 트레오닌의 혼합물 또는 AEC (아미노에틸시스테인)과 트레오닌의 혼합물에 의해 또는 리신 단독으로 또는 AEC 단독에 의한 억제에 저 민감도 (5 내지 10% 이상, 10% 내지 15% 또는 10% 내지 20%)를 갖는 아스파테이트 키나아제를 의미하는 것으로 이해된다. L-리신을 생산하는 균주는 전형적으로 이런 "피드백" 저항성 또는 탈감작(desensitized) 아스파테이트 키나아제를 함유한다.

코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체의 뉴클레오티드 서열은 공지되고, 특허 출원 EP-A-1108790 및 「유럽 분자생물학 연구소」 (EMBL, Heidelberg, Germany and Cambridge, UK)의 뉴클레오티드 서열 데이터 뱅크의 접근 번호 (Accession No.) AX114121 에서 찾을 수 있다. orfX의 뉴클레오티드 서열, leuA 유전자 및 asd 유전자는 접근 번호 AX120364 (orfX), AX123517 (leuA) 및 AX123519 (asd)을 갖는다.

다른 데이터 뱅크, 예를 들어, 「국립 의약 도서관」 (Bethesda, MD, USA)의 「국립 생명공학 정보 센터」 (NCBI)도 또한 사용될 수 있다.

또 다른 데이터 베이스로는, 예를 들어 「국립 생명공학 정보 센터」 (NCBI, Bethesda, MD, USA) 또는 「Swiss Institute of Bioinformatics」 (Swissprot, Geneva, Switzerland) 또는 「Protein Information Resource Database」 (PIR, Washington, DC, USA)의 데이터 베이스도 사용될 수 있다.

"1개 이상, 특히 2번째, 임의로 3번째 또는 4번째 부위"는 "본래 부위"와 다른 부위를 의미하는 것으로 이해된다. 그것은 또한 하기에서 "표적 부위" 또는 "표적 서열"로 불린다. 그것은 또한 "통합 부위" 또는 "형질전환 부위"로 불린다. 상기 부위, 또는 상응하는 부위에 존재하는 뉴클레오티드 서열은, 바람직하게는 염색체내에 위치하고, 일반적으로 목적하는 화학적 화합물의 성장 및 생산에 필수적이지는 않다.

표적 부위로는 코리네박테리움 글루타미쿰의의 염색체의 유전자내부 영역 및 염색체내에 전형적으로 포함되는 프로파지 및 결손파지 또는 파지 성분을 코딩하는 DNA 영역이 바람직하다. 상기 부위의 예는 표 12 및 13에 제시된다.

본 발명에 따른 코리네형 박테리아를 생산하기 위해, 임의로 발현 및/또는 조절 신호 {예, 촉진인자(promotor), 감쇠인자(attenuator), 조절 단백질에 대한 결합 부위, 리보솜 결합 부위, 감쇠인자 및 종결인자(terminator)}를 포함하는 목적하는 ORF, 유전자, 대립유전자 또는 오페론(operon)을 가진 하나 이상의 DNA 단편은, 예를 들어 PCR 또는 제한 효소를 사용한 후에 젤 추출에 의해서 단리된다. DNA 단편의 길이는 특정 ORF, 유전자, 대립유전자 또는 오페론의 본래 길이에 따라 다양하다. 일반적으로 길이는 0.25 내지 10 kb 또는 0.5 내지 10 kb 이다. 그 다음 DNA 단편은 5'- 및 3'-말단에 표적 부위의 뉴클레오티드 서열과 함께 제공된다. 그 다음 이들은 바람직하게는 복제되지 않거나, 또는 단지 한정된 정도로 복제되는 벡터(vector)를 사용하여, 목적하는 코리네형 박테리움 내로 전이시키고, 목적하는 ORF, 유전자 또는 대립유전자가 표적 부위에 혼입된 이들 박테리아를 단리하여, 미생물에서 에피좀의 복제가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열이 없고, 전위가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열이 없고, 표적 부위에 남아있는 항생제에 저항성을 부여하는 뉴클레오티드 서열이 없음. 방법은 물론, 예를 들어 표적 부위를 먼저 벡터 내로 삽입하고(클로닝하고), 목적하는 ORF, 유전자 대립유전자 또는 오페론을 이어서 상기 표적 부위 내로 삽입하는 것과 같이 변형될 수 있다.

본 발명은 따라서 또한, 하나 이상의 화학적 화합물을 생산하는 하기를 포함하는 코리네형 박테리아의 제조 방법을 제공한다:

a) 임의로 발현 및/또는 조절 신호를 포함하는 하나 이상의 목적하는 ORF, 유전자 또는 대립유전자의 뉴클레오티드 서열 단리하는 것,

b) 표적 부위의 뉴클레오티드 서열을 가진 ORF, 유전자 또는 대립유전자의 5' 및 3' 말단을 제공하는 것 (여기서 상기 부위는 유전자내부 영역, 프로파지, 결손파지 또는 파지 성분으로 이루어진 군으로부터 선택됨),

c) 바람직하게는 코리네형 박테리움에서, 복제되지 않거나, 또는 단지 한정된 정도로 복제되는 벡터 내에 표적 부위의 뉴클레오티드 서열과 함께 제공된 목적하는 ORF, 유전자 또는 대립유전자의 뉴클레오티드 서열을 혼입하는 것,

d) 상기 b) 또는 c)에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 코리네형 박테리아 내로 전이시키는 것, 및

e) 상기 a)에 따른 뉴클레오티드 서열이 미생물에서 에피좀의 복제가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열, 전위가 가능하거나/가능하게 하는 비 뉴클레오티드 서열, 항생제에 저항성을 부여하는 뉴클레오티드 서열이 표적 부위에 남아있지 않은, 표적 부위에 혼입되는 코리네형 박테리아를 단리하는 것.

바람직하게는, 또한, 사용된 벡터의 서열 또는 외래-종의(species-foreign) DNA, 예컨대, 예를 들면, 제한 효소 절단 부위 또는 특히 형질전환된 박테리아에서 복제 또는 전사가 가능하거나, 가능하게 하는 뉴클레오티드 서열의 잔기 및 항생제에 저항성을 부여하는 뉴클레오티드 서열이 표적 부위에 남아있지 않다. 혼입된 ORF, 유전자 또는 대립유전자의 DNA 상부 또는 하부의 최대 24개, 바람직하게는 최대 12개, 특히 바람직하게는 최대 6개의 뉴클레오티드가 표적 부위에 임의로 남아있다.

화학적 화합물의 생산을 위한 단백질 또는 RNA를 암호화하는 ORF, 유전자 또는 대립유전자의 5'- 및 3'-말단에 부착된 표적 부위의 뉴클레오티드 서열의 길이는, 염기쌍 100개 이상의 최소 길이를 가진다. 염기쌍 200, 300, 400, 500, 600, 800, 1000, 1200, 1400, 16000, 18000 또는 20000개 이상의 길이의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA를 유사하게 사용할 수 있다. 최대 길이는 일반적으로 염기쌍 3000, 5000 또는 10000개를 초과하지 않는다. 길이는 300 이상, 최대 3000개가 바람직하다.

본 발명에 따른 측정에 의해, 코리네형 박테리아 또는 화학적 화합물 제조용 발효 방법의 생산성은, 농도 (단위 부피에 기초해서 형성된 화학적 화합물), 수율 (소비된 탄소 공급원에 기초해서 형성된 화학적 화합물) 및 생성물 형성비 (시간에 기초해서 형성된 화학적 화합물)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특성에 대해 0.5 내지 1.0% 이상 또는 1.0 내지 1.5% 이상 또는 1.5 내지 2.0% 이상 개선된다.

예를 들어, 염색체 DNA의 단리, 플라스미드 DNA, 제한 효소의 취급 등과 같은 통상적인 유전 공학 방법에 대한 지침은, Sambrook 등.(Molecular cloning - A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press)에서 발견된다. 코리네형 박테리아에서 형질전환 및 접합에 대한 지침은 특히, Thierbach 등. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Schafer 등. (Journal of Bacteriology 172, 1663-1666 (1990) 및 Gene 145, 69-73 (1994)) 및 Schwarzer and Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991))에서 발견된다.

단지 한정된 정도로 복제되는 벡터는, 숙주 또는 운반체(carrier)를 배양하는 조건의 기능으로, 복제 또는 복제되지 않는 플라스미드 벡터를 의미하는 것으로 이해된다. 31℃ 또는/이 이하의 온도에서 단지 한정된 정도로 복제될 수 있는 코리네형 박테리아에 대한 온도-민감성 플라스미드가 Nakamura 등. (US-A-6,303,383)에 기재되었다.

게다가, 본 발명의 코리네형 박테리아를 단리 및 동정하기 위해, 플레이팅, 선별 및 스크리닝과 같은 통상적인 미생물학적 기법 및 DNA 혼성화(hybridization), 중합 효소 연쇄반응 (PCR) 및 DNA 스크리닝과 같은 통상적인 유전 공학 기법 및 효소 활성의 측정과 같은 통상적인 생화학적 방법을 사용할 수 있다.

본 발명은 게다가, 본래 부위 (유전자좌)에 존재하는 리신 생산 단백질을 코딩하는 하나 이상의 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자 또는 대립유전자의 1개 복제본에 더해, 상기 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자의 1개 이상, 특히 2번째, 임의로 3번째 또는 4번째 복제본을, 염색체에 통합된 2번째, 임의로 3번째 또는 4번째 위치에 포함하는 L-리신을 생성하는 코리네형 박테리아를, 특히 코리네박테리움 속을 제공하며, 여기서 하나 이상의 상기 부위는 유전자내부 영역, 프로파지, 결손파지 또는 파지 성분 또는 상기 프로파지, 결손파지 또는 파지 성분을 코팅하는 DNA로 이루어진 군으로부터 선택된다.

미생물에서 에피좀의 복제가 가능하거나/가능하게 하는, 또는 전위가 가능하거나/가능하게 하는, 또는 항생제에 저항성을 부여하는 뉴클레오티드 서열이 상기 위치에 존재하지 않는다.

본 발명은 또한 게다가 하기를 포함하는 L-리신의 제조 방법을 제공한다:

a) 상기 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자의 발현을 허용하는 조건 하에서, 상기 코리네형 박테리아의, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰의 발효,

b) 발효 브로스에서 L-리신의 농도,

c) 임의로, 발효 브로스로부터 L-리신의 단리,

d) 발효 브로스 및/또는 생물자원으로부터 0 내지 100% 초과까지의 성분을 가짐.

"리신 생산의 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자의 복제본"은 향상/과발현이 리신 생산 효과를 증대시킬 수 있는 모든, 바람직하게는 내생의, 외래전사 해독 프레임, 유전자 또는 대립유전자를 의미하는 것으로 이해된다. 향상은 출발 박테리아에서 단백질 또는 효소의 농도 또는 활성에 비해, 특정 유전자 생성물, 단백질 또는 효소의 세포내 농도 또는 활성에서 증가를 의미하는 것으로 이해된다.

이들은 특히, 하기의 외래전사 해독 프레임, 유전자 또는 대립유전자를 포함한다: accBC, accDA, cstA, cysD, cysE, cysH, cysK, cysN, cysQ, dapA, dapB, dapC, dapD, dapE, dapF, ddh, dps, eno, gap, gap2, gdh, gnd, lysC, lysC^FBR, lysE, msiK, opcA, oxyR, ppc, ppc^FBR, pgk, pknA, pknB, pknD, pknG, ppsA, ptsH, ptsI, ptsM, pyc, pyc P458S, sigC, sigD, sigE, sigH, sigM, tal, thyA, tkt, tpi, zwa1, zwf 및 zwf A213T. 이들은 표 1에 요약되고 설명된다.

이들은 특히, "피드백" 저항성 아스파테이트 키나아제를 코딩하는 lysC^FBR 대립유전자를 포함한다. 다양한 lysC^FBR 대립유전자가 표 2에 요약되고 설명된다.

하기의 lysC^FBR 대립유전자가 바람직하다: lysC A279T (서열 번호: 2에 따라 코딩된 아스파테이트 키나아제 단백질의 279 위치에서 알라닌이 트레오닌으로 치환됨), lysC A279V (서열 번호: 2에 따라 코딩된 아스파테이트 키나아제 단백질의 279 위치에서 알라닌이 발린으로 치환됨), lysC S301F (서열 번호: 2에 따라 코딩된 아스파테이트 키나아제 단백질의 301 위치에서 세린이 페닐알라닌으로 치환됨), lysC T308I (서열 번호: 2에 따라 코딩된 아스파테이트 키나아제 단백질의 308 위치에서 트레오닌이 이소루신으로 치환됨), lysC S301Y (서열 번호: 2에 따라 코딩된 아스파테이트 키나아제 단백질의 308 위치에서 세린이 티로신으로 치환됨), lysC G345D (서열 번호: 2에 따라 코딩된 아스파테이트 키나아제 단백질의 345 위치에서 글리신이 아스파르트산으로 치환됨), lysC R320G (서열 번호: 2에 따라 코딩된 아스파테이트 키나아제 단백질의 320 위치에서 아르기닌이 글리신으로 치환됨), lysC T311I (서열 번호: 2에 따라 코딩된 아스파테이트 키나아제 단백질의 311 위치에서 트레오닌이 이소루신으로 치환됨), lysC S381F (서열 번호: 2에 따라 코딩된 아스파테이트 키나아제 단백질의 381 위치에서 세린이 페닐알라닌으로 치환됨).

lysC^FBR 대립유전자 lysC T311I (서열 번호: 2에 따라 코딩된 아스파테이트 키나아제 단백질의 311 위치에서 트레오닌이 이소루신으로 치환됨), 서열 번호:3 으로 제시되는 뉴클레오티드 서열이 특히 바람직하다; 코딩된 아스파테이트 키나아제 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호:4 로 제시된다.

문제의 리신 생산의 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자의 3번째 또는 4번째 복제본은, 3번째 또는 4번째 부위에 통합될 수 있다. 하기의 외래전사 해독 프레임, 유전자 또는 뉴클레오티드 서열은 특히, 이를 위해 사용될 수 있다: aecD, ccpA1, ccpA2, citA, citB, citE, fda, gluA, gluB, gluC, gluD, luxR, luxS, lysR1, lysR2, lysR3, menE, mqo, pck, pgi, poxB 및 zwa2, 특히 유전자 aecD, gluA, gluB, gluC, gluD 및 pck. 이들은 표 3에 요약되고 설명된다.

언급된 부위는, 물론, 언급된 외래전사 해독 프레임 또는 유전자의 코딩 영역 뿐 아니라, 발현 및 조절을 담당하는, 예컨대, 예를 들면, 리보솜 결합 부위, 촉진인자, 조절 단백질에 대한 결합 부위, 리보핵산 및 감쇠인자에 대한 결합 부위와 같은 상부에 놓인 영역 또는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 영역은 일반적으로 코딩 영역의 1-800, 1-600, 1-400, 1-200, 1-100 또는 1-50 범위의 뉴클레오티드 상부에 놓여있다. 동일한 방식으로, 하부에 놓인 영역, 예컨대, 예를 들면, 전사 종결인자도 또한 포함된다. 상기 영역은 일반적으로 코딩 영역의 1-400, 1-200, 1-100, 1-50 또는 1-25 범위의 뉴클레오티드 하부에 놓여있다.

염색체에서 유전자내부 영역, 즉 코딩 기능이 없는 뉴클레오티드 서열이 사용될 수 있다. 마지막으로, 전형적으로 염색체에 포함되는 프로파지 또는 결손파지 또는 파지 성분이 이를 위해 사용될 수 있다.

프로파지는 박테리오파지, 특히 그의 게놈을 의미하는 것으로 이해되고, 여기서 이것은 숙주의 게놈과 함께 복제되고, 감염 입자는 형성되지 않는다. 결손파지는 프로파지, 특히 그의 게놈을 의미하는 것으로 이해되고, 다양한 돌연변이의 결과로서, 이는 소위 말하는 감염 입자를 형성하는 능력을 잃었다. 결손파지는 또한 잠재(cryptic)라고도 불리운다. 프로파지 및 결손파지는 종종 그들 숙주의 염색체에 통합된 형태로 존재한다. 자세한 세부 사항은 당 업계에, 예를 들면 Edward A. Birge (Bacterial and Bacteriophage Genetics, 3^rd ed., Springer-Verlag, New York, USA, 1994)에 의한 텍스트 또는 S. Klaus 등. (Bakterienviren, Gustav Fischer Verlag, Jena, Germany, 1992)에 의한 텍스트에 있다.

염색체내부 영역, 프로파지, 결손파지 또는 파지 성분 또는 상기 프로파지, 결손파지 또는 파지 성분을 암호화하는 DNA를 나타내는 코리네박테리움 글루타미쿰 염색체의 영역의 예는 표 12 및 13에 제시된다. DNA 영역의 위치는 EP-A-1108790에서 또는 「유럽 분자생물학 연구소」 (EMBL, Heidelberg, Germany and Cambridge, UK)의 데이터 뱅크에 나타난 바와 같이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 지도에 언급된다.

표 12의 유전자내부 영역의 경우에는 - 균주는 야생형마다 다르며 돌연변이 유발 처리를 받은 것에 따라 다양하므로 - 표 12에서 기술된 것과 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지고, 코딩기능 즉, 유전자 또는 대립유전자를 포함하지 않는 영역을 본 발명에 따라 사용할 수 있다는 것이 당업자에 명백하다.

표 13으로부터 선택되는 프로파지, 결손파지 또는 파지 성분을 코딩하는 DNA 영역의 경우에는 - 균주는 야생형마다 다르며 돌연변이 유발 처리를 받은 것에 따라 다양하므로 - 표 13에서 기술된 것과 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 6%, 97%, 98% 및 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지고, 프로파지, 결손파지 또는 파지 성분을 코딩하는 영역을 본 발명에 따라 사용할 수 있다는 것이 당업자에 명백하다.

리신 생산의 외래전사 해독 프레임, 유전자 및 대립유전자
명칭	코딩된 효소 및 단백질의 기술	참조	접근 번호
accBC	아실-CoA 탈탄산효소EC 6.3.4.14 (아실-CoA 탈탄산효소)	Jager 등. Archives of Microbiology (1996) 166:76-82EP1108790;WO0100805	U35023AX123524 AX066441
accDA	아세틸-CoA 탈탄산효소EC 6.4.1.2 (아세틸-CoA 탈탄산효소)	EP1055725EP1108790WO0100805	AX121013 AX066443
cstA	탄소 기아 단백질 A(탄소 기아 단백질 A)	EP1108790WO0100804	AX120811 AX066109
cysD	술페이트 아데닐릴전달효소 서브-유닛 IIEC 2.7.7.4(술페이트 아데닐릴전달효소 작은 사슬)	EP1108790	AX123177
cysE	세린 아세틸전달효소EC 2.3.1.30(세린 아세틸전달효소)	EP1108790WO0100843	AX122902AX063961
cysH	3'-포스포아데닐 술페이트 환원 효소EC 1.8.99.4(3'-포스포아데노신 5'-포스포술페이트 환원 효소)	EP1108790WO0100842	AX123178AX066001
cysK	시스테인 생성 효소 EC 4.2.99.8(시스테인 생성 효소)	EP1108790WO0100843	AX122901 AX063963
cysN	술페이트 아데닐릴전달효소 서브-유닛 IEC 2.7.7.4(술페이트 아데닐릴전달효소)	EP1108790	AX123176 AX127152
cysQ	수송 단백질 CysQ(수송체 cysQ)	EP1108790WO0100805	AX127145AX066423
dapA	디히드로디피콜리네이트 생성 효소 EC 4.2.1.52(디히드로디피콜리네이트 생성 효소)	Bonnassie 등. Nucleic Acids Research 18:6421 (1990) Pisabarro 등., Journal of Bacteriology 175:2743-2749(1993)EP1108790WO0100805EP0435132 EP1067192EP1067193	X53993Z21502AX123560AX063773

dapB	디히드로디피콜리네이트 환원 효소 EC 1.3.1.26(디히드로디피콜리네이트 환원 효소)	EP1108790WO0100843EP1067192EP1067193 Pisabarro 등., Journal of Bacteriology 175:2743-2749(1993)JP1998215883JP1997322774JP1997070291JP1995075578	AX127149 AX063753 AX137723 AX137602 X67737Z21502E16749 E14520 E12773 E08900
dapC	N-숙시닐 아미노케토피멜레이트 아미노기 전달효소EC 2.6.1.17 (N-숙시닐 디아미노피멜레이트 아미노기 전달효소)	EP1108790WO0100843EP1136559	AX127146 AX064219
dapD	테트라히드로디피콜리네이트 숙시닐레이즈EC 2.3.1.117(테트라히드로디피콜리네이트 숙시닐레이즈)	EP1108790WO0100843Wehrmann 등. Journal of Bacteriology 180:3159-3165(1998)	AX127146 AX063757 AJ004934
dapE	N-숙시닐 디아미노피멜레이트 데숙시닐레이즈 EC 3.5.1.18(N-숙시닐 디아미노피멜레이트 데숙시닐레이즈)	EP1108790WO0100843Wehrmann 등. Microbiology 140:3349-3356 (1994)	AX127146 AX063749 X81379
dapF	디아미노피멜레이트 에피머레이즈EC 5.1.1.7(디아미노피멜레이트 에피머레이즈)	EP1108790WO0100843EP1085094	AX127149 AX063719 AX137620
ddh	디아미노피멜레이트 탈수소효소EC 1.4.1.16 (디아미노피멜레이트 탈수소효소)	EP1108790WO0100843Ishino 등., Nucleic Acids Research 15:3917-3917(1987)JP1997322774JP1993284970Kim 등., Journal of Microbiology and Biotechnology 5:250-256(1995)	AX127152AX063759Y00151E14511 E05776 D87976
dps	DNA 보호 효소(기아 동안 보호 단백질)	EP1108790	AX127153
eno	에놀레이즈EC 4.2.1.11(에놀레이즈)	EP1108790WO0100844EP1090998Hermann 등., 전기 영동 19:3217-3221 (1998)	AX127146 AX064945AX136862

gap	글리세르알데히드 3-인산염 탈수소효소EC 1.2.1.12(글리세르알데히드 3-인산염 탈수소효소)	EP1108790WO0100844Eikmanns 등., Journal of Bacteriology 174:6076-6086(1992)	AX127148AX064941X59403
gap2	글리세르알데히드 3-인산염 탈수소효소EC 1.2.1.12(글리세르알데히드 3-인산염 탈수소효소 2)	EP1108790WO0100844	AX127146 AX064939
gdh	글루타메이트 탈수소효소EC 1.4.1.4(글루타메이트 탈수소효소)	EP1108790WO0100844Boermann 등., Molecular Microbiology 6:317-326 (1992).Guyonvarch 등., NCBI	AX127150AX063811X59404X72855
gnd	6-포스포글루코네이트 탈수소효소EC 1.1.1.44(6-포스포글루코네이트 탈수소효소)	EP1108790WO0100844	AX127147AX121689AX065125
lysC	아스파테이트 키나아제EC 2.7.2.4(아스파테이트 키나아제)	EP1108790WO0100844Kalinowski 등., Molecular Microbiology 5:1197-204 (1991)	AX120365AX063743X57226
lysC^FBR	아스파테이트 키나아제 피드백 저항성 (fbr)EC 2.7.2.4(아스파테이트 키나아제 fbr)	표 2 참조
lysE	리신 배출체(리신 배출체 단백질)	EP1108790WO0100843Vrljic 등., Molecular Microbiology 22:815-826 (1996)	AX123539AX123539X96471
msiK	당 수입체(다중 당 수입 단백질)	EP1108790	AX120892
opcA	글루코스 6-인산염 탈수소효소(글루코스 6-인산염 탈수소효소의 서브유닛)	WO0104325	AX076272
oxyR	전사 조절인자(전사 조절 인자)	EP1108790	AX122198AX127149
ppc^FBR	포스포에놀 피루베이트 탈탄산효소 피드백 저항성EC 4.1.1.31(포스포에놀 피루베이트 탈탄산효소 피드백 저항성)	EP0723011WO0100852
ppc	포스포에놀 피루베이트 탈탄산효소EC 4.1.1.31(포스포에놀 피루베이트 탈탄산효소)	EP1108790O'Reagan 등., Gene 77(2):237-251(1989)	AX127148AX123554M25819

pgk	포스포글리세레이트 키나아제EC 2.7.2.3(포스포글리세레이트 키나아제)	EP1108790WO0100844Eikmanns, Journal of Bacteriology 174:6076-6086 (1992)	AX121838AX127148AX064943X59403
pknA	단백질 키나아제 A(단백질 키나아제 A)	EP1108790	AX120131AX120085
pknB	단백질 키나아제 B(단백질 키나아제 B)	EP1108790	AX120130AX120085
pknD	단백질 키나아제 D(단백질 키나아제 D)	EP1108790	AX127150AX122469AX122468
pknG	단백질 키나아제 G(단백질 키나아제 G)	EP1108790	AX127152AX123109
ppsA	포스포에놀 피루베이트 생성 효소EC 2.7.9.2(포스포에놀 피루베이트 생성 효소)	EP1108790	AX127144AX120700AX122469
ptsH	인산 전달효소 시스템 단백질 HEC 2.7.1.69(인산 전달효소 시스템 성분 H)	EP1108790WO0100844	AX122210AX127149 AX069154
ptsI	인산 전달효소 시스템 효소 IEC 2.7.3.9(인산 전달효소 시스템 효소 I)	EP1108790	AX122206AX127149
ptsM	글루코스-특이적 인산 전달효소 시스템 효소 IIEC 2.7.1.69(글루코스 인산 전달효소 시스템 효소 II)	Lee 등., FEMS Microbiology Letters 119 (1-2):137-145 (1994)	L18874
pyc	피루베이트 탈탄산효소 EC 6.4.1.1(피루베이트 탈탄산효소)	WO9918228Peters-Wendisch 등., Microbiology 144:915-927 (1998)	A97276Y09548
pycP458S	피루베이트 탈탄산효소 EC 6.4.1.1(피루베이트 탈탄산효소)아미노산 교환 P458S	EP1108790
sigC	시그마 인자 CEC 2.7.7.6(세포질외부의 기능 대안적인 시그마 인자 C)	EP1108790	AX120368AX120085

sigD	RNA 중합 효소 시그마 인자 DEC 2.7.7.6(RNA 중합 효소 시그마 인자)	EP1108790	AX120753AX127144
sigE	시그마 인자 EEC 2.7.7.6(세포질외부의 기능 대안적인 시그마 인자 E)	EP1108790	AX127146 AX121325
sigH	시그마 인자 HEC 2.7.7.6(시그마 인자 SigH)	EP1108790	AX127145AX120939
sigM	시그마 인자 MEC 2.7.7.6(시그마 인자 SigM)	EP1108790	AX123500AX127145
tal	트랜스알돌레이즈EC 2.2.1.2(트랜스알돌레이즈)	WO0104325	AX076272
thyA	티미딜레이트 생성 효소 EC 2.1.1.45(티미딜레이트 생성 효소)	EP1108790	AX121026AX127145
tkt	트랜스케톨레이즈EC 2.2.1.1(트랜스케톨레이즈)	Ikeda 등., NCBI	AB023377
tpi	트리오스 포스페이트 이소머레이즈 EC 5.3.1.1(트리오스 포스페이트 이소머레이즈)	Eikmanns, Journal of Bacteriology 174:6076-6086 (1992)	X59403
zwa1	세포 성장 인자 1(성장 인자 1)	EP1111062	AX133781
zwf	글루코스 6-포스페이트 1-탈수소효소EC 1.1.1.49(글루코스 6-포스페이트 1-탈수소효소)	EP1108790WO0104325	AX127148AX121827AX076272
zwfA213T	글루코스 6-포스페이트 1-탈수소효소EC 1.1.1.49(글루코스 6-포스페이트 1-탈수소효소)아미노산 교환 A213T	EP1108790

피드백 저항성 아스파테이트 키나아제를 코딩하는 lysC^FBR 대립유전자
대립유전자의 명칭	부가 정보	참조	접근 번호
lysC^FBR-E05108		JP 1993184366-A(서열 1)	E05108
lysC^FBR-E06825	lysC A279T	JP 1994062866-A(서열 1)	E06825
lysC^FBR-E06826	lysC A279T	JP 1994062866-A(서열 2)	E06826
lysC^FBR-E06827		JP 1994062866-A(서열 3)	E06827
lysC^FBR-E08177		JP 1994261766-A(서열 1)	E08177
lysC^FBR-E08178	lysC A279T	JP 1994261766-A(서열 2)	E08178
lysC^FBR-E08179	lysC A279V	JP 1994261766-A(서열 3)	E08179
lysC^FBR-E08180	lysC S301F	JP 1994261766-A(서열 4)	E08180
lysC^FBR-E08181	lysC T308I	JP 1994261766-A(서열 5)	E08181
lysC^FBR-E08182		JP 1994261766-A(서열 6)	E08182
lysC^FBR-E12770		JP 1997070291-A(서열 13)	E12770
lysC^FBR-E14514		JP 1997322774-A(서열 9)	E14514
lysC^FBR-E16352		JP 1998165180-A(서열 3)	E16352
lysC^FBR-E16745		JP 1998215883-A(서열 3)	E16745
lysC^FBR-E16746		JP 1998215883-A(서열 4)	E16746
lysC^FBR-I74588		US 5688671-A(서열 1)	I74588
lysC^FBR-I74589	lysC A279T	US 5688671-A(서열 2)	I74589
lysC^FBR-I74590		US 5688671-A(서열 7)	I74590
lysC^FBR-I74591	lysC A279T	US 5688671-A(서열 8)	I74591
lysC^FBR-I74592		US 5688671-A(서열 9)	I74592
lysC^FBR-I74593	lysC A279T	US 5688671-A(서열 10)	I74593
lysC^FBR-I74594		US 5688671-A(서열 11)	I74594
lysC^FBR-I74595	lysC A279T	US 5688671-A(서열 12)	I74595

lysC^FBR-I74596		US 5688671-A(서열 13)	I74596
lysC^FBR-I74597	lysC A279T	US 5688671-A(서열 14)	I74597
lysC^FBR-X57226	lysC S301Y	EP0387527Kalinowski 등., Molecular and General Genetics 224:317-324 (1990)	X57226
lysC^FBR-L16848	lysC G345D	Follettie and SinskeyNCBI 뉴클레오티드 Database (1990)	L16848
lysC^FBR-L27125	lysC R320GlysC G345D	Jetten 등., Applied Microbiology Biotechnology 43:76-82 (1995)	L27125
lysC^FBR	lysC T311I	WO0063388 (서열 17)
lysC^FBR	lysC S301F	US3732144
lysC^FBR	lysC S381F
lysC^FBR		JP6261766(서열 1)
lysC^FBR	lysC A279T	JP6261766(서열 2)
lysC^FBR	lysC A279V	JP6261766(서열 3)
lysC^FBR	lysC S301F	JP6261766(서열 4)
lysC^FBR	lysC T308I	JP6261766(서열 5)

리신 생산의 외래전사 해독 프레임, 유전자 및 대립유전자의 통합을 위한 표적 부위
유전자 명칭	코딩된 효소 또는 단백질의 기술	참조	접근 번호
aecD	베타 C-S 분해효소EC 2.6.1.1(베타 C-S 분해효소)	Rossol 등., Journal of Bacteriology 174(9):2968-77 (1992)	M89931
ccpA1	분해산물 통제 단백질(분해산물 통제 단백질 A1)	WO0100844EP1108790	AX065267AX127147
ccpA2	분해산물 통제 단백질(분해산물 통제 단백질 A2)	WO0100844EP1108790	AX065267AX121594
citA	센서 키나아제 CitA(센서 키나아제 CitA)	EP1108790	AX120161
citB	전사 조절인자 CitB(전사 조절인자 CitB)	EP1108790	AX120163
citE	구연산염 분해효소EC 4.1.3.6(구연산염 분해효소)	WO0100844EP1108790	AX065421AX127146
fda	과당 비스포스페이트 알돌레이즈EC 4.1.2.13(과당 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈)	von der Osten 등., Molecular Microbiology 3(11):1625-37 (1989)	X17313
gluA	글루타메이트 수송 ATP-결합 단백질(글루타메이트 수송 ATP-결합 단백질)	Kronemeyer 등., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluB	글루타메이트-결합 단백질(글루타메이트-결합 단백질)	Kronemeyer 등., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluC	글루타메이트 수송 투과 효소(글루타메이트 수송 시스템 투과 효소)	Kronemeyer 등., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluD	글루타메이트 수송 투과 효소(글루타메이트 수송 시스템 투과 효소)	Kronemeyer 등., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
luxR	전사 조절인자 LuxR(전사 조절인자 LuxR)	WO0100842EP1108790	AX065953AX123320
luxS	히스티딘 키나아제 LuxS(히스티딘 키나아제 LuxS)	EP1108790	AX123323 AX127145
lysR1	전사 조절인자 LysR1(전사 조절인자 LysR1)	EP1108790	AX064673 AX127144
lysR2	전사 촉진인자 LysR2(전사 조절인자 LysR2)	EP1108790	AX123312
lysR3	전사 조절인자 LysR3(전사 조절인자 LysR3)	WO0100842EP1108790	AX065957AX127150
menE	O-숙시닐벤조산 CoA 연결 효소EC 6.2.1.26(O-숙시닐벤조에이트 CoA 연결 효소)	WO0100843EP1108790	AX064599 AX064193AX127144

mqo	말레이트-퀴논 산화 환원 효소(말레이트-퀴논-산화 환원 효소)	Molenaar 등., Eur. Journal of Biochemistry 1;254(2):395-403 (1998)	AJ224946
pck	포스포에놀 피루베이트 카르복시키나아제(포스포에놀 피루베이트 카르복시키나아제)	WO0100844	AJ269506 AX065053
pgi	글루코스 6-포스페이트 이소머레이즈 EC 5.3.1.9(글루코스 6-포스페이트 이소머레이즈)	EP1087015EP1108790	AX136015AX127146
poxB	피루베이트 산화 효소EC 1.2.3.3(피루베이트 산화 효소)	WO0100844EP1096013	AX064959 AX137665
zwa2	세포 성장 인자 2(성장 인자 2)	EP1106693EP1108790	AX113822AX127146

본 발명은 따라서 또한 L-리신을 생산하는 코리네형 박테리아의 생산 방법을 제공하는 것으로, 이는 하기를 포함한다

a) 임의로 발현 및/또는 조절 신호를 포함하는, 리신 생산의 1개 이상의 목적하는 ORF, 유전자 또는 대립유전자의 뉴클레오티드 서열을 단리하는 것,

b) 표적 부위의 뉴클레오티드 서열과 함께 리신 생산의 ORF, 유전자 또는 대립유전자의 5' 및 3' 말단을 제공하는 것으로, 여기서 상기 부위는 유전자내부 영역, 프로파지, 결손파지 또는 파지 성분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것,

c) 바람직하게는 코리네형 박테리아에서 복제되지 않거나, 단지 제한된 정도로 복제되는 벡터 내에 표적 부위의 뉴클레오티드 서열과 함께 제공되는 목적하는 ORF, 유전자 또는 대립유전자의 뉴클레오티드 서열을 혼입시키는 것,

d) 상기 b) 또는 c)에 따른 상기 언급한 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 코리네형 박테리아내에 전이시키는 것, 및

e) 상기 a)에 따른 뉴클레오티드 서열이 표적 부위에 혼입된 코리네형 박테리아를 단리하는 것. 상기 미생물에서 에피좀의 복제가 가능하거나/가능하게 하는, 또는 전위가 가능하거나/가능하게 하는, 또는 항생제에 저항성을 부여하는 뉴클레오티드 서열이 예를 들면 벡터 기원과 함께 표적 부위에 남아있지 않다.

본 발명은 게다가 코리네형 박테리아, 특히 청구항 제 1 항에 따라 L-메티오닌 및/또는 L-트레오닌을 생산하는 코리네박테리움 속을 제공한다.

본 발명은 또한 게다가 청구항 제 20 항에 따라 L-메티오닌 및/또는 L-트레오닌의 제조 방법을 제공한다.

"메티오닌 생산의 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자의 복제본"은 향상/과발현이 메티오닌 생산을 증대시키는 효과를 갖는, 바람직하게는 내생의, 외래전사 해독 프레임, 유전자 또는 대립유전자를 모두 의미하는 것으로 이해된다.

이들은 특히, 하기의 외래전사 해독 프레임, 유전자 또는 대립유전자를 포함한다: accBC, accDA, aecD, cstA, cysD, cysE, cysH, cysK, cysN, cysQ, dps, eno, fda, gap, gap2, gdh, gnd, glyA, hom, hom^FBR, lysC, lysC^FBR, metA, metB, metE, metH, metY, msiK, opcA, oxyR, ppc, ppc^FBR, pgk, pknA, pknB, pknD, pknG, ppsA, ptsH, ptsI, ptsM, pyc, pyc P458S, sigC, sigD, sigE, sigH, sigM, tal, thyA, tkt, tpi, zwa1, zwf 및 zwf A213T. 이들은 표 4에 요약되고 설명된다. 이들은 특히, "피드백" 저항성 아스파테이트 키나아제를 코딩하는 lysC^FBR 대립유전자 (표 2 참조) 및 "피드백" 저항성 호모세린 탈수소효소를 코딩하는 hom^FBR 대립유전자를 포함한다.

"피드백" 저항성 호모세린 탈수소효소는, 트레오닌 또는 AHV (α-아미노-β-히드록시발레르산)에 의한 저해에 대해 야생형 형태와 비교해서 저 민감도를 갖는 (5% 내지 10%, 10% 내지 15% 또는 10% 내지 20% 이상) 호모세린 탈수소효소를 의미하는 것으로 이해된다. L-트레오닌을 생산하는 균주는 전형적으로 상기 "피드백" 저항성 또는 감감화된 호모세린 탈수소효소 (또한 Eikmanns 등. (Antonie van Leuwenhoek 64: 145-163, 1993)의 페이지 153 내지 156 참조)를 포함한다.

메티오닌 생산의 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자의 3번째 또는 4번째 복제본은, 3번째 또는 4번째 부위에 통합될 수 있다. 하기 외래전사 해독 프레임, 유전자 또는 뉴클레오티드 서열이, 특히, 통합에 대한 부위로서 사용될 수 있다: brnE, brnF, brnQ, ccpA1, ccpA2, citA, citB, citE, ddh, gluA, gluB, gluC, gluD, luxR, luxS, lysR1, lysR2, lysR3, menE, metD, metK, pck, pgi, poxB 및 zwa2. 이들은 표 5에 요약되고 설명된다.

언급된 부위는, 물론, 언급된 외래전사 해독 프레임 또는 유전자의 코딩 영역 뿐 아니라, 발현 및 조절을 담당하는, 예컨대, 예를 들면, 리보솜 결합 부위, 촉진인자, 조절 단백질에 대한 결합 부위, 리보핵산 및 감쇠인자에 대한 결합 부위와 같은 상부에 놓여 있는 영역 또는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 영역은 일반적으로 코딩 영역의 1-800, 1-600, 1-400, 1-200, 1-100 또는 1-50 범위의 뉴클레오티드 상부에 놓여있다. 동일한 방식으로, 하부에 놓인 영역, 예컨대, 예를 들면, 전사 종결인자도 또한 포함된다. 상기 영역은 일반적으로 코딩 영역의 1-400, 1-200, 1-100, 1-50 또는 1-25 범위의 뉴클레오티드 하부에 놓여있다.

염색체에서 유전자내부 영역, 즉 코딩 기능이 없는 뉴클레오티드 서열이, 게다가 사용될 수 있다. 마지막으로, 전형적으로 염색체에 포함된 프로파지 또는 결손파지 또는 파지 성분도 역시 이를 위해 사용될 수 있다.

유전자내부 영역, 프로파지, 결손파지 또는 파지 성분을 나타내는 코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체의 영역의 예는 표 12 및 표 13에서 제시된다. DNA 영역의 위치는 EP-A-1108790에서 또는 「유럽 분자생물학 연구소」 (EMBL, Heidelberg, Germany and Cambridge, UK)의 데이터 뱅크에 존재하는 바와 같이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 지도를 언급한다.

표 12의 유전자내부 영역의 경우에는 - 균주는 야생형마다 다르며 돌연변이 유발 처리를 받은 것에 따라 다양하므로 - 표 12에서 기술된 것과 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지고, 코딩 기능, 즉 유전자 또는 대립유전자를 포함하지 않은 영역을 본 발명에 따라 사용할 수 있다는 것이 당업자에 명백하다.

메티오닌 생성의 외래전사 해독 프레임, 유전자 및 대립유전자
명칭	코딩된 효소 또는 단백질의 기술	참조	접근 번호
AccBC	아실-CoA 탈탄산효소EC 6.3.4.14(아실-CoA 탈탄산효소)	Jager 등. Archives of Microbiology (1996) 166:76-82EP1108790;WO0100805	U35023AX123524 AX066441
AccDA	아세틸-CoA 탈탄산효소EC 6.4.1.2(아세틸-CoA 탈탄산효소)	EP1055725EP1108790WO0100805	AX121013 AX066443
AecD	시스타티오닌 베타-분해효소EC 4.4.1.8(시스타티오닌 베타-분해효소)	Rossol 등., Journal of Bacteriology 174:2968-2977 (1992)	M89931
CstA	탄소 기아 단백질 A(탄소 기아 단백질 A)	EP1108790WO0100804	AX120811 AX066109
CysD	술페이트 아데닐릴전달효소 서브-유닛 IIEC 2.7.7.4(술페이트 아데닐릴전달효소 작은 사슬)	EP1108790	AX123177
CysE	세린 아세틸전달효소EC 2.3.1.30(세린 아세틸전달효소)	EP1108790WO0100843	AX122902AX063961
CysH	3'-포스포아데닐 술페이트 환원 효소EC 1.8.99.4(3'-포스포아데노신 5'-포스포술페이트 환원 효소)	EP1108790WO0100842	AX123178AX066001
CysK	시스테인 생성 효소 EC 4.2.99.8(시스테인 생성 효소)	EP1108790WO0100843	AX122901 AX063963
CysN	술페이트 아데닐릴전달효소 서브-유닛 IEC 2.7.7.4(술페이트 아데닐릴전달효소)	EP1108790	AX123176 AX127152
CysQ	수송 단백질 CysQ(수송체 cysQ)	EP1108790WO0100805	AX127145AX066423
Dps	DNA 보호 효소(기아 동안 보호 단백질)	EP1108790	AX127153
Eno	에놀레이즈EC 4.2.1.11(에놀레이즈)	EP1108790WO0100844EP1090998Hermann 등., Electrophoresis 19:3217-3221 (1998)	AX127146 AX064945AX136862

Fda	과당 비스포스페이트 알돌레이즈EC 4.1.2.13(과당 비스포스페이트 알돌레이즈)	van der Osten 등., Molecular Microbiology 3:1625-1637 (1989)	X17313
Gap	글리세르알데히드 3-인산염 탈수소효소EC 1.2.1.12(글리세르알데히드 3-인산염 탈수소효소)	EP1108790WO0100844Eikmanns 등., Journal of Bacteriology 174:6076-6086(1992)	AX127148AX064941X59403
gap2	글리세르알데히드 3-인산염 탈수소효소EC 1.2.1.12(글리세르알데히드 3-인산염 탈수소효소 2)	EP1108790WO0100844	AX127146 AX064939
Gdh	글루타메이트 탈수소효소EC 1.4.1.4(글루타메이트 탈수소효소)	EP1108790WO0100844Boermann 등., Molecular Microbiology 6:317-326 (1992);Guyonvarch 등., NCBI	AX127150AX063811X59404X72855
GlyA	글리신/세린 히드록시메틸전달효소 EC 2.1.2.1(글리신/세린 히드록시메틸전달효소)	EP1108790	AX127146 AX121194
Gnd	6-포스포글루코네이트 탈수소효소EC 1.1.1.44(6-포스포글루코네이트 탈수소효소)	EP1108790WO0100844	AX127147AX121689AX065125
Hom	호모세린 탈수소효소EC 1.1.1.3(호모세린 탈수소효소)	Peoples 등., Molecular Microbiology 2:63-72 (1988)	Y00546
hom^FBR	호모세린 탈수소효소 피드백 저항성 (fbr)EC 1.1.1.3(호모세린 탈수소효소 fbr)	Reinscheid 등., Journal of Bacteriology 173:3228-30 (1991)
LysC	아스파테이트 키나아제EC 2.7.2.4(아스파테이트 키나아제)	EP1108790WO0100844Kalinowski 등., Molecular Microbiology 5:1197-204 (1991)	AX120365AX063743X57226
lysC^FBR	아스파테이트 키나아제 피드백 저항성 (fbr)EC 2.7.2.4(아스파테이트 키나아제 fbr)	표 2 참조
MetA	호모세린 아세틸전달효소EC 2.3.1.31(호모세린 아세틸전달효소)	Park 등., Molecular Cells 8:286-94 (1998)	AF052652
MetB	시스타티오닌 γ-분해효소EC 4.4.1.1(시스타티오닌 감마-생성 효소)	Hwang 등., Molecular Cells 9:300-308 (1999)	AF126953

MetE	호모시스테인 메틸전달효소EC 2.1.1.14(호모시스테인 메틸전달효소)	EP1108790	AX127146 AX121345
MetH	호모시스테인 메틸전달효소 (비타민 B12-의존적)EC 2.1.1.14(호모시스테인 메틸전달효소)	EP1108790	AX127148AX121747
MetY	아세틸호모세린 술프히드로레이즈(아세틸호모세린 술프히드로레이즈)	EP1108790	AX120810AX127145
MsiK	당 수입체(다중 당 수입체 단백질)	EP1108790	AX120892
OpcA	글루코스 6-인산염 탈수소효소(글루코스 6-인산염 탈수소효소의 서브유닛)	WO0104325	AX076272
OxyR	전사 조절인자(전사 조절 인자)	EP1108790	AX122198AX127149
ppc^FBR	포스포에놀 피루베이트 탈탄산효소 피드백 저항성EC 4.1.1.31(포스포에놀 피루베이트 탈탄산효소 피드백 저항성)	EP0723011WO0100852
Ppc	포스포에놀 피루베이트 탈탄산효소EC 4.1.1.31(포스포에놀 피루베이트 탈탄산효소)	EP1108790O'Reagan 등., Gene 77(2):237-251(1989)	AX127148AX123554M25819
Pgk	포스포글리세레이트 키나아제EC 2.7.2.3(포스포글리세레이트 키나아제)	EP1108790WO0100844Eikmanns, Journal of Bacteriology 174:6076-6086 (1992)	AX121838AX127148AX064943X59403
PknA	단백질 키나아제 A(단백질 키나아제 A)	EP1108790	AX120131AX120085
PknB	단백질 키나아제 B(단백질 키나아제 B)	EP1108790	AX120130AX120085
PknD	단백질 키나아제 D(단백질 키나아제 D)	EP1108790	AX127150AX122469AX122468
PknG	단백질 키나아제 G(단백질 키나아제 G)	EP1108790	AX127152AX123109
PpsA	포스포에놀 피루베이트 생성 효소EC 2.7.9.2(포스포에놀 피루베이트 생성 효소)	EP1108790	AX127144AX120700AX122469
PtsH	인산 전달효소 시스템 단백질 HEC 2.7.1.69(인산 전달효소 시스템 성분 H)	EP1108790WO0100844	AX122210AX127149 AX069154

PtsI	인산 전달효소 시스템 효소 IEC 2.7.3.9(인산 전달효소 시스템 효소 I)	EP1108790	AX122206AX127149
PtsM	글루코스-특이적 인산 전달효소 시스템 효소 IIEC 2.7.1.69(글루코스 인산 전달효소 시스템 효소 II)	Lee 등., FEMS Microbiology Letters 119 (1-2):137-145 (1994)	L18874
Pyc	피루베이트 탈탄산효소 EC 6.4.1.1(피루베이트 탈탄산효소)	WO9918228Peters-Wendisch 등., Microbiology 144:915-927 (1998)	A97276Y09548
PycP458s	피루베이트 탈탄산효소 EC 6.4.1.1(피루베이트 탈탄산효소)아미노산 교환 P458S	EP1108790
SigC	시그마 인자 CEC 2.7.7.6(세포질외부의 기능 대안적인 시그마 인자 C)	EP1108790	AX120368AX120085
SigD	RNA 중합 효소 시그마 인자 DEC 2.7.7.6(RNA 중합 효소 시그마 인자)	EP1108790	AX120753AX127144
SigE	시그마 인자 EEC 2.7.7.6(세포질외부의 기능 대안적인 시그마 인자 E)	EP1108790	AX127146 AX121325
SigH	시그마 인자 HEC 2.7.7.6(시그마 인자 SigH)	EP1108790	AX127145AX120939
SigM	시그마 인자 MEC 2.7.7.6(시그마 인자 SigM)	EP1108790	AX123500AX127153
Tal	트랜스알돌레이즈EC 2.2.1.2(트랜스알돌레이즈)	WO0104325	AX076272
ThyA	티미딜레이트 생성 효소 EC 2.1.1.45(티미딜레이트 생성 효소)	EP1108790	AX121026AX127145
Tkt	트랜스케톨레이즈EC 2.2.1.1(트랜스크톨레이즈)	Ikeda 등., NCBI	AB023377
Tpi	트리오스 포스페이트 이소머레이즈 EC 5.3.1.1(트리오스 포스페이트 이소머레이즈)	Eikmanns, Journal of Bacteriology 174:6076-6086 (1992)	X59403
zwa1	세포 성장 인자 1(성장 인자 1)	EP1111062	AX133781
Zwf	글루코스 6-포스페이트 1-탈수소효소EC 1.1.1.49(글루코스 6-포스페이트 1-탈수소효소)	EP1108790WO0104325	AX127148AX121827AX076272
ZwfA213T	글루코스 6-포스페이트 1-탈수소효소EC 1.1.1.49(글루코스 6-포스페이트 1-탈수소효소)아미노산 교환 A213T	EP1108790

메티오닌 생성의 외래전사 해독 프레임, 유전자 및 대립유전자의 통합을 위한 표적 부위
유전자 명칭	코딩된 효소 또는 단백질의 기술	참조	접근 번호
BrnE	분지쇄 아미노산의 수송체(분지쇄 아미노산 수송체)	EP1096010	AX137709AX137714
BrnF	분지쇄 아미노산의 수송체(분지쇄 아미노산 수송체)	EP1096010	AX137709AX137714
BrnQ	분지쇄 아미노산의 담체 단백질(분지쇄 아미노산 수송 시스템 담체 단백질)	Tauch 등., Archives of Microbiology 169(4):303-12 (1998)WO0100805EP1108790	M89931AX066841AX127150
ccpA1	분해산물 통제 단백질(분해산물 통제 단백질 A1)	WO0100844EP1108790	AX065267AX127147
ccpA2	분해산물 통제 단백질(분해산물 통제 단백질 A2)	WO0100844EP1108790	AX065267AX121594
citA	센서 키나아제 CitA(센서 키나아제 CitA)	EP1108790	AX120161
citB	전사 조절인자 CitB(전사 조절인자 CitB)	EP1108790	AX120163
citE	구연산염 분해효소EC 4.1.3.6(구연산염 분해효소)	WO0100844EP1108790	AX065421AX127146
ddh	디아미노피멜레이트 탈수소효소 EC 1.4.1.16(디아미노피멜레이트 탈수소효소)	Ishino 등., Nucleic Acids Research 15: 3917 (1987)EP1108790	S07384AX127152
gluA	글루타메이트 수송 ATP-결합 단백질(글루타메이트 수송 ATP-결합 단백질)	Kronemeyer 등., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluB	글루타메이트-결합 단백질(글루타메이트-결합 단백질)	Kronemeyer 등., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluC	글루타메이트 수송 투과 효소(글루타메이트 수송 시스템 투과 효소)	Kronemeyer 등., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluD	글루타메이트 수송 투과 효소(글루타메이트 수송 시스템 투과 효소)	Kronemeyer 등., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
luxR	전사 조절인자 LuxR(전사 조절인자 LuxR)	WO0100842EP1108790	AX065953AX123320
luxS	히스티딘 키나아제 LuxS(히스티딘 키나아제 LuxS)	EP1108790	AX123323 AX127145
lysR1	전사 조절인자 LysR1(전사 조절인자 LysR1)	EP1108790	AX064673 AX127144
lysR2	전사 촉진인자 LysR2(전사 조절인자 LysR2)	EP1108790	AX123312
lysR3	전사 조절인자 LysR3(전사 조절인자 LysR3)	WO0100842EP1108790	AX065957AX127150

menE	O-숙시닐벤조산 CoA 연결 효소EC 6.2.1.26(O-숙시닐벤조에이트 CoA 연결 효소)	WO0100843EP1108790	AX064599 AX064193AX127144
metD	전사 조절인자 MetD(전사 조절인자 MetD)	EP1108790	AX123327AX127153
metK	메티오닌 아데노실 전달효소EC 2.5.1.6(S-아데노실메티오닌 합성효소)	WO0100843EP1108790	AX063959AX127148
pck	포스포에놀 피루베이트 카르복시키나아제(포스포에놀 피루베이트 카르복시키나아제)	WO0100844	AJ269506 AX065053
pgi	글루코스 6-포스페이트 이소머레이즈 EC 5.3.1.9(글루코스-6-포스페이트 이소머레이즈)	EP1087015EP1108790	AX136015AX127146
poxB	피루베이트 산화 효소EC 1.2.3.3(피루베이트 산화 효소)	WO0100844EP1096013	AX064959 AX137665
zwa2	세포 성장 인자 2(성장 인자 2)	EP1106693EP1108790	AX113822AX127146

"트레오닌 생산의 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자의 복제본"은, 향상/과발현이 트레오닌 생산을 증대시키는 효과를 갖는 외래전사 해독 프레임, 유전자 또는 대립유전자 모두를 의미하는 것으로 이해된다.

이들은 특히, 하기의 외래전사 해독 프레임, 유전자 또는 대립유전자를 포함한다: accBC, accDA, cstA, cysD, cysE, cysH, cysI, cysN, cysQ, dps, eno, fda, gap, gap2, gdh, gnd, hom, hom^FBR, lysC, lysC^FBR, msiK, opcA, oxyR, ppc, ppc^FBR, pgk, pknA, pknB, pknD, pknG, ppsA, ptsH, ptsI, ptsM, pyc, pyc P458S, sigC, sigD, sigE, sigH, sigM, tal, thyA, tkt, tpi, thrB, thrC, thrE, zwa1, zwf 및 zwf A213T. 이들은 표 6에 요약되고 설명된다. 이들은 특히, "피드백" 저항성 아스파테이트 키나아제를 코딩하는 lysC^FBR 대립유전자 (표 2 참조) 및 "피드백" 저항성 호모세린 탈수소효소를 코딩하는 hom^FBR 대립유전자를 포함한다.

"피드백" 저항성 호모세린 탈수소효소는, 트레오닌 또는 AHV (α-아미노-β-히드록시발레르산)에 의한 저해에 대해 야생형 형태와 비교해서 저 민감도를 갖는 (5% 내지 10%, 10% 내지 15% 또는 10% 내지 20% 이상), 호모세린 탈수소효소를 의미하는 것으로 이해된다. L-트레오닌을 생산하는 균주는 전형적으로 상기 "피드백" 저항성 또는 감감화된 호모세린 탈수소효소 (또한 Eikmanns 등. (Antonie van Leuwenhoek 64: 145-163, 1993)의 페이지 153 내지 156 참조)를 포함한다.

트레오닌 생산의 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자의 3번째 또는 4번째 복제본은, 3번째 또는 4번째 부위에 통합될 수 있다. 하기 외래전사 해독 프레임, 유전자 또는 뉴클레오티드 서열이, 특히, 통합에 대한 부위로서 사용될 수 있다: ccpA1, ccpA2, citA, citB, citE, ddh, gluA, gluB, gluC, gluD, glyA, ilvA, ilvBN, ilvC, ilvD, luxR, luxS, lysR1, lysR2, lysR3, mdh, menE, metA, metD, pck, poxB, sigB 및 zwa2. 이들은 표 7에 요약되고 설명된다.

염색체에서 유전자내부 영역, 즉 코딩 기능이 없는 뉴클레오티드 서열이, 게다가 사용될 수 있다. 마지막으로, 전형적으로 염색체에 포함되는 프로파지 또는 결손파지 또는 파지 성분도 역시 이를 위해 사용될 수 있다.

표 12의 유전자내부 영역의 경우에는 - 균주는 야생형마다 다르며 돌연변이 유발 처리를 받은 것에 따라 다양하므로 - 표 12에서 기술된 것과 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지고, 코딩 작용 즉, 유전자 또는 대립유전자를 포함하지 않은 영역을 본 발명에 따라 사용할 수 있다는 것이 당업자에 명백하다.

트레오닌 생산의 외래전사 해독 프레임, 유전자 및 대립유전자
명칭	코딩된 효소 또는 단백질의 기술	참조	접근 번호
accBC	아실-CoA 탈탄산효소EC 6.3.4.14(아실-CoA 탈탄산효소)	Jager 등. Archives of Microbiology 166:76-82 (1996)EP1108790WO0100805	U35023AX123524 AX066441
accDA	아세틸-CoA 탈탄산효소EC 6.4.1.2(아세틸-CoA 탈탄산효소)	EP1055725EP1108790WO0100805	AX121013 AX066443
cstA	탄소 기아 단백질 A(탄소 기아 단백질 A)	EP1108790WO0100804	AX120811 AX066109
cysD	술페이트 아데닐릴전달효소 서브-유닛 IIEC 2.7.7.4(술페이트 아데닐릴전달효소 작은 사슬)	EP1108790	AX123177
cysE	세린 아세틸전달효소EC 2.3.1.30(세린 아세틸전달효소)	EP1108790WO0100843	AX122902AX063961
cysH	3'-포스포아데닐 술페이트 환원 효소EC 1.8.99.4(3'-포스포아데노신 5'-포스포술페이트 환원 효소)	EP1108790WO0100842	AX123178AX066001
cysK	시스테인 생성 효소 EC 4.2.99.8(시스테인 생성 효소)	EP1108790WO0100843	AX122901 AX063963
cysN	술페이트 아데닐릴전달효소 서브-유닛 IEC 2.7.7.4(술페이트 아데닐릴전달효소)	EP1108790	AX123176 AX127152
cysQ	수송 단백질 CysQ(수송체 cysQ)	EP1108790WO0100805	AX127145AX066423
dps	DNA 보호 효소(기아 동안 보호 단백질)	EP1108790	AX127153
eno	에놀레이즈EC 4.2.1.11(에놀레이즈)	EP1108790WO0100844EP1090998Hermann 등., Electrophoresis 19:3217-3221 (1998)	AX127146 AX064945AX136862
fda	과당 비스포스페이트 알돌레이즈EC 4.1.2.13(과당 비스포스페이트 알돌레이즈)	van der Osten 등., Molecular Microbiology 3:1625-1637 (1989)	X17313
gap	글리세르알데히드 3-인산염 탈수소효소EC 1.2.1.12(글리세르알데히드 3-인산염 탈수소효소)	EP1108790WO0100844Eikmanns 등., Journal of Bacteriology 174:6076-6086(1992)	AX127148AX064941X59403

gap2	글리세르알데히드 3-인산염 탈수소효소EC 1.2.1.12(글리세르알데히드 3-인산염 탈수소효소 2)	EP1108790WO0100844	AX127146 AX064939
gdh	글루타메이트 탈수소효소EC 1.4.1.4(글루타메이트 탈수소효소)	EP1108790WO0100844Boermann 등., Molecular Microbiology 6:317-326 (1992);Guyonvarch 등., NCBI	AX127150AX063811X59404X72855
gnd	6-포스포글루코네이트 탈수소효소EC 1.1.1.44(6-포스포글루코네이트 탈수소효소)	EP1108790WO0100844	AX127147AX121689AX065125
hom	호모세린 탈수소효소EC 1.1.1.3(호모세린 탈수소효소)	Peoples 등., Molecular Microbiology 2:63-72 (1988)	Y00546
hom^FBR	호모세린 탈수소효소 피드백 저항성 (fbr)EC 1.1.1.3(호모세린 탈수소효소 fbr)	Reinscheid 등., Journal of Bacteriology 173:3228-30 (1991)
lysC	아스파테이트 키나아제EC 2.7.2.4(아스파테이트 키나아제)	EP1108790WO0100844Kalinowski 등., Molecular Microbiology 5:1197-204 (1991)	AX120365AX063743X57226
lysC^FBR	아스파테이트 키나아제 피드백 저항성 (fbr)EC 2.7.2.4(아스파테이트 키나아제 fbr)	표 2 참조
msiK	당 수입체(다중 당 수입체 단백질)	EP1108790	AX120892
opcA	글루코스 6-인산염 탈수소효소(글루코스 6-인산염 탈수소효소의 서브유닛)	WO0104325	AX076272
oxyR	전사 조절인자(전사 조절 인자)	EP1108790	AX122198AX127149
ppc^FBR	포스포에놀 피루베이트 탈탄산효소 피드백 저항성EC 4.1.1.31(포스포에놀 피루베이트 탈탄산효소 피드백 저항성)	EP0723011WO0100852
ppc	포스포에놀 피루베이트 탈탄산효소EC 4.1.1.31(포스포에놀 피루베이트 탈탄산효소)	EP1108790O'Reagan 등., Gene 77(2):237-251(1989)	AX127148AX123554M25819

pgk	포스포글리세레이트 키나아제EC 2.7.2.3(포스포글리세레이트 키나아제)	EP1108790WO0100844Eikmanns, Journal of Bacteriology 174:6076-6086 (1992)	AX121838AX127148AX064943X59403
pknA	단백질 키나아제 A(단백질 키나아제 A)	EP1108790	AX120131AX120085
pknB	단백질 키나아제 B(단백질 키나아제 B)	EP1108790	AX120130AX120085
pknD	단백질 키나아제 D(단백질 키나아제 D)	EP1108790	AX127150AX122469AX122468
pknG	단백질 키나아제 G(단백질 키나아제 G)	EP1108790	AX127152AX123109
ppsA	포스포에놀 피루베이트 생성 효소EC 2.7.9.2(포스포에놀 피루베이트 생성 효소)	EP1108790	AX127144AX120700AX122469
ptsH	인산 전달효소 시스템 단백질 HEC 2.7.1.69(인산 전달효소 시스템 성분 H)	EP1108790WO0100844	AX122210AX127149 AX069154
ptsI	인산 전달효소 시스템 효소 IEC 2.7.3.9(인산 전달효소 시스템 효소 I)	EP1108790	AX122206AX127149
ptsM	글루코스-특이적 인산 전달효소 시스템 효소 IIEC 2.7.1.69(글루코스 인산 전달효소-시스템 효소II)	Lee 등., FEMS Microbiology Letters 119 (1-2):137-145 (1994)	L18874
pyc	피루베이트 탈탄산효소 EC 6.4.1.1(피루베이트 탈탄산효소)	WO9918228Peters-Wendisch 등., Microbiology 144:915-927 (1998)	A97276Y09548
pycP458S	피루베이트 탈탄산효소 EC 6.4.1.1(피루베이트 탈탄산효소)아미노산 교환 P458S	EP1108790
sigC	시그마 인자 CEC 2.7.7.6(세포질외부의 기능 대안적인 시그마 인자 C)	EP1108790	AX120368AX120085

sigD	RNA 중합 효소 시그마 인자 DEC 2.7.7.6(RNA 중합 효소 시그마 인자)	EP1108790	AX120753AX127144
sigE	시그마 인자 EEC 2.7.7.6(세포질외부의 기능 대안적인 시그마 인자 E)	EP1108790	AX127146 AX121325
sigH	시그마 인자 HEC 2.7.7.6(시그마 인자 SigH)	EP1108790	AX127145AX120939
sigM	시그마 인자 MEC 2.7.7.6(시그마 인자 SigM)	EP1108790	AX123500AX127153
tal	트랜스알돌레이즈EC 2.2.1.2(트랜스알돌레이즈)	WO0104325	AX076272
thrB	호모세린 키나아제EC 2.7.1.39(호모세린 키나아제)	Peoples 등., Molecular Microbiology 2:63-72 (1988)	Y00546
thrC	트레오닌 생산 효소 EC 4.2.99.2(트레오닌 생산 효소)	Han 등., Molecular Microbiology 4:1693-1702 (1990)	X56037
thrE	트레오닌 배출체(트레오닌 배출 운반체)	EP1085091	AX137526
thyA	티미딜레이트 생성 효소 EC 2.1.1.45(티미딜레이트 생성 효소)	EP1108790	AX121026AX127145
tkt	트랜스케톨레이즈EC 2.2.1.1(트랜스케톨레이즈)	Ikeda 등., NCBI	AB023377
tpi	트리오스 포스페이트 이소머레이즈 EC 5.3.1.1(트리오스 포스페이트 이소머레이즈)	Eikmanns, Journal of Bacteriology 174:6076-6086 (1992)	X59403
zwa1	세포 성장 인자 1(성장 인자 1)	EP1111062	AX133781
zwf	글루코스 6-포스페이트 1-탈수소효소EC 1.1.1.49(글루코스 6-포스페이트 1-탈수소효소)	EP1108790WO0104325	AX127148AX121827AX076272
zwfA213T	글루코스 6-포스페이트 1-탈수소효소EC 1.1.1.49(글루코스 6-포스페이트 1-탈수소효소)아미노산 교환 A213T	EP1108790

메티오닌 생산의 외래전사 해독 프레임, 유전자 및 대립유전자의 통합을 위한 표적 부위
유전자 명칭	코딩된 효소 또는 단백질의 기술	참조	접근 번호
ccpA1	분해산물 통제 단백질(분해산물 통제 단백질 A1)	WO0100844EP1108790	AX065267AX127147
ccpA2	분해산물 통제 단백질(분해산물 통제 단백질 A2)	WO0100844EP1108790	AX065267AX121594
citA	센서 키나아제 CitA(센서 키나아제 CitA)	EP1108790	AX120161
citB	전사 조절인자 CitB(전사 조절인자 CitB)	EP1108790	AX120163
citE	구연산염 분해효소EC 4.1.3.6(구연산염 분해효소)	WO0100844EP1108790	AX065421AX127146
ddh	디아미노피멜레이트 탈수소효소 EC 1.4.1.16(디아미노피멜레이트 탈수소효소)	Ishino 등., Nucleic Acids Research 15: 3917 (1987)EP1108790	S07384AX127152
gluA	글루타메이트 수송 ATP-결합 단백질(글루타메이트 수송 ATP-결합 단백질)	Kronemeyer 등., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluB	글루타메이트-결합 단백질(글루타메이트-결합 단백질)	Kronemeyer 등., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluC	글루타메이트 수송 투과 효소(글루타메이트 수송 시스템 투과 효소)	Kronemeyer 등., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluD	글루타메이트 수송 투과 효소(글루타메이트 수송 시스템 투과 효소)	Kronemeyer 등., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
glyA	글리신 히드록시메틸전달효소 EC 2.1.2.1(글리신 히드록시메틸전달효소)	WO0100843	AX063861AF327063
ilvA	트레오닌 탈수효소EC 4.2.1.16(트레오닌 탈수효소)	Mockel 등., Journal of Bacteriology 174 (24), 8065-8072 (1992)EP1108790	A47044L01508AX127150
ilvBN	아세토락테이트 생산효소EC 4.1.3.18(아세토락테이트 생산효소)	Keilhauer 등., Journal of Bacteriology 175(17):5595-603 (1993)EP1108790	L09232AX127147
ilvC	리덕토이소머레이즈 EC 1.1.1.86(케톨-산 리덕토이소머레이즈)	Keilhauer 등., Journal of Bacteriology 175(17):5595-603 (1993)EP1108790	C48648AX127147
ilvD	디히드록시-산 탈수효소EC 4.2.1.9(디히드록시-산 탈수효소)	EP1006189	AX136925

luxR	전사 조절인자 LuxR(전사 조절인자 LuxR)	WO0100842EP1108790	AX065953AX123320
luxS	히스티딘 키나아제 LuxS(히스티딘 키나아제 LuxS)	EP1108790	AX123323 AX127153
lysR1	전사 조절인자 LysR1(전사 조절인자 LysR1)	EP1108790	AX064673 AX127144
lysR2	전사 촉진인자 LysR2(전사 조절인자 LysR2)	EP1108790	AX123312
lysR3	전사 조절인자 LysR3(전사 조절인자 LysR3)	WO0100842EP1108790	AX065957AX127150
mdh	말레이트 탈수소효소EC 1.1.1.37(말레이트 탈수소효소)	WO0100844	AX064895
menE	O-숙시닐벤조산 CoA 연결 효소EC 6.2.1.26(O-숙시닐벤조에이트 CoA 연결 효소)	WO0100843EP1108790	AX064599 AX064193AX127144
metA	호모세린 O-아세틸전달효소EC 2.3.1.31(호모세린 O-아세틸전달효소)	Park 등., Molecular Cells 30;8(3):286-94 (1998)WO0100843EP1108790	AX063895AX127145
metD	전사 조절인자 MetD(전사 조절인자 MetD)	EP1108790	AX123327AX127153
pck	포스포에놀 피루베이트 카르복시키나아제(포스포에놀 피루베이트 카르복시키나아제)	WO0100844	AJ269506 AX065053
poxB	피루베이트 산화 효소EC 1.2.3.3(피루베이트 산화 효소)	WO0100844EP1096013	AX064959 AX137665
sigB	RNA 중합 효소 전사 인자(RNA 중합 효소 전사 인자)	EP1108790	AX127149
zwa2	세포 성장 인자 2(성장 인자 2)	EP1106693EP1108790	AX113822AX127146

본 발명은 따라서 또한 L-메티오닌 및/또는 L-트레오닌을 생산하는, 하기를 포함하는 코리네형 박테리아의 생산 방법을 제공한다

a) 임의로 발현 및/또는 조절 신호를 포함하는, 메티오닌 생산 또는 트레오닌 생산의 1개 이상의 목적하는 ORF, 유전자 또는 대립유전자의 뉴클레오티드 서열을 단리하는 것,

b) 표적 부위의 뉴클레오티드 서열과 함께 ORF, 유전자 또는 대립유전자의 5' 및 3' 말단을 제공하는 것으로, 여기서 상기 부위는 유전자내부 영역, 프로파지, 결손파지 또는 파지 성분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것,

c) 바람직하게는 코리네형 박테리아에서 복제되지 않거나, 또는 단지 제한된 정도로 복제되는 벡터 내에, 표적 부위의 뉴클레오티드 서열과 함께 제공되는 목적하는 ORF, 유전자 또는 대립유전자의 뉴클레오티드 서열을 혼입시키는 것,

d) 상기 b) 또는 c)에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 코리네형 박테리아내에 전이시키는 것, 및

f) 상기 a)에 따른 뉴클레오티드 서열이 표적 부위에 혼입된 코리네형 박테리아를 단리하는 것.

바람직하게는 상기 미생물에서 에피좀의 복제가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열, 전위가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열, 및 항생제에 저항성을 부여하는 뉴클레오티드 서열이 표적 부위에 남아있지 않다.

본 발명은 게다가 청구항 제 1 항에 따라 L-발린을 생산하는 코리네형 박테리아, 특히 코리네박테리움 속을 제공한다.

본 발명은 또한 게다가 청구항 제 20 항에 따라 L-발린의 제조 방법을 제공한다.

"발린 생산의 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자의 복제본"은 향상/과발현이 발린 생산을 증대시키는 효과를 가질 수 있는 외래전사 해독 프레임, 유전자 또는 대립유전자를 모두 의미하는 것으로 이해된다.

이들은 특히, 하기의 외래전사 해독 프레임, 유전자 또는 대립유전자를 포함한다: brnE, brnF, brnEF, cstA, cysD, dps, eno, fda, gap, gap2, gdh, ilvB, ilvN, ilvBN, ilvC, ilvD, ilvE msiK, pgk, ptsH, ptsI, ptsM, sigC, sigD, sigE, sigH, sigM, tpi, zwa1. 이들은 표 8에 요약되고 설명된다. 이들은 특히, 발린-저항성 아세토락테이트 생산효소를 코딩하는 ilvBN 대립유전자를 포함한다.

"피드백" 저항성 아세토락테이트 생산효소는 (= 아세토히드록시 산 합성효소), 발린 또는 발린 유사체 2-티아졸알라닌 이상에 의한 저해에 대해, 야생형 형태와 비교해서 저 민감도를 갖는 (10% 내지 15% 또는 10% 내지 20% 이상) 아세토락테이트 생산효소를 의미하는 것으로 이해된다 (EP 출원 제 03 014 640.1 호).

발린 생산의 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자의 3번째 또는 4번째 복제본은, 3번째 또는 4번째 부위에 통합될 수 있다. 하기 외래전사 해독 프레임, 유전자 또는 뉴클레오티드 서열이 특히, 통합에 대한 부위로서 사용될 수 있다: aecD, ccpA1, ccpA2, citA, citB, citE, ddh, gluA, gluB, gluC, gluD, glyA, ilvA, luxR, lysR1, lysR2, lysR3, panB, panC, poxB 및 zwa2. 이들은 표 9에 요약되고 설명된다.

유전자내부 영역, 프로파지, 결손파지 또는 파지 성분을 나타내는 코리네박테리움 글루타미쿰 염색체의 영역의 예는 표 12 및 표 13에서 제시된다. DNA 영역의 위치는 EP-A-1108790에서 또는 「유럽 분자생물학 연구소」 (EMBL, Heidelberg, Germany and Cambridge, UK)의 데이터 뱅크에 존재하는 바와 같이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 지도를 언급한다.

표 12의 유전자내부 영역의 경우에는 - 균주는 야생형마다 다르며 돌연변이 유발 처리를 받은 것에 따라 다양하므로 - 표 12에서 기술된 것과 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지고, 코딩 기능 즉, 유전자 또는 대립유전자를 포함하지 않은 영역을 본 발명에 따라 사용할 수 있다는 것이 당업자에 명백하다.

발린 생산의 외래전사 해독 프레임, 유전자 및 대립유전자
명칭	코딩된 효소 또는 단백질의 기술	참조	접근 번호
brnEF	분지쇄 아미노산의 배출(분지쇄 아미노산 배출)	EP1096010Kennerknecht 등., NCBI	AF454053
cstA	탄소 기아 단백질 A(탄소 기아 단백질 A)	EP1108790WO0100804	AX120811 AX066109
dps	DNA 보호 효소(기아 동안 보호 단백질)	EP1108790	AX127153
eno	에놀레이즈EC 4.2.1.11(에놀레이즈)	EP1108790WO0100844EP1090998Hermann 등., Electrophoresis 19:3217-3221 (1998)	AX127146 AX064945AX136862
fda	과당 비스포스페이트 알돌레이즈EC 4.1.2.13(과당 비스포스페이트 알돌레이즈)	van der Osten 등., Molecular Microbiology 3:1625-1637 (1989)	X17313
gap	글리세르알데히드 3-인산염 탈수소효소EC 1.2.1.12(글리세르알데히드 3-인산염 탈수소효소)	EP1108790WO0100844Eikmanns 등., Journal of Bacteriology 174:6076-6086(1992)	AX127148AX064941X59403
gap2	글리세르알데히드 3-인산염 탈수소효소EC 1.2.1.12(글리세르알데히드 3-인산염 탈수소효소 2)	EP1108790WO0100844	AX127146 AX064939
gdh	글루타메이트 탈수소효소EC 1.4.1.4(글루타메이트 탈수소효소)	EP1108790WO0100844Boermann 등., Molecular Microbiology 6:317-326 (1992);Guyonvarch 등., NCBI	AX127150AX063811X59404X72855
ilvBN	아세토락테이트 생산효소EC 4.1.3.18(아세토락테이트 생산효소)	Keilhauer 등., Journal of Bacteriology 175(17):5595-603 (1993)EP1108790	L09232AX127147
ilvC	이소메로환원 효소EC 1.1.1.86(아세토히드록시 산 이소메로환원 효소)	Keilhauer 등., Journal of Bacteriology 175(17):5595-603 (1993)EP1108790	C48648AX127147
ilvD	디히드록시-산 탈수효소EC 4.2.1.9(디히드록시산 탈수효소)	EP1006189	AX136925
ilvE	아미노기 전달효소 BEC 2.6.1.42(아미노기 전달효소 B)	EP1108790	AX127150AX122498

msiK	당 수입체(다중 당 수입체 단백질)	EP1108790	AX120892
pgk	포스포글리세레이트 키나아제EC 2.7.2.3(포스포글리세레이트 키나아제)	EP1108790WO0100844Eikmanns, Journal of Bacteriology 174:6076-6086 (1992)	AX121838AX127148AX064943X59403
ptsH	인산 전달효소 시스템 단백질 HEC 2.7.1.69(인산 전달효소 시스템 성분 H)	EP1108790WO0100844	AX122210AX127149 AX069154
ptsI	인산 전달효소 시스템 효소 IEC 2.7.3.9(인산 전달효소 시스템 효소 I)	EP1108790	AX122206AX127149
ptsM	글루코스-특이적 인산 전달효소 시스템 효소 IIEC 2.7.1.69(글루코스 인산 전달효소-시스템 효소II)	Lee 등., FEMS Microbiology Letters 119 (1-2):137-145 (1994)	L18874
sigC	시그마 인자 CEC 2.7.7.6(세포질외부의 기능 대안적인 시그마 인자 C)	EP1108790	AX120368AX120085
sigD	RNA 중합 효소 시그마 인자 DEC 2.7.7.6(RNA 중합 효소 시그마 인자)	EP1108790	AX120753AX127144
sigE	시그마 인자 EEC 2.7.7.6(세포질외부의 기능 대안적인 시그마 인자 E)	EP1108790	AX127146 AX121325
sigH	시그마 인자 HEC 2.7.7.6(시그마 인자 SigH)	EP1108790	AX127145AX120939
sigM	시그마 인자 MEC 2.7.7.6(시그마 인자 SigM)	EP1108790	AX123500AX127153
tpi	트리오스 포스페이트 이소머레이즈 EC 5.3.1.1(트리오스 포스페이트 이소머레이즈)	Eikmanns, Journal of Bacteriology 174:6076-6086 (1992)	X59403
zwa1	세포 성장 인자 1(성장 인자 1)	EP1111062	AX133781

트레오닌 생산의 외래전사 해독 프레임, 유전자 및 대립유전자의 통합을 위한 표적 부위
유전자 명칭	코딩된 효소 또는 단백질의 기술	참조	접근 번호
aecD	베타 C-S 분해효소EC 2.6.1.1(베타 C-S 분해효소)	Rossol 등., Journal of Bacteriology 174(9):2968-77 (1992)	M89931
ccpA1	분해산물 통제 단백질(분해산물 통제 단백질 A1)	WO0100844EP1108790	AX065267AX127147
ccpA2	분해산물 통제 단백질(분해산물 통제 단백질 A2)	WO0100844EP1108790	AX065267AX121594
citA	센서 키나아제 CitA(센서 키나아제 CitA)	EP1108790	AX120161
citB	전사 조절인자 CitB(전사 조절인자 CitB)	EP1108790	AX120163
citE	구연산염 분해효소EC 4.1.3.6(구연산염 분해효소)	WO0100844EP1108790	AX065421AX127146
ddh	디아미노피멜레이트 탈수소효소 EC 1.4.1.16(디아미노피멜레이트 탈수소효소)	Ishino 등., Nucleic Acids Research 15: 3917 (1987)EP1108790	S07384AX127152
gluA	글루타메이트 수송 ATP-결합 단백질(글루타메이트 수송 ATP-결합 단백질)	Kronemeyer 등., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluB	글루타메이트-결합 단백질(글루타메이트-결합 단백질)	Kronemeyer 등., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluC	글루타메이트 수송 투과 효소(글루타메이트 수송 시스템 투과 효소)	Kronemeyer 등., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluD	글루타메이트 수송 투과 효소(글루타메이트 수송 시스템 투과 효소)	Kronemeyer 등., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
glyA	글리신 히드록시메틸전달효소 EC 2.1.2.1(글리신 히드록시메틸전달효소)	WO0100843	AX063861AF327063
ilvA	트레오닌 탈수효소EC 4.2.1.16(트레오닌 탈수효소)	Mockel 등., Journal of Bacteriology 174 (24), 8065-8072 (1992)EP1108790	A47044L01508AX127150
luxR	전사 조절인자 LuxR(전사 조절인자 LuxR)	WO0100842EP1108790	AX065953AX123320
lysR1	전사 조절인자 LysR1(전사 조절인자 LysR1)	EP1108790	AX064673 AX127144
lysR2	전사 촉진인자 LysR2(전사 조절인자 LysR2)	EP1108790	AX123312
lysR3	전사 조절인자 LysR3(전사 조절인자 LysR3)	WO0100842EP1108790	AX065957AX127150

panB	케토판토에이트 히드록시메틸전달효소EC 2. 1. 2. 11(케토판토에이트 히드록시메틸전달효소)	US6177264	X96580
panC	판토테네이트 합성효소EC 6.3.2.1(판토테네이트 합성효소)	US6177264	X96580
poxB	피루베이트 산화 효소EC 1.2.3.3(피루베이트 산화 효소)	WO0100844EP1096013	AX064959 AX137665
zwa2	세포 성장 인자 2(성장 인자 2)	EP1106693EP1108790	AX113822AX127146

본 발명은 따라서 또한 L-발린을 생산하는 코리네형 박테리아의 생산 방법을 제공하고, 이는 하기를 포함한다

a) 임의로 발현 및/또는 조절 신호를 포함하는, 발린 생산의 1개 이상의 목적하는 ORF, 유전자 또는 대립유전자의 뉴클레오티드 서열을 단리하는 것,

c) 바람직하게는 코리네형 박테리아에서 복제되지 않거나, 또는 단지 제한된 정도로 복제되는 벡터 내에 표적 부위의 뉴클레오티드 서열과 함께 제공되는, 목적하는 ORF, 유전자 또는 대립유전자의 뉴클레오티드 서열을 혼입시키는 것,

e) 상기 a)에 따른 뉴클레오티드 서열이 표적 부위에 혼입되는 코리네형 박테리아를 단리하는 것.

상기 미생물에서 에피좀의 복제가 가능하거나/가능하게 하는, 또는 전위가 가능하거나/가능하게 하거나, 또는 항생제에 저항성을 부여하는 뉴클레오티드 서열이 벡터 기원과 함께 표적 부위에 남아있지 않다.

본 발명은 또한 게다가 L-트립토판 생산 방법을 제공하는 것으로, 하기 단계를 포함한다.

a) 코리네형 박테리아의 발효, 특히 청구항 제 1 항에 따른 코리네박테리움 글루타미쿰.

"트립토판 생산의 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자의 복제본"은 향상/과발현이 트립토판 생산을 증대시키는 효과를 가질 수 있는 외래전사 해독 프레임, 유전자 또는 대립유전자를 모두 의미하는 것으로 이해된다.

상기는 특히, 하기의 외래전사 해독 프레임, 유전자 또는 대립유전자를 포함한다: aroA, aroB, aroC, aroD, aroE, aroG, aroK, cstA, eno, gap, gap2, gnd, ppsA, rpe, serA, serB, serC, tal, thyA, tkt, tpi, trpA, trpB, trpC, 임의로, A215T (215 위치에서 알라닌을 트레오닌으로 치환), D138A (138 위치에서 아스파르트산을 알라닌으로 치환), S149F (149 위치에서 세린을 페닐알라닌으로 치환) 및 A162E (162 위치에서 알라닌을 글루탐산으로 치환)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 trpD , trpE, 예, 아미노산 치환 S38R (38 위치에서 세린을 아르기닌으로 치환)을 함유하는 trpE^FBR, trpG, 임의로 돌연변이 W14*를 함유하는 trpL , zwa1, 임의로 아미노산 치환 A213T (213 위치에서 알라닌을 트레오닌으로 치환)을 함유하는 zwf. 이들은 표 10에 요약되고 설명된다. 게다가 이들은 특히, 트립토판-저항성 안트라닐레이트 생성 효소를 코딩하는 trpE, trpG, trpD, trpC 및 trpA 및 임의로 trpL을 포함하는 트립토판 오페론을 포함한다.

"피드백" 저항성 안트라닐레이트 생성 효소는, 트립토판 또는 5-플루오로트립토판 (Matsui 등., Journal of Bacteriology 169 (11): 5330 5332(1987)) 또는 비슷한 유사체에 의한 저해에 대해 야생형 형태와 비교해서 저 민감도를 갖는 (5% 내지 10%, 10% 내지 15% 또는 10% 내지 20% 이상), 안트라닐레이트 생성 효소를 의미하는 것으로 이해된다. L-트립토판을 생산하는 균주는 전형적으로 상기 "피드백" 저항성 또는 감감화된 호모세린 탈수소효소 안트라닐레이트 생성 효소 (예를 들어, US 6180373 및 EP 0338474 참조)를 포함한다.

트립토판 생산의 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자의 3번째 또는 4번째 복제본은, 3번째 또는 4번째 부위에 통합될 수 있다. 하기 외래전사 해독 프레임, 유전자 또는 뉴클레오티드 서열이, 특히, 통합에 대한 부위로서 사용될 수 있다: ccpA1, ccpA2, citA, citB, citE, cysE, gluA, gluB, gluC, gluD, glyA, luxR, luxS, lysR1, lysR2, lysR3, menE, pgi, pheA, poxB 및 zwa2. 이들은 표 11에 요약되고 설명된다.

트레오닌 생산의 외래전사 해독 프레임, 유전자 및 대립유전자
유전자 명칭	코딩된 효소 또는 단백질의 기술	참조	접근 번호
aroA	에놀피루빌쉬키메이트 포스페이트 생성 효소EC 2.5.1.19(에놀피루빌쉬키메이트 3-포스페이트 생성 효소)	O'Donohue 등., NCBI	AF114233
aroB	데히드로퀴네이트 합성효소 EC 4.6.1.3(데히드로퀴네이트 합성효소)	Burke 등., NCBI	AF124600
aroC	코리스메이트 생성 효소 EC 4.6.1.4(코리스메이트 생성 효소)	Burke 등., NCBI	AF124600
aroD	데히드로퀴네이트 탈수효소 EC 4.2.1.10(데히드로퀴네이트 탈수효소)	Joy 등., NCBI	AF124518
aroE	쉬키메이트 탈수소효소 EC 1.1.1.25(쉬키메이트 탈수소효소)	Joy 등., NCBI	AF124518
aroG	데히드로-3-데옥시포스포헵토네이트 알돌레이즈 EC4.1.2.15(데히드로-3-데옥시포스포헵토네이트 알돌레이즈)	Chen 등., FEMS Microbioliology Letters 107:223-230(1993).	L07603
aroK	쉬키메이트 키나아제 EC 2.7.1.71(쉬키메이트 키나아제)	Burke 등., NCBI	AF124600
cstA	탄소 기아 단백질 A(탄소 기아 단백질 A)	EP1108790WO0100804	AX120811 AX066109
eno	에놀레이즈EC 4.2.1.11(에놀레이즈)	EP1108790WO0100844EP1090998Hermann 등., Electrophoresis 19:3217-3221 (1998)	AX127146AX064945AX136862
gap	글리세르알데히드-3-인산염 탈수소효소EC 1.2.1.12(글리세르알데히드-3-인산염 탈수소효소)	EP1108790WO0100844Eikmanns 등., Journal of Bacteriology 174:6076-6086(1992)	AX127148AX064941X59403
gap2	글리세르알데히드-3-인산염 탈수소효소EC 1.2.1.12(글리세르알데히드-3-인산염 탈수소효소 2)	EP1108790WO0100844	AX127146AX064939
gnd	6-포스포글루코네이트 탈수소효소EC 1.1.1.44(6-포스포글루코네이트 탈수소효소)	EP1108790WO0100844	AX127147AX121689AX065125

ppsA	포스포에놀피루베이트 합성효소Ec 2.7.9.2(포스포에놀피루베이트-생성 효소)	EP1108790	AX127144AX120700
rpe	리불로스-포스페이트 에피머레이즈 EC 5.1.3.1(리불로스-포스페이트-에피머레이즈)	EP1108790	AX127148AX121852
serA	포스포글리세레이트 탈수소효소 EC1.1.1.95(포스포글리세레이트-탈수소효소)	EP1108790	AX127147AX121499
serB	포스포세린 포스파테이즈 EC 3.1.3.3(포스포세린 포스파테이즈)	EP1108790	AX127144AX120551
serC	포스포세린 아미노전달효소 EC 2.6.1.52(포스포세린 아미노전달효소)	EP1108790	AX127145AX121012
tal	트랜스알돌레이즈EC 2.2.1.2(트랜스알돌레이즈)	WO0104325	AX076272
thyA	티미딜레이트 생성 효소 EC 2.1.1.45(티미딜레이트 생성 효소)	EP1108790	AX121026AX127145
tkt	트랜스케톨레이즈EC 2.2.1.1(트랜스케톨레이즈)	Ikeda 등., NCBI	AB023377
tpi	트리오스-포스페이트 이소머레이즈 EC 5.3.1.1(트리오스-포스페이트 이소머레이즈)	Eikmanns, Journal of Bacteriology 174:6076-6086 (1992)	X59403
trpA	트립토판 생산 효소 (알파 케테) EC 4.2.1.20(트립토판 생산 효소 (알파 사슬))	Matsui 등., Nucleic Acids Research 14:10113-10114 (1986)	X04960
trpB	트립토판 생산 효소 (베타 케테) EC 4.2.1.20(트립토판 생산 효소 (베타 사슬))	Matsui 등., Nucleic Acids Research 14:10113-10114 (1986)	X04960
trpC	포스포리보실안트라닐레이트 이소머레이즈 EC 5.3.1.24(포스포리보실안트라닐레이트 이소머레이즈)	Matsui 등., Nucleic Acids Research 14:10113-10114 (1986)	X04960
trpD	안트라닐레이트 포스포리보실전달효소 EC 2.4.2.18(안트라닐레이트 포스포리보실전달효소)	Matsui 등., Nucleic Acids Research 14:10113-10114 (1986)	X04960

trpDA125T, D138A, S149F, A162E	안트라닐레이트 포스포리보실전달효소 EC 2.4.2.18안트라닐레이트 (포스포리보실전달효소) 아미노산 교환 A125T, D138A, S149F, A162E	O'Gara 등., Applied and Environmental Microbiology 61:4477-4479 (1995)
trpE	안트라닐레이트 생성 효소 성분 I EC 4.1.3.27(안트라닐레이트 생성 효소 성분 I)	Matsui 등., Nucleic Acids Research 14:10113-10114 (1986)	X04960
trpE fbr	안트라닐레이트 생성 효소 성분 I 피드백 저항성EC 4.1.3.27(안트라닐레이트 생성 효소 성분 I 피드백 저항성)	Matsui 등., Journal of Bacteriology 169:5330-5332 (1987)
trpG	안트라닐레이트 생성 효소 성분 IIEC 4.1.3.24(안트라닐레이트 생성 효소 성분 II)	Matsui 등., Nucleic Acids Research 14:10113-10114 (1986)	X04960
trpL	Trp 오페론 선도 펩티드(trp 오페론 선도 펩티드)	Matsui 등., Nucleic Acids Research 14:10113-10114 (1986)	X04960
trpL W14*	Trp 오페론 선도 펩티드(trp 오페론 선도 펩티드 돌연변이 W14*)	Herry 등., Applied and Environmental Microbiology 59:791-799 (1993)
zwa1	세포 성장 인자 1(성장 인자 1)	EP1111062	AX133781
zwf	글루코스-6-포스페이트-1-탈수소효소EC 1.1.1.49(글루코스-6-포스페이트-1-탈수소효소)	EP1108790WO0104325	AX127148AX121827AX076272
zwfA213T	글루코스-6-포스페이트-1-탈수소효소EC 1.1.1.49(글루코스-6-포스페이트-1-탈수소효소)아미노산 교환 A213T	EP1108790

트립토판 생산의 외래전사 해독 프레임, 유전자 및 대립유전자의 통합을 위한 표적 부위
유전자 명칭	코딩된 효소 또는 단백질의 기술	참조	접근 번호
ccpA1	분해산물 통제 단백질(분해산물 통제 단백질 A1)	WO0100844EP1108790	AX065267AX127147
ccpA2	분해산물 통제 단백질(분해산물 통제 단백질 A2)	WO0100844EP1108790	AX065267AX121594
citA	센서-키나아제 CitA(센서 키나아제 CitA)	EP1108790	AX120161
citB	전사 조절인자 CitB(전사 조절인자 CitB)	EP1108790	AX120163
citE	구연산염-분해효소EC 4.1.3.6(구연산염 분해효소)	WO0100844EP1108790	AX065421AX127146
cysE	세린 O-아세틸전달효소 EC 2.3.1.30(세린 O-아세틸전달효소)	EP1108790	AX122902
gluA	글루타메이트 수송 ATP-결합 단백질(글루타메이트 수송 ATP-결합 단백질)	Kronemeyer 등., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluB	글루타메이트-결합 단백질(글루타메이트 결합 단백질)	Kronemeyer 등., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluC	글루타메이트 수송 투과 효소(글루타메이트 수송 시스템 투과 효소)	Kronemeyer 등., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluD	글루타메이트 수송 투과 효소(글루타메이트 수송 시스템 투과 효소)	Kronemeyer 등., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
glyA	글리신 히드록시메틸전달효소 EC 2.1.2.1(글리신 히드록시메틸전달효소)	JP1997028391	E12594
luxR	전사 조절인자 LuxR(전사 조절인자 LuxR)	WO0100842EP1108790	AX065953AX123320
luxS	히스티딘 키나아제 LuxS(히스티딘 키나아제 LuxS)	EP1108790	AX123323 AX127153
lysR1	전사 조절인자 LysR1(전사 조절인자 LysR1)	EP1108790	AX064673 AX127144
lysR2	전사 활성인자 LysR2(전사 조절인자 LysR2)	EP1108790	AX123312
lysR3	전사 조절인자 LysR3(전사 조절인자 LysR3)	WO0100842EP1108790	AX065957AX127150
menE	O-숙시닐벤조산-CoA-연결 효소EC 6.2.1.26(O-숙시닐벤조에이트-CoA 연결 효소)	WO0100843EP1108790	AX064599 AX064193AX127144

pgi	글루코스-6-포스페이트-이소머레이즈 EC 5.3.1.9(글루코스-6-포스페이트 이소머레이즈)	EP1087015EP1108790	AX136015AX127146
pheA	프레페네이트 탈수효소 EC 4.2.1.51(프레페네이트 탈수효소)	Follettie 등., Journal of Bacteriology 167:695-702(1986)	M13774
poxB	피루베이트-산화 효소EC 1.2.3.3(피루베이트 산화 효소)	WO0100844EP1096013	AX064959 AX137665
zwa2	세포 성장 인자 2(성장 인자 2)	EP1106693EP1108790	AX113822AX127146

본 발명은 따라서 또한 L-트립토판을 생산하는 코리네형 박테리아의 생산 방법을 제공하는 것으로, 이는 하기를 포함한다

a) 임의로 발현 및/또는 조절 신호를 포함하는, 트립토판 생산의 1개 이상의 목적하는 ORF, 유전자 또는 대립유전자의 뉴클레오티드 서열을 단리하는 것,

c) 바람직하게는 코리네형 박테리아에서 단지 제한된 정도로 복제되거나 또는 복제되지 않는 벡터 내에 표적 부위의 뉴클레오티드 서열과 함께 제공되는 목적하는 ORF, 유전자 또는 대립유전자의 뉴클레오티드 서열을 혼입시키는 것,

상기 미생물에서 에피좀의 복제가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열, 또는 전위가 가능하거나/가능하게 하거나, 또는 항생제에 저항성을 부여하는 뉴클레오티드 서열이 표적 부위에 남아있지 않음.

외래전사 해독 프레임, 유전자 및 대립유전자의 통합을 위한 표적 부위로서 유전자내부 영역
참조	접근 번호	서열 시작의 위치	서열 말단의 위치
EP1108790	AX120085	192176	194501
EP1108790	AX127145	235840	237311
EP1108790	AX127145	236096	237311
EP1108790	AX127148	322628	330877
EP1108790	AX127148	334045	336467
EP1108790	AX127148	289565	291841
EP1108790	AX127149	154823	161111
EP1108790	AX127149	190088	193497
EP1108790	AX127149	27398	28707
EP1108790	AX127149	61478	62944
EP1108790	AX127149	116234	117561
EP1108790	AX127149	140847	144605
EP1108790	AX127150	113274	114324
EP1108790	AX127152	244281	246403

외래전사 해독 프레임, 유전자 및 대립유전자의 통합에 적절한 파지 또는 파지 성분을 코딩하는 표적 부위
참조	접근 번호	서열 시작의 위치	서열 말단의 위치
EP1108790	AX127149	50474	51049
EP1108790	AX127149	67886	68587
EP1108790	AX127151	72893	73480
EP1108790	AX127149	88231	89445
EP1108790	AX127148	139781	140155
EP1108790	AX127148	140546	141001
EP1108790	AX127149	194608	195294
EP1108790	AX127147	200185	200940
EP1108790	AX127147	208157	208450
EP1108790	AX127149	269616	269948
EP1108790	AX127148	336468	338324
EP1108790	AX127148	342235	342681
EP1108790	AX127148	343518	345356
EP1108790	AX127148	345872	346207

본 발명에 대한 연구 동안에, lysC^FBR 대립유전자의 2번째 복제본을, 미생물에서 에피좀의 복제가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열, 전위가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열 및 항생제에 저항성을 부여하는 뉴클레오티드 서열이 gluB 유전자 부위에 남아 있지 않은, 코리네박테리움 글루타미쿰의 gluB 유전자 내로 혼입하였다. DSM13994glu::lysC라고 불리는 상기 균주는, 그것의 본래 lysC 부위에 lysC^FBR 대립유전자 lysC T311I 및 2번째 부위 (표적 부위), 즉 gluB 유전자에 lysC^FBR 대립유전자 lysC T311I의 2번째 복제본을 지닌다. gluB 유전자 내로 lysC^FBR 대립유전자의 혼입으로 수득할 수 있는 플라스미드는 도 1에서 제시된다. 그것은 명칭 pK18mobsacBglu1_1을 갖는다.

본 발명에 대한 연구 동안에, lysC^FBR 대립유전자의 복제본을, 미생물에서 에피좀의 복제가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열, 전위가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열 및 항생제에 저항성을 부여하는 뉴클레오티드 서열이 gluB 유전자 부위에 남아 있지 않은, 표적 부위로서 코리네박테리움 글루타미쿰의 gluB 유전자 내로 혼입하였다. DSM12866glu::lysC라고 불리는 상기 균주는, 그것의 본래 lysC 부위에 lysC 유전자의 야생형 형태 및 2번째 부위에 (표적 부위) lysC^FBR 대립유전자 lysC T311I의 형태로 lysC 유전자의 2번째 복제본, 즉 gluB 유전자를 지닌다. 그것은 「Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen」 (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)에 번호 DSM15039 로 수탁하였다. gluB 유전자 내로 lysC^FBR 대립유전자의 혼입으로 수득할 수 있는 플라스미드는 도 1에서 제시된다. 그것은 명칭 pK18mobsacBglu1_1을 갖는다.

본 발명에 대한 연구 동안에, lysC^FBR 대립유전자의 복제본을, 미생물에서 에피좀의 복제가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열, 전위가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열 및 항생제에 저항성을 부여하는 뉴클레오티드 서열이 aecD 유전자 부위에 남아 있지 않은, 표적 부위로서 코리네박테리움 글루타미쿰의 aecD 유전자내에 혼입하였다. DSM12866aecD::lysC라고 불리는 상기 균주는, 그것의 본래 lysC 부위에 lysC 유전자의 야생형 형태 및 2번째 부위에 (표적 부위) lysC^FBR 대립유전자 lysC T311I의 형태로 lysC 유전자의 2번째 복제본, 즉 aecD 유전자를 지닌다. aecD 유전자 내로 lysC^FBR 대립유전자의 혼입으로 수득할 수 있는 플라스미드는 도 2에서 제시된다. 그것은 명칭 pK18mobsacBaecD1_1을 갖는다.

본 발명에 대한 연구 동안에, lysC^FBR 대립유전자의 복제본을, 미생물에서 에피좀의 복제가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열, 전위가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열 및 항생제에 저항성을 부여하는 뉴클레오티드 서열이 gluB 유전자 부위에 남아 있지 않은, 표적 부위로서 코리네박테리움 글루타미쿰의 pck 유전자 내로 혼입하였다. DSM12866pck::lysC라고 불리는 상기 균주는, 그것의 본래 lysC 부위에 lysC 유전자의 야생형 형태 및 2번째 부위에 (표적 부위) lysC^FBR 대립유전자 lysC T311I의 형태로 lysC 유전자의 2번째 복제본, 즉 pck 유전자를 지닌다. pck 유전자 내로 혼입으로 수득할 수 있는 플라스미드는 도 3에서 제시된다. 그것은 명칭 pK18mobsacBpck1_1을 갖는다.

본 발명에 대한 연구 동안에, ddh 유전자의 복제본을, 미생물에서 에피좀의 복제가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열, 전위가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열 및 항생제에 저항성을 부여하는 뉴클레오티드 서열이 gluB 유전자 부위에 남아 있지 않은, 표적 부위로서 코리네박테리움 글루타미쿰의 gluB 유전자 내로 혼입하였다. DSM12866glu::ddh라고 불리는 상기 균주는, 그것의 본래 ddh 부위에 ddh 유전자의 복제본 및 2번째 부위에 (표적 부위) ddh 유전자의 2번째 복제본, 즉 gluB 유전자를 지닌다. gluB 유전자 내로 ddh 유전자의 혼입으로 수득할 수 있는 플라스미드는 도 4에 제시된다. 그것은 명칭 pK18mobsacBgluB2_1을 갖는다.

본 발명에 대한 연구 동안에, dapA 유전자의 복제본을, 미생물에서 에피좀의 복제가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열, 전위가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열 및 항생제에 저항성을 부여하는 뉴클레오티드 서열이 aecD 유전자 부위에 남아 있지 않은, 표적 부위로서 코리네박테리움 글루타미쿰의 aecD 유전자 내로 혼입하였다. DSM12866aecD::dapA라고 불리는 상기 균주는, 그것의 본래 dapA 부위에 dapA 유전자의 복제본 및 2번째 부위에 (표적 부위) dapA 유전자의 2번째 복제본, 즉 aecD 유전자를 지닌다. aecD 유전자 내로 dapA 유전자의 혼입으로 수득할 수 있는 플라스미드는 도 5에 제시된다. 그것은 명칭 pK18mobsacBaecD2_1을 갖는다.

본 발명에 대한 연구 동안에, pyc 대립유전자의 복제본을, 미생물에서 에피좀의 복제가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열, 전위가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열, 항생제에 저항성을 부여하는 뉴클레오티드 서열이 aecD 유전자 부위에 남아 있지 않은, 표적 부위로서 코리네박테리움 글루타미쿰의 pck 유전자 내로 혼입하였다. DSM12866pck::pyc라고 불리는 상기 균주는, 그것의 본래 pyc 부위에 야생형 형태의 pyc 유전자의 복제본 및 2번째 부위에 (표적 부위) pyc 대립유전자 pyc P458S의 형태로 pck 유전자의 2번째 복제본, 즉 pck 유전자를 지닌다. pck 유전자 내로 pyc 유전자의 혼입으로 수득할 수 있는 플라스미드는 도 6에 제시된다. 그것은 명칭 pK18mobsacBpck1_3을 갖는다.

본 발명에 대한 연구 동안에, 트립토판 오페론의 복제본을, 미생물에서 에피좀의 복제가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열, 전위가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열, 항생제에 저항성을 부여하는 뉴클레오티드 서열이 표적 부위에 남아 있지 않은, 표 12 (표적 부위)로 부터 선택되는 코리네박테리움 글루타미쿰의 유전자내부 영역으로 혼입하였다. ATCC21850nc::trp이라고 불리는 상기 균주는, 트립토판 오페론의 복제본 즉, 그의 본래 트립트판 오페론 부위에 균주 ATCC 21850의 트립토판 오페론 및 2번째 부위에 (표적 부위) 상기 트립트판 오페론의 2번째 복제본, 즉 표 12에 따른 27398 내지 28707 위치를 가진 유전자내부 영역을 지닌다. 상기 표적 부위 내로 상기 트립토판 오페론의 혼입으로 수득할 수 있는 플라스미드는 도 9에 제시된다. 그것은 명칭 pK18mobsacBnc::trp을 갖는다.

본 발명에 대한 연구 동안에, 트립토판 오페론의 복제본을, 미생물에서 에피좀의 복제가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열, 전위가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열, 항생제에 저항성을 부여하는 뉴클레오티드 서열이 표적 부위에 남아 있지 않은, 프로파지, 결손파지 또는 파지 성분을 암호화하는 표 12 (표적 부위)로부터 선택되는 코리네박테리움 글루타미쿰의 유전자내부 영역으로 혼입하였다. ATCC21850pha1::trp이라고 불리는 상기 균주는, 트립토판 오페론의 복제본 즉, 그의 본래 트립트판 오페론 부위에 균주 ATCC 21850의 트립토판 오페론 및 2번째 부위에 (표적 부위) 상기 트립트판 오페론의 2번째 복제본, 즉 표 13에 따른 88231 내지 89445 위치를 가진 유전자내부 영역을 지닌다. 상기 표적 부위 내로 상기 트립토판 오페론의 혼입으로 수득할 수 있는 플라스미드는 도 10에 제시된다. 그것은 명칭 pK18mobsacBpha1::trp을 갖는다.

본 발명에 따라 생성되는 코리네형 박테리아는 화합물의 생성 목적으로 연속적으로 또는 비연속적으로 뱃치법 (뱃치 배양) 또는 주입 뱃치 (주입법) 또는 연속된 주입 뱃치법 (반복되는 주입법)으로 배양할 수 있다. 공지된 배양 방법에 대한 요약은 Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) 또는 Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))에 의한 텍스트에 기재된다.

사용되는 배양 배지는 적합한 방법으로 특정 균주의 요구를 충족시킨다. 다양한 미생물을 위한 배양 배지의 기술은 전문서 "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)에 포함된다.

당 및 탄수화물, 예컨대 예, 글루코스, 수크로스, 락토오스, 과당, 말토오스, 당밀, 녹말 및 섬유소, 오일 및 지방, 예컨대, 소야 오일, 해바라기 오일, 땅콩 오일 및 코코넛 지방, 지방산, 예컨대, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산, 알콜, 예컨대, 글리세롤 및 에탄올, 및 유기산, 예컨대, 아세트산 또는 락트산을, 탄소 공급원으로 사용할 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로 사용할 수 있다.

유기 질소-함유 화합물, 예컨대 펩톤, 이스트 추출물, 육류 추출물, 말트 추출물, 옥수수침지액, 소야 콩 소맥분 및 우레아, 또는 무기 화합물, 예컨대 암모늄 술페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 포스페이트, 암모늄 카르보네이트 및 암모늄 니트레이트를, 질소 공급원으로 사용할 수 있다. 질소 공급원은 개별적으로 또는 혼합물로 사용할 수 있다.

인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염을 인 공급원으로 사용할 수 있다. 배양 배지는 게다가 성장에 필수적인 금속 염, 예컨대 예, 마그네슘 술페이트 또는 철 술페이트를 포함해야만 한다. 마지막으로, 필수 성장 물질, 예컨대 아미노산 및 비타민을 상기 언급한 물질에 더해서 사용할 수 있다. 적합한 전구체를 더욱이 배양 배지에 첨가할 수 있다. 언급된 출발 물질은 단일 뱃치의 형태로 포함할 수 있거나, 또는 배양동안에 적합한 방법으로 주입할 수 있다.

염기 화합물, 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 수성 암모니아, 또는 산 화합물, 예컨대 인산 또는 술푸르산을, 배양의 pH를 조절하기 위해 적합한 방법으로 사용할 수 있다. 소포제, 예컨대 예, 지방산 폴리글리콜 에스테르를 거품의 발달을 조절하기 위해 사용할 수 있다. 선별 작용을 가진 적합한 물질, 예컨대 예, 항생제를 플라스미드의 안정성을 유지시키기 위해 배지에 첨가할 수 있다. 호기성 상태를 유지하기 위해, 산소 또는 산소-함유 산소 예컨대 예, 공기가 배양내로 혼입된다. 배양 온도는 일반적으로 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃ 이다. 배양은 최대치의 목적하는 화합물이 형성될 때까지 계속된다. 상기 표적은 일반적으로 10 시간 내지 160 시간내에 도달하였다.

본 발명에 따른 코리네형 박테리아, 특히 L-리신을 생성하는 코리네형 박테리아는, 예상치 못한 높은 안정성을 가지고 있다는 것을 발견하였다. 이들은 10-20, 20-30, 30-40, 40-50 이상, 바람직하게는 50-60, 60-70, 70-80 및 80-90 세대 또는 세포 분열 주기 이상 안정했다.

하기 미생물을 수탁하였다:

균주 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM12866glu::lysC를 순수 배양의 형태로 부다페스트 조약(Budapest Treaty)에 따라 2002년 6월 5일에 「Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen」 (DSMZ = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany)에서 번호 DSM15039로 수탁하였다.

플라스미드 pK18mobsacBglu1_1을 균주 이콜라이 DH5αmcr/pK18mobsacBglu1_1 (=DH5αlphamcr/pK18mobsacBglu1_1)의 순수 배양의 형태로 부다페스트 조약에 따라 2001년 4월 20일에 「Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen」 (DSMZ, Braunschweig, Germany)에서 번호 DSM14243으로 수탁하였다.

플라스미드 pK18mobsacBaecD1_1을 이콜라이 DH5αmcr/pK18mobsacBaecD1_1 (= DH5αlphamcr/pK18mobsacBaecD1_1)의 순수 배양의 형태로 부다페스트 조약에 따라 2002년 6월 5일에 「Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen」 (DSMZ, Braunschweig, Germany)에서 번호 DSM15040으로 수탁하였다.

실시예 1

lysC^FBR 대립유전자의 2번째 복제본을 균주 DSM13994 및 균주 DSM12866의 염색체 내로 혼입

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM13994는 C. 글루타미쿰 ATCC13032로부터 다중, 비-유도된 돌연변이 유발, 선별 및 돌연변이체 선별로부터 생성되었다. 상기 균주는 리신 유사체 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 저항성이고, 리신과 트레오닌의 혼합물(각 경우에서 25 mM)에 의한 억제에 민감하지 않은 피드백-저항성인 아스파테이트 키나아제를 갖는다. 상기 균주의 lysC^FBR 대립유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호:3에 제시된다. 이것은 또한 하기에서 lysC T311I라고 불린다. 코딩된 아스파테이트 키나아제 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호:4에 제시된다. 상기 균주의 순수 배양은 부다페스트 조약에 따라 2001년 1월 16일에 「Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen」 (DSMZ = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany)에 수탁하였다.

균주 DSM12866은 비-유도된 돌연변이 유발 및 바로 그 L-리신 축적물과 함께 돌연변이체의 선별에 의해 C. 글루타미쿰 ATCC13032로부터 생산되었다. 이것은 메티오닌-민감성이다. L-메티오닌을 함유하는 최소 배지에서 성장은 트레오닌의 첨가에 의해 재-확립될 수 있다. 상기 균주는 서열 번호:1에서 제시된 바와 같이 야생형 형태의 lysC 유전자를 갖는다. 야생형 아스파테이트 키나아제 단백질에 상응하는 아미노산 서열은 서열 번호:2에 제시된다. 상기 균주의 순수 배양은 부다페스트 조약에 따라 1999년 6월 10일에 「Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen」 (DSMZ, Braunschweig, Germany)에 수탁하였다.

1.1 균주 DSM13994의 lysC 대립유전자 DNA의 단리 및 서열분석

균주 DSM13994로 부터, 염색체 DNA를 통상적인 방법 (Eikmanns 등., Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994))에 의해 단리한다. 중합 효소 연쇄 반응으로, lysC 유전자 또는 대립유전자를 가진 DNA 구획을 증폭시킨다. C. 글루타미쿰에 대해 공지된 lysC 유전자의 서열에 기초해서 (Kalinowski 등., Molecular Microbiology, 5 (5), 1197 1204 (1991); 접근 번호 X57226), 하기 프라이머 올리고뉴클레오티드가 PCR을 위해 선택되었다:

lysC1beg (서열 번호: 5):

5` TA(G GAT CC)T CCG GTG TCT GAC CAC GGT G 3`

lysC2end: (서열 번호: 6):

5` AC(G GAT CC)G CTG GGA AAT TGC GCT CTT CC 3`

제시된 프라이머는 MWG Biotech사에서 합성되고, PCR 반응은 Innis 등. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press)의 표준 PCR 방법에 의해 수행한다. 프라이머는 lysC 유전자 또는 대립유전자를 가진 길이 대략 1.7 kb의 DNA 구획을 증폭하게 한다. 프라이머는 더욱이 상기 제시된 뉴클레오티드 서열에서 삽입으로 표시된 제한 효소 BamHI의 절단 서열을 포함한다.

균주 DSM13994의 lysC 대립유전자를 가진 증폭된 길이 1.7 kb의 DNA 구획을0.8% 아가로스 젤에서 전기 영동으로 확인하고, 젤로부터 단리하고, 통상적인 방법 (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden)에 따라 정제한다.

그 다음, 조각의 라이게이션(ligation)은 벡터 pCRII-TOPO 내에서 Topo TA Cloning Kit (Invitrogen, Leek, The Netherlands, 카탈로그 번호 K4600-01)을 사용하여 수행한다. 라이게이션 뱃치를 이콜라이 균주 TOP10 (Invitrogen, Leek, The Netherlands)에서 형질전환시킨다. 플라스미드-함유 세포의 선별은 X-Gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 β-D-갈락토피라노시드, 64　mg/l)이 있는 LB 카나마이신 (50 mg/l)-함유 LB 아가(agar)상에 플레이팅해서 수행한다.

수득된 플라스미드를 제한 효소 절단으로 확인하고, DNA를 단리한 후, 아가로스 젤에서 확인한다. 수득된 플라스미드를 pCRIITOPOlysC라고 부른다.

증폭된 DNA 조각 또는 PCR 생성물의 뉴클레오티드 서열은 PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Germany)사의 "ABI Prism 377" 서열분석 장치를 사용하여 Sanger 등. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 74:5463-5467 (1977))의 디데옥시 연쇄 종결법에 의해서 분석한다. PCR 생성물의 코딩 영역의 서열은 서열 번호:3에 제시된다. 관련된 아스파테이트 키나아제 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호:4에 제시된다.

염기 티민은 균주 DSM13994의 the lysC^FBR 대립유전자의 코딩 영역의 위치 932의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호:3)에서 발견된다. 염기 시토신은 야생형 유전자 (서열 번호:1)의 상응하는 위치에서 발견된다.

아미노산 이소루신은 균주 DSM13994의 아스파테이트 키나아제 단백질의 아미노산 서열 (서열 번호:4)의 위치 311에서 발견된다. 아미노산 트레오닌은 야생형 단백질 (서열 번호:2)의 상응하는 위치에서 발견된다.

염기 티민을 코딩 영역의 위치 932에 함유하고, 따라서 아미노산 서열의 311 위치에 아미노산 이소루신을 포함하는 아스파테이트 키나아제 단백질을 코딩하는 lysC 대립유전자는, 하기에서 lysC^FBR 대립유전자 또는 lysC T311I이라고 불린다.

lysC^FBR 대립유전자 lysC T311I을 가진 플라스미드 pCRIITOPOlysC는, 부다페스트 조약에 따라 균주 이콜라이 TOP 10/pCRIITOPOlysC의 순수 배양의 형태로 2001년 4월 20일에 「Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen」 (DSMZ, Braunschweig, Germany)에서 번호 DSM14242로 수탁하였다.

1.2 교체 벡터 pK18mobsacBglu1_1의 제작

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC13032를 염색체 DNA를 위한 공여체로 사용한다. 균주 ATCC13032로부터, 염색체 DNA를 통상적인 방법 (Eikmanns 등., Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994))을 이용하여 단리한다. 중합 효소 연쇄 반응으로, gluB 유전자 및 주변 영역을 가진 DNA 단편을 증폭시킨다. C. 글루타미쿰에 대해 공지된 gluABCD 유전자 클러스터(cluster)의 서열에 기초해 (Kronemeyer 등., Journal of Bacteriology, 177: 1152 1158 (1995)) (접근 번호 X81191), 하기 프라이머 올리고뉴클레오티드가 PCR을 위해 선택된다:

gluBgl1 (서열 번호: 7):

5` TA(A GAT CT)G TGT TGG ACG TCA TGG CAA G 3`

gluBgl2 (서열 번호: 8):

5` AC(A GAT CT)T GAA GCC AAG TAC GGC CAA G 3`

제시된 프라이머는 MWG Biotech사에서 합성되고, PCR 반응은 Innis 등. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press)의 표준 PCR 방법에 의해 수행한다. 프라이머는 gluB 유전자 및 주변 영역을 지닌 대략 1.7 kb 크기의 DNA 단편을 증폭하게 한다. 주변 영역은 gluA 유전자의 3' 말단을 나타내는 gluB 유전자의 상부에 대략 0.33 kb의 길이의 서열 구역, gluC 유전자의 5' 말단을 나타내는 gluB 유전자의 하부에 대략 0.44 kb 길이의 서열 구역이다. 프라이머는 더욱이 상기 제시된 뉴클레오티드 서열에서 삽입으로 표시된 제한 효소 BglII의 절단 서열을 포함한다.

gluB 유전자 및 주변 영역을 가진 대략 1.7 kb 길이의 증폭된 DNA 단편을 0.8% 아가로스 젤에서 전기 영동으로 확인하고, 젤로부터 단리하고, 통상적인 방법 (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden)에 따라 정제한다.

그 다음, 조각의 라이게이션(ligation)은 벡터 pCRII-TOPO 내에서 Topo TA Cloning Kit (Invitrogen, Leek, The Netherlands, 카탈로그 번호 K4600-01)을 사용하여 수행한다. 라이게이션 뱃치를 이콜라이 균주 TOP10 (Invitrogen, Leek, The Netherlands)에서 형질전환시킨다. 플라스미드-함유 세포의 선별은 X-Gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 β-D-갈락토피라노시드, 64　mg/l)이 있는 LB 카나마이신 (50 mg/l)-함유 LB 아가(agar)상에 형질전환 뱃치를 플레이팅해서 수행한다.

수득된 플라스미드를 제한 효소 절단으로 확인하고, DNA를 단리한 후, 아가로스 젤에서 확인한다. 수득된 플라스미드를 pCRII-TOPOglu라고 부른다.

플라스미드 pCRII-TOPOglu를 제한 효소 BglII (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)로 절단하고, 아가로스 젤 (0.8%)에서 분리한 후, QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 대략 1.7 kb의 gluB 조각을 아가로스 젤로부터 단리하여, Schafer 등.에 의해 기술되는 (Gene 14: 69-73 (1994)) 동원가능한 클로닝 벡터 pK18mobsacB와 함께 라이게이션에 사용한다. 이것을 제한 효소 BamHI로 미리 절단하고, 알칼린 포스파테이즈 (Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim)로 탈인산화하고, 대략 1.7 kb의 gluB 조각과 혼합하고, 혼합물에 T4 DNA 연결 효소 (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)를 처리한다.

그 다음 이콜라이 균주 DH5α (Grant 등.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649)를 라이게이션 뱃치 (Hanahan, In. DNA cloning. A practical approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)로 형질전환시킨다. 플라스미드-함유 세포의 선별은 50 mg/l 카나마이신이 추가된 LB 아가상에 형질전환 뱃치를 플레이팅해서 수행한다 (Sambrook 등., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989).

플라스미드 DNA는 Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit를 사용해서 형질전환체로부터 단리하고, 제한 효소 절단 및 이어서 아가로스 젤 전기영동으로 확인한다. 플라스미드를 pK18mobsacBglu1라고 부른다.

플라스미드 DNA를, 플라스미드 pCRIITOPOlysC를 가진 균주 DSM14242 (실시예 1.1 참조)로부터 단리하고, 제한 효소 BamHI (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)로 절단하고, QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용해 아가로스 젤 (0.8%)에서 분리한 후, 대략 1.7 kb 길이의 lysC^FBR-함유 DNA 조각을 아가로스 젤로부터 단리하여, 상기 언급된 벡터 pK18mobsacBglu1와 함께 라이게이션에 사용한다. 이것을 제한 효소 BamHI로 미리 절단하고, 알칼린 포스파테이즈 (Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim)로 탈인산화하고, 대략 1.7 kb의 lysC^FBR 조각과 혼합하고, 혼합물에 T4 DNA 연결 효소 (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)를 처리한다.

그 다음 이콜라이 균주 DH5αmcr (Life Technologies GmbH, Karlsruhe, Germany)를 라이게이션 뱃치 (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)로 형질전환시킨다. 플라스미드-함유 세포의 선별은 50 mg/l 카나마이신이 추가된 LB 아가상에 형질전환 뱃치를 플레이팅해서 수행한다 (Sambrook 등., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989).

플라스미드 DNA는 Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit를 사용해서 형질전환체로부터 단리하고, 제한 효소 절단 및 이어서 아가로스 젤 전기영동으로 확인한다. 플라스미드를 pK18mobsacBglu1_1라고 부른다. 플라스미드 지도는 도 1에 나타낸다.

플라스미드 pK18mobsacBglu1_1는, 부다페스트 조약에 따라 균주 이콜라이 DH5αmcr/pK18mobsacBglu1_1 (= DH5αlphamcr/pK18mobsacBglu1_1)의 순수 배양의 형태로 2001년 4월 20일에 「Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen」 (DSMZ, Braunschweig, Germany)에서 번호 DSM14243으로 수탁하였다.

1.3 교체 벡터 pK18mobsacBglu1_1을 사용해서 lysC^FBR 대립유전자 lysC T311I의 2번째 복제본을 균주 DSM13994의 염색체 (표적 부위: gluB gene) 내로 혼입

실시예 1.2에서 기술된 벡터 pK18mobsacBglu1_1를 Schafer 등. (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990))의 프로토콜에 의해 접합시켜 C. 글루타미쿰 균주 DSM13994 내로 형질전환킨다. 벡터는 DSM13994 내에서 독립적으로 복제되지 못하고, 단지 염색체에 통합되면 세포 내에 남아 있다. 통합된 pK18mobsacBglu1_1을 가진 클론 또는 전이접합체의 선별은 50 mg/l 카나마이신 및 이 추가된 LB 아가상에 접합 뱃치를 플레이팅해서 수행한다 (Sambrook 등., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989). 카나마이신-저항성 전이접합체를 25 mg/l 카나마이신이 있는 LB 아가 플레이트에 플레이팅하고, 33℃에서 48시간 동안 배양한다.

2번째 재조합 실험의 결과로 플라스미드가 잘려진 돌연변이체의 선별을 위해, 클론을 LB 액체 배지에서 20시간 동안 배양하고, 그 다음 10% 수크로스가 있는 LB 아가에 플레이팅하여, 48시간 동안 배양한다.

플라스미드 pK18mobsacBglu1_1은, 출발 플라스미드 pK18mobsacB와 같이, 카나마이신 저항성 유전자에 더해, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 레반 수크라제(levan sucrase)를 코딩하는 sacB 유전자의 복제본을 함유한다. 수크로스에 의해서 유도될 수 있는 발현이, 생성물 레반의 합성을 촉매작용하는 라반 수크라제의 형성을 야기하는 것으로, 이것은 C. 글루타미쿰에 유독하다. pK18mobsacBglu1_1에 통합된 클론들만 2번째 재조합 실험의 결과로 잘리므로 LB 아가에서 자란다. 2번째 재조합 실험의 위치에도 불구하고, lysC^FBR 대립유전자의 삭제후에 2번째 복제본은 그 자체가 염색체에서 gluB 유전자좌에 나타나거나, 또는 숙주의 본래 gluB 유전자좌가 남아있다.

대략 40 내지 50개의 콜로니를 표현형 "수크로스의 존재에서 생장" 및 "카나마이신의 존재에서 비생장"을 위해 시험한다. 표현형 "수크로스의 존재에서 생장" 및 "카나마이신의 존재에서 비생장"을 나타내는 대략 20개의 콜로니를 중합 효소 연쇄 반응으로 조사한다. gluB 유전자 및 주변 영역을 가진 DNA 조각은 콜로니의 염색체 DNA로부터 여기 증폭된다. 통합 플라스미드의 제작을 위해 실시예 1.2에서 기술한 바와 같이 동일한 프라이머 올리고뉴클레오티드를 PCR을 위해 선택한다.

gluBgl1 (서열 번호: 7):

5` TA(A GAT CT)G TGT TGG ACG TCA TGG CAA G 3`

gluBgl2 (서열 번호: 8):

5` AC(A GAT CT)T GAA GCC AAG TAC GGC CAA G 3`

프라이머는 본래 gluB 유전자좌를 가진 대조군 클론내에서 대략 1.7 kb 크기의 DNA 조각의 증폭을 가능하게 한다. gluB 유전자좌에 있는 염색체에서 lysC^FBR 대립유전자의 2번째 복제본을 가진 클론에서, 대략 3.4 kb 크기의 DNA 조각을 증폭한다.

증폭된 DNA 조각을 0.8% 아가로스 젤에서 전기 영동으로 확인한다.

lysC 유전자좌에 존재하는 복제본에 더해, lysC^FRB 대립유전자 lysC T311I 염색체에서 gluB 유전자좌에 lysC^FRB 대립유전자 lysC T311I의 2번째 복제본을 가진 클론을 상기 방법으로 확인하였다. 상기 클론을 균주 DSM13994glu::lysC라고 불렀다.

1.4 교체 벡터 pK18mobsacBglu1_1을 사용해서 lysC 유전자의 2번째 복제본을 lysC^FBR 대립유전자 lysC T311I의 형태로 균주 DSM12866의 염색체 (표적 부위: gluB gene) 내로 혼입

실시예 1.3에서 기술된 바와 같이, 플라스미드 pK18mobsacBglu1_1을 C. 글루타미쿰 균주 DSM12866내로 접합에 의해서 형질전환시킨다. lysC 유전자좌에 존재하는 야생형 유전자의 복제본에 더해, 염색체에서 gluB 유전자좌에 lysC^FBR 대립유전자 lysC T311I의 형태로 lysC 유전자의 2번째 복제본을 가진 클론을 1.3에서 기술한 방법으로 확인하였다. 상기 클론을 균주 DSM12866glu::lysC라고 불렀다.

gluB 유전자내에 lysC^FBR 대립유전자의 2번째 복제본을 가지고 있는 본 발명에 따른 코리네박테리움 글루타미쿰의 균주는 부다페스트 조약에 따라 2002년 6월 5일 「Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen」 (DSMZ, Braunschweig, Germany)에 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM12866glu::lysC의 순수 배양의 형태로 번호 DSM15039 로 수탁하였다.

1.5 교체 벡터 pK18mobsacBpck1_1의 제작

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC13032를 염색체 DNA에 대한 공여체로 사용한다. 균주 ATCC13032로부터, 염색체 DNA를 통상적인 방법 (Eikmanns 등., Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994))을 사용하여 단리한다. 중합 효소 연쇄 반응으로, pck 유전자 및 주변 영역을 가진 DNA 조각을 증폭한다. C. 글루타미쿰 (EP1094111 and Riedel 등., Journal of Molecular and Microbiological Biotechnology 3:573-583 (2001)) (접근 번호 AJ269506)으로 알려진 pck 유전자의 서열에 기초해서, 하기 프라이머 올리고뉴클레오티드가 PCR을 위해 선택된다:

pck_beg (서열 번호: 9):

5` TA(A GAT CT) G CCG GCA TGA CTT CAG TTT 3`

pck_end (서열 번호: 10):

5` AC(A GAT CT) G GTG GGA GCC TTT CTT GTT ATT3`

제시된 프라이머는 MWG Biotech사에 의해서 합성되고, PCR 반응은 Innis 등. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press)의 표준 PCR 방법에 의해 수행한다. 프라이머는 pck 유전자 및 근접한 영역을 가진 대략 2.9 kb 크기의 DNA 조각의 증폭을 가능하게 한다. 프라이머는 더욱이 상기 제시된 뉴클레오티드 서열에서 삽입으로 표시된 제한 효소 BglII의 절단 부위에 대한 서열을 포함한다.

유전자 및 주변 영역을 가진 대략 2.9 kb 길이의 증폭된 DNA 조각을 0.8% 아가로스 젤에서 전기 영동으로 확인하고, 젤로부터 단리하고, 통상적인 방법 (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden)에 의해 정제한다.

그 다음 조각의 라이게이션을 벡터 pCRII-TOPO에서 TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, Leek, The Netherlands, 카탈로그 번호 K4600-01)로 수행한다. 라이게이션 뱃치를 이콜라이 균주 TOP10 (Invitrogen, Leek, The Netherlands)내로 형질전환시킨다. 플라스미드-함유 세포의 선별은 X-Gal (64　mg/l)이 있는 LB 카나마이신 (50 mg/l)-함유 LB 아가상에 형질전환 뱃치를 플레이팅해서 수행한다.

수득된 플라스미드를 제한 효소 절단으로 조사하고, DNA를 단리한 후에, 아가로스 젤에서 확인한다. 수득된 플라스미드를 pCRII-TOPOpck라고 부른다.

플라스미드 pCRII-TOPOpck를 제한 효소 BglII (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)로 절단하고, 아가로스 젤 (0.8%)에서 QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany)로 분리한 후, 대략 2.9 kb의 pck 조각을 아가로스 젤로부터 단리하고, Schafer 등. (Gene 14: 69-73 (1994))에 의해서 기술된 동원가능한 클로닝 벡터 pK18mobsacB와 함께 라이게이션에 사용한다. 이것을 제한 효소 BamHI로 미리 절단하고, 알칼린 포스파테이즈 (Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim)로 탈인산화하고, 대략 2.9 kb의 pck 조각과 혼합하고, 혼합물에 T4 DNA 연결 효소 (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)를 처리한다.

그 다음 이콜라이 균주 DH5α (Grant 등.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649)를 라이게이션 뱃치 (Hanahan, In. DNA cloning. A practical approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)로 형질전환시킨다. 플라스미드-함유 세포의 선별은 50 mg/l 카나마이신이 첨가된 LB 아가 (Sambrook 등., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989)상에 형질전환 뱃치를 플레이팅해서 수행한다.

플라스미드 DNA를 Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit를 사용해서 형질전환체로부터 단리하고, 제한 효소 절단으로 조사하고, 이어서 아가로스 젤 전기영동으로 확인한다. 플라스미드를 pK18mobsacBpck1라고 부른다.

플라스미드 DNA를 플라스미드 pCRIITOPOlysC를 가진 균주 DSM14242 (실시예 1.1 참조)로부터 단리하고, 제한 효소 BamHI (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)으로 절단하고, QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany)으로 아가로스 젤 (0.8%)에서 분리한 후, 대략 1.7 kb길이의 lysC^FBR-함유 DNA 조각을 아가로스 젤로부터 단리하여, 상기 기술한 벡터 pK18mobsacBpck1과 함께 라이게이션에 사용한다. 이것을 제한 효소 BamHI로 미리 절단하고, 알칼린 포스파테이즈 (Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim)로 탈인산화하고, 대략 1.7 kb의 lysC^FBR 조각과 혼합하고, 혼합물에 T4 DNA 연결 효소 (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)를 처리한다.

이콜라이 균주 DH5αmcr (Life Technologies GmbH, Karlsruhe, Germany)을 라이게이션 뱃치 (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)로 형질전환시킨다.

플라스미드-함유 세포의 선별은 50 mg/l 카나마이신이 첨가된 LB 아가 (Sambrook 등., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989) 상에 형질전환 뱃치를 플레이팅해서 수행한다.

플라스미드 DNA를 Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit를 사용해서 형질전환체로부터 단리하고, 제한 효소 절단으로 조사하고, 이어서 아가로스 젤 전기영동으로 확인한다. 플라스미드를 pK18mobdsacBpck1_1라고 부른다. 플라스미드의 지도를 도 3에 나타내었다.

1.6 균주 DSM12866의 염색체 (표적 부위: pck 유전자) 내로 lysC^FBR 대립유전자 lysC T311I의 형태로 lysC 유전자의 2번째 복제본을 교체 벡터 pK18mobsacBpck1_1에 의해서 혼입

실시예 1.3에서 기술한 바와 같이, 실시예 1.5에서 기술한 플라스미드 pK18mobsacBpck1_1를 접합에 의해서 C. 글루타미쿰 균주 DSM12866내로 형질전환시켰다. 선별은 실시예 1.3에서 기술한 바와 같이 표적된 재조합 실험에 대해 C. 글루타미쿰 DSM12866의 염색체 내에서 이루어졌다. 2번째 재조합 실험의 위치에 따라, 삭제 후에 삭제 후에 lysC^FBR 대립유전자 2번째 복제본은 그 자체가 염색체에서 pck 유전자좌에 나타나거나, 또는 숙주의 본래 pck 유전자가 남아있다.

대략 40 내지 50개의 콜로니를 표현형 "수크로스의 존재에서 생장" 및 "카나마이신의 존재에서 비생장"을 위해 시험한다. 표현형 "수크로스의 존재에서 생장" 및 "카나마이신의 존재에서 비생장"을 나타내는 대략 20개의 콜로니를 중합 효소 연쇄 반응으로 조사한다. pck 유전자 및 주변 영역을 가진 DNA 조각은 콜로니의 염색체 DNA로부터 여기 증폭된다. 통합 플라스미드의 제작을 위해 실시예 1.5에서 기술한 바와 같이 동일한 프라이머 올리고뉴클레오티드를 PCR을 위해 선택한다.

pck_beg (서열 번호: 9):

5` TA(A GAT CT) G CCG GCA TGA CTT CAG TTT 3`

pck_end (서열 번호: 10):

5` AC(A GAT CT) G GTG GGA GCC TTT CTT GTT ATT3`

프라이머는 본래의 pck 유전자좌가 있는 대조군 클론에서 대략 2.9 kb 크기의 DNA 조각의 증폭을 가능하게 한다. 유전자좌에 염색체내에 lysC^FBR 대립유전자의 2번째 복제본을 가진 클론에서, 대략 4.6 kb 크기의 DNA 조각을 증폭한다.

lysC 유전자좌에 존재하는 야생형 유전자의 복제본 뿐 아니라, 염색체에서 pck 유전자좌에 lysC^FBR 대립유전자 lysC T311I의 형태로 lysC 유전자의 2번째 복제본을 가진 클론이 상기 방법으로 확인되었다. 상기 클론을 균주 DSM12866pck::lysC로 불렀다.

1.7 교체 벡터 pK18mobsacBaecD1_1의 제작

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC13032는 염색체 DNA에 대한 공여체로 사용된다. 균주 ATCC13032로부터, 염색체 DNA를 통상적인 방법 (Eikmanns 등., Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994))을 사용하여 단리한다. 중합 효소 연쇄 반응으로, aecD 유전자 및 주변 영역을 지닌 DNA 조각을 증폭한다. C. 글루타미쿰 (Rossol 등., Journal of Bacteriology 174:2968-2977 (1992)) (접근 번호 M89931)으로 알려진 aecD 유전자의 서열에 기초하여, 하기 프라이머 올리고뉴클레오티드가 PCR을 위해 선택된다:

aecD_beg (서열 번호: 11):

5` GAA CTT ACG CCA AGC TGT TC 3`

aecD_end (서열 번호: 12):

5` AGC ACC ACA ATC AAC GTG AG 3`

제시된 프라이머는 MWG Biotech사에서 합성되고, PCR 반응은 Innis 등. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press)의 표준 PCR 방법에 의해 수행된다. 프라이머는 aecD 유전자 및 근접 영역을 가진, 크기 대략 2.1 kb의 DNA 조각의 증폭을 가능하게 한다.

대략 2.1 kb 길이의 증폭된 DNA 조각을 0.8% 아가로스 젤에서 전기 영동으로 확인하고, 젤로부터 단리하고, 통상적인 방법 (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden)에 의해 정제한다.

정제된 DNA 조각을 제한 효소 BamHI 및 EcoRV (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)로 절단한다. 그 다음 벡터 pUC18에서 조각을 라이게이션 시킨다 (Norrander 등., 유전자 26:101-106 (1983)). 이것을 미리 제한 효소 BglII 및 SmaI으로 절단하고, 탈인산화시키고, 대략 1.5 kb의 aecD-함유 조각과 혼합하고, 혼합물에 T4 DNA 연결 효소 (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)를 처리한다. 라이게이션 뱃치를 이콜라이 균주 TOP10 (Invitrogen, Leek, The Netherlands)내로 형질전환시킨다. 플라스미드-함유 세포의 선별은 X-Gal (64 mg/l)이 있는 카나마이신 (50　mg/l)-함유 LB 아가상에 형질전환 뱃치를 플레이팅해서 수행한다.

수득된 플라스미드를 제한 효소 절단으로 조사하고, DNA를 단리한 후, 아가로스 젤에서 확인한다. 수득된 플라스미드를 pUC18aecD라고 부른다.

플라스미드 DNA를 플라스미드 pCRIITOPOlysC를 가진 균주 DSM14242 (실시예 1.1 참조)로부터 단리하고, 제한 효소 BamHI (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)로 절단하고, 그 다음 Klenow 중합 효소로 처리한다. 아가로스 젤 (0.8%)에서 분리한 후, QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용해서 대략 1.7 kb 길이의 lysC^FBR-함유 DNA 조각을 아가로스 젤로부터 분리하고, 상기 기술한 벡터 pUC18aecD와 함께 라이게이션에 사용한다. 이것을 미리 제한 효소 StuI으로 절단하고, 알칼린 포스파테이즈 (Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim, Germany)로 탈인산화시키고, 대략 1.7 kb의 lysC^FBR 조각과 혼합하고, 혼합물에 T4 DNA 연결 효소 (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)를 처리한다.

그 다음 이콜라이 균주 DH5αmcr (Life Technologies GmbH, Karlsruhe, Germany)를 라이게이션 뱃치 (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)로 형질전환시킨다. 플라스미드-함유 세포의 선별은 50 mg/l 카나마이신이 첨가된 LB 아가 (Sambrook 등., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989)상에 형질전환 뱃치를 플레이팅해서 수행한다.

플라스미드 DNA를 Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit를 사용해서 형질전환체로부터 단리하고, 제한 효소 절단으로 조사하고, 이어서 아가로스 젤 전기영동으로 확인한다. 플라스미드를 pUC18aecD1이라고 부른다.

플라스미드 pUC18aecD1를 제한 효소 KpnI로 절단하고, 그 다음 Klenow 중합 효소를 처리한다. 그 다음 플라스미드를 제한 효소 SalI (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)으로 절단하고, QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용해서 아가로스 젤 (0.8%)에서 분리한 후에, aecD 및 lysC을 가진 대략 3.2 kb의 조각을 아가로스 젤로부터 단리하고, Schafer 등. (Gene 14: 69-73 (1994))에 의해 기술된 동원가능한 클로닝 벡터 pK18mobsacB와 함께 라이게이션에 사용한다. 이것을 미리 제한 효소 SmaI 및 SalI으로 절단하고, 알칼린 포스파테이즈 (Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim)로 탈인산화시키고, aecD 및 lysC를 가진 대략 3.2 kb의 조각과 혼합하고, 혼합물에 T4 DNA 연결 효소 (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)을 처리한다.

플라스미드 DNA는 Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit를 사용해서 형질전환체로부터 단리하고, 제한 효소 절단으로 조사하고, 이어서 아가로스 젤 전기영동으로 확인한다. 플라스미드를 pK18mobsacBaecD1_1라고 부른다. 플라스미드 지도는 도 2에 나타낸다.

플라스미드 pK18mobsacBaecD1_1을 부다페스트 조약에 따라 2002년 6월 5일, 균주 이콜라이 DH5αmcr/pK18mobsacBaecD1_1 (= DH5αlphamcr/pK18mobsacBaecD1_1)의 순수 배양 형태로 「Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen」 (DSMZ, Braunschweig, Germany)에 번호 DSM15040으로 수탁하였다.

1.8 균주 DSM12866의 염색체 (표적 부위: aecD 유전자) 내로 lysC^FBR 대립유전자로 lysC 유전자의 2번째 복제본을 교체 벡터 pK18mobsacBaecD1_1에 의해서 혼입

실시예 1.3에서 기술된 바와 같이, 실시예 1.4에서 기술된 플라스미드 pK18mobsacBaecD1_1을 C. 글루타미쿰 균주 DSM12866내로 접합에 의해 형질전환시킨다. 실시예 1.3에서 기술된 바와 같이 C. 글루타미쿰 DSM12866의 염색체에서 표적된 재조합 실험에 대한 선별을 한다. 2번째 재조합 실험의 위치에 따라, 삭제 후에 삭제 후에 lysC^FBR 대립유전자의 2번째 복제본이 그 자체가 염색체내에서 aecD 유전자좌에 나타나거나, 또는 숙주의 본래 aecD 유전자가 남아있다.

대략 40 내지 50개의 콜로니를 표현형 "수크로스의 존재에서 생장" 및 "카나마이신의 존재에서 비생장"을 위해 시험한다. 표현형 "수크로스의 존재에서 생장" 및 "카나마이신의 존재에서 비생장"을 나타내는 대략 20개의 콜로니를 중합 효소 연쇄 반응으로 조사한다. aecD 유전자 및 주변 영역을 가진 DNA 조각은 콜로니의 염색체 DNA로부터 여기 증폭된다. 통합 플라스미드의 제작을 위해 실시예 1.7에서 기술한 바와 같이 동일한 프라이머 올리고뉴클레오티드를 PCR을 위해 선택한다.

aecD_beg (서열 번호: 11):

5` GAA CTT ACG CCA AGC TGT TC 3`

aecD_end (서열 번호: 12):

5` AGC ACC ACA ATC AAC GTG AG 3`

프라이머는 본래 aecD 유전자좌와 함께 대조군 클론에서 대략 2.1 kb 크기의 DNA 조각의 증폭을 가능하게 한다. 염색체내의 aecD 유전자좌에 lysC^FBR 대립유전자의 2번째 복제본을 가진 클론에서, 대략 3.8 kb 크기의 DNA 조각을 증폭한다.

lysC 유전자좌에 존재하는 야생형 유전자의 복제본 뿐 아니라, 염색체에서 aecD 유전자좌에 lysC^FBR 대립유전자 lysC T311I의 형태로 lysC 유전자의 2번째 복제본을 가진 클론이 상기 방법으로 확인되었다. 상기 클론을 균주 DSM12866aecD::lysC로 불렀다.

실시예 2

균주 DSM12866의 염색체 (표적 부위: gluB 유전자) 내로 ddh 유전자의 2번째 복제본의 혼입

2.1 교체 벡터 pK18mobsacBglu2_1의 제작

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC13032는 염색체 DNA에 대한 공여체로 사용된다. 균주 ATCC13032로부터, 염색체 DNA를 통상적인 방법 (Eikmanns 등., Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994))을 사용하여 단리한다. 중합 효소 연쇄 반응으로, gluB 유전자 및 주변 영역을 가진 DNA 조각을 증폭한다. C. 글루타미쿰 (Kronemeyer 등., Journal of Bacteriology, 177: 1152 1158 (1995); EP1108790) (접근 번호 X81191 및 AX127149)에 대해 알려진 gluABCD 유전자 클러스터의 서열에 기초하여, 하기 프라이머 올리고뉴클레오티드가 PCR을 위해 선택된다:

gluA_beg (서열 번호: 13):

5` CAC GGT TGC TCA TTG TAT CC 3`

gluD_end (서열 번호: 14):

5` CGA GGC GAA TCA GAC TTC TT 3`

제시된 프라이머는 MWG Biotech사에서 합성되고, PCR 반응은 Innis 등. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press)의 표준 PCR 방법에 의해 수행된다. 프라이머는 gluB 유전자 및 근접 영역을 가진, 크기 대략 4.4 kb 의 DNA 조각의 증폭을 가능하게 한다.

증폭된 DNA 조각을 0.8% 아가로스 젤에서 전기 영동으로 확인하고, 젤로부터 단리하고, 통상적인 방법 (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden)에 의해 정제한다.

그 다음 벡터 pCRII-TOPO에서 TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, Leek, The Netherlands, 카탈로그 번호 K4600-01)를 이용하여 조각의 라이게이션을 수행했다. 라이게이션 뱃치를 이콜라이 균주 TOP10 (Invitrogen, Leek, The Netherlands)에서 형질전환 시킨다. 플라스미드-함유 세포의 선별은 X-Gal (64　mg/l)이 있는 LB 카나마이신 (50 mg/l)-함유 LB 아가상에 형질전환 뱃치를 플레이팅해서 수행한다.

수득된 플라스미드를 제한 효소 절단에 의해 조사하고, DNA를 단리한 후에, 아가로스 젤에서 확인한다. 수득된 플라스미드를 pCRII-TOPOglu2라고 부른다.

플라스미드 pCRII-TOPOglu2를 제한 효소 EcoRI 및 SalI (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)로 절단하고, QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용해서 아가로스 젤 (0.8%)에서 분리한 후, 대략 3.7 kb의 gluB 조각을 아가로스 젤로부터 분리하고, pK18mobsacB Schafer 등. (Gene 14, 69-73 (1994))에 의해 기술된 동원가능한 클로닝 벡터와 함께 라이게이션에 사용한다. 이것을 제한 효소 EcoRI 및 SalI으로 미리 절단하고, 알칼린 포스파테이즈 (Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim)로 탈인산화하고, 대략 3.7 kb의 gluB 조각과 혼합하고, 혼합물에 T4 DNA 연결 효소 (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)를 처리한다.

이콜라이 균주 DH5α (Grant 등.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649)를 라이게이션 뱃치 (Hanahan, In. DNA cloning. A practical approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)로 형질전환시킨다. 플라스미드-함유 세포의 선별은 50 mg/l 카나마이신이 첨가된 LB 아가 (Sambrook 등., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989)상에 형질전환 뱃치를 플레이팅해서 수행한다.

플라스미드 DNA는 Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit를 사용해서 형질전환체로부터 단리하고, 제한 효소 절단에 의해 조사하고, 이어서 아가로스 젤 전기영동으로 확인한다. 플라스미드를 pK18mobsacBglu2라고 부른다.

실시예 2.1에서 기술된 바와 같이, ddh 유전자 및 주변 영역을 가진 DNA 조각을 또한 중합 효소 연쇄 반응의 도움에 의해 증폭시킨다.

C. 글루타미쿰 (Ishino 등., Nucleic Acids Research 15, 3917(1987)) (접근 번호 Y00151)에 대해 알려진 ddh 유전자 클러스터의 서열에 기초하여, 하기 프라이머 올리고뉴클레오티드가 PCR을 위해 선택된다:

ddh_beg (서열 번호: 15):

5` CTG AAT CAA AGG CGG ACA TG 3`

ddh_end (서열 번호: 16):

5` TCG AGC TAA ATT AGA CGT CG 3`

제시된 프라이머는 MWG Biotech사에서 합성되고, PCR 반응은 Innis 등. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press)의 표준 PCR 방법에 의해 수행한다. 프라이머는 ddh 유전자 또는 주변 영역을 가진 길이 대략 1.6 kb의 DNA 조각을 증폭하게 한다.

대략 1.6 kb 길이의 증폭된 DNA 조각을 0.8% 아가로스 젤에서 전기 영동으로 확인하고, 젤로부터 단리하고, 통상적인 방법 (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden)에 의해 정제한다.

정제 후에, ddh 유전자를 가진 조각을 기술된 벡터 pK18mobsacBglu2에서 라이게이션에 사용한다. 이것을 미리 부분적으로 제한 효소 BamHI로 절단한다. 벡터에 Klenow 중합 효소 (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)를 처리함으로써, 절단된 말단의 돌출부분이 평활말단(blunt end)으로 끝나고, 그 다음 벡터를 ddh 유전자를 가진 대략 1.6 kb의 DNA 조각과 혼합하고, 혼합물을 T4 DNA 연결 효소 (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)로 처리한다. PCR 반응에 Vent 중합 효소 (New England Biolabs, Frankfurt, Germany)를 사용함으로써, 평활말단을 가지고 예비처리된 벡터 pK18mobsacBglu2에서 라이게이션에 적합한 ddh-함유 DNA 조각이 생성된다.

이콜라이 균주 DH5αmcr (Life Technologies GmbH, Karlsruhe, Germany)를 라이게이션 뱃치 (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)로 형질전환시킨다. 플라스미드-함유 세포의 선별은 50 mg/l 카나마이신이 첨가된 LB 아가 (Sambrook 등., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989)상에 형질전환 뱃치를 플레이팅해서 수행한다.

플라스미드 DNA는 Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit를 사용해서 형질전환체로부터 단리하고, 제한 효소 절단에 의해 조사하고, 이어서 아가로스 젤 전기영동으로 확인한다. 플라스미드를 pK18mobsacBglu2_1이라고 부른다. 플라스미드의 지도를 도 4에 나타낸다.

2.2 교체 벡터 pK18mobsacBglu2_1을 사용해서 균주 DSM12866의 염색체 (표적 부위: gluB 유전자) 내로 ddh 유전자의 2번째 복제본을 혼입

실시예 1.3에서 기술된 바와 같이, 실시예 2.1에서 기술된 플라스미드 pK18mobsacBglu2_1을 접합에 의해 C. 글루타미쿰 균주 DSM12866 내로 형질전환시켰다. 선별은 실시예 1.3에서 기술한 바와 같이 표적된 재조합 실험에 대해 C. 글루타미쿰 DSM12866의 염색체에서 이루어졌다. 2번째 재조합 실험의 위치에 따라, 삭제 후에 삭제 후에 ddh 유전자의 2번째 복제본은 그 자체가 염색체내에 gluB 유전자좌에 나타나거나, 또는 숙주의 본래 gluB 유전자가 남아있다.

대략 40 내지 50개의 콜로니를 표현형 "수크로스의 존재에서 생장" 및 "카나마이신의 존재에서 비생장"을 위해 시험한다. 표현형 "수크로스의 존재에서 생장" 및 "카나마이신의 존재에서 비생장"을 나타내는 대략 20개의 콜로니를 중합 효소 연쇄 반응으로 조사한다. 기술된 glu 영역을 가진 DNA 조각은 콜로니의 염색체 DNA로부터 여기 증폭된다. 통합 플라스미드의 제작을 위해 실시예 2.1에서 기술한 바와 같이 동일한 프라이머 올리고뉴클레오티드를 PCR을 위해 선택한다.

gluA_beg (서열 번호: 13):

5` CAC GGT TGC TCA TTG TAT CC 3`

gluD_end (서열 번호: 14):

5` CGA GGC GAA TCA GAC TTC TT 3`

프라이머는 본래 glu 유전자좌와 함께 대조군 클론내에서 크기 대략 4.4 kb의 DNA 조각의 증폭을 가능하게 한다. gluB 유전자좌에서 염색체내에 ddh 유전자의 2번째 복제본을 가진 클론에서, 대략 6 kb 크기의 DNA 조각을 증폭시킨다.

ddh 유전자좌에 존재하는 복제본 뿐 아니라, 염색체에서 gluB 유전자좌에 ddh 유전자의 2번째 복제본을 가진 클론이 상기 방법으로 확인되었다. 상기 클론을 균주 DSM12866glu::ddh로 불렀다.

실시예 3

균주 DSM12866의 염색체 (표적 부위: aecD gene) 내로 dapA 유전자의 2번째 복제본의 혼입

3.1 교체 벡터 pK18mobsacBaecD2_1의 제작

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC13032는 염색체 DNA에 대한 공여체로 사용된다. 균주 ATCC13032로부터, 염색체 DNA를 통상적인 방법 (Eikmanns 등., Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994))을 사용하여 단리한다. 중합 효소 연쇄 반응으로, aecD 유전자 및 주변 영역을 가진 DNA 조각을 증폭한다. C. 글루타미쿰 (Rossol 등., Journal of Bacteriology 174:2968-2977 (1992)) (접근 번호 M89931)에 대해 알려진 aecD 유전자의 서열에 기초하여, 하기 프라이머 올리고뉴클레오티드가 PCR을 위해 선택된다:

aecD_beg (서열 번호: 11):

5` GAA CTT ACG CCA AGC TGT TC 3`

aecD_end (서열 번호: 12):

5` AGC ACC ACA ATC AAC GTG AG 3`

제시된 프라이머는 MWG Biotech사에서 합성되고, PCR 반응은 Innis 등. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press)의 표준 PCR 방법에 의해 수행한다. 프라이머는 aecD 유전자 또는 인접 영역을 가진 길이 대략 2.1 kb의 DNA 조각을 증폭하게 한다.

정제된 DNA 조각을 제한 효소 BglII 및 EcoRV (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)로 단리한다. 그 다음 벡터 pUC18에서 조각을 라이게이션 했다 (Norrander 등., 유전자 26:101-106 (1983)). 이것을 제한 효소 BamHI 및 SmaI으로 미리 절단하고, 탈인산화시키고, 대략 1.5 kb의 aecD-함유 조각과 혼합하고, 혼합물에 T4 DNA 연결 효소 (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)를 처리한다. 라이게이션 뱃치를 이콜라이 균주 TOP10 (Invitrogen, Leek, The Netherlands)내로 형질전환시킨다. 플라스미드-함유 세포의 선별은 X-Gal (64　mg/l)이 있는 LB 카나마이신 (50 mg/l)-함유 LB 아가상에 형질전환 뱃치를 플레이팅해서 수행한다.

수득된 플라스미드를 제한 효소 절단으로 조사하고, DNA의 단리 후에, 아가로스 젤에서 확인한다. 수득된 플라스미드를 pUC18aecD라고 부른다.

중합 효소 연쇄 반응으로, dapA 유전자 및 주변 영역을 가진 또다른 DNA 조각을 증폭한다. C. 글루타미쿰 (Bonassi 등., Nucleic Acids Research 18:6421 (1990)) (접근 번호 X53993 및 AX127149)에 대해 알려진 dapA 유전자의 서열에 기초하여, 하기 프라이머 올리고뉴클레오티드가 PCR을 위해 선택된다:

dapA_beg (서열 번호: 17):

5' CGA GCC AGT GAA CAT GCA GA 3'

dapA_end (서열 번호: 18):

5' CTT GAG CAC CTT GCG CAG CA 3'

제시된 프라이머는 MWG Biotech사에서 합성되고, PCR 반응은 Innis 등. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press)의 표준 PCR 방법에 의해 수행한다. 프라이머는 dapA 유전자 또는 인접 영역을 가진 크기 대략 1.4 kb의 DNA 조각을 증폭하게 한다. 프라이머는 더욱이 상기 제시된 뉴클레오티드 서열에서 삽입으로 표시된 제한 효소 BamHI의 절단 서열을 포함한다.

대략 1.4 kb 길이의 증폭된 DNA 조각을 0.8% 아가로스 젤에서 전기 영동으로 확인하고, 젤로부터 단리하고, 통상적인 방법 (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden)에 의해 정제한다.

정제 후에, 대략 1.4 kb 길이의 dapA-함유 DNA 조각을 상기 기술한 벡터 pUC18aecD와 함께 라이게이션에 사용했다. 이것을 제한 효소 StuI으로 미리 절단하고, 대략 1.4 kb의 DNA 조각과 혼합하고, 혼합물에 T4 DNA 연결 효소 (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)를 처리한다.

그 다음 이콜라이 균주 DH5αmcr (Life Technologies GmbH, Karlsruhe, Germany)를 라이게이션 뱃치 (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)로 형질전환시킨다. 플라스미드-함유 세포의 선별은 50 mg/l 카나마이신이 첨가된 LB 아가 (Sambrook 등., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989)상에 형질전환 뱃치를 플레이팅해서 수행한다.

플라스미드 DNA는 Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit를 사용해서 형질전환체로부터 단리하고, 제한 효소 절단에 의해 조사하고, 이어서 아가로스 젤 전기영동으로 확인한다. 플라스미드를 pUC18aecD2라고 부른다.

플라스미드 pUC18aecD2를 제한 효소 SalI 및 부분적으로 EcoRI (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)으로 절단하고, QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 아가로스 젤 (0.8%)에서 분리한 후, aecD 및 dapA를 가진 대략 2.7 kb의 조각을 아가로스 젤로부터 단리하고, Schafer 등. (Gene 14: 69-73 (1994))에 의해 기술된 동원가능한 클로닝 벡터 pK18mobsacB와 함께 라이게이션에 사용한다. 이것을 제한 효소 EcoRI 및 SalI으로 미리 절단하고, 알칼린 포스파테이즈 (Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim)로 탈인산화하고, 대략 2.7 kb의 aecD 및 dapA 조각과 혼합하고, 혼합물에 T4 DNA 연결 효소 (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)를 처리한다.

플라스미드 DNA는 Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit를 사용해서 형질전환체로부터 단리하고, 제한 효소 절단에 의해 조사하고, 이어서 아가로스 젤 전기영동으로 확인한다. 플라스미드를 pK18mobsacBaecD2_1이라고 부른다. 플라스미드의 지도를 도 5에 나타낸다.

3.2 균주 DSM12866의 염색체 (표적 부위: aecD 유전자) 내로 교체 벡터 pK18mobsacBaecD2_1에 의해서 dapA 유전자의 2번째 복제본의 혼입

실시예 1.3에서 기술된 바와 같이, 실시예 3.1에서 기술된 플라스미드 pK18mobsacBaecD2_1을 접합에 의해 C. 글루타미쿰 균주 DSM12866 내로 형질전환시켰다. 선별은 실시예 1.3에서 기술한 바와 같이 표적된 재조합 실험에 대해 C. 글루타미쿰 DSM12866의 염색체 내에서 이루어졌다. 2번째 재조합 실험의 위치에 따라, 삭제 후에 dapA 유전자의 2번째 복제본은 그 자체가 염색체내에 aecD 유전자좌에 나타나거나, 또는 숙주의 본래 aecD 유전자가 남아있다.

대략 40 내지 50개의 콜로니를 표현형 "수크로스의 존재에서 생장" 및 "카나마이신의 존재에서 비생장"을 위해 시험한다. 표현형 "수크로스의 존재에서 생장" 및 "카나마이신의 존재에서 비생장"을 나타내는 대략 20개의 콜로니를 중합 효소 연쇄 반응으로 조사한다. aecD 유전자 및 주변 영역을 가진 DNA 조각은 콜로니의 염색체 DNA로부터 여기 증폭된다. 통합 플라스미드의 제작을 위해 실시예 3.1에서 기술한 바와 같이 동일한 프라이머 올리고뉴클레오티드를 PCR을 위해 선택한다.

aecD_beg (서열 번호: 11):

5' GAA CTT ACG CCA AGC TGT TC 3'

aecD_end (서열 번호: 12):

5' AGC ACC ACA ATC AAC GTG AG 3'

프라이머는 본래 aecD 유전자좌와 함께 대조군 클론에서 크기 대략 2.1 kb의 DNA 조각의 증폭을 가능하게 한다. 염색체에서 dapA 유전자의 2번째 복제본을 aecD 유전자좌에 가지는 클론에서, 대략 3.6 kb 크기의 DNA 조각을 증폭시킨다.

dapA 유전자좌에 존재하는 복제본 뿐 아니라, 염색체에서 aecD 유전자좌에 dapA 유전자의 2번째 복제본을 가진 클론이 상기 방법으로 확인되었다. 상기 클론을 균주 DSM12866aecD::dapA로 불렀다.

실시예 4

균주 DSM12866의 염색체 (표적 부위: pck 유전자) 내로 pyc 대립유전자 pycP458S의 형태로 pyc 유전자의 2번째 복제본의 혼입

4.1 교체 벡터 pK18mobsacBpck1_3의 제작

실시예 1.5에서 기술된 교체 벡터 pK18mobsacBpck1이 pyc 대립유전자의 삽입에 대한 기본 벡터로 사용된다.

실시예 2.1에서 기술된 바와 같이, pyc 유전자 및 주변 영역을 가진 DNA 조각을 또한 중합 효소 연쇄 반응으로 증폭시킨다. C. 글루타미쿰 (Peters-Wendisch 등., Journal of Microbiology 144: 915-927 (1998)) (접근 번호 Y09548)에 대해 알려진 pyc 유전자 클러스터의 서열에 기초하여, 하기 프라이머 올리고뉴클레오티드가 PCR을 위해 선택된다:

pyc_beg (서열 번호: 19):

5' TC(A CGC GT)C TTG AAG TCG TGC AGG TCA G 3'

pyc_end (서열 번호: 20):

5' TC(A CGC GT)C GCC TCC TCC ATG AGG AAG A 3'

제시된 프라이머는 MWG Biotech사에서 합성되고, PCR 반응은 Innis 등. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press)의 표준 PCR 방법에 의해 수행한다. 프라이머는 pyc 유전자 또는 인접 영역을 가진 길이 대략 3.6 kb의 DNA 조각을 증폭하게 한다. 프라이머는 더욱이 상기 제시된 뉴클레오티드 서열에서 삽입으로 표시된 제한 효소 MluI의 절단 서열을 포함한다.

pyc 유전자를 가진 대략 3.6 kb 길이의 증폭된 DNA 조각을 제한 표소 MluI로 절단하여, 0.8% 아가로스 젤에서 전기 영동으로 확인하고, 젤로부터 단리하고, 통상적인 방법 (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden)에 의해 정제한다.

정제 후에, pyc 유전자를 가진 조각을 기술된 벡터 pK18mobsacBpck1에서 라이게이션에 사용한다. 이것을 제한 효소 BssHII로 미리 절단하고, 알칼린 포스파테이즈 (Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim)로 탈인산화하고, 대략 3.6 kb의 pyc 유전자를 가진 DNA 조각과 혼합하고, 혼합물에 T4 DNA 연결 효소 (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)를 처리한다.

이콜라이 균주 DH5αmcr (Life Technologies GmbH, Karlsruhe, Germany)를 라이게이션 뱃치 (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)로 형질전환시킨다. 플라스미드-함유 세포의 선별은 50 mg/l 카나마이신이 첨가된 LB 아가 (Sambrook 등., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989)상에 형질전환 뱃치를 플레이팅해서 수행한다.

플라스미드 DNA는 Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit를 사용해서 형질전환체로부터 단리하고, 제한 효소 절단에 의해 조사하고, 이어서 아가로스 젤 전기영동으로 확인한다. 플라스미드를 pK18mobsacBpck1_2라고 부른다.

4.2 야생형 pyc 유전자의 특정-부위 돌연변이 유발에 의한 pyc 대립유전자 pyc P458S의 제작

특정-부위 돌연변이 유발은 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, USA)를 사용하여 수행한다. EP-A-1108790는 향상된 L-리신 생산을 하게하는 C. 글루타미쿰에 대한 pyc 유전자에서 점 돌연변이를 기술한다. pyc 유전자에서 1372 위치에 시토신의 뉴클레오티드 서열을 티민으로 점 돌연변이에 기초해, 그의 유도된 아미노산 서열에서 위치 458에서 프롤린이 세린으로 치환된다. 대립유전자를 pyc P458S라고 부른다. 기술된 돌연변이체를 생성하기 위해서, 하기 프라이머 올리고뉴클레오티드가 선형 증폭을 위해 선택된다:

P458S-1 (서열 번호: 21):

5' GGATTCATTGCCGATCAC (TCG) CACCTCCTTCAGGCTCCA 3'

P458S-2 (서열 번호: 22):

5' TGGAGGAAGTCCGAGGT (CGA) GTGATCGGCAATGAATCC 3'

제시된 프라이머는 MWG Biotech사에서 합성된다. 458 위치에 프롤린을 치환하는 세린에 대한 코돈은, 상기 제시된 뉴클레오티드 서열에서 삽입으로 표시된다. 실시예 4.1에서 기술된 플라스미드 pK18mobsacBpck1_2를 플라스미드의 가닥에 서로 상보적인 2개의 프라이머와 함께 Pfu Turbo DNA 중합 효소를 사용하여 선형 증폭을 위해 사용한다. 상기 프라이머의 신장에 의해, 망가진 원형 가닥을 가진 돌연변이된 플라스미드가 형성된다. 선형 증폭의 생성물에 DpnI을 처리한다 - 상기 엔도뉴클레아제는 메틸화된 및 반-메틸화된 주형 DNA를 특이적으로 절단한다. 새롭게 합성된 망가진, 돌연변이된 벡터 DNA를 이콜라이 균주 XL1 Blue (Bullock, Fernandez and Short, BioTechniques (5) 376-379 (1987))내로 형질전환시킨다. 형질전환 후에, XL1 Blue 세포는 돌연변이된 플라스미드에서 파손을 수선한다. 형질전환체의 선별은 카나마이신 50 mg/l이 있는 LB 배지에서 수행한다. 수득된 플라스미드를 제한 효소 절단에 의해서 조사하고, DNA를 단리한 후, 아가로스 젤에서 확인한다. 돌연변이된 DNA 조각의 DNA 서열을 서열분석에 의해 조사한다. PCR 생성물의 서열은 Ohnishi 등. (2002) 기술된 서열과 일치한다. 수득된 플라스미드를 pK18mobsacBpck1_3이라고 부른다. 플라스미드의 지도는 도 6에 제시된다.

4.3 균주 DSM12866의 염색체 (표적 부위: pck 유전자) 내로 교체 벡터 pK18mobsacBpck1_3에 의해서 pyc 대립유전자 pycP458S의 형태로 pyc 유전자의 2번째 복제본의 혼입

실시예 4.2에서 기술된 플라스미드 pK18mobsacBpck1_3를 실시예 1.3에서 기술된 바와 같이, 접합에 의해 C. 글루타미쿰 균주 DSM12866내로 형질전환시킨다.

선별은 실시예 1.3에서 기술한 바와 같이 표적된 재조합 실험에 대해 C. 글루타미쿰 DSM12866의 염색체 내에서 이루어졌다. 2번째 재조합 실험의 위치에 따라, 삭제 후에 pyc 대립유전자 2번째 복제본은 그 자체가 염색체내에 pck 유전자좌에 나타나거나, 또는 숙주의 본래 pck 유전자가 남아있다.

pck_beg (서열 번호: 9):

5` TA(A GAT CT) G CCG GCA TGA CTT CAG TTT 3`

pck_end (서열 번호: 10):

5` AC(A GAT CT) G GTG GGA GCC TTT CTT GTT ATT3`

프라이머는 본래 pck 유전자좌와 함께 대조군 클론내에서 크기 대략 2.1 kb의 DNA 조각의 증폭을 가능하게 한다. pck 유전자좌에서 염색체내에 pck 대립유전자의 2번째 복제본을 가진 클론에서, 대략 6.5 kb 크기의 DNA 조각을 증폭시킨다.

pyc 유전자좌에 존재하는 야생형 유전자의 복제본 뿐 아니라, 염색체에서 pck 유전자좌에 pyc 대립유전자 pycP458S의 형태로 pyc 유전자의 2번째 복제본을 가진 클론이 상기 방법으로 확인되었다. 상기 클론을 균주 DSM12866pck::pyc로 불렀다.

실시예 5

리신의 제조

실시예 1, 2, 3 및 4에서 수득된 C. 글루타미쿰 균주 DSM13994glu::lysC, DSM12866glu::lysC, DSM12866pck::lysC, DSM12866aecD::lysC, DSM12866glu::ddh, DSM12866aecD::dapA 및 DSM12866pck::pyc를 리신의 생산에 적합한 영양 배지에서 배양하고, 배양 상층액에서 리신 함량을 측정한다.

이를 위해, 배양을 처음 뇌-심장(brain-heart) 아가 플레이트 (Merck, Darmstadt, Germany)상에 33℃에서 4시간 동안 배양한다. 상기 아가 플레이트 배양으로부터 출발하여, 예비배양을 접종한다 (100 ml 원뿔 플라스크에 배지 10 ml). 배지 MM을 예비배양용 배지로 사용한다. 예비배양은 240 rpm의 진탕 배양기에서 33℃에서 24시간 동안 배양한다. 주 배양의 초기 OD (660 nm)가 0.1 OD인 예비배양으로부터 주 배양을 접종한다. 배지 MM가 또한 주 배양용 배지로 사용된다.

배지 MM

CSL 5 g/l

MOPS 20 g/l

글루코스 (개별적으로 오토클레이브됨) 50 g/l

염:

(NH₄)₂SO₄ 25 g/l

KH₂PO₄ 0.1 g/l

MgSO₄ * 7 H₂O 1.0 g/l

CaCl₂ * 2 H₂O 10 mg/l

FeSO₄ * 7 H₂O 10 mg/l

MnSO₄ * H₂O 5.0 mg/l

바이오틴 (살균-여과됨) 0.3 mg/l

티아민 * HCl (살균-여과됨) 0.2 mg/l

CaCO₃ 25 g/l

CSL (옥수수침지액), MOPS (모르폴리노프로판술폰산) 및 염 용액을 수성 암모니아로 pH 7에 맞추고, 오토클레이브한다. 살균 물질 및 비타민 용액에 더해서, 건조된 상태로 오토클레이브된 CaCO₃을 그 다음 첨가한다.

배양은 배플이 있는 100 ml 원뿔 플라스크에서 10 ml 부피로 수행한다. 배양은 33℃ 및 80% 대기 습도에서 수행한다.

48시간 후에, OD를 Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich)으로 660 nm의 측정 파장에서 측정한다. 형성된 리신의 양을 닌히드린 측정과 함께 이온 교환 크로마토그래피 및 후-컬럼 파생에 의해 Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany)사의 아미노산 분석기로 측정한다.

실험의 결과는 표 14에 제시된다.

균주	OD (660 nm)	리신 HCl g/l
DSM13994	12.0	19.1
DSM13994glu::lysC	9.9	20.0
DSM12866	12.5	14.9
DSM15039	11.4	16.2
DSM12866pck::lysC	12.6	16.5
DSM12866aecD::lysC	12.0	15.9
DSM12866glu::ddh	11.0	15.5
DSM12866aecD::dapA	11.1	16.2
DSM12866pck::pyc	10.9	16.9

실시예 6

균주 DSM13992의 염색체의 유전자내부 영역 ncodel내로 lysC_T3111I-대립유전자의 복제본의 통합

6.1 교환 벡터 pK18mobsacBncl::lysC의 제작

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM13994 (실시예 1 참조)는 염색체 DNA에 대한 공여체로 사용된다. 균주 ATCC13032로부터, 염색체 DNA를 통상적인 방법 (Eikmanns 등., Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994))을 사용하여 단리한다. 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)의 도움으로, "ncodel" (서열 번호: 23)이라 불리는 염색체의 유전자내부 영역을 포함하는 DNA 조각을 증폭한다. 상기 영역은 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈의 서열 27398 내지 28707 위치내에 놓이는데, 이것은 접근 코드 (표 12 참조)로 접근이 가능하다. 상기 영역의 알려진 서열때문에, 하기 프라이머 올리고뉴클레오티드가 PCR을 위해 선택된다:

프라이머 ncode 1 (서열 번호: 24):

5' GA(A GAT CT)A AGC TCT ATT GTC CCC TAC G 3'

프라이머 ncode 2 (서열 번호: 25):

5' GAT CCT TTT AAA AGC CAG TAA CAA G 3'

프라이머 ncode 3 (서열 번호: 26):

5' CTT GTT ACT GGC TTT TAA AAG GAT CCT ATT AAA GAA CAC TCC CCT AT 3'

제시된 프라이머는 MWG Biotech사에서 합성되고, PCR 반응은 Innis 등. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press)의 표준 PCR 방법에 의해 수행하는데, 여기서 처음 2개 생성물은 프라이머 조합 ncode 1 및 ncode 2 또는 ncode 3 및 ncode 4와 함께 증폭되고, 그 다음 ncode 1 및 ncode 4가 함께 2번째 PCR에서 프라이머 조합에 대한 주형으로 수행한다. 상기 방법으로, 선별된 프라이머는 유전자내부 영역의 중심에 (밑줄로 강조됨, (서열 번호: 28)) 인위적으로 형성된 제한 효소 BarnHI의 간섭을 가진 대략 1.2 kb 크기의 DNA 조각의 증폭을 가능하게 한다. 게다가, 프라이머는 상기 제시된 뉴클레오티드 연결에 괄호로 표시된 제한 효소 Bglll의 간섭에 대한 서열을 포함한다.

유전자내의 영역을 가진 대략 1.2 kb 길이의 증폭된 DNA 조각을 0.8% 아가로스 젤에서 전기 영동으로 확인하고, 젤로부터 단리하고, 통상적인 방법 (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden)에 의해 세척한다.

그 다음, Topo TA Cloning Kit (Invitrogen, Leek, Netherlands, Cat. Num-her K4600-01)를 사용하여 조각을 pCRII-TOPO 내로 라이게이션한다. 라이게이션 배지를 이콜라이 균주 TOP10 (Invitrogen, Leek, Netherlands)내로 형질전환시킨다. 플라스미드-지닌 세포의 선별은 X-Gal (64　mg/l)이 있는 LB 카나마이신 (50 mg/l)-함유 LB 아가상에 형질전환 배양의 플레이팅을 통해 수행한다.

DNA를 단리한 후, 수득된 플라스미드를 제한 효소 파편을 사용해서 검증하고, 아가로스 젤에서 확인한다. 수득된 플라스미드를 pCRII-TOPOnc라고 부른다.

플라스미드 pCRII-TOPOnc를 제한 효소 Bg1II (Amersham-Pharmarcia, Freiburg, Germany)로 자르고, 아가로스 젤 (0.8%)에서 절단 후, 대략 1.2 kb의 조각을 Qiagenquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany)을 사용해서 아가로스 젤로부터 단리하고, Schafer 등. (Gene 14, 69-73 (1994))에서 기술된 동원가능한 클로닝 벡터 pK18mobsacB와 함께 라이게이션에 사용한다. 이것을 먼저 제한 효소 BamHI로 절단하고, 알칼린 포스파테이즈 (Alkaline Phosphatase, Boehringer Man-nheim)로 탈인산화시키고, 대략 1.2 kb의 조각과 혼합하고, 조각 및 배양에 T4-DNA 연결 효소 (Amersham-Pharma-cia, Freiburg, Germany)를 처리한다.

이 후에, 이콜라이 균주 DH5α (Grant 등.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649)를 라이게이션 배양 (Hanahan, In. DNA cloning. A practical approach. Uol.l. ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)으로 형질전환시킨다. 플라스미드-함유 세포의 선별을 25 mg/1 카나마이신이 첨가된 LB 아가 (Sambrock 등., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor, New York, 1989)상에 형질전환 배지를 플레이팅하여 수행한다.

플라스미드 DNA는 Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit를 사용해서 형질전환체로부터 단리하고, 효소 Xbal에 의한 제한 조각을 사용하여 조사하고, 이어서 아가로스 젤 전기영동으로 확인한다. 플라스미드를 pK18mobsacBnc라고 부른다.

실시예 1에서 기슬된 플라스미드 pCRIITOPOlysC를 제한 효소 BamHI (Amersham-Pharmarcia, Freiburg, Germany)를 사용해서 절단한다. Qiagenquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용해서 아가로스 젤 (0.8%)에서 절단한 후, 대략 1.7kb 길이의, lysC T311I 함유 DNA 조각을 아가로스 젤로부터 단리하고, 상기 기술한 벡터 pK18mobsacBnc와 함께 라이게이션에 사용한다. 이것을 먼저 제한 효소 BamHI로 절단하고, 알칼린 포스파테이즈 (Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim)로 탈인산화시키고, 대략 1.7 kb의 조각과 혼합하고, 배양에 T4-DNA 연결 효소 (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)를 처리한다.

이 후에, 이콜라이 균주 DH5αmcr (Life Technologies GmbH, Karlsruhe, Germany)을 라이게이션 배양 (Hanahan, In. DNA cloning. A practical approach. Uol.l. ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)을 사용해서 형질전환시킨다. 플라스미드-함유 세포의 선별을 25 mg/1 카나마이신을 첨가한 LB 아가 (Sambrock 등., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor, New York, 1989)상에 형질전환 배양의 플레이팅으로 수행한다. 플라스미드 DNA를 Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit를 사용해서 형질전환체로부터 단리하고, 아가로스 젤 전기영동 후에 효소 HindIII 및 Xbal과 제한 표소 파편을 통해 조사한다. 플라스미드를 pK18mobsacBnc::lysC라고 부른다. 플라스미드의 목록은 도 7에 나타난다.

6.2 교환 벡터 pK18mobsacBnc::lysC를 사용해서 균주 DSM13992의 염색체 (표적 부위: the 유전자내부 영역 ncodel) 내로, IYSC^FBRM 대립유전자 lysC T311I의 형태로 lysC 유전자의 2번째 복제본의 혼입

실시예 6.1에서 명명된 벡터 pK18mobsacBnc::lysC를 Schafer 등.(1990 Journal of Microbiology 172: 1663-1666)의 수정된 프로토콜에 따라서 C. 글루타미쿰 균주 DSM13992 내로 형질전환시킨다.

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM13992를 C. 글루타미쿰 ATCC13032로부터 반복된, 비직접적인 돌연변이 유발, 선별 및 돌연변이체 선별에 의해서 제조한다. 균주는 항생제 스트렙토마이신(Streptomycin)에 저항성이고, 표현형적으로 리신 유사체 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 저항성이다. 그러나, 균주는 리신과 그 안의 (각 25 mM)의 혼합물에 의한 억제에 대해 민감한 야생형 아스파테이트 키나아제를 가진다. 상기 균주의 순수 배양은 부다페스트 조약에 따라 2001년 1월 16일에 「Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen」 [=German Collection of Microorganisms and Cell Cultures] (DSMZ, Braunschweig, Germany)에 수탁하였다.

벡터 pK18mobsacBnc::lysC는 독립적으로 DSM13992 에서 복제될 수 없고, 단지 재조합을 통해서 염색체내에 통합되면 세포에 남는다.

통합된 pK18mobsacBnc::lysC를 가진 클론의 선별을 15 mg/1 카나마이신 및 50 mg/1 날리디신산을 첨가한 LB 아가 (Sambrock 등., Molecu-lar Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989)상에 접합 배양을 플레이팅하여 수행한다. 자라기 시작한 클론들을 25 mg/1 카나마이신이 있는 LB 아가 플레이트상에 플레이팅하고 33℃에서 16시간 동안 배양한다. 2번째 재조합 실험을 통해 플라스미드의 삭제하기 위해, LB 액체 배지에서 16시간 동안 배양한 후 클론을 10% 수크로스와 함께 시작한다. 플라스미드 pK18mobsacB는 수크로스를 레반으로 바꾸는 sacB 유전자의 복제본을 함유하는데 이것은 C. 글루타미쿰에게 유독하다.

따라서, 통합된 pK18mobsacBnc::lysC가 잘려진 클론만이 수크로스가 있는 아가에서 LB 다시 생장한다. 2번째 재조합 실험의 위치로부터 독립적으로, 절단 동안, 주변 유전자내부 영역 ncodel과 함께 lysC의 복제본이 플라스미드와 함께 삭제되거나, 또는 유전자내부 영역 ncodel만 삭제될 것이다.

lysC의 복제본이 염색체의 유전자내부 영역 ncodel내에 남아 있는 것을 증명하기 위해, Innis 등. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press)의 표준 PCR 방법에 따라 표현형 "수크로스의 존재에서 생장" 및 "카나마이신의 존재에서 비생장"을 나타내는 대략 20개의 콜로니를 중합 효소 연쇄 반응으로 조사한다. 상기에서, lysC 유전자를 가진 DNA의 염색체 콜로니로부터 DNA 조각뿐 아니라 주변 영역도 증폭된다. 하기 프라이머 올리고뉴클레오티드가 PCR을 위해 선택된다:

3371V (서열 번호: 29):

5' TAT CAT GCG GTG AGC TGT GA 3'

3372N (서열 번호: 30):

5' TAG GGG TGA TGT GCT ACT GT 3'

본래 ncodel 위치를 가진 대조군 세포에서, 프라이머는 대략 1.3 kb 크기의 DNA 조각의 증폭을 가능하게 한다. 염색체의 유전자내부 영역 ncodel내에 lysC 유전자의 복제본을 가진 클론에서, 대략 3.0 kb의 크기를 가진 DNA 조각을 증폭한다.

상기 방법에서, lysC 위치에 존재하는 복제본에 더해 확인되는 클론은, 염색체내의 유전자내부 영역 ncodel내에서 lysC^FBR 대립유전자 lysC T311I의 2번째 복제본을 가진다. 상기 클론을 균주 DSM13992nc::lysC라고 명명한다.

실시예 7

균주 브레비박테리움 락토페르멘툼(lactofermentum) FERM BP-1763의 염색체 (표적 부위: ddh 유전자)내로 ilvD 유전자의 2번째 복제본의 혼입

디히드록시-산 탈수효소를 코딩하는 유전자 ilvD의 2번째 복제본을, FERM BP-1763의 균주의 발린 생산을 증대시키기 위해 디아미노피멜레이트 탈수소효소를 코딩하는, 균주 브레비박테리움 락토페르멘툼의 ddh 유전자 내로 혼입한다.

브레비박테리움 락토페르멘툼 균주 FERM BP-1763는 미코페놀산 저항성 발린 생산자 (US-A-5,188,948)이다. 이것은 L-이소루신 및 L-메티오닌 영양 요구성이다.

7.1. 균주 FERM BP-1763의 ilvD 유전자 DNA의 단리

균주 브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM BP-1763으로부터, 염색체 DNA를 통상적인 방법 (Eikmanns 등., Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994))에 의해 단리한다. 중합 효소 연쇄 반응으로, ilvD 유전자를 함유하는 DNA 부분을 증폭한다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 ilvD 유전자 서열은 공지된다 (Genbank 접근 번호 AJ012293; SEQ. ID. No. 1 from DE19907567, 접근 번호 AX034412, and SEQ. ID. No. 7063 및 1399 from EP1108790, 접근 번호 AX127147 및 AX121483). 브레비박테리움 락토페르멘툼과 코리네박테리움 글루타미쿰이 동일하지 않다면, 가깝게 관련되어 있다고 지시하는 수많은 데이터가 존재한다 (Abe 등., Journal of General and Applied Microbiology 13: 279-301 (1967); Suzuki 등., International Journal of Systematic Bacteriology 31: 131 - 138 (1981)). 그러므로, 코리네박테리움 글루타미쿰에 대해 알려진 ilvD 유전자의 서열에 기초해 하기 프라이머 올리고뉴클레오티드가 PCR을 위해 선택된다:

ilvD-A1 (서열 번호: 31):

5` ATC GTC TCT AGA CTT GGA GCG CCA AAA GGC AC 3`

ilvD-E1 (서열 번호: 32):

5` GTC ATC TCT AGA TCG AGG CAG AGT TCG CTG GT 3`

제시된 프라이머는 MWG Biotech사에서 합성되고, PCR 반응은 Innis 등. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press)의 표준 PCR 방법에 의해 수행한다. 프라이머는 ilvD 유전자 또는 주변 영역을 가진 길이 대략 2970 bp의 DNA 조각을 증폭하게 한다. 상기 주변 영역은 ilvD 유전자의 코딩 영역의 상부 영역의 대략 284 bp 및 하부 영역의 대략 819 bp을 포함한다. 프라이머는 더욱이 상기 제시된 뉴클레오디드 서열에서 밑줄로 표시된 제한 효소 XbaI의 절단 위치에 대한 서열을 포함한다.

ilvD 유전자뿐 아니라, 그것의 상부 및 하부 영역을 가진 증폭된 DNA 조각을 제한 효소 XbaI로 절단하고, 0.8% 아가로스-젤에서 아가로스-젤 전기 영동으로 확인한다. 대략 2,95 kb길이의 DNA 조각을 젤로부터 단리하고, 통상적인 방법 (High Pure PCR Product Purification Kit, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)에 의해 정제한다.

7.2 교체 벡터 pK18mobsacBddh::ilvD의 제작

실시예 7.1에서 단리된 균주 FERM BP-1763 으로부터 염색체 DNA를 ddh 통합 카세트(cassette)의 제조에 주형으로 사용했다. 용어 "ddh 통합 카세트"는 다른 유전자 또는 서열이 삽입될 수 있는, 제한 효소를 위해 인위적으로 만들어진 구획을 포함하는, 주로 ddh 유전자의 서열로 이루어진 DNA 구획을 표시한다. 최종 제작물은 염색체 ddh 유전자 내로 유전자 또는 다른 DNA 서열의 통합에 사용할 수 있다.

코리네박테리움 글루타미쿰에 알려진 ddh 유전자의 서열에 기초해 (Ishino 등., Nucleic Acids Research 15 (9), 319 ff (1987), Genbank 접근 번호 Y00151, EP1108790로부터 서열 번호. 7068 및 3494, 접근 번호. AX127152 및 AX123578), 하기 올리고뉴클레오티드 프라이가 유전자 SOEing 방법 (Gene Splicing by Overlap Extension, Horton, Molecular Biotechnology 3: 93-98 (1995))에 의해 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)으로 ddh 통합 카세트의 생산을 위해 선택된다:

ddh_del1 (서열 번호: 33 ):

5` ATC GTC GCT AGC CCA ACG AAT CTC CAC GAG ACG 3`

ddh_del2 (서열 번호: 34):

5` GAC ATC CGC ACC ATG CCT GA 3`

ddh_del3 (서열 번호: 35 ):

5` TCA GGC ATG GTG CGG ATG TC T AGA GTC GGC AAC CAC GAA GCA TT 3`

ddh_del4 (서열 번호: 36 ):

5` ATG CTC GCT AGC ATG ACC AAC ATC CGC GTA GC 3`

제시된 프라이머는 MWG Biotech사에서 합성되고, PCR 반응은 Innis 등. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press)의 표준 PCR 방법에 의해 수행한다. 프라이머 ddh_del1 및 ddh_del4은 각각 상기 제시된 뉴클레오디드 서열에서 밑줄로 표시된 제한 효소의 절단 위치에 대한 서열을 포함한다. 프라이머 ddh_del3은 2 영역의 뉴클레오티드 서열로 구성되는데, 하나는 ddh 유전자의 코딩 서열에서 뉴클레오티드 653 내지 634에 결합하고, 다른 하나는 뉴클레오티드 606 내지 587에 결합한다. 상기 두 영역 사이에서, ddh 유전자의 코딩 서열의 27 염기짝을 삭제하고, 인위적인 제한 효소 XbaI의 절단 부위를 생성하기 위해 4개 염기 "TAGA"를 두 프라이머 ddh_del3의 영역 사이에 통합시킨다. 4개의 염기는 이탤릭체로 표시하고, XbaI 위치는 상기 제시된 서열에서 밑줄로 표시된다. 프라이머 ddh_del3의 5'-말단 영역은 프라이머 ddh_del2에 대해 역 상보적이다.

PCR의 도움으로, 프라이머 ddh_del1 및 ddh_del2는 ddh 유전자의 3'-말단 영역 및 주변 영역을 함유하는 대략 0.75 kb 길이의 DNA 조각의 증폭을 가능하게 하고, 프라이머 ddh_del3 및 ddh_del4는 ddh 유전자의 5'-말단 영역을 함유하는 대략 0.64 kb 길이의 DNA 조각의 증폭을 가능하게 한다. 0.8% 아가로스-젤에서 연이어지는 아가로스-젤 전기 영동으로 증폭체를 검사하고, 젤로부터 단리하여, 통상적인 방법 (High Pure PCR Product Purification Kit, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)에 의해 정제한다. 두 증폭체를 함께 프라이머 ddh_del1 및 ddh_del4를 사용하는 다른 PCR 반응에서 주형으로 사용한다. 상기는 31 bp 삭제 및 제한 효소 XbaI의 인위적인 절단-위치, 및 ddh 유전자의 하부 영역의 412 bp을 포함하는 ddh 유전자를 포함하는 대략 1.38 bp 크기의 ddh 통합 카세트 생산을 야기한다.

ddh 통합 카세트를 제한 효소 NheI으로 절단하고, 0.8% 아가로스-젤에서 아가로스-젤 전기 영동에 의해 확인한다. 대략 1,36 kb 길이의 DNA 조각을 젤로부터 단리하고, 통상적인 방법 (High Pure PCR Product Purification Kit, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)에 의해 정제하고, Schafer 등. (Gene 145: 69-73 (1994))에 의해 기술된 동원가능한 클로닝 벡터 pK18mobsacB와 함께 라이게이션에 사용한다. 벡터 pK18mobsacB는 제한 효소 XbaI으로 미리 절단하고, 알칼린 포스파테이즈 (Boehringer, Mannheim)로 탈인산화시키고, 그 다음 ddh 통합 카세트와 혼합하여, T4 DNA 연결 효소 (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)를 처리한다. 제한 효소 NheI 및 XbaI의 점착력있는 말단은 융화성이 있고, 상기 라이게이션의 생성물은 더 이상 임의의 상기 2개 효소에 의해 절단되지 않는다.

플라스미드 DNA는 Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit를 사용해서 형질전환체로부터 단리하고, 제한 효소 절단에 의해 조사하고, 이어서 아가로스 젤 전기영동으로 확인한다. 플라스미드를 pK18mobsacBddh_Xba라고 부른다.

벡터 pK18mobsacBddh_Xba를 ddh 통합 카세트 내부의 인위적으로 만들어진 XbaI-부위를 단 한번 자르는 제한 효소 XbaI로 자른다. 그 다음 벡터를 알칼린 포스파테이즈 (Boehringer Mannheim, Germany)로 탈인산화시키고, 제한 효소 XbaI에 의해 이미 절단된, 실시예 7.1로부터 대략 2.95 kb의 ilvD 조각과 혼합한다. 혼합물에 T4 DNA 연결 효소 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)를 처리한다.

플라스미드 DNA는 Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit를 사용해서 형질전환체로부터 단리하고, 제한 효소 절단에 의해 조사하고, 이어서 아가로스 젤 전기영동으로 확인한다. 플라스미드를 pK18mobsacBddh::ilvD라고 부른다. 플라스미드의 지도를 도 8에 나타낸다.

7.3 염색체 (표적 부위: ddh 유전자)내로 ilvD 유전자의 2번째 복제본의 혼입

실시예 7.2에서 기술된 벡터 pK18mobsacBddh::ilvD를 Schafer 등. (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990))의 프로토콜에 의해 접합에 의해 브레비박테리움 락토페르멘툼 균주 FERM BP-1763 내로 형질전환시킨다. 벡터는 독립적으로 FERM BP-1763내에서 복제될 수 없고, 그것이 염색체 내에 통합되면, 필요하다면 ddh 영역 내에 또는 ilvD 영역 내에, 세포내에 남아있다. 처음에, 염색체적으로 통합된 pK18mobsacBddh::ilvD를 가진 클론 또는 전이접합체의 선별은 15 mg/l 카나마이신 및 50 mg/l 날리딕산이 첨가된 LB 아가 (Sambrook 등., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989)상에 접합 뱃치를 플레이팅하여 만든다. 카나마이신-저항성 전이접합체를 25 mg/l 카나마이신을 함유하는 LB 아가 플레이트상에 플레이팅하고, 33℃에서 48시간 동안 배양한다. 그 다음 수득된 전이접합체를 ddh 유전자좌내로 플라스미드의 통합하기 위해 스크린한다.

20개의 카나마이신-저항성 전이접합체를 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)의 도움으로 ddh 유전자좌 내로 플라스미드 pK18mobsacBddh::ilvD의 통합을 테스트한다. 클론의 염색체 DNA를 통상적인 방법 (Eikmanns 등., Microbiology 140: 1817 1828 (1994))으로 단리한다. 하기 프라이머 올리고뉴클레오티드가 PCR을 위해 선택된다:

ddh-int1 (서열 번호: 37):

5' - attcttccgcgaccgcgata - 3'

ddh-A1 (서열 번호: 38):

5' - ccggataaaccaccatgaac - 3'

제시된 프라이머는 MWG Biotech사에서 합성된다 (Ebersberg, Germany). 이들은 ddh 통합 카세트의 밖에 위치하고, ilvD 유전자좌 내에 통합된 벡터 pK18mobsacBddh::ilvD를 가진 클론의 DNA로부터 대략 1.45 kb의 PCR 조각을 증폭하게 한다. 대략 10 kb 크기의 벡터가 ddh 유전자좌 내로 통합되면, 중합체가 보이지 않을 것이다. PCR을 Innis 등. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press)의 표준 PCR 방법으로 수행한다.

증폭된 DNA 조각을 아가로스-젤에서 전기 영동에 의해 확인한다.

보이는 PCR 증폭체가 없는 것을 나타내는 2개 클론을, 2번째 재조합 실험의 결과로 플라스미드가 삭제된 클론의 선별을 위해 사용한다. 클론을 LB 액체 배지에서 20시간 동안 배양하고, 그 다음 10% 수크로스가 있는 LB 아가상에 플레이팅하여, 48시간 동안 배양한다.

출발 플라스미드 pK18mobsacB처럼, 플라스미드 pK18mobsacBddh::ilvD는 카나마이신 저항 유전자뿐 아니라, 바실러스 서브틸리스로부터 레반 수크라제를 코딩하는 sacB 유전자의 복제본을 함유한다. 수크로스에 의해 유도될 수 있는 발현은 C. 글루타미쿰에 유독한 레반 생성물의 합성을 촉매하는 레반 수크라제의 형성을 야기한다. 그러므로, 수크로스가 첨가된 LB 아가상에서 자라는 클론만이 2번째 재조합 실험의 결과로 통합된 pK18mobsacBddh::ilvD가 절단된 것들이다. 2번째 재조합 실험의 위치에 따라, 삭제 후에 ilvD 유전자의 2번째 복제본은 그 자체가 염색체에서 ddh 유전자좌에 나타나거나, 또는 숙주의 본래 ddh 유전자가 남아있다.

대략 40 내지 50개의 콜로니를 표현형 "수크로스의 존재에서 생장" 및 "카나마이신의 존재에서 비생장"을 위해 시험한다. 표현형 "수크로스의 존재에서 생장" 및 "카나마이신의 존재에서 비생장"을 나타내는 대략 20개의 콜로니를 중합 효소 연쇄 반응으로 조사한다. 클론의 염색체 DNA를 통상적인 방법 (Eikmanns 등., Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994))에 의해 단리한다.

상기 실시예에서 이미 설명되었던 프라이머 올리고뉴클레오티드 ddh-int1 및 ddh-A1 (서열 번호: 38 및 서열 번호: 39)는, Innis 등. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press)의 표준 PCR 방법에 의해 수행되는 PCR을 위해 선택된다. 프라이머는 ddh 유전자를 함유하는 DNA 조각의 증폭을 가능하게 한다. 대략 1.65 kb 크기의 DNA 조각이 본래 ddh 유전자좌를 가진 대조군 세포에서 증폭된다. 염색체내에 통합된 ilvD 유전자의 2번째 복제본을 ddh 유전자좌에 가진 클론에서, 대략 4.6 kb 크기의 DNA 조각이 증폭된다.

증폭된 DNA 조각을 0.8% 아가로스 젤에서 전기 영동에 의해 확인한다.

염색체의 ddh 유전자좌 내에 통합된 ilvD 유전자의 복제본을 함유하는 클론을 상기 방법으로 확인한다. 상기 클론을 균주 FERM BP-1763ddh::ilvD라고 부른다.

실시예 8

L-발린의 생산

실시예 7.3에서 수득된 브레비박테리움 락토페르멘툼 균주 FERM BP-1763ddh::ilvD를 발린의 생산에 적합한 영양 배지에서 배양하고, 배양 상층액의 발린 함량을 측정한다.

이를 위해, 균주를 초기에 아가 플레이트 (뇌/심장 아가)상에 33℃에서 24시간 동안 배양한다. 상기 아가 플레이트 배양으로부터 출발하여, 예비 배양을 접종한다 (100 ml 원뿔 플라스크내에 10 ml의 배지). 완전 배지 CgIII (2.5 g/l NaCl, 10 g/l 박토-펩톤, 10 g/l 박토-이스트 추출물, pH 7.4, 20 g/l 글루코스 (개별적으로 오토클레이브됨)를 상기 예비배양용 배지로 사용한다. 예비배양은 240 rpm의 진탕 배양기에서 33℃에서 48시간 동안 배양한다. 주 배양의 초기 흡광도 (OD, 660 nm)가 0.1 OD인 상기 예비배양으로부터 주 배양을 접종한다. 배지 MM가 주 배양용 배지로 사용된다.

배지 MM

CSL (옥수수침지액) 5 g/l

MOPS (모르폴리노프로판술폰산) 20 g/l

글루코스 (개별적으로 오토클레이브됨) 50 g/l

염:

(NH₄)₂SO₄ 25 g/l

KH₂PO₄ 0.1 g/l

MgSO₄ * 7 H₂O 1.0 g/l

CaCl₂ * 2 H₂O 10 mg/l

FeSO₄ * 7 H₂O 10 mg/l

MnSO₄ * H₂O 5.0 mg/l

이소루신 (살균-여과됨) 0.1 g/l

메티오닌 (살균-여과됨) 0.1 g/l

티아민 * HCl (살균-여과됨) 0.2 mg/l

루신 (살균-여과됨) 0.1 mg/l

CaCO₃ 25 g/l

CSL, MOPS 및 염 용액을 수성 암모니아로 pH 7에 맞추고, 오토클레이브한다. 살균 물질 및 비타민 용액에 더해서, 건조된 상태로 오토클레이브된 CaCO₃을 그 다음 첨가한다.

배양은 흐름 막이가 있는 100 ml 원뿔 플라스크에서 10 ml 부피로 수행한다. 배양은 33℃ 및 80% 대기 습도에서 수행한다.

48시간 후에, OD를 Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich)을 사용해서 660 nm의 측정 파장에서 측정한다. 형성된 발린의 양을 닌히드린 측정과 함께 이온 교환 크로마토그래피 및 후-컬럼 파생에 의해 Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany)사의 아미노산 분석기로 측정한다.

실험의 결과는 표 15에 제시된다.

균주	OD(660)	발린(g/l)
FERM BP-1763	8.6	12.1
FERM BP-1763ddh::ilvD	8.5	12.9

실시예 9

균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21850 (US 3,849,251)의 염색체 (표적 부위: 유전자내부 영역 ncode1)내로 트립토판 오페론의 2번째 복제본의 혼입

균주의 L-트립토판 생산을 증대시키기 위해 트립토판 오페론의 2번째 복제본을 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21850의 유전자내부 영역 ncode1 (C. 글루타미쿰 게놈의 서열 위치 27398 및 28707 사이에 상응하는 영역 ncode1, 표 12 참조, 실시예 6.1 및 서열 번호: 23) 내로 혼입한다.

코리네박테리움 글루타미쿰의 트립토판 오페론은 감소 조절에 중요한 트립토판 오페론 선도 펩티드를 코딩하는 유전자 trpL, 안트라닐레이트 생성 효소 성분 I을 코딩하는 trpE, 안트라닐레이트 생성 효소 성분 II를 코딩하는 trpG, 포스포리보실전달효소를 코딩하는 trpD, 포스포리보실안트란닐레이트 이소머레이즈를 코딩하는 trpC, 트립토판 생산 효소 (베타 사슬)를 코딩하는 trpB 및 트립토판 생산 효소 (알파 사슬)를 코딩하는 trpA를 포함한다.

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC21850 (US 3,849,251)는 L-트립토판 및 다른 방향족 아미노산의 화학적 유사체에 대한 다중 저항성을 가진 트립토판 생산자이다. 이것은 L-페닐알라닌 및 L-티로신 영양 요구성이다.

ATCC21850로부터의 유전자 trpL의 뉴클레오티드 서열은 위치 42에 구아닌 대신에 아데닌을 가진다. 이것은 아미노산 트립토판을 코딩하는 선도 펩티드의 위치 14에 코돈 tgg을, 중지 코돈 tga로 변화시킨다. 상기 넌센스 돌연변이의 위치는 종결 구조의 형성을 막고, 구조상 항종결 반응을 야기한다 (Heery and Dunican, Applied and Environmental Microbiology 59 (3): 791-799 (1993)).

9.1. 균주 ATCC21850의 트립토판 오페론을 함유하는 DNA의 단리

균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21850로부터 염색체 DNA를 통상적인 방법 (Eikmanns 등., Microbiology 140: 1817 1828 (1994))에 의해 단리한다. 중합 효소 연쇄 반응으로, 트립토판 오페론을 가진 DNA 구역이 증폭된다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체의 뉴클레오티드 서열은 공지되고, 특허 출원 EP-A-1108790 및 「유럽 분자생물학 연구소」 (EMBL, Heidelberg, Germany and Cambridge, UK)의 뉴클레오티드 서열 데이터뱅크의 접근 번호 AX114121에서 찾을 수 있다. 이것은 또한 「국립 의약 도서관」 (Bethesda, MD, USA)의 「국립 생명공학 정보 센터」 (NCBI)의 데이터뱅크에서 찾을 수 있다. 트립토판 오페론의 유전자의 뉴클레오티드 서열은 접근 번호 AX123436 (trpE), AX123438 (trpG), AX123439 (trpD), AX123440 (trpC), AX123442 (trpB) 및 AX123443 (trpA)을 가진다. trpL의 뉴클레오티드 서열은 접근 번호 M17892로 찾을 수 있다.

코리네박테리움 글루타미쿰에 대해 알려진 트립토판 오페론의 서열에 기초해, 하기 프라이머 올리고뉴클레오티드가 PCR을 위해 선택된다:

trp-A1 (서열 번호: 39 ):

5` GTAC GGA TCC CAA GGA CAG CTC GTG TAG AC 3`

trp-E1 (서열 번호: 40):

5` AGCT GGA TCC CAC CGG CTC GAA GCT AAG AT 3`

제시된 프라이머는 MWG Biotech사에서 합성되고 (Ebersberg, Germany), PCR 반응은 Eppendorf (Hamburg, Germany)에 의한 TripleMaster PCR 시스템을 사용해서 수행한다. 프라이머는 트립토판 오페론 또는 주변 영역을 가진 길이 대략 7.95 kb의 DNA 조각을 증폭하게 한다. 프라이머는 더욱이 상기 제시된 뉴클레오티드 서열내에서 밑줄에 의해 표시된 제한 효소 BamHI의 절단 위치에 대한 서열을 포함한다.

트립토판 오페론뿐아니라, 그것의 상부 및 하부-영역을 가진 증폭된 DNA 조각을 제한 효소 BamHI로 절단하고, 0.8% 아가로스-젤에서 아가로스-젤 전기 영동으로 확인한다. 대략 7.93 kb 길이의 DNA 조각을 젤로부터 단리하고, 통상적인 방법 (High Pure PCR Product Purification Kit, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)에 의해 정제한다.

9.2 교체 벡터 pK18mobsacBnc::trp의 제작

실시예 6.1에서 수득된 플라스미드 pK18mobsacBnc는, 유전자내부 영역 ncode1 (서열 번호: 23)을 함유한다. 플라스미드를 제한 효소 BamHI로 절단하고, 그 다음 알칼린 포스파테이즈 (Boehringer Mannheim, Germany)에 의해 탈인산화시키고, 제한 효소 BamHI에 의해 이미 절단된 실시예 9.1로부터의 트립토판 오페론을 함유하는 DNA 조각과 혼합하고, 정제한다. 혼합물에 T4 DNA 연결 효소 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)를 처리한다.

플라스미드 DNA는 Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit를 사용해서 형질전환체로부터 단리하고, 제한 효소 절단에 의해 조사하고, 이어서 아가로스 젤 전기영동으로 확인한다. 플라스미드를 pK18mobsacBnc::trp이라고 부른다. 플라스미드의 지도를 도 9에 나타낸다.

9.3 염색체 유전자내부 영역 ncode1내로 트립토판 오페론의 2번째 복제본의 혼입

실시예 9.2에서 기술된 벡터 pK18mobsacBnc::trp을 접합에 의해 Schafer 등. (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990))의 프로토콜에 의해 균주 ATCC21850 내로 형질전환시킨다. 벡터는 ATCC21850 내에서 독립적으로 복제되지 못하고, 단지 염색체에 통합되면, 여기 필요하다면 ncode1 영역 내로 또는 트립토판 오페론 영역 내로, 세포내에 남아 있다.

처음에, 염색체적으로 통합된 pK18mobsacBnc::trp을 가진 클론 또는 전이접합체의 선별은 15 mg/l 카나마이신 및 50 mg/l 날리딕산이 첨가된 LB 아가 (Sambrook 등., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989)상에 접합 뱃치를 플레이팅하여 만든다. 카나마이신-저항성 전이접합체를 25 mg/l 카나마이신을 함유하는 LB 아가 플레이트상에 플레이팅하고, 33℃에서 48시간 동안 배양한다. 그 다음 수득된 전이접합체를 ncode1 영역 내로 플라스미드의 통합 실험하기 위해 스크린한다.

20개의 카나마이신-저항성 전이접합체를 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)의 도움으로 ncode1-유전자좌 내로 플라스미드 pK18mobsacBnc::trp의 통합을 테스트한다. 클론의 염색체 DNA를 통상적인 방법 (Eikmanns 등., Microbiology 140: 1817 1828 (1994))으로 단리한다. 하기 프라이머 올리고뉴클레오티드가 PCR을 위해 선택된다:

ncode1-A1 (서열 번호: 41):

5 - ACT ATC ATG CGG TGA GCT GT-3

ncode1-E1 (서열 번호: 42):

5`- GGC AGC TCT GTA GCC ATA TT -3`

제시된 프라이머는 MWG Biotech사에서 합성된다 (Ebersberg, Germany). 이들은 ncode1-영역의 클론된 일부 외부 염색체에 위치하고, 트립토판 오페론 내에 통합된 벡터 pK18mobsacBnc::trp을 가진 클론의 DNA로부터 대략 1.47 kb의 PCR 조각을 증폭하게 한다. 대략 14.9 kb 크기의 벡터가 ncode1-영역 내로 통합되면, 중합체가 보이지 않을 것이다. PCR을 Innis 등. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press)의 표준 PCR 방법으로 수행한다.

증폭된 DNA 조각을 아가로스-젤 전기 영동에 의해서 확인한다.

보이는 PCR 증폭체가 없는 것을 나타내는 2개 클론을 2번째 재조합 실험의 결과로 플라스미드가 삭제된 클론의 선별을 위해 사용한다. 클론을 LB 액체 배지에서 20시간 동안 배양하고, 그 다음 10% 수크로스가 있는 LB 아가상에 플레이팅하여, 48시간 동안 배양한다.

출발 플라스미드 pK18mobsacB처럼, 플라스미드 pK18mobsacBnc::trp은 카나마이신 저항 유전자뿐 아니라, 바실러스 서브틸리스로부터 레반 수크라제를 코딩하는 sacB 유전자의 복제본을 함유한다. 수크로스에 의해 유도될 수 있는 발현은 C. 글루타미쿰에 유독한 레반 생성물의 합성을 촉매하는 레반 수크라제의 형성을 야기한다. 그러므로, 수크로스가 첨가된 LB 아가상에서 자라는 클론만이 2번째 재조합 실험의 결과로 통합된 pK18mobsacBnc::trp이 절단된 것들이다. 2번째 재조합 실험의 위치에 따라, 삭제 후에 트립토판 오페론의 2번째 복제본은 그 자체가 ncode1 유전자좌에 염색체내에 나타나거나, 또는 숙주의 본래 ncode1 유전자가 남아있다.

상기 실시예에서 이미 기술된 프라이머 올리고뉴클레오티드 ncode1-A1 (서열 번호: 41) 및 부가적인 프라이머 trp-test가 PCR을 위해 선택된다:

trp-test (서열 번호: 43):

5`- CCA ACC ACG ATG AGA AGG AC -3`

PCR은 Innis 등. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press)의 표준 PCR 방법에 의해 수행된다. 프라이머는 염색체내에 ncode1-영역에 통합된 오직 trp 오페론의 2번째 복제본을 가진 클론에서 대략 0.92 kb 크기의 DNA 조각의 증폭을 가능하게 한다.

증폭된 DNA 조각을 0.8% 아가로스-젤 전기 영동에 의해서 확인한다.

염색체의 유전자내부 영역 ncode1 내에 통합된 트립토판 오페론의 복제본을 함유하는 클론을 상기 방법으로 확인한다. 상기 클론을 균주 ATCC21850nc::trp이라고 부른다.

실시예 10

균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21850 (US 3,849,251)의 염색체 (표적 부위: 파지 성분 pha1)내에 트립토판 오페론의 2번째 복제본의 혼입

본 실시예에서, 균주의 L-트립토판 생산을 향상시키기 위해 트립토판 오페론의 2번째 복제본을 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21850의 파지 성분 pha1 (Genebank 접근 번호 AX127149: 뉴클레오티드 88231 - 89445, 차조 표 13)내로 혼입한다.

10.1 교체 벡터 pK18mobsacBpha1::trp의 제작

실시예 9.1에서 단리된 균주 ATCC21850로부터 염색체 DNA를 파지 성분 pha1 통합 카세트의 증폭에 대한 주형으로 사용했다. 용어 "파지 성분 pha1 통합 카세트"는 다른 유전자 또는 서열이 삽입될 수 있는 제한 효소 BamHI를 위해 인위적으로 만들어진 구획을 포함하는, 주로 파지 성분 pha1의 서열로 이루어진 DNA 구획을 표시한다. 최종 제작물은 염색체 파지 성분 pha1 내로 유전자 또는 다른 DNA 서열의 통합에 사용할 수 있다.

중합 효소 연쇄 반응으로 유전자 SOEing 방법 (Gene Splicing by Overlap Extension, Horton, Molecular Biotechnology 3: 93-98 (1995))에 의해, 파지 성분 pha1 통합 카세트를 증폭한다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 파지 성분 pha1의 뉴클레오티드 서열이 표 13에 언급되고, 그것은 뉴클레오티드 서열의 88231 - 89445 위치에서 Genebank 접근 번호 AX127149의 번호로 찾을 수 있다. 하기 프라이머가 PCR을 위해 생성된다:

pha1-int1 (서열 번호: 44):

5` A GTC GTC GAC GCT ATC AAC GCT TCG ATC AC 3`

pha1-int2 (서열 번호: 45):

5' TG TCT CGT ACG GAT GAC AG 3'

pha1-int3 (서열 번호: 46):

5' TG TCA TCC GTA CGA GAC AGG GAT CC A TAC CTT GCC AGT CAA ATC T 3

pha1-int4 (서열 번호: 47):

5` G TCA GAA TTC GCA GCA TGT AAC GGA TAG GT 3`

제시된 프라이머는 MWG Biotech사에서 합성되고, PCR 반응은 Innis 등. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press)의 표준 PCR 방법에 의해 수행한다. 프라이머 pha1-int1 및 pha1-int4는 상기 제시된 뉴클레오티드 서열에서 밑줄로 표시된 제한 효소 SalI 및 EcoRI의 절단 부위에 대한 서열을 포함한다. 프라이머 pha1-int3은 2 영역의 파지 성분 pha1의 뉴클레오티드 서열로 구성되는데, 뉴클레오티드 서열의 17 염기쌍을 삭제하고, 인위적인 제한 효소 BamHI의 절단 부위를 생성하기 위해 5개 염기 "GATCC"를 통합시킨다.

5개의 염기는 이탤릭체로 표시되고, BamHI 위치는 상기 제시된 서열에서 밑줄로 표시된다. 프라이머 pha1-int3의 5'-말단 영역은 프라이머 pha1-int2에 대해 역 상보적이다.

PCR의 도움으로, 프라이머 pha1-int1 및 pha1-int2는 대략 0.59 kb 길이의 DNA 조각의 증폭을 가능하게 하고, 프라이머 pha1-int3 및 pha1-int4는 대략 0.9 kb 길이의 DNA 조각의 증폭을 가능하게 한다. 0.8% 아가로스-젤에서 이어지는 아가로스-젤 전기 영동으로 증폭체를 검사하고, 젤로부터 단리하여, 통상적인 방법 (High Pure PCR Product Purification Kit, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)에 의해 정제한다. 두 증폭체를 함께 프라이머 pha1-int1 및 pha1-int4를 사용하는 다른 PCR 반응에서 주형으로 사용한다. 상기는 17 bp 삭제 및 제한 효소 BamHI의 인위적인 절단 위치를 포함하는, 파지 성분 pha1 및 주변 영역을 포함하는 대략 1.48 bp 크기의 파지 성분 pha1 통합 카세트 생성을 야기한다.

파지 성분 pha1 통합 카세트를 제한 효소 SalI 및 EcoRI으로 절단하고, 0.8% 아가로스-젤에서 아가로스-젤 전기 영동에 의해 확인한다. 대략 1.47 kb 길이의 DNA 조각을 젤로부터 단리하고, 통상적인 방법 (High Pure PCR Product Purification Kit, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)에 의해 정제하고, Schafer 등. (Gene 145: 69-73 (1994))에 의해 기술된 동원가능한 클로닝 벡터 pK18mobsacB와 함께 라이게이션에 사용한다. 벡터 pK18mobsacB는 제한 효소 제한 효소 SalI 및 EcoRI으로 미리 절단하고, 그 다음 파지 성분 pha1 통합 카세트와 혼합하여, T4 DNA 연결 효소 (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)를 처리한다.

그 다음 이콜라이 균주 DH5α (Grant 등.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649)를 라이게이션 뱃치 (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)로 형질전환시킨다. 플라스미드-함유 세포의 선별은 50 mg/l 카나마이신이 첨가된 LB 아가 (Sambrook 등., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989)상에 형질전환 뱃치를 플레이팅해서 수행한다.

플라스미드 DNA는 Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit를 사용해서 형질전환체로부터 단리하고, 제한 효소 절단에 의해 조사하고, 이어서 아가로스 젤 전기영동으로 확인한다. 플라스미드를 pK18mobsacBpha1이라고 부른다.

벡터 pK18mobsacBpha1을 파지 성분 pha1 통합 카세트 내부의 인위적으로 만들어진 BamHI-위치를 단 한번 자르는 제한 효소 BamHI로 자른다. 그 다음 벡터를 알칼린 포스파테이즈 (Boehringer Mannheim, Germany)로 탈인산화시키고, 제한 효소 BamHI에 의해 이미 절단되고 정제된 실시예 9.1로부터 트립토판 오페론을 함유하는 DNA 조각과 혼합한다. 혼합물에 T4 DNA 연결 효소 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)를 처리한다.

플라스미드 DNA는 Qiagen사의 QIAprep Spin Miniprep Kit를 사용해서 형질전환체로부터 단리하고, 제한 효소 절단에 의해 조사하고, 이어서 아가로스 젤 전기영동으로 확인한다. 플라스미드를 pK18mobsacBpha1::trp이라고 부른다. 플라스미드의 지도를 도 10에 나타낸다.

10.3 염색체 (표적 부위: 파지 성분 pha1)내로 트립토판 오페론의 2번째 복제본의 혼입

실시예 10.2에서 기술된 벡터 pK18mobsacBpha1::trp을 Schafer 등. (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990))의 프로토콜에 의해 접합에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21850내로 형질전환시킨다. 벡터는 ATCC21850 내에서 독립적으로 복제되지 못하고, 단지 염색체에 통합되면, 여기 필요하다면 파지 성분 pha1 내로 또는 트립토판 오페론 내로, 세포내에 남아 있다. 처음에, 염색체적으로 통합된 pK18mobsacpha1::trp을 가진 클론 또는 전이접합체의 선별은 15 mg/l 카나마이신 및 50 mg/l 날리딕산이 첨가된 LB 아가 (Sambrook 등., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989)상에 접합 뱃치를 플레이팅하여 만든다. 카나마이신-저항성 전이접합체를 25 mg/l 카나마이신을 함유하는 LB 아가 플레이트상에 플레이팅하고, 33℃에서 48시간 동안 배양한다. 그 다음 수득된 전이접합체를 파지 성분 pha1 내로 플라스미드의 통합하기 위해 스크린한다.

20개의 카나마이신-저항성 전이접합체를 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)의 도움으로 파지 성분 pha1 내로 플라스미드 pK18mobsacBpha1::trp의 통합을 위해 테스트한다. 클론의 염색체 DNA를 통상적인 방법 (Eikmanns 등., Microbiology 140: 1817 1828 (1994))으로 단리한다. 하기 프라이머 올리고뉴클레오티드가 PCR을 위해 선택된다:

pha1-test1 (서열 번호: 48):

5'- GCG CTC CAT CAC TAG AGT TC-3

pha1-test2 (서열 번호: 49):

5`- GGT CAG AGT GAG CAC CTA AG -3`

제시된 프라이머는 MWG Biotech사에서 합성된다 (Ebersberg, Germany). 이들은 파지 성분 pha1 통합 카세트의 밖에 위치하고, 트립토판 오페론 내에 통합된 벡터 pK18mobsacBpha1::trp을 가진 클론의 DNA로부터 대략 1.56 kb의 PCR 조각을 증폭하게 한다. 대략 15 kb 크기의 벡터가 파지 성분 pha1 유전자좌 내로 통합되면, 중합체가 보이지 않을 것이다. PCR을 Innis 등. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press)의 표준 PCR 방법으로 수행한다.

출발 플라스미드 pK18mobsacB처럼, 플라스미드 pK18mobsacBpha1::trp은 카나마이신 저항 유전자뿐 아니라, 바실러스 서브틸리스로부터 레반 수크라제를 코딩하는 sacB 유전자의 복제본을 함유한다. 수크로스에 의해 유도될 수 있는 발현은 C. 글루타미쿰에 유독한 레반 생성물의 합성을 촉매하는 레반 수크라제의 형성을 야기한다. 그러므로, 수크로스가 첨가된 LB 아가상에서 자라는 클론만이 2번째 재조합 실험의 결과로 통합된 pK18mobsacBpha1::trp이 절단된 것들이다. 2번째 재조합 실험의 위치에 따라, 삭제 후에 트립토판 오페론의 2번째 복제본은 그 자체가 파지 성분 pha1내에 나타나거나, 또는 숙주의 본래 파지 성분 pha1이 남아있다.

본 실시예에서 이미 기술된 프라이머 올리고뉴클레오티드 pha1-test1 (서열 번호: 48), 및 부가적인 프라이머 pha1-test3가 PCR에 대해 선택된다:

pha1-test3 (서열 번호: 50):

5`- CTG CGA GCT TCA TTC GAT CC -3`

PCR은 Innis 등. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press)의 표준 PCR 방법에 의해 수행된다. 프라이머는 파지 성분 pha1에서 염색체내에 통합된 trp 오페론의 2번째 복제본만을 가진 클론에서 대략 1.6 kb 크기의 DNA 조각의 증폭을 가능하게 한다.

염색체의 파지 영역 pha1 내에 통합된 트립토판 오페론의 복제본을 함유하는 클론을 상기 방법으로 확인한다. 상기 클론을 균주 ATCC21850pha1::trp이라고 부른다.

실시예 11

L-트립토판의 생성

실시예 9.3에서 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC21850nc::trp 및 실시예 10.2에서 수득된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC21850pha1::trp을 트립토판의 생성에 적합한 영양 배지에서 배양하고, 배양 상층액의 트립토판 함량을 측정한다.

이를 위해, 균주를 초기에 아가 플레이트 (뇌/심장 아가)상에 33℃에서 24시간 동안 배양한다. 상기 아가 플레이트 배양으로부터 출발하여, 예비 배양을 접종한다 (100 ml 원뿔 플라스크내에 10 ml의 배지). 완전 배지 CgIII (2.5 g/l NaCl, 10 g/l 박토-펩톤, 10 g/l 박토-이스트 추출물, pH 7.4, 20 g/l 글루코스 (개별적으로 오토클레이브됨)를 상기 예비배양용 배지로 사용한다. 예비배양은 240 rpm의 진탕 배양기에서 33℃에서 16시간 동안 배양한다.

L-페닐알라닌 및 L-티로신이 첨가된 트립토판 생산 배지가 주 배양용 배지로 사용된다.

트립토판 생산 배지

몰라쎄 (Molasse) 100 g/l

CSL (옥수수침지유) 10 g/l

염:

(NH₄)₂SO₄ 20 g/l

KH₂PO₄ 0.5 g/l

MgSO₄ * 7 H₂O 0.25 g/l

K₂HPO₄ 0.5 mg/l

L-페닐알라닌 (살균-여과됨) 0.3 g/l

L-티로신 (살균-여과됨) 0.15 g/l

몰라쎄, CSL 및 염 용액을 수성 암모니아로 pH 7에 맞추고, 오토클레이브한다. 그 다음 살균 물질을 첨가한다.

흐름 막이가 있는 500 ml Erlenmeyer 플라스크내에 50 ml 트립토판 생산 배지의 배양을 위해, 예비배양의 흡광도 (OD)를 Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich)을 사용해서 660 nm의 측정 파장에서 측정한다. 그 다음 예비 배양을 원심분리하고, 상층액을 따라 버리고, 각 펠렛을 5 ml 트립토판 생산 배지에 재현탁시킨다. 주 배양을, 주 배양의 초기 흡광도 (OD, 660 nm)가 0.1 OD인 상기 현탁물로부터 접종한다. 배양균을 5일동안 150 rpm의 진탕 배양기에서 33℃에서 5일 동안 인큐베이션한다.

5일 후에, 각 배양균의 흡광도 (OD)를 Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich)을 사용해서 660 nm의 측정 파장에서 측정한다. 형성된 트립토판의 양을 닌히드린 측정과 함께 이온 교환 크로마토그래피 및 후-컬럼 파생에 의해 Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany)사의 아미노산 분석기로 측정한다.

실험의 결과는 표 16에 제시된다.

균주	OD(660)	트립토판 HClg/l
ATCC21850	10,3	1,0
ATCC21850nc::trp	10,1	1,4
ATCC21850pha1::trp	10,2	1,5

<110> Degussa AG <120> Bacteria and Process for Producing Chemical Compounds by said bacteria I <130> 010301 BT <160> 50 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1263 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)..(1263) <223> lysC wild-type gene <400> 1 gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg 48 Val Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 1 5 10 15 gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct 96 Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 20 25 30 gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat 144 Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 35 40 45 gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt 192 Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60 gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc 240 Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80 gtc gcc atg gct 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300 gac ggc acc acc gac atc acc ttc acc tgc cct cgt tcc gac ggc cgc 960 Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg 305 310 315 320 cgc gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc 1008 Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr 325 330 335 aat gtg ctt tac gac gac cag gtc ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct 1056 Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala 340 345 350 ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg 1104 Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu 355 360 365 cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa ttg att tcc acc tct gag att cgt 1152 Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375 380 att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca 1200 Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400 ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat 1248 Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr 405 410 415 gca ggc acc gga cgc 1263 Ala Gly Thr Gly Arg 420 <210> 2 <211> 421 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 1 5 10 15 Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 20 25 30 Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 35 40 45 Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80 Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95 Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 100 105 110 Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly 115 120 125 Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140 Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175 Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp 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Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400 Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr 405 410 415 Ala Gly Thr Gly Arg 420 <210> 3 <211> 1263 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)..(1263) <223> lysC-fbr allele lysC T311I <400> 3 gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg 48 Val Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 1 5 10 15 gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct 96 Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 20 25 30 gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat 144 Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 35 40 45 gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt 192 Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60 gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc 240 Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80 gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa gcc caa tct ttc acg 288 Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95 ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc cac gga aac gca cgc 336 Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 100 105 110 att gtt gat gtc act cca ggt cgt gtg cgt gaa gca ctc gat gag ggc 384 Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly 115 120 125 aag atc tgc att gtt gct ggt ttc cag ggt gtt aat aaa gaa acc cgc 432 Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140 gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac acc act gca gtt gcg 480 Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160 ttg gca gct gct ttg aac gct gat gtg tgt gag att tac tcg gac gtt 528 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175 gac ggt gtg tat acc gct gac ccg cgc atc gtt cct aat gca cag aag 576 Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys 180 185 190 ctg gaa aag ctc agc ttc gaa gaa atg ctg gaa ctt gct gct gtt ggc 624 Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly 195 200 205 tcc aag att ttg gtg ctg cgc agt gtt gaa tac gct cgt gca ttc aat 672 Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 210 215 220 gtg cca ctt cgc gta cgc tcg tct tat agt aat gat ccc ggc act ttg 720 Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240 att gcc ggc tct atg gag gat att cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc 768 Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr 245 250 255 ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att 816 Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile 260 265 270 tcc gat aag cca ggc gag gct gcg aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat 864 Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp 275 280 285 gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac gtc tct tct gta gaa 912 Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 290 295 300 gac ggc acc acc gac atc atc ttc acc tgc cct cgt tcc gac ggc cgc 960 Asp Gly Thr Thr Asp Ile Ile Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg 305 310 315 320 cgc gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc 1008 Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr 325 330 335 aat gtg ctt tac gac gac cag gtc ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct 1056 Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala 340 345 350 ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg 1104 Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu 355 360 365 cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa ttg att tcc acc tct gag att cgt 1152 Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375 380 att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca 1200 Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400 ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat 1248 Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu 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<213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer ddh_beg <400> 15 ctgaatcaaa ggcggacatg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer ddh_end <400> 16 tcgagctaaa ttagacgtcg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer dapA_beg <400> 17 cgagccagtg aacatgcaga 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer dapA_end <400> 18 cttgagcacc ttgcgcagca 20 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer pyc_beg <220> <221> misc_feature <222> (1)..(28) <223> Primer pyc_anf <220> <221> misc_feature <222> (1)..(28) <223> Primer pyc_beg <400> 19 tcacgcgtct tgaagtcgtg caggtcag 28 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer pyc_end <220> <221> misc_feature <222> (1)..(28) <223> Primer pyc_end <400> 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ttgaaacaac tcactctgct gcatattaaa 420 aggtcgatta actaacgatt gaattgatcc ttaaaaagcc tttatctatc gcattatgaa 480 taaatattta atcgaccttt aatagtgacc taaaagcctt ttaaaagcca acgcattcag 540 tgacttttaa aaggctatta agtgtcaatt gaattgcctt gttactggct tttaaaaggc 600 tattaaagaa cactccccta ttgtctttta atcgtcactt aatcgacctc taaaaggtaa 660 ctaattgact cttgagtgac acatatttaa ttgaccttta agtaacgatt ataaggcaat 720 taatgtgacc aaataaagac acgtaactga ctaatcttta tctgactatt acaaggcttt 780 aaaagagcac ttatgtgtcg attaagtgtc tacgcaataa ctgtgcttta agaggcttta 840 aaaactacaa ttgaatcgac cactaatcgt tacttaaatg actattaaca aaagtcactt 900 ttagagcacc gcaaaagcct tttaatggtc acgcaataag cctttaagta acaattaaat 960 aagtggcttt aaaatcacta ctgcagcacg attgaaaggt aattagcggt cgattaagtg 1020 tcaattaatt aatagtgatt caaaatctca ttaaagcgca attcaattga cagctaataa 1080 gcccttaagt aacaaatact ttatccgtac tttaagggca cgctaaaagc cttttaatcg 1140 acatctaatt gtcataacgc ttcgatgcgc ccatgggaat acacttagcg gtcgattaaa 1200 tggatactaa gtagcaatta gccagagtcg cgtgacagag 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gctctattgt cccctacgtg ctcgtttctg gccttttagt aagcaccagg 60 aataagcgcc gatgaagaca caatcatacc gacaattaat cgtgccgata tgagctctta 120 aaagacagca taaaacgagt ttttcaaaag cctattaagt gtcaattacg acgtgcatta 180 atagatactc aatcacctta aattgttgac acactccact aaaacaggtc tattaaaaga 240 caattgaatt acgccctagt agtacttgtt tcaggccacc acttagaagg cttttaagta 300 tccactatgt atcaattatc tagaaccttt agtgactttg aaacggcagt actctattgg 360 ctcttaatgg tcaattacat aacaattata ttgagccttt gaaacaactc actctgctgc 420 atattaaaag gtcgattaac taacgattga attgatcctt aaaaagcctt tatctatcgc 480 attatgaata aatatttaat cgacctttaa tagtgaccta aaagcctttt aaaagccaac 540 gcattcagtg acttttaaaa ggctattaag tgtcaattga attgccttgt tactggcttt 600 taaaaggatc ctattaaaga acactcccct attgtctttt aatcgtcact taatcgacct 660 ctaaaaggta actaattgac tcttgagtga cacatattta attgaccttt aagtaacgat 720 tataaggcaa ttaatgtgac caaataaaga cacgtaactg actaatcttt atctgactat 780 tacaaggctt taaaagagca cttatgtgtc gattaagtgt ctacgcaata actgtgcttt 840 aagaggcttt aaaaactaca attgaatcga ccactaatcg ttacttaaat gactattaac 900 aaaagtcact tttagagcac cgcaaaagcc ttttaatggt cacgcaataa gcctttaagt 960 aacaattaaa taagtggctt taaaatcact actgcagcac gattgaaagg taattagcgg 1020 tcgattaagt gtcaattaat taatagtgat tcaaaatctc attaaagcgc aattcaattg 1080 acagctaata agcccttaag taacaaatac tttatccgta ctttaagggc acgctaaaag 1140 ccttttaatc gacatctaat tgtcataacg cttcgatgcg cccatgggaa tacacttagc 1200 ggtcgattaa atggatacta agtagcaatt agccagagtc gagatctag 1249 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer 3371V <400> 29 tatcatgcgg tgagctgtga 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer 3372N <400> 30 taggggtgat gtgctactgt 20 <210> 31 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer ilvD-A1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> Primer ilvD-A1 <400> 31 atcgtctcta gacttggagc gccaaaaggc ac 32 <210> 32 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer ilvD-E1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> Primer ilvD-E1 <400> 32 gtcatctcta gatcgaggca gagttcgctg gt 32 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer ddh_del1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(33) <223> Primer ddh_del1 <400> 33 atcgtcgcta gcccaacgaa tctccacgag acg 33 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer ddh_del2 <400> 34 gacatccgca ccatgcctga 20 <210> 35 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer ddh_del3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> Primer ddh_del3 <400> 35 tcaggcatgg tgcggatgtc tagagtcggc aaccacgaag catt 44 <210> 36 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer ddh_del4 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> Primer ddh_del4 <400> 36 atgctcgcta gcatgaccaa catccgcgta gc 32 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer ddh-int1 <400> 37 attcttccgc gaccgcgata 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer ddh_A1 <400> 38 ccggataaac caccatgaac 20 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer trp-A1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> Primer trp-A1 <400> 39 gtacggatcc caaggacagc tcgtgtagac 30 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer trp-E1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> Primer trp-E1 <400> 40 agctggatcc caccggctcg aagctaagat 30 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer ncode1-A1 <400> 41 actatcatgc ggtgagctgt 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer ncode1-E1 <400> 42 ggcagctctg tagccatatt 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer trp-test <400> 43 ccaaccacga tgagaaggac 20 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer pha1-int1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> Primer pha1-int1 <400> 44 agtcgtcgac gctatcaacg cttcgatcac 30 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer pha1-int2 <400> 45 ctgtctcgta cggatgacag 20 <210> 46 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer pha1-int3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) <223> Primer pha1-int3 <400> 46 ctgtcatccg tacgagacag ggatccatac cttgccagtc aaatc 45 <210> 47 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer pha1-int4 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> Primer pha1-int4 <400> 47 gtcagaattc gcagcatgta acggataggt 30 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer pha1-test1 <400> 48 gcgctccatc actagagttc 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer pha1-test2 <400> 49 ggtcagagtg agcacctaag 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer pha1-test3 <400> 50 ctgcgagctt cattcgatcc 20

Claims

본래 부위(유전자좌)에 존재하고 화학적 화합물의 합성을 위한 단백질 또는 RNA를 암호화하는, 하나 이상의 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자의 1개 복제본에 더해, 하기를 포함하는 코리네형 박테리아:

a) 염색체내에 통합된 부위에 상기 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자의 하나 이상의 복제본, 이에 따라

b) 미생물에서 복제 또는 전위가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열이 없고,

c) 상기 부위에 존재하는 항생제에 저항성을 부여하는 뉴클레오티드가 없고,

d) 상기 박테리아의 생장 및 목적하는 화합물의 제조에 필수적인 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자와 관련되지 않은 상기 부위, 및

e) 유전자내부 영역, 프로파지 및 결손파지 또는 파지 성분 또는 상기 프로파지, 결손파지 또는 파지 성분을 암호화하는 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 상기 부위.

제 1 항에 있어서, 유전자내부 영역이 하기 표로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드와 70% 이상 동일한 코리네형 박테리아.

참조 접근 번호 서열 시작 위치 서열 말단 위치 EP1108790 AX120085 192176 194501 EP1108790 AX127145 235840 237311 EP1108790 AX127145 236096 237311 EP1108790 AX127148 322628 330877 EP1108790 AX127148 334045 336467 EP1108790 AX127148 289565 291841 EP1108790 AX127149 154823 161111 EP1108790 AX127149 190088 193497 EP1108790 AX127149 27398 28707 EP1108790 AX127149 61478 62944 EP1108790 AX127149 116234 117561 EP1108790 AX127149 140847 144605 EP1108790 AX127150 113274 114324 EP1108790 AX127152 244281 246403

제 1 항에 있어서, 염색체 내에 포함된 프로파지, 결손파지 및 파지 성분이 하기 표로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드와 70% 이상 동일한 코리네형 박테리아.

참조 접근 번호 서열 시작 위치 서열 말단 위치 EP1108790 AX127149 50474 51049 EP1108790 AX127149 67886 68587 EP1108790 AX127151 72893 73480 EP1108790 AX127149 88231 89445 EP1108790 AX127148 139781 140155 EP1108790 AX127148 140546 141001 EP1108790 AX127149 194608 195294 EP1108790 AX127147 200185 200940 EP1108790 AX127147 208157 208450 EP1108790 AX127149 269616 269948 EP1108790 AX127148 336468 338324 EP1108790 AX127148 342235 342681 EP1108790 AX127148 343518 345356 EP1108790 AX127148 345872 346207

제 1 항에 있어서, 코리네형 박테리아가 코리네박테리움 속에 속하는 코리네형 박테리아.
제 2 항에 있어서, 이들이 코리네박테리움 글루타미쿰 종에 속하는 코리네박테리움 속의 코리네형 박테리아.
제 1 항에 있어서, 화학적 화합물이 L-아미노산, 비타민, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 코리네형 박테리아.
제 1 항에 있어서, 화학적 화합물이 L-아스파르트산, L-아스파라진, L-트레오닌, L-세린, L-글루탐산, L-글루타민, 글리신, L-알라닌, L-시스테인, L-발린, L-메티오닌, L-이소루신, L-루신, L-티로신, L-페닐알라닌, L-히스티딘, L-리신, L-트립토판, L-프롤린 및 L-아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 L-아미노산인 코리네형 박테리아.
제 6 항에 있어서, L-아미노산이 L-리신인 코리네형 박테리아.
제 8 항에 있어서, 리신 생성을 위한 단백질을 암호화하는 하나 이상의 상기 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자가 accBC, accDA, cstA, cysD, cysE, cysH, cysK, cysN, cysQ, dapA, dapB, dapC, dapD, dapE, dapF, ddh, dps, eno, gap, gap2, gdh, gnd, lysC, lysC^FBR, lysE, msiK, opcA, oxyR, ppc, ppc^FBR, pgk, pknA, pknB, pknD, pknG, ppsA, ptsH, ptsI, ptsM, pyc, pyc P458S, sigC, sigD, sigE, sigH, sigM, tal, thyA, tkt, tpi, zwa1, zwf 및 zwf A213T로 이루어진 군으로부터 선택되는 코리네형 박테리아.
제 8 항에 있어서, 하나 이상의 상기 외래전사 해독 프레임 (ORF)이 dapA, ddh, lysC^FBR 및 pyc P458S로 이루어진 군으로부터 선택되는 리신 생성을 위한 단백질을 암호화하는 유전자 또는 대립유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 코리네형 박테리아.
제 8 항에 있어서, 피드백 저항성 형태의 아스파테이트 키나아제를 암호화하는 lysC^FBR 대립유전자를 함유하는 코리네형 박테리아.
제 11 항에 있어서, A279T, A279V, S301F, T308I, S301Y, G345D, R320G, T311I 및 S381F로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하는 서열 번호:2에 따른 아미노산 서열을 함유하는 lysC^FBR 대립유전자에 의해 암호화되는 피드백 저항성 아스파테이트 키나아제를 포함하는 코리네형 박테리아.
제 11 항에 있어서, lysC^FBR 대립유전자에 의해 암호화되는 피드백 저항성 아스파테이트 키나아제가 서열 번호:4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 코리네형 박테리아.
제 11 항에 있어서, lysC^FBR 대립유전자의 코딩 영역이 서열 번호:3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 코리네형 박테리아.
제 8 항에 있어서, 상기 유전자 또는 대립유전자의 3번째 또는 4번째 복제본이 aecD, ccpA1, ccpA2, citA, citB, citE, fda, gluA, gluB, gluC, gluD, luxR, luxS, lysR1, lysR2, lysR3, menE, mqo, pck, pgi 및 poxB로 이루어진 군으로부터 선택되는 부위에 통합되는 코리네형 박테리아.
제 15 항에 있어서, 상기 부위가 aecD 유전자 부위인 코리네형 박테리아.
제 15 항에 있어서, 상기 부위가 gluB 유전자 부위인, L-리신을 생산하는 코리네형 박테리아.
제 15 항에 있어서, 상기 부위가 pck 유전자 부위인, L-리신을 생산하는 코리네형 박테리아.
적합한 배지에서 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 코리네형 박테리아의 발효를 포함하는 화학적 화합물의 제조 방법.
하기 단계를 수행하는 코리네형 박테리아의 발효에 의한 화학적 화합물의 제조 방법:

a) 본래 부위(유전자좌)에 존재하고 화학적 화합물의 합성을 위한 단백질 또는 RNA를 코딩하는, 하나 이상의 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자의 하나 이상의 복제본을 추가로 포함하는 코리네형 박테리아의 발효

b) 상기 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자의 발현을 허용하는 조건하에서 염색체내로 통합된 부위에, 상기 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자의, 하나 이상의 특히 2번째, 임의로 3번째 또는 4번째 복제본, 이에 따라

c) 미생물에서 에피좀의 복제 또는 전위가 가능하거나/가능하게 하는 뉴클레오티드 서열이 없고,

d) 상기 부위에 존재하는 항생제에 저항성을 부여하는 뉴클레오티드가 없고, 이에 따라

e) 염색체 내에 모두 포함된 유전자내부 영역, 프로파지, 결손파지 또는 파지 성분 또는 상기 프로파지, 결손파지 또는 파지 성분을 암호화하는 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 상기 부위,

f) 박테리아의 발효 브로스 및/또는 세포내에서 화학적 화합물의 농도,

g) 임의로 화학적 화합물의 단리,

h) 발효 브로스 및/또는 생물자원으로부터 0 내지 100 중량% 초과까지의 성분을 가짐.
제 20 항에 있어서, 유전자내부 영역이 제 2 항의 표로부터 선택되는 방법.
제 20 항에 있어서, 상기 프로파지, 결손파지 또는 파지 성분이 제 3 항의 표로부터 선택되는 방법.
제 20 항에 있어서, 상기 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자에 의해 암호화되는 상응하는 단백질의 세포내 활성이 증가되는, 특히 상기 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 과발현되는 코리네형 박테리아가 사용되는 방법.
제 20 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아가 코리네박테리움 속에 속하는 방법.
제 24 항에 있어서, 상기 박테리아가 코리네박테리움 글루타미쿰 종에 속하는 방법.
제 20 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학적 화합물이 L-아미노산, 비타민, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제 27 항에 있어서, 화학적 화합물이 L-아스파르트산, L-아스파라진, L-트레오닌, L-세린, L-글루탐산, L-글루타민, 글리신, L-알라닌, L-시스테인, L-발린, L-메티오닌, L-이소루신, L-루신, L-티로신, L-페닐알라닌, L-히스티딘, L-리신, L-트립토판, L-프롤린 및 L-아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 L-아미노산인 방법.
제 26 항에 있어서, 화학적 화합물이 L-리신인 방법.
제 20 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 외래전사 해독 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자가 accBC, accDA, cstA, cysD, cysE, cysH, cysK, cysN, cysQ, dapA, dapB, dapC, dapD, dapE, dapF, ddh, dps, eno, gap, gap2, gdh, gnd, lysC, lysC^FBR, lysE, msiK, opcA, oxyR, ppc, ppc^FBR, pgk, pknA, pknB, pknD, pknG, ppsA, ptsH, ptsI, ptsM, pyc, pyc P458S, sigC, sigD, sigE, sigH, sigM, tal, thyA, tkt, tpi, zwa1, zwf 및 zwf A213T로 이루어진 군으로부터 선택되는 코리네형 박테리아가 사용되는 L-리신 제조 방법.
제 20 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자가 유전자 또는 대립유전자 dapA, ddh, lysC^FBR 및 pyc P458S로 이루어진 군으로부터 선택되는 코리네형 박테리아가 발효되는 L-리신 제조 방법.
제 30 항에 있어서, 대립유전자가 피드백 저항성 아스파테이트 키나아제를 코딩하는 lysC^FBR 대립유전자인 L-리신 제조 방법.
제 31 항에 있어서, lysC^FBR 대립유전자에 의해 암호화되는 피드백 저항성 아스파테이트 키나아제가 A279T, A279V, S301F, T308I, S301Y, G345D, R320G, T311I 및 S381F로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하는 서열 번호:2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 L-리신 제조 방법.
제 31 항에 있어서, lysC^FBR 대립유전자에 의해 암호화되는 피드백 저항성 아스파테이트 키나아제가 서열 번호:4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 L-리신 제조 방법.
제 31 항에 있어서, lysC^FBR 대립유전자의 코딩 영역이 서열 번호:3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 L-리신 제조 방법.
제 20 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 3번째 또는 4번째 부위가 유전자 aecD, ccpA1, ccpA2, citA, citB, citE, fda, gluA, gluB, gluC, gluD, luxR, luxS, lysR1, lysR2, lysR3, menE, mqo, pck, pgi 및 poxB로 이루어진 군으로부터 선택되는 코리네형 박테리아가 발효되는 L-리신 제조 방법.
하기를 포함하는 코리네형 박테리아의 생산 방법:

a) 임의로 발현 및/또는 조절 신호를 포함하는, 바람직하게는 코리네형 박테리아로부터 화학적 화합물 생산의 단백질 또는 RNA를 암호화하는 하나 이상의 목적하는 ORF, 유전자 또는 대립유전자의 뉴클레오티드 서열을 단리하고,

b) 표적 부위의 뉴클레오티드 서열을 가진 상기 ORF, 유전자 또는 대립유전자와 함께 5' 및 3' 말단을 제공하고,

c) 상기 부위는 유전자내부 영역, 프로파지, 결손파지 또는 파지 성분으로 이루어진 군으로부터 선택되고,

d) 바람직하게 코리네형 박테리아에서 복제되지 않거나, 또는 단지 한정된 정도로 복제되는 적합한 벡터 내에 표적 부위의 뉴클레오티드 서열과 함께 제공되는 목적하는 ORF, 유전자 또는 대립유전자의 뉴클레오티드 서열을 혼입하고,

e) 상기 b) 또는 c)에 따른 상기 뉴클레오티드 서열을 코리네형 박테리아내로 전이시키고,

f) 상기 a)에 따른 뉴클레오티드 서열이 표적 부위에 혼입된 코리네형 박테리아를 단리함.