DE102004061696A1

DE102004061696A1 - Mutante des proB-Gens aus coryneformen Bakterien

Info

Publication number: DE102004061696A1
Application number: DE102004061696A
Authority: DE
Inventors: Stephan Hans; Brigitte Dr. Bathe; Georg Dr. Thierbach
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2004-12-22
Filing date: 2004-12-22
Publication date: 2006-07-06
Also published as: ES2362105T3; DK1828384T3; EP2210946A1; DK2210946T3; JP4637183B2; KR100923806B1; ZA200705143B; US7982020B2; ES2537647T3; BRPI0519207A2; ATE503016T1; CN101084312A; WO2006066758A1; KR20070091663A; US20090221043A1; JP2008523832A; EP2210946B1; DE602005027111D1; BRPI0519207B1; EP1828384A1

Abstract

Die Erfindung betrifft mutierte Varianten des proB-Gens aus coryneformen Bakterien, kodierend für gamma-Glutamylkinase, und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Prolin unter Verwendung von Bakterien, die diese Mutation enthalten.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Enzym, welches γ-Glutamylkinase-Aktivität aufweist. Insbesondere kennzeichnet die vorliegende Erfindung derartige Enzyme, die an Position 149 der Aminosäuresequenz oder vergleichbarer Position eine andere proteinogene Aminosäure als Glycin aufweisen.
Die Enzyme mit γ-Glutamylkinase-Aktivität kommen vorzugsweise bei der fermentativen Herstellung von L-Prolin zum Einsatz. Der Biosyntheseweg für L-Prolin ausgehend von Glutamat ist in Schema 1 dargestellt.
Schema 1

Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen z.B. coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden können. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und die Aminosäuren produzieren. Ein bekannter Antimetabolit ist das Prolinanalogon 3,4-Dehydro-DL-Prolin (DHP).

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L-Aminosäure produzierenden Stämmen von Corynebacterium eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure-Produktion untersucht.

Die Nukleotidsequenz des Genoms von Corynebacterium glutamicum ist unter anderem in der EP-A-1108790 beschrieben und ebenfalls in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicin (Bethesda, MD, USA) unter den Zugangsnummern (Accession Number's) NC_003450.2 und BX927148.1 bis BX927157.1 hinterlegt.

Sleator et al. berichten über die Möglichkeit, durch Mutation im proB-Gen von Listeria monocytogenes eine Überproduktion bei der Prolin-Biosynthese hervorzurufen (Appl. Environ. Microbiol. 2001, 67, 4560–5). Die dort dargestellten und als erfolgreich titulierten Mutationen betreffen proB-Gene, die für γ-Glutamylkinasen kodieren, bei denen folgende Mutationen vorliegen: V121I, A144V und E146K. Es wird darüber hinaus erwähnt, dass die Regionen, in denen diese Mutationen auftreten, sehr gut mit der Region übereinstimmt, die auch in anderen Organismen als Zielbereich für vorteilhafte Mutationen identifiziert wurde.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, weitere gegebenenfalls verbesserte mutierte Proteinvarianten für eine γ-Glutamylkinase zur Verfügung zu stellen, die in einem technischen Prozess zur fermentativen Herstellung von L-Prolin vorteilhaft zum Einsatz kommen können.

Diese und weitere nicht näher genannte, sich jedoch in naheliegender Weise aus dem Stand der Technik ergebende Aufgaben, werden durch die Angabe der γ-Glutamylkinasen des Anspruchs 1 gelöst. Anspruch 2 ist auf bevorzugte Enzyme dieser Gattung gerichtet. Anspruch 3 betrifft die diese Enzyme codierenden Nukleotidsequenzen, während Anspruch 4 auf rekombinant hergestellte Vehikel gerichtet ist, die die eben genannten Nukleotidsequenzen aufweisen. Anspruch 5 schließlich betrifft ein erfindungsgemäßes Herstellerverfahren für L-Prolin unter Zuhilfenahme der angesprochenen Enzyme.

Dadurch, dass man eine γ-Glutamylkinase (ProB-Genprodukt), welche an Aminosäureposition 149 oder vergleichbarer Position eine andere proteinogene Aminosäure aufweist als Glycin, bereitstellt, gelangt man besonders überraschend dafür aber nicht minder vorteilhaft zur Lösung der gestellten Aufgabe. γ-Glutamylkinasen mit einer entsprechenden Mutation helfen gegenüber den Wildtyp-Enzymen, L-Prolin in verbesserter Art und Weise in einem technischen fermentativen Herstellprozess zu produzieren. Mit den Methoden der Erfindung kann die Leistung der Wirtsorganismen bzw. des Fermentationsprozesses bezüglich eines oder mehrerer der Parameter ausgewählt aus der Gruppe der Produkt-Konzentration (Produkt pro Volumen), der Produkt-Ausbeute (gebildetes Produkt pro verbrauchter Kohlenstoff-Quelle) und der Produkt-Bildung (gebildetes Produkt pro Volumen und Zeit) oder auch anderer Prozess-Parameter und Kombinationen davon um mindestens 0,5%, mindestens 1%, mindestens 1,5% oder mindestens 2% bezogen auf den Ausgangstamm bzw. Elternstamm bzw. den Fermentationsprozess unter Verwendung derselben verbessert werden.

Vorzugsweise werden γ-Glutamylkinase bereitgestellt, bei denen sich an der erfindungsgemäß bezeichneten oder vergleichbaren Aminosäuresäureposition eine Aminosäure, bevorzugt L-Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys oder Phe befindet. (Die genannten Aminosäuren enschließlich des Glycins werden in der Fachwelt auch als proteinogene Aminosäuren bezeichnet.) Ganz besonders bevorzugt ist der Austausch Glycin gegen L-Asparaginsäure an Position 149 (G149D) in besagtem Enzym. Äußerst bevorzugt ist eine wie oben dargestellte erfindungsgemäße γ-Glutamylkinase, deren Länge 369 ± 40, vorzugsweise ±20, mehr bevorzugt ±10 und ganz besonders bevorzugt ±5 Aminosäuren oder ±3 Aminosäuren beträgt. Es ist bekannt, dass wirtseigene Enzyme, sogenannte Aminopeptidasen, die N-terminale Aminosäure Methionin des gebildeten Proteins abspalten können. Es ist weiterhin bekannt, dass durch Abspaltung von einer (1) oder zwei (2) maximal drei (3) Aminosäuren vom C-terminalen Ende des Proteins die Enzymaktivität nicht oder höchstens unwesentlich beeinträchtigt wird. Die Länge des Enzyms kann jedoch durch Anhängen von bestimmten Fusionsproteinen vergrößert sein (s.u.).

Umfasst ist dabei auch die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO.: 2, vorzugsweise 4, oder eine Sequenz, die zu mindestens 90% identisch mit diesen ist, wobei für die Sequenzen gilt, dass an Position 149 oder vergleichbarer Position der erfindungsgemäße Aminosäureaustausch des Glycins gegen eine andere insbesondere die als bevorzugt genannten Aminosäuren vorhanden ist. Von der Erfindung sind also auch solche Enzyme umfasst, die die vorstehend genannten Identitätswerte auf Aminosäureebene im Vergleich zur SEQ ID NO.: 2, vorzugsweise 4, aufweisen. Diese können ebenfalls aus natürlichen Quellen stammen. Andererseits können sie durch rekombinante DNA-Technologie dergestalt verändert worden sein, dass für den Fachmann vorhersehbar die enzymatische Aktivität erhalten oder im wesentlichen erhalten bleibt (vgl. beispielsweise Sambrook et al, „Molecular Cloning, A Laboratory Handbook", 2. Auflage 1989, CSH Press, Cold Spring Harbor, Ausubel et al. „Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, NY 2001). So können Aminosäuren, die sich nicht im aktiven Zentrum befinden und von denen prima facie nicht erwartet wird, dass der Austausch durch eine „gleichartige" Aminosäure zu einer wesentlich veränderten dreidimensionalen Struktur führt, durch eine „gleichartige" Aminosäure ausgetauscht werden. Beispielsweise kann erwartet werden, dass bestimmte Aminosäuren mit nicht polaren Seitenketten (gleichartige Aminosäuren), z.B. Isoleucin durch Valin, ausgetauscht werden können, ohne das dies einen (wesentlichen) Einfluss auf die biologische bzw. enzymatische Funktion des Enzyms, im Sinne der Erfindung auf die enzymatische Aktivität hätte. Auf der Basis seines Fachwissens kann der Fachmann entsprechende Schlussfolgerungen auch für den Austausch anderer Aminosäurearten (zum Beispiel den Ersatz basischer Aminosäuren durch andere basische Aminosäuren oder von Aminosäuren mit ungeladenen polaren Seitenketten durch andere Aminosäuren aus dieser Gruppe) erstellen.

Ebenfalls bevorzugt ist eine γ-Glutamylkinase, welche mindestens die Aminosäuresequenz entsprechend den Positionen oder vergleichbaren Positionen 145 bis 154, mehr bevorzugt 130 bis 169 und ganz besonders bevorzugt 110 bis 189 von SEQ. ID NO.: 2, vorzugsweise 4, aufweist, wobei die Länge der Aminosäuresequenz der γ-Glutamylkinase den oben angegebenen Werten entsprechen kann.

In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen Enzyme darüber hinaus mindestens einen heterologen Aminosäureabschnitt, der diese Polypeptide als Fusionsproteine kennzeichnet. Heterologe Bestandteile des erfindungsgemäßen Fusionsproteins können beispielsweise Tags (z. B. His-Tag oder Flag-Tag) sein, die bei der Aufreinigung der erfindungsgemäßen Fusionsproteine eingesetzt werden können. In anderen Ausführungsformen können die heterologen Bestandteile eine eigene enzymatische Aktivität aufweisen. In einem derartigen Fall sind die beiden enzymatischen Komponenten vorzugsweise durch einen Linker wie einen flexiblen 6–10 Aminosäure langen Glycin oder Glycin-Serin Linker verbunden, um die Funktionalität der Komponenten zu gewährleisten. Wie hier verwendet, kann der Begriff „heterolog" einerseits bedeuten, dass die Komponenten des Fusionsproteins natürlicherweise nicht zusammen kovalent verbunden vorkommen, andererseits, dass die Komponenten aus verschiedenen Spezies stammen. Fusionsproteine werden üblicherweise durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt (siehe Sambrook et al., a.a.O.).

In einer weiteren Ausgestaltung bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Nukleotidsequenz (Nucleinsäuresequenz) kodierend für eine wie oben dargestellte erfindungsgemäße γ-Glutamylkinase. Gegenstand der Erfindung sind demnach auch für das Enzym γ-Glutamylkinase kodierende, replizierbare Nukleotidsequenzen, wobei die zugehörigen durch diese Nukleotidsequenzen kodierten Aminosäuresequenzen an Position 149 oder vergleichbarer Position jede proteinogene Aminosäure aufweisen können ausgenommen Glycin.

Vorzugsweise kodieren die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen für eine γ-Glutamylkinase, wobei die zugehörige, kodierte Aminosäuresequenz an Position 149 oder vergleichbarer Position eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys oder Phe enthält. Ganz besonders bevorzugt ist eine solche Nukleotidsequenz, die für eine γ-Glutamylkinase kodiert; welche an Position 149 oder vergleichbarer Position eine L-Asparaginsäure aufweist.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls replizierbare Nukleinsäuresequenzen, die für eine γ-Glutamylkinase kodieren, welche an Position 149 oder vergleichbarer Position den erfindungsgemäßen Aminosäureaustausch aufweist, wobei diese

a) mindestens 70% identisch zur Seq. ID NO.: 1, vorzugsweise SEQ. ID NO.: 3, sind, oder
b) für eine erfindungsgemäße γ-Glutamylkinase kodieren, welche eine Länge von 369 ± 40 Aminosäuren besitzt, oder
c) für eine erfindungsgemäße γ-Glutamylkinase kodieren, wobei diese mindestens von Position oder vergleichbaren Position 145 bis 154 die Aminosäuresequenz der SEQ. ID NO.: 2, vorzugsweise SEQ. ID NO.: 4, aufweist, oder
d) für eine erfindungsgemäße γ-Glutamylkinase kodieren, wobei diese mindestens von Position oder vergleichbaren Position 145 bis 154 die Aminosäuresequenz der SEQ. ID NO.: 2, vorzugsweise SEQ. ID NO.: 4, aufweist und mit der zu SEQ. ID NO.: 1 oder SEQ ID NO.: 3 komplementären Nukleotidsequenz unter stringenten Versuchsbedingungen hybidisiert, oder
e) für das erfindungsgemäße Enzym γ-Glutamylkinase kodierende, replizierbare Nukleotidsequenz, deren Basensequenz an der Position 446 Adenin enthält, wie in SEQ ID NO.: 3 dargestellt.

Vorzugsweise sind ebenfalls replizierbare Nukleinsäuresequenzen, die für erfindungsgemäße γ-Glutamylkinasen kodieren, welche eine Länge von 369 ± 20, mehr bevorzugt ±10 und ganz bevorzugt ±5 oder ±3, Aminosäureresten besitzen, vom Anspruchsumfang umfasst.

Gegenstand der Erfindung ist auch eine Nukleotidsequenz wie in SEQ. ID NO.: 1, vorzugsweise 3, dargestellt. Mitumfasst sind wie gesagt auch solche Sequenzen, die zu dieser Sequenz eine Identität auf Nukleotidebene aufweisen, die mindestens 70% beträgt. Ein Beispiel für eine Nukleotidsequenz, die mindestens 70% identisch ist mit der von SEQ ID NO.: 3, ist in SEQ ID NO.: 5 gezeigt. SEQ ID NO.: 6 zeigt die von SEQ ID NO.: 5 kodierte Aminosäuresequenz der γ-Glutamylkinase.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls replizierbare Nukleinsäuresequenzen, die für γ-Glutamylkinasen kodieren, welche bevorzugt mindestens die Aminosäuresequenz entsprechend Position 130–169 oder vergleichbarer Position und ganz besonders bevorzugt Position 110 bis 189 von SEQ ID NO: 2, vorzugsweise 4, enthalten und mit der zu SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO.: 3 komplementären Nukleotidsequenz unter stringenten Versuchsbedingungen hybridisieren.

Der Begriff „komplementär" bedeutet erfindungsgemäß, dass sich die Komplementarität über den gesamten Bereich des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls ohne Lücken erstreckt. Mit anderen Worten ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Komplementarität sich zu 100% über den gesamten Bereich der erfindungsgemäßen Sequenz, d.h. vom dargestellten 5'-Ende bis zum dargestellten 3'-Ende, insbesondere der Kodierregion (cds), erstreckt. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen erstreckt sich die Komplementarität über einen Bereich von mindestens 19, bevorzugt mindestens 21 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die bevorzugt nicht für das aktive Zentrum der enzymatischen Aktivität kodieren.

Bevorzugt sind solche Nukleinsäuresequenzen, die aus coryneformen Bakterien, bevorzugt Corynebacterium glutamicum, stammen. Nukleinsäuresequenzen von Genen oder Allelen, die in der Population einer Art vorhanden sind, werden in der Fachwelt auch als endogene Gene oder Allele bezeichnet.

Einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung bilden rekombinante (rec-) Vehikel, welche die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen aufweisen. Als Vehikel kommen alle dem Fachmann für diesen Zweck in Frage kommenden Ausführungsformen in Betracht, insbesondere Vektoren und Wirtsorganismen.

Als Wirtsorganismen sind diesbezüglich Organismen wie z.B. Hefen wie Hansenula polymorpha, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Prokaryonten, wie E. coli, Bacillus subtilis, coryneforme Bakterien, wie Corynebacterium glutamicum oder Eukaryonten, wie Säugerzellen, Insektenzellen oder Pflanzenzellen zu nennen. Diese reichern ggf. bereits vor den Massnahmen der vorliegenden Erfindung L-Prolin in ihren Zellen oder in dem sie umgebenden Fermentationsmedium an. Der erfindungsgemäße Wirt ist also in dieser bevorzugten Ausführungsform eine rekombinante Zelle, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder einem erfindungsgemäßen Vektor (s.u.) transformiert oder transfiziert oder per Konjugation mit diesen versehen wurde (die Begriffe „Transformation" und „Transfektion" und „Konjugation" werden gemäß dieser Erfindung sinngleich verwendet). Die Transformation bzw. Transfektion kann nach bekannten Methoden erfolgen, z.B. durch Calciumphosphat-Copräzipitation, Lipofektion, Elektroporation, Partikelbeschuß oder virale Infektion. Die erfindungsgemäße Zelle kann die rekombinante Nukleinsäure in extrachromosomaler oder chromosomal integrierter Form enthalten. Mit anderen Worten kann die Transfektion/Transformation eine stabile oder transiente Transfektion/Transformation sein. Die Verfahren zur Klonierung sind dem Fachmann wohlbekannt (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Für die rekombinanten Herstellungs- und Mutagenesemethoden können E. coli-Stämme benutzt werden. Dies sind unter anderem: E. coli XL1 Blue, NM 522, JM101, JM109, JM105, RR1, DH5α, TOP10 , HB101, BL21 codon plus, BL21 (DE3) codon plus, BL21, BL21 (DE3), MM294. Plasmide, mit denen das die erfindungsgemäße Nukleinsäure aufweisende Genkonstrukt unter anderem in den Wirtsorganismus kloniert wird, sind dem Fachmann ebenfalls bekannt (s.a. PCT/EP03/07148; s.u.).

Bei der Gattung Corynebacterium als Wirt ist insbesondere die in der Fachwelt bekannte Art Corynebacterium glutamicum zu nennen. Bekannte Wildtypstämme der Gattung Corynebacterium sind beispielsweise
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium effiziens DSM 44549
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020.

Angaben zur taxonomischen Einordnung von Stämmen dieser Gruppe von Bakterien findet man unter anderem bei Kämpfer und Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989–1005 (1996)) und in der US-A-5,250,434. Seit einigen Jahren (Liebl et al., International Journal of Systematic Bacteriology 41(2), 255–260 (1991)) werden coryneforme Bakterien mit Artbezeichnung „Brevibacterium flavum", „Brevibacterium lactofermentum" und „Brevibacterium divaricatum" in die Art Corynebacterium glutamicum eingeordnet. Coryneforme Bakterien mit Artbezeichnung „Corynebacterium melassecola" gehören ebenfalls zur Art Corynebacterium glutamicum.

L-Prolin produzierende Stämme coryneformer Bakterien sind beispielsweise die in der US 4,224,409 und US 4,444,885 beschriebenen Stämme
Brevibacterium lactofermentum NRRL B-11421,
Brevibacterium flavum NRRL B-11422,
Corynebacterium glutamicum NRRL B-11423,
Microbacterium ammoniaphilum NRRL B-11424,
Corynebacterium glutamicum ATCC 21157,
Corynebacterium glutamicum ATCC 21158,
Corynebacterium glutamicum ATCC 21159,
Corynebacterium glutamicum ATCC 21355,
Corynebacterium acetophilum FERM-P 4045,
Corynebacterium acetoacidophilum FERM-P 4962,
Arthrobacter citreus FERM-P 4963, und
Microbacterium ammoniaphilum FERM-P 4964.

In den erfindungsgemäßen Vektoren liegen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen bevorzugt in operativer Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz vor, so dass sie in eine geeigneten Wirtszelle transkribiert und gegebenenfalls translatiert werden können. Expressionskontrollsequenzen umfassen üblicherweise einen Promotor und gegebenenfalls weitere regulatorische Sequenzen wie Operatoren oder Enhancer. Weiterhin können auch Translations-Initiationssequenzen vorhanden sein. Geeignete Expressionskontrollsequenzen für prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen sind dem Fachmann bekannt (siehe z.B. Sambrook et al., a.a.O.). Der erfindungsgemäße rekombinante Vektor kann weiterhin noch übliche Elemente wie einen Replikationsursprung und ein Selektionsmarkergen enthalten. Beispiele für geeignete rekombinante Vektoren sind Plasmide, Cosmide, Phagen, oder Viren (siehe z.B. Sambrook et al., supra).

Als Plasmide kommen im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck zur Verfügung stehenden Ausführungsformen in Frage. Derartige Plasmide können z. B. von Studier und Mitarbeiter (Studier, W. F.; Rosenberg A. H.; Dunn J. J.; Dubendroff J. W.; (1990), Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 185, 61–89) oder den Broschüren der Firmen Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech oder Gibco BRL entnommen werden. Weiter bevorzugte Plasmide und Vektoren können gefunden werden in: Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I–III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179–204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3–7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Plasmide, mit denen die ins Auge gefassten Nukleinsäuresequenzen aufweisenden Genkonstrukte in ganz bevorzugter Weise in den Wirtsorganismus kloniert werden können, sind oder basieren auf: pUC18/19 (Roche Biochemicals), pKK-177-3H (Roche Biochemicals), pBTac2 (Roche Biochemicals), pCR (Invitrogen), pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech), pKK-233-3 (Stratagene) oder pET (Novagen). Weitere bevorzugte Plasmide sind pBR322 (DSM3879), pACYC184 (DSM4439) und pSC101 (DSM6202), welche von der DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany bezogen werden können. Bevorzugte Promotoren sind beispielsweise der T7-Promotor, lac-Promotor, tac-Promotor, trp-Promotor, rha-Promotor und ara-Promotor.

Vorzugsweise werden die erfindungsgemässen γ-Glutamylkinasen bzw. die sie kodierenden Nukleinsäuren in coryneformen Bakterien, vorzugsweise der Gattung Corynebacterium, besonders bevorzugt der Art Corynebacterium glutamicum überexprimiert.

Unter Überexpression versteht man eine Erhöhung der intrazellulären Konzentration oder Aktivität der erfindungsgemäßen γ-Glutamylkinasen.

Durch die Maßnahmen der Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000%, bezogen auf die Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.

Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der erfindungsgemäßen Gene beziehungsweise Allele um mindestens eine (1) Kopie erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der fermentativen L-Prolin-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.

Zur Erhöhung der Kopienzahl der erfindungsgemäßen proB-Allele eignen sich Plasmide, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren wie z.B. pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549–554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93–98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69–74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren wie z. B. solche, die auf pCG4 (US-A 4,489,160), oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119–124 (1990)) oder pAG1 (US-A 5,158,891) beruhen, können in gleicher Weise verwendet werden. Eine zusammenfassende Darstellung über Plasmidvektoren von Corynebacterium glutamicum findet man bei Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104 (1–3), 27–40 (2003).

Weiterhin kann zur Erhöhung der Kopienzahl das Verfahren der chromosomalen Genamplifikation angewendet werden, so wie es beispielsweise von Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen bzw. Allel in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren werden kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784–791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69–73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman, Journal of Biological Chemistry 269: 32678–84 (1994); US-A 5,487,993), pCR^®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534–541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al., Journal of Bacteriology 173: 4510–4516 (1991)) oder pBGS8 (Spratt et al., Gene 41: 337–342 (1986)) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen bzw. Allel enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756–759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356–362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067–1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343–347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross over"-Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens bzw. Allels. Insbesondere kann auch die Methode der Tandem-Amplifikation wie sie in der WO 03/014330 beschrieben oder die Methode der Amplifikation durch Integration an einen gewünschten Ort wie in der WO 03/040373 beschrieben zur Erhöhung der Kopienzahl um mindestens 1, 2 oder 3 verwendet werden.

Zur Erzeugung des erfindungsgemäßen Aminosäureaustausches in γ-Glutamylkinasen (z.B. SEQ ID NO: 2) und weiterer erfindungsgemäßer proB-Mutationen, gekennzeichnet durch einen Aminosäureaustausch an Position 149, werden im Stand der Technik beschriebene Mutagenesemethoden verwendet. Als Mutagenesemethoden kommen alle dem Fachmann für diesen Zweck zur Verfügung stehenden Methoden in Frage.

Für die Mutagenese können klassische in-vivo Mutageneseverfahren unter Verwendung mutagener Stoffe wie beispielsweise N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin oder ultraviolettes Licht verwendet werden. Die mutagenisierten Zellen werden gegebenenfalls anschließend auf einem Minimalagar aufgebracht, der 3,4-Dehydro-DL-Prolin in Konzentrationen von ca. 0,5–1 g/l, ca. 1–2 g/l oder ca. 2–3 g/l enthält. Einzelne Mutanten werden isoliert und die Nukleotidsequenz des proB-Gens bzw. Allels, gegebenenfalls nach vorangeschalteter Klonierung, bestimmt. Weiterhin können für die Mutagenese in-vitro Methoden wie beispielsweise eine Behandlung mit Hydroxylamin (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992) oder mutagene Oligonukleotide (T. A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993; Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995); Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990); Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986)) oder die Polymerasekettenreaktion (PCR), wie sie im Handbuch von Newton und Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994) beschrieben ist, verwendet werden. Insbesondere sind dies die Sättigungsmutagenese, die Random-Mutagenesis, in vitro-Rekombinations-Methoden sowie Site-Directed-Mutagenesis (Eigen, M. und Gardiner, W. (1984), Evolutionary molecular engineering based on RNA replication, Pure Appl. Chem. 56, 967–978; Chen, K. und Arnold, F. (1991), Enzyme engineering for nonaqueous solvents: random mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar organic media. Bio/Technology 9, 1073–1077; Horwitz, M. und Loeb, L. (1986), Promoters Selected From Random DNA-Sequences, Proc Natl Acad Sci USA 83, 7405–7409; Dube, D. und L. Loeb (1989), Mutants Generated By The Insertion Of Random Oligonucleotides Into The Active-Site Of The Beta-Lactamase Gene, Biochemistry 28, 5703–5707; Stemmer, P.C. (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370, 389–391 und Stemmer, P.C. (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci USA 91, 10747–10751).

Bei Verwendung von in-vitro Methoden wird das im Stand der Technik beschriebene proB-Gen ausgehend von isolierter Gesamt-DNA eines Wildtypstammes mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion amplifiziert, gegebenenfalls in geeignete Plasmidvektoren kloniert, und die DNA anschließend dem Mutageneseverfahren unterworfen. Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994). In gleicher Weise können auch Methoden der in-vitro Mutagenese verwendet werden wie sie beispielsweise in dem bekannten Handbuch von Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1989) beschrieben sind. Entsprechende Methoden sind auch kommerziell in Form sogenannter „kits" wie beispielsweise der von Papworth et al. (Strategies 9(3), 3–4 (1996)) beschriebene „QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit" der Firma Stratagene (La Jolla, USA) verfügbar. Geeignete proB-Mutanten werden anschließend mit den oben beschriebenen Verfahren ausgelesen und untersucht.

Es kann für die Produktion von L-Prolin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verwendung der erfindungsgemäßen γ-Glutamylkinasen, welche ggf. überexprimiert oder verstärkt vorliegen können, neben diesen gleichzeitig eines oder mehrere Enzyme der Prolin-Biosynthese zu verstärken, insbesondere zu überexprimieren. Die Verwendung endogener Gene wird im allgemeinen bevorzugt.

Unter „endogenen Genen" oder „endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die in der Population einer Art vorhandenen Gene beziehungsweise Nukleotidsequenzen und Allele.

Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme oder Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym oder Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Enzyms oder Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp-Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.

So kann für die Herstellung von L-Prolin zusätzlich zur Verwendung der Variante des erfindungsgemäßen proB-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• das für die Glutamat-Dehydrogenase (EC 1.4.1.4) kodierende gdh-Gen,
• das für die γ-Glutamylphoshat-Reduktase (EC 1.2.1.41) kodierende proA-Gen,
• das für die Pyrrolin-5-carboxylat-Reduktase (EC 1.5.1.2) kodierende proC-Gen, und
• das für die Ornithin-Cyclodeaminase (EC 4.3.1.12) kodierende ocd-Gen

verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Prolin vorteilhaft sein, neben der Verwendung der erfindungsgemäßen Mutanten des proB-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der endogenen Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• das für die Threonin-Deaminase (EC 4.2.1.16) kodierende ilvA-Gen,
• das für die Prolin-Dehydrogenase/Pyrrolin-5-Carboxylat-Dehydrogenase (EC 1.5.99.8) kodierende putA-Gen,
• das für die 2-Ketoglutarat-Dehydrogenase (EC 1.2.4.2) kodierende sucA-Gen,
• das für die Dihydrolipoamid-Succinyltransferase (EC 2.3.1.61) kodierende sucB-Gen, und
• das für die Acetylornithin-Aminotransferase (EC 2.6.1.11) kodierende argD-Gen

abzuschwächen, insbesondere die Expression zu verringern.

Der Begriff „Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme oder Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym oder Protein inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die Expression der Gene oder die katalytischen oder regulatorischen Eigenschaften der Enzymproteine herabgesetzt oder ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.

Die Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression verringert werden. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z.B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949–5952 (1988)), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3584–3590 (1998), bei Pátek et al. (Microbiology 142: 1297–309 (1996) und Journal of Biotechnology 104: 311–323 (2003)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).

Ein Beispiel für die gezielte Regulation der Genexpression ist die Klonierung des abzuschwächenden Gens unter die Kontrolle eines durch Zugabe dosierter Mengen von IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) induzierbaren Promotors wie zum Beispiel des trc-Promotors oder des tac-Promotors. Hierzu eignen sich Vektoren wie beispielsweise der Escherichia coli Expressionsvektor pXK99E (WO0226787; hinterlegt gemäß Budapester Vertrag am 31. Juli 2001 in DH5alpha/pXK99E als DSM14440 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland)) oder pVWEx2 (Wendisch, Ph. D. thesis, Berichte des Forschungszentrums Jülich, Jül-3397, ISSN 0994-2952, Jülich, Deutschland (1997)), die eine IPTG-abhängige Expression des klonierten Gens in Corynebacterium glutamicum ermöglichen.

Eingesetzt wurde diese Methode beispielsweise in der Patentschrift WO02/26787 zur regulierten Expression des deaD-Gens durch Integration des Vektors pXK99EdeaD in das Genom von Corynebacterium glutamicum und von Simic et al. (Applied and Environmental Microbiology 68: 3321–3327 (2002)) zur regulierten Expression des glyA-Gens durch Integration des Vektors pK18mobglyA' in Corynebacterium glutamicum.

Eine weitere Methode zur spezifischen Verringerung der Genexpression ist die Antisense-Technik, wobei kurze Oligoribonukleotide oder Oligodesoxyukleotide oder Vektoren zur Synthese längerer Antisense-RNA in die Zielzellen gebracht werden. Die Antisense-RNA kann dort an komplementäre Abschnitte spezifischer mRNAs binden und deren Stabilität verringern oder die Translatierbarkeit blocken. Ein Beispiel hierzu findet der Fachmann bei Srivastava et al. (Applied Environmental Microbiology 2000 Oct; 66 (10): 4366–4371).

Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611–8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760–1762 (1997)) und Möckel (Ph. D. thesis, Berichte des Forschungszentrums Jülich, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland (1994)) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen („missense mutations") oder Nichtsinnmutationen („nonsense mutations") gesprochen. Die Nichtsinnmutation führt zu mindestens einem Stop-Kodon im Kodierbereich des Gens und damit zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen („frame shift mutations"), in deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von einem oder mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10%, 0 bis 5% oder 0 bis 1% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen, welche ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch – Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Prolin kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.

Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual of Methods for General Bacteriology„ der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten.

Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie zum Beispiel Glycerin und Ethanol, Zuckeralkohole wie zum Beispiel Ribitol oder Mannitol und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH – Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak beziehungsweise Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an L-Prolin gebildet hat, beziehungsweise die Ausbeute oder Produktivität einen gewünschten optimalen Wert erreicht hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Methoden zur Bestimmung von L-Prolin sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustausch-Chromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung und Detektion bei einer geeigneten Wellenlänge erfolgen.

Demgemäß bildet eine nächste Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von L-Prolin durch

a) Fermentation von Wirtsorganismen, in welchen mindestens eine der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen exprimiert oder überexprimiert wird, und
b) Isolieren oder Sammeln des L-Prolins, gegebenenfalls mit Bestandteilen aus der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse.

Vorzugsweise wird ein Verfahren zur Herstellung von L-Prolin herangezogen, bei dem man folgende Schritte durchführt:

a) Fermentation coryneformer Bakterien, in welchen mindestens eine der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen exprimiert oder überexprimiert wird,
b) Anreicherung des L-Prolins in der Fermentationsbrühe oder in den Zellen der coryneformen Bakterien,
c) Isolieren oder Sammeln des L-Prolins aus der Fermentationsbrühe, gegebenenfalls
d) mit Bestandteilen aus der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse (> 0 bis < 100 Gew.-% Biomasse, vorzugsweise 10 bis 80 Gew.-%, mehr bevorzugt 20–60 Gew.-%).

Das auf diese Weise hergestellte L-Prolin kann nach Maßgabe des Fachmanns gesammelt und isoliert und gegebenfalls gereinigt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Prolin.

Unter dem Ausdruck "vergleichbare Position" wird erfindungsgemäß eine Position verstanden, die durch Vergleich der Ausgangssequenz mit der Vergleichsequenz unter Anwendung eines Sequenz-Vergleichs-Programms (BLAST, Altschul et al. J. Mol. Biol. 1990, 215, 403–10) bei der ins Auge gefassten Position der Ausgangssequenz eine Aminosäuren-Position in der Vergleichssequenz liefert, die sich von der zu vergleichenden Position um höchstens ±5, mehr bevorzugt ±4, weiter bevorzugt ±3, noch weiter bevorzugt ±2, extrem bevorzugt ±1 und äußerst bevorzugt um keine Position unterscheidet.

Anleitungen zur Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255–260 (1991)). Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das heißt, es werden nur Hybride gebildet, bei denen Sonde, beispielsweise die zu SEQ ID NO: 3 komplementäre Nukleotidsequenz, und Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 70% identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst bzw. bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird im Allgemeinen bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).

Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein Puffer entsprechend 5× SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 50°C–68°C eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70% Identität zur Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf 2× SSC und gegebenenfalls nachfolgend 0,5× SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 50°C–68°C, ca. 52°C–68°C, ca. 54°C–68°C, ca. 56°C–68°C, ca. 58°C–68°C, ca. 60°C–68°C, ca. 62°C–68°C, ca. 64°C–68°C, ca. 66°C–68°C eingestellt wird. Vorzugsweise werden die Waschschritte bei Temperaturen von ca. 62°C–68°C, besonders bevorzugt ca. 64°C–68°C oder ca. 66°C–68°C durchgeführt. Es ist gegebenenfalls möglich die Salzkonzentration bis auf eine Konzentration entsprechend 0,2× SSC oder 0,1× SSC zu senken. Durch schrittweise Erhöhung der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1–2°C von 50°C auf 68°C können Polynukleotidfragmente isoliert werden, die beispielsweise mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 90% bis 95% oder mindestens 96% bis 98% oder mindestens 99% Identität zur Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z.B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No. 1603558).

Von den beanspruchten Polypeptiden (Aminosäuresequenzen) und den Nukleinsäuresequenzen werden erfindungsgemäß auch solche Sequenzen umfasst, die eine Homologie (auf Aminosäureebene) bzw. Identität (auf Nukleinsäureebene, exclusive der natürlichen Degeneration) größer als 70%, vorzugsweise 80%, mehr bevorzugt 85% (in Bezug auf die Nukleinsäuresequenz) bzw. 90% (auch in Bezug auf die Polypeptide), bevorzugt größer als 91%, 92%, 93% oder 94%, mehr bevorzugt größer als 95% oder 96% und besonders bevorzugt größer als 97%, 98% oder 99% (in Bezug auf beide Arten von Sequenzen) zu einer dieser Sequenzen aufweisen, sofern die Wirkungsweise bzw. Zweck einer solchen Sequenz erhalten bleibt. Der Ausdruck "Homologie" (oder Identität) wie hierin verwendet, kann durch die Gleichung H (%) = [1 – V/X] × 100 definiert werden, worin H Homologie bedeutet, X die Gesamtzahl an Nukleobasen/Aminosäuren der Vergleichssequenz ist und V die Anzahl an unterschiedlichen Nukleobasen/Aminosäuren der zu betrachtenden Sequenz bezogen auf die Vergleichssequenz ist. Auf jeden Fall sind mit dem Begriff Nukleinsäuresequenzen, welche für Polypeptide codieren, alle Sequenzen umfasst, die nach Maßgabe der Degeneration des genetischen Codes möglich erscheinen.

Die prozentuale Identität zu den Aminosäuresequenzen, die in dieser Beschreibung durch SEQ ID Nummern beschrieben sind, kann mit im Stand der Technik bekannten Verfahren vom Fachmann ohne weiteres ermittelt werden. Ein geeignetes Programm, das erfindungsgemäß eingesetzt werden kann, ist BLASTP (Altschul et al.. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25(17): 3389–3402.). Die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz kann ein DNA- oder ein RNA-Molekül sein. Bevorzugt ist, dass die Nukleinsäuresequenz ein DNA- oder ein mRNA-Molekül ist. Erfindungsgemäß kann das DNA-Molekül des weiteren ein genomisches oder isoliertes DNA-Molekül sein. Ferner umfasst von der Erfindung sind Ausführungsformen, in denen das DNA-Molekül ein PNA-Molekül oder ein anderes Derivat eines DNA-Moleküls ist.

Die in dieser Anmeldung genannten Mikroorganismen, welche mit einer DSMZ-Nr. bezeichnet sind, können von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 4, Braunschweig (Deutschland) bezogen werden.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

γ-Glutamylkinase, welche an Aminosäureposition 149 oder vergleichbarer Position eine andere proteinogene Aminosäure aufweist als Glycin.
γ-Glutamylkinase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich an der in Anspruch 1 bezeichneten oder vergleichbaren Aminosäuresäureposition eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys oder Phe befindet.
Nukleinsäuresequenz kodierend für eine γ-Glutamylkinase der Ansprüche 1 oder 2.
Nukleinsäuresequenzen, nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass diese a) mindestens 70% identisch zur SEQ. ID No.: 1 sind, oder b) für eine γ-Glutamylkinase des Anspruchs 1 oder 2 kodieren, welche eine Länge von 369 ± 40 Aminosäuren besitzt, oder c) für eine γ-Glutamylkinase des Anspruchs 1 oder 2 kodieren, wobei diese mindestens von Position oder vergleichbarer Position 145 bis 154 die Aminosäuresequenz der SEQ. ID No.: 2 aufweist, oder d) für eine γ-Glutamylkinase des Anspruchs 1 oder 2 kodieren, wobei diese mindestens von Position oder vergleichbarer Position 145 bis 154 die Aminosäuresequenz der SEQ. ID No.: 2 aufweist und mit der zu SEQ. ID NO.: 1 oder SEQ. ID NO.: 3 komplementären Nukleotidsequenz unter stringenten Versuchsbedingungen hybidisiert.
Rec-Vehikel aufweisend die Nukleotidsequenz des Anspruchs 3 oder 4.
Verfahren zur Herstellung von L-Prolin durch a) Fermentation von Wirtsorganismen, in welchen die Nukleotidsequenz des Anspruchs 3 oder 4 exprimiert oder überexprimiert wird, und b) Isolieren oder Sammeln des L-Prolins, gegebenenfalls mit Bestandteilen aus der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse.