CN114181878A

CN114181878A - 增强氨基酸合成基因的转录水平以提高tg酶发酵水平的方法

Info

Publication number: CN114181878A
Application number: CN202111493084.3A
Authority: CN
Inventors: 白林泉; 王丹; 步建国
Original assignee: Taixing Dongsheng Bio Tech Co ltd; Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Taixing Dongsheng Bio Tech Co ltd; Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2021-12-08
Filing date: 2021-12-08
Publication date: 2022-03-15

Abstract

本发明公开了一种增强氨基酸合成基因的转录水平以提高TG酶发酵水平的方法，是通过在茂源链霉菌IPIO中，利用自身启动子分别过量表达内源脯氨酸、组氨酸、芳香族氨基酸、精氨酸合成途径中的基因，得到高产TG酶的突变株。本发明通过增强脯氨酸、组氨酸、芳香族氨基酸、精氨酸合成基因的转录水平，增强了这些氨基酸的合成，增加了TG酶合成过程中的氨基酸供应，以此来提高谷氨酰胺转氨酶的发酵水平。本发明所得的工程菌株WD15、WD18、WD19和WD22的谷氨酰胺转氨酶发酵产量在实验室摇瓶水平下较对照菌株分别提高22％、50％、48％和13％。

Description

增强氨基酸合成基因的转录水平以提高TG酶发酵水平的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种增强氨基酸合成基因的转录水平以提高TG酶发酵水平的方法，具体说是一种增强脯氨酸、组氨酸、芳香族氨基酸、精氨酸的合成以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(TG酶)是由茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis)产生的一种单亚基蛋白，它能够催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-酰胺基和赖氨酸的ε-氨基之间进行酰胺基转移反应，形成ε-(γ-谷酰胺)-赖氨酸的异型肽键，从而改变蛋白质的功能性质，被广泛应用于食品行业蛋白制品食用添加剂、交联抗体和药物分子生产抗体偶联药物、提高羊毛纺织品的强度等，市场需求量逐年上升，然而目前该酶产量仍然较低，亟待进一步提升。氨基酸作为TG酶合成的前体，本发明发现，在茂源链霉菌生产TG酶的过程中，胞内的脯氨酸、组氨酸、芳香族氨基酸及精氨酸含量相对较低，通过分别过表达脯氨酸、组氨酸、芳香族氨基酸及精氨酸合成途径中的基因，增强了该些氨基酸的合成，进而提高了TG酶的产量。进一步的，本发明通过基因组学信息找到了脯氨酸合成基因 SMDS_4329-SMDS_4331、组氨酸合成基因SMDS_4883-SMDS_4890、芳香族氨基酸合成基因SMDS_5474-SMDS_5478、精氨酸合成基因SMDS_5364-SMDS_5368和SMDS_5394- SMDS_5395。增强氨基酸合成基因的表达可以增强氨基酸的合成，进而增加TG酶合成过程中的氨基酸供应，最终提高谷氨酰胺转氨酶的产量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种增强氨基酸合成基因的转录水平以提高TG酶发酵水平的方法，具体说是一种提高脯氨酸、组氨酸、芳香族氨基酸、精氨酸合成基因的转录水平以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法；通过在茂源链霉菌IPIO中利用自身启动子分别过量表达内源的脯氨酸合成基因SMDS_4329-SMDS_4331、组氨酸合成基因 SMDS_4883-SMDS_4890、芳香族氨基酸合成基因SMDS_5474-SMDS_5478、精氨酸合成基因SMDS_5364-SMDS_5368和SMDS_5394-SMDS_5395，分别增强了脯氨酸、组氨酸、芳香族氨基酸、精氨酸的合成，最终可明显提高谷氨酰胺转氨酶产量。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种通过增强氨基酸合成基因的转录水平而获得的TG酶高产菌株，所述菌株的脯氨酸、组氨酸、芳香族氨基酸或精氨酸合成途径中的基因过量表达。

作为本发明的一个实施方案，所述菌株为茂源链霉菌。

作为本发明的一个实施方案，所述菌株过量表达内源的氨基酸合成编码基因。

作为本发明的一个实施方案，在茂源链霉菌IPIO中过量表达内源的脯氨酸合成基因SMDS_4329-SMDS_4331、组氨酸合成基因SMDS_4883-SMDS_4890、芳香族氨基酸合成基因SMDS_5474-SMDS_5478、精氨酸合成基因SMDS_5364-SMDS_5368和 SMDS_5394-SMDS_5395，分别增强了脯氨酸、组氨酸、芳香族氨基酸、精氨酸的合成，最终可明显提高谷氨酰胺转氨酶产量。

第二方面，本发明涉及一种用于过量表达氨基酸合成基因的整合型质粒载体，所述载体分别包含源于茂源链霉菌IPIO的脯氨酸合成基因SMDS_4329-SMDS_4331及其启动子P_proB、组氨酸合成基因SMDS_4883-SMDS_4890及其启动子P_hisD、芳香族氨基酸合成基因SMDS_5474-SMDS_5478及其启动子P_aroE、或精氨酸合成基因SMDS_5364- SMDS_5368和SMDS_5394-SMDS_5395及其启动子P₅₃₆₄和P₅₃₉₄。

作为本发明的一个实施方案，所述氨基酸合成基因源于茂源链霉菌IPIO。

作为本发明的一个实施方案，所述脯氨酸合成基因及其启动子为序列如SEQ IDNO.1-NO.4所示的SMDS_4329-SMDS_4331及P_proB；所述组氨酸合成基因及其启动子为序列如SEQ ID NO.5-NO.13所示的SMDS_4883-SMDS_4890及P_hisD；所述芳香族氨基酸合成基因及其启动子为序列如SEQ ID NO.14-NO.19所示的SMDS_5474-SMDS_5478及 P_aroE；所述精氨酸合成基因及其启动子为序列如SEQ ID NO.20-NO.28所示的 SMDS_5364-SMDS_5368和SMDS_5394-SMDS_5395及P₅₃₆₄和P₅₃₉₄。

作为本发明的一个实施方案，所述过量表达为同源过量表达。

第三方面，本发明涉及一种用于过量表达氨基酸合成基因的整合型质粒载体的构建方法，质粒的构建方法包括以下步骤：

通过PCR扩增得到3661bp的P_proB和SMDS_4329-SMDS_4331基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pSET152中的XbaI/EcoRI位点，获得整合型质粒载体pLQ1766；

或，通过PCR扩增得到5760bp的P_hisD和SMDS_4883-SMDS_4890基因序列的PCR 片段，通过Gibson连接的方法连入整合型质粒pSET152中的XbaI/EcoRI位点，获得整合型质粒载体pLQ1769；

或，通过PCR扩增得到4773bp的P_aroE和SMDS_5474-SMDS_5478基因序列的PCR 片段，通过Gibson连接的方法连入整合型质粒pSET152中的XbaI/EcoRI位点，获得整合型质粒载体pLQ1770；

或通过PCR扩增得到4771bp的P₅₃₆₄和SMDS_5364-SMDS_5368基因序列的PCR 片段与3255bp的P₅₃₉₄和SMDS_5394-SMDS_5395基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pSET152中的XbaI/SpeI位点，获得整合型质粒载体pLQ1772。

作为本发明的一个实施方案，所述扩增采用的引物为序列如SEQ ID NO.28/29所示的引物Pro-F/R、SEQ ID NO.30/31所示的引物His-F/R、SEQ ID NO.32/33所示的引物SA-F/R、SEQ ID NO.34/35-NO.36/37所示的引物Arg-F1/R1和Arg-F2/R2。

第四方面，本发明涉及一种高产谷氨酰胺转氨酶的茂源链霉菌菌株，将前述的整合型质粒载体，或前述的方法构建得到的整合型质粒载体接合转移导入受体菌茂源链霉菌中进行重组获得所述菌株。

作为本发明的一个实施方案，所述重组为位点特异性重组。

作为本发明的一个实施方案，重组之后还包括通过抗性和PCR验证筛选得到基因过量表达的重组突变株的步骤。

第五方面，本发明涉及一种提高谷氨酰胺转氨酶产量的方法，通过增强脯氨酸、组氨酸、芳香族氨基酸或精氨酸合成基因的转录水平，以增强相应氨基酸的合成、增加TG 酶合成过程中的氨基酸供应，最终提高茂源链霉菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶的产量。

作为本发明的一个实施方案，所述脯氨酸合成基因为序列如SEQ ID NO.1-NO.3所示的SMDS_4329-SMDS_4331；所述组氨酸合成基因为序列如SEQ ID NO.4-NO.12所示的SMDS_4883-SMDS_4890；所述芳香族氨基酸合成基因及其启动子为序列如SEQ ID NO.14-NO.18所示的SMDS_5474-SMDS_5478；所述精氨酸合成基因及其启动子为序列如SEQ IDNO.20-NO.26所示的SMDS_5364-SMDS_5368和SMDS_5394-SMDS_5395。

作为本发明的一个实施方案，在茂源链霉菌IPIO过量表达内源氨基酸合成基因获得过量表达突变株，发酵，获得谷氨酰胺转氨酶。作为一个具体示例，在茂源链霉菌IPIO 中分别过量表达来源于茂源链霉菌IPIO的脯氨酸合成基因SMDS_4329-SMDS_4331、组氨酸合成基因SMDS_4883-SMDS_4890、芳香族氨基酸合成基因SMDS_5474-SMDS_5478、精氨酸合成基因SMDS_5364-SMDS_5368和SMDS_5394-SMDS_5395，获得过量表达突变株(记为WD15、WD18、WD19和WD22)，发酵，获得谷氨酰胺转氨酶。通过在茂源链霉菌IPIO中利用自身启动子分别过量表达内源过量表达内源的氨基酸合成基因，增强氨基酸的合成，进而提高谷氨酰胺转氨酶产量。

作为本发明的一个实施方案，所述发酵包括以下步骤：将活化后的过表达突变株孢子接种于种子培养基中，30℃、200-220rpm条件下培养24h，按10％接种量转接至发酵培养基中，30℃、200-220rpm的条件下发酵28-32h。收集发酵液并进行酶活检测的步骤。

作为一个具体示例，所述发酵包括以下步骤：将活化后的过表达突变株孢子接种于种子培养基中，30℃、200rpm条件下培养24h，按10％接种量转接至发酵培养基中， 30℃、200rpm的条件下发酵30h。

作为本发明的一个实施方案，所述种子培养基包括甘油1-3％(w/v)，酵母提取物0.4- 0.8％(w/v)，鱼粉蛋白胨1-3％(w/v)，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.3％(w/v)，K₂HPO₄·3H₂O0.1- 0.3％(w/v)。作为一个具体示例，所述种子培养基包括甘油2％(w/v)，酵母提取物0.6％ (w/v)，鱼粉蛋白胨2.5％(w/v)，MgSO₄·7H₂O 0.2％(w/v)，K₂HPO₄·3H₂O 0.2％(w/v)。

作为本发明的一个实施方案，所述发酵培养基包括甘油1-3％(w/v)，酵母提取物0.4- 0.8％(w/v)，鱼粉蛋白胨1-3％(w/v)，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.3％(w/v)，K₂HPO₄·3H₂O0.1- 0.3％(w/v)，发酵促进剂0.1-0.4％(w/v)。作为一个具体示例，所述发酵培养基包括甘油 2％(w/v)，酵母提取物0.6％(w/v)，鱼粉蛋白胨2.5％(w/v)，MgSO₄·7H₂O 0.2％(w/v)， K₂HPO₄·3H₂O 0.2％(w/v)，发酵促进剂0.1％(w/v)。

本发明所涉及的质粒pSET152已经在SCI数据库文献《Wilkinson CJ,Hughes-Thomas ZA,Martin CJ,Bohm I,Mironenko T,Deacon M,Wheatcroft M,Wirtz G,StauntonJ, Leadlay PF:Increasing the efficiency of heterologous promoters inactinomycetes.J Mol Microbiol Biotechnol 2002,4(4):417-426.》中记载。

本发明所涉及的菌株茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO)由泰兴东圣生物科技有限公司经菌种诱变获得，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为M 2020196，保藏日期为2020.6.10。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明发现，茂源链霉菌IPIO在发酵过程中胞内的脯氨酸、组氨酸、芳香族氨基酸及精氨酸含量相对较低，这可能是限制TG酶产量提升的一个因素；增强这些氨基酸合成基因的表达可以增强氨基酸的合成，最终提高谷氨酰胺转氨酶的产量；

2)本发明进一步在茂源链霉菌IPIO中，利用整合型载体pSET152，在IPIO染色体上分别插入一个拷贝、来源于茂源链霉菌IPIO的脯氨酸合成基因SMDS_4329- SMDS_4331、组氨酸合成基因SMDS_4883-SMDS_4890、芳香族氨基酸合成基因 SMDS_5474-SMDS_5478、精氨酸合成基因SMDS_5364-SMDS_5368和SMDS_5394- SMDS_5395，实验室摇瓶水平下较对照菌株(空白载体整合菌株)酶活分别提高22％、 50％、48％、13％；通过本发明可显著提高TG酶的发酵产量，同时使发酵成本大幅降低。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为SMDS_4329-SMDS_4331基因过量表达质粒构建示意图；

图2为SMDS_4883-SMDS_4890基因过量表达质粒构建示意图；

图3为SMDS_5474-SMDS_5478基因过量表达质粒构建示意图；

图4为SMDS_5364-SMDS_5368和SMDS_5394-SMDS_5395基因过量表达质粒构建示意图；

图5为氨基酸合成基因增强表达突变株与对照菌株TG酶发酵产量示意图；

图6为氨基酸合成基因增强表达突变株与对照菌株胞内相应氨基酸含量示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法的，按照常规条件或制造厂商的建议条件。

实施例1

本实施例为制备脯氨酸合成基因SMDS_4329-SMDS_4331、组氨酸合成基因 SMDS_4883-SMDS_4890、芳香族氨基酸合成基因SMDS_5474-SMDS_5478、精氨酸合成基因SMDS_5364-SMDS_5368和SMDS_5394-SMDS_5395过量表达的突变株WD15、 WD18、WD19和WD22的具体过程。具体包括以下步骤：

第一步：构建质粒pLQ1766：以茂源链霉菌IPIO基因组DNA作为模板，使用在两端引入酶切序列的引物Pro-F/R，通过PCR扩增得到P_proB和SMDS_4329-SMDS_4331基因序列的PCR片段(3661bp)。在质粒pSET152的XbaI/EcoRI位点插入扩增片段，得到质粒pLQ1766，如图1。

第二步：构建质粒pLQ1769：以茂源链霉菌IPIO基因组DNA作为模板，使用在两端引入Gibson重复序列的引物His-F/R，通过PCR扩增得到P_hisD和SMDS_4883- SMDS_4890基因序列的PCR片段(5760bp)。在质粒pSET152的XbaI/EcoRI位点插入扩增片段，得到质粒pLQ1769，如图2。

第三步：构建质粒pLQ1770：以茂源链霉菌IPIO基因组DNA作为模板，使用在两端引入Gibson重复序列的引物SA-F/R，通过PCR扩增得到P_aroE和SMDS_5474- SMDS_5478基因序列的PCR片段(4773bp)。在质粒pSET152的XbaI/EcoRI位点插入扩增片段，得到质粒pLQ1770，如图3。

第四步：构建质粒pLQ1772：以茂源链霉菌IPIO基因组DNA作为模板，使用在两端引入酶切序列的引物Arg-F1/R1，通过PCR扩增得到P₅₃₆₄和SMDS_5364-SMDS_5368 基因序列的PCR片段(4771bp)；使用在两端引入酶切序列的引物Arg-F2/R2，通过PCR 扩增得到P₅₃₉₄和SMDS_5394-SMDS_5395基因序列的PCR片段(3255bp)；然后通过酶切连接的方法连入整合型质粒pSET152中的XbaI/SpeI位点，获得整合型质粒载体 pLQ1772，如图4。

*第一至四步涉及的内切酶识别位点(酶切位点)如下：

XbaI识别位点： EcoRI识别位点： SpeI识别位点：

5'...T^CTAGA...3' 5'...G^AATTC...3' 5'...A^CTAGT...3'

3'...AGATC^T...5' 3'...CTTAA^G...5' 3'...TGATC^A...5'

*第一至四步所用到的引物序列为：

*第一至四步中基因片段制备所采用的PCR体系及条件：

PCR反应体系：DNA模板30ng，引物20pmol，13％DMSO 5μL，dNTP 10nmol，缓冲液25μL，Taq DNA聚合酶1个单位，加纯水补齐至50μL；

PCR条件：95℃ 5min；95℃ 15s；60℃ 15s；72℃ 4min；循环30次；72℃ 10 min。

第五步：将第一至四步构建得到的过量表达的质粒载体pLQ1766、pLQ1769、pLQ1770、pLQ1772分别通过接合转移导入受体菌茂源链霉菌IPIO中进行位点特异性重组，并通过抗性及PCR验证筛选正确的接合子，从而得到SMDS_4329-SMDS_4331、 SMDS_4883-SMDS_4890、SMDS_5474-SMDS_5478、SMDS_5364-SMDS_5368和 SMDS_5394-SMDS_5395基因过量表达的突变株。具体包括以下步骤：

将基因过量表达的质粒pLQ1766、pLQ1769、pLQ1770、pLQ1772分别转化进入宿主ET12567(pUZ8002)中。将对应ET12567(pUZ8002)接种于含有Apr(终浓度50μg/mL)、 Kan(终浓度50μg/mL)和Chl(终浓度25μg/mL)三种抗生素的LB中，37℃培养20 h，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。同时将茂源链霉菌IPIO 的新鲜孢子(固体培养基上活化约7-10d)收集于TES溶液中，50℃热激10min，用 LB溶液漂洗2～3次之后，将其与之前制备的宿主菌ET12567(pUZ8002)混合(受体菌细胞和供体菌的比例约为10⁸：10⁹)均匀后涂布于含有20mM镁离子的ISP4MYM固体培养基上，于37℃培养箱倒置培养。14-16h后取出平板，分别将安普霉素(终浓度50 μg/mL)和甲氧苄啶(终浓度50μg/mL)两种抗生素加入1mL无菌水中混匀后覆盖在 ISP4MYM固体培养基上，将固体培养基晾干后转移至30℃培养箱中倒置培养。一般 3～5d后可见平板上有接合子长出，将其通过转接于含有安普霉素(终浓度50μg/mL) 和甲氧苄啶(终浓度50μg/mL)两种抗生素的ISP4MYM固体培养基上扩大培养，通过菌丝体PCR验证筛选得到SMDS_4329-SMDS_4331、SMDS_4883-SMDS_4890、 SMDS_5474-SMDS_5478、SMDS_5364-SMDS_5368和SMDS_5394-SMDS_5395基因加倍的突变株，分别记为WD15、WD18、WD19、WD22。

*第五步所用到的引物序列为：

引物名称	碱基序列
		AA-YZ-F	ACCGCATCAGGCGCCATTCG SEQ ID NO.39
Pro-YZ-R	GCCGCCGGTGCCGACGCCCG SEQ ID NO.40
		His-YZ-R	CCGCTCCACGTGCTTCGTCGCG SEQ ID NO.41
SA-YZ-R	GGCGCGGGACCAGTCGGCGGT SEQ ID NO.42
		Arg-YZ-R	CCGGTGCCCGCCCCCGACCC SEQ ID NO.43

*第五步中通过PCR验证筛选突变株时所采用的PCR体系及条件：

PCR体系：DNA模板10～100ng，引物10pmol，13％DMSO 2μL，2×Mix缓冲液 10μL，加纯水补齐至20μL；

PCR条件：95℃ 10min；95℃ 30s；60℃ 30s；72℃ 1min；循环30次；72℃ 10 min。

实施例2

本实施例为利用氨基酸合成基因过量表达的突变株WD15、WD18、WD19、WD22 发酵产生TG酶的过程。具体步骤如下：分别将突变株WD15、WD18、WD19、WD22 涂布于固体ISP4MYM培养基上活化，30℃培养7-10d后，刮取一平板孢子接种至种子培养基中，30℃、200rpm条件下培养24h，按10％的接种量转接至发酵培养基，30℃、 200rpm条件下发酵30h，收集发酵液进行酶活检测。

表1种子培养基及发酵培养基的成分构成

实施例3

本实施例为利用比色法检测TG酶的酶活的方法。具体为：取200μL稀释10-20倍的发酵液上清于试管中，其中一管加入200μL水作为对照，加入2mL 37℃预热好的A 液，37℃反应10min后，加入2mL B液终止反应。用石英比色皿在分光光度计525nm 处测定发酵液的吸光度。最终将OD₅₂₅带入由标准曲线换算得到的公式，计算出TG酶的酶活。

其中，溶液配制方法如下：

A液：称取9.688g三羟甲基氨基甲烷，2.780g盐酸羟胺，1.229g还原型谷胱甘肽，4.048g底物N-苄氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸(N-α-CBZ-GLN-GLY)于烧杯中，加350 mL水，调节pH为6.0，加水定容至400mL。

B液：3mol/L盐酸，12％三氯乙酸，3％FeCl₃溶于0.1mol/L HCl中，将三种溶液等量混合均匀。

图5为氨基酸合成基因增强表达突变株与对照菌株TG酶发酵产量示意图。结果表明，在实验室摇瓶水平下突变株WD15、WD18、WD19、WD22的产量对比野生型菌株分别提高22％、50％、48％、13％。

图6为氨基酸合成基因增强表达突变株与对照菌株胞内相应氨基酸含量示意图。结果表明，突变株WD15、WD18、WD19、WD22的胞内脯氨酸、组氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸、精氨酸含量对比野生型菌株分别提高30％、26％、52％和74％、23％。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 增强氨基酸合成基因的转录水平以提高TG酶发酵水平的方法

<130> KAG48221

<141> 2021-12-06

<160> 43

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 726

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO (Streptomyces mobaraensis IPIO) SMDS_4329

<400> 1

atgggcgcgg tcccggtcgt caacgagaac gacacggtgg ccacggacga gatccggttc 60

ggcgacaacg accggctcgc cgccctcgtc gcccacctcg tccgcgccga cctgctcgtc 120

ctcctctccg acgtggacgg cctctacgac ggcgacccca gcaccccggg cacctcgcgg 180

atcgccgagg tcagcgggcc gcaggacctg gaaggcgtct ccatcggcag cgccggcaag 240

gcgggcgtcg gcaccggcgg catggtgacc aaggtcgagg ccgcccggat cgccgccgcc 300

gcgggcatcc cggtcgtcct cacctccgcc agccgcgccg ccgacgccct cctcggccgg 360

cccaccggca ccctcttcca ccgcaccggc cgccgctccg ccgaccggct gctgtggctg 420

gcgcacgcct ccaccccgcg cggcgccctc acgctggacg acggcgcggt gcgcgcggtg 480

gtccggggca ccggctcgct gctgccggcg ggcatcgcgg ccgtcgaggg cgagttcagc 540

gcgggcgacc cggtcgagct gcgggacggc gcgggccgcg cggtggcccg cgggctggtg 600

gcctacgacg cgggggagat cccgcagctg ctcggccgct ccacccggga cctggcccgc 660

gagctcgggc ccgagtacga gcgcgaggtc gtgcaccggg acgatctggt cgttctccac 720

ccctga 726

<210> 2

<211> 144

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) SMDS_4330

<400> 2

atgacctcca gacccacgat ctcccagggc ggcagccggg ccgtcgagcg gtgctcgccc 60

cagagccgca gggcgacggc cgccgcgtcg tgcaggtcgc gggcctcctc ccagtaccgg 120

atctcggcgt ggtcgttggc gtag 144

<210> 3

<211> 1305

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) SMDS_4331

<400> 3

atgagcagcg acaccctccc gtccagtccc tccggcactc tccccgagtc ccccgtgctc 60

cgtgccgcgg tccgcgcccg taccgccgcc gccgagctcg cgccgctgcc acgcgcggcc 120

aaggacgcgg cgctgctcgc cgtcgcggac gccctggagg cccggaccgc cgacatcgtc 180

gccgccaacg ccgaggacgt cgcgcgggcg cgcgccgccg gcaccgccga gggcgtcgtc 240

gaccggctga cgctcacccc cgagcgggtc ctggccatcg cggcggacgt gcgcagcgtg 300

gccgggctgc ccgacccggt cggcgaggtg gtgcgtggct ccaccctgcc caacggcatc 360

gacctgcggc aggtccgggt gccgctcggc gtcgtcggga tcgtctacga ggcccggccg 420

aacgtgacgg tggacgcggc cgcgctctgc ctgaagtccg gcaacgcggt cctgctgcgc 480

ggctcctcct cggcgtacgc gtcgaacacc gcgctggtgg ccgtcgtccg cgacgcggtg 540

gcgggcgccg ggctgcccgc ggacgccgtg cagctggtgc cgggggagag ccgggagtcc 600

gtgaaggagc tgatgcgcgc ccgcggcctg gtcgacgtgc tgatcccgcg cggcggcgcc 660

tcgctgatcc ggaccgtcgt cgaggagtcc acggtcccgg tgatcgagac gggcaccggc 720

aactgccacg tgtacgtgga cgccgacgcc gatctcggca cggcggtccg ggtgctcgtc 780

aactccaagg cgcaccgcgt cagcgtgtgc aacgccgccg agaccctcct cgtccaccgg 840

gacatcgccg agcgcctgct cccggccgcg ctggacgccc tggcggaggc cggggtgacc 900

gtgcacgccg acgagcgggt gcgggcgctg gccggcggga cgaaggcgac cgtggtgccc 960

gccacggagg aggactgggc gaccgagtac ctctcctacg acatcgcggc cgcggtggtg 1020

gactcgctgg acgacgccgt gcggcacatc cggcagtggt cctccggaca cacggaggcg 1080

atcgtcacca cctcgcagca ggcggcccgc cggttcaccc agctggtgga ttccacgacg 1140

gtcgcggtga acgcgtcgac gcggttcacc gacggcgggc agttcggttt cggcgccgag 1200

atcgggatct ccacgcagaa gctgcacgcg cgggggccga tggggctgcc ggagctcacc 1260

tcgaccaagt acatcgtcac gggcgacggg cacatccggg gctga 1305

<210> 4

<211> 739

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) PproB

<400> 4

cgcgagtagc gccgcggcct gtacggctcg gcgggggact gttccggcag gcactgggcg 60

ggctcctggc aggagaactg agggatcggg atggaccggg tcggacacgt catgggacaa 120

cggtctggac aacggccgca accgaccgta tgacggccgc tgggccagga gcaatcttcg 180

gtcacggcaa ccgccacaaa atagggtcga acgaccacaa tcgtcaggcg gtagattggc 240

cgtttccagc ggaagacggc aggaccggcg ggcgagagca gaggtgcgga gcacggtgcg 300

ggcagggacg gcggaggaaa cggcgaccgg agcggacgga gggatccggc cggaggtcac 360

cggcgcccgc aggatcgtgg tcaaggtggg ctcgtcctct ctcaccaccg cgggcggggg 420

actggacgcc gaccgggttg acgccctcgt cgacgtcctg gcccgggtgc tcggcgacac 480

ggcgggcaag gagatcgtcc tcgtctcgtc cggcgccatc gccgccggcc tcgcgccgct 540

gggcctcgac cggcggccga aggacctggc ccgccagcag gccgccgcca gcgtcggcca 600

gggcctgctg gtcgcccgct acaccgcgtc cttcgcccgc tacggccgcc gcgtcgggca 660

ggtgctgctg accaccgacg acaccagccg ccgcgcgcac taccgcaacg cccgccggac 720

cctggaccag ctgctggcc 739

<210> 5

<211> 897

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) SMDS_4883

<400> 5

atgaacgtcg tgcccgcgca ggaggccggc gtcgcctcgc tggccgtgtc gtccccgccg 60

cagaaggact tcgggggcct cccgcacccg accatcctcg ccgcctgcgc cctgctcggc 120

gtcgacgagg tgtacgcggc cggcggcgct caggccatcg ccatgttcgc ctacggcacc 180

gacgagtgcc ggcccgccca gctcgtcacc ggccccggca acatctgggt cgccgccgcc 240

aagcggctgc tcaagggccg tatcggcatc gacgccgagg ccggcccgac cgagatcgcg 300

atcctcgccg acgacaccgc cgacgcggcg cacgtcgccg ccgacctgat cagccaggcc 360

gagcacgaca cgctggccgc cgccgtcctc gtcacgccct ccgaggcgct cgccgaggcc 420

gtcgaggccg agctcaagac ccaggtggcc gcgacgaagc acgtggagcg gatcaccgag 480

gcgctggccg gccggcagtc ggggatcgtc ctcgtcgacg acctcgacca gggcctcgcc 540

gtcgtcgacg cctacgccgc cgaacacctg gagatccaga ccgccgacgc ctccgccgtc 600

gccgcccggg tccgcaacgc cggcgccgtc ttcgtcggcc cgtacgcgcc cgtctccctc 660

ggcgactact gcgccggctc caaccacgtc ctgcccaccg gcggctgcgc ctgccactcc 720

tccggcctgt ccgtgcagtc cttcctgcgc ggcatccacg tcgtggacta cagccgcgac 780

gcgctcgccg acgtcaccca ccacgtggtg acgctggcgg aggccgagga tctgccggcg 840

cacggcgcgg cgctcaaggc gcggttcggg tggaaggttc ccggtaagag ctcgtga 897

<210> 6

<211> 762

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) SMDS_4884

<400> 6

atgggcttcg agccctcgta ctcgatgcac gcgctgatct cccggggcac cggcaccggc 60

tggctcgccg ggccgcgccg ggacgacttc accatcgacg tggacgcggc ggtcgacgcc 120

atcgccgagc accgccctga cgtcgtcttc gtctgctcgc ccaacaaccc caccggcacc 180

gccgtcgacg cggagaccgt gctgcggctg tacgacgcgg cgcaggcggc caagccgtcg 240

atggtcgtgg tcgacgaggc gtacggcgag ttcagccacc acccgtcgct gctgccgctg 300

atcgagggcc ggccgcacct cgtcgtctcg cggacgatgt ccaaggcgtt cggcgcggcc 360

gggctgcggc tgggctacct cgccgccgac ccggcggtgg tggacgccgt gcagctcgtc 420

cggctgccgt accacctctc gtccgtcacc caggcgaccg ccctcgcggc gctggagcac 480

accgacacgc tgctcggcta cgtcgagcgg ctcaagtccg agcgggaccg cctggtcgcc 540

gagctgcggg cgatgggctg cgaggtcacc gcgtccgacg cgaacttcgt ccagttcggg 600

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gacaacggcg tgcccggccg gctgcgggtc accgcgggca cccccgagga gaacgacgcg 720

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<210> 7

<211> 597

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) SMDS_4885

<400> 7

atgaaccacc gcgtgggtcg cgtcgagcgg accaccaagg agacgtccgt cctggtcgag 60

atagacctcg acgggaccgg gcaggtcgac gtgtcgacgg gcgtcggctt ctacgaccac 120

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ctgcacatcg acacccacca caccatcgag gacaccgccc tcgcgctggg cgccgccttc 240

cggcaggcgc tcggcgacaa ggtgggcatc taccggttcg gcaactgcac ggtcccgctg 300

gacgagtcgc tggcccaggt gaccgtcgac ctctccggcc ggccatacct ggtgcacacc 360

gagcccgaga acatcgcgcc gatgatcggc acgtacgaca cgacgatgac ccggcacata 420

ctggagtcct tcgtcgccca ggcgcagatc gcgctgcacg tccacgtgcc gtacgggcgc 480

aacgcccacc acatcgtgga gtgccagttc aaggcgctgg cgcgggcgct gcggtacgcg 540

tgcgagcgcg acccgcgggc cgccggaatc ctcccgtcca cgaagggtgc gctgtga 597

<210> 8

<211> 90

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) SMDS_4886

<400> 8

atgcccaagg gcgtcatcgt gctgcttggc atcggggccg cgatggccct gaccgccggt 60

gtgatgcgga tcgaaagcct gtggtcatga 90

<210> 9

<211> 636

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) SMDS_4887

<400> 9

atgagcaaga aggtcgtcgt cttcgactac gggttcggca acgtccggtc ggccgagcgg 60

gccctcgccc acgtcggcgc cgatgtcgag atcacccgcg acttcgaccg ggccatgaac 120

gccgacggcc tcctcgtccc cggcgtcggc gcgttcgccg cctgcatgag cgggctgcgc 180

gcggcgcgcg gcgactggat cgtcgaccgg cggctgtccg gcggccggcc cgtgatgggc 240

atctgcgtcg gcatgcaggt cctcttcgcc cggggcgtcg agcacggcgt cgagaccgac 300

ggcctggacg agtggcccgg caccgtcgag ccgctcaagg ccccggtcgt cccgcacatg 360

gggtggaaca ccgtcaccgc cgccgagggc tccgccctct tcgccgggct cgacgccgac 420

acgcgctact acttcgtgca ctcctacgcc gtccgcgact ggagcctcga cgtcaccaac 480

gaggccatca agccgcccct ggtgacctgg gccgagcatg gcgagccgtt cgtcgccgcc 540

gtcgagaacg ggcccctgtg ggccacccag ttccaccccg agaagtccgg cgacgccgga 600

tcccagctgc tgaccaactg gatcgagacc ctctga 636

<210> 10

<211> 726

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) SMDS_4888

<400> 10

atgcccaagc tcgaactcct ccccgccgtc gacgtccgcg acggccaggc cgtacggctc 60

gtccatggcg agtcgggctc cgagacctcg tacggcgacc cgctggccgc cgcccgcgcc 120

tggcagcagg ccggcgccga gtggctgcac ctcgtcgacc tggacgccgc cttcggcacc 180

ggcgacaacc gggagcggat cgccgaggtc gtccgggcca tggacatcaa ggtcgagctg 240

tccggcggca tccgcgacga cgcctcgctg gccgccgccc tcgccaccgg ctgcacccgc 300

gtcaacctgg gcacggccgc cctggagacc cccgagtggg tcgccaaggt catcgccgag 360

cacggcgaca agatcgccgt cgggctggac gtgcgcggca ccacgctgcg cggccgcggc 420

tggacccgcg acggcggcga cctctacgag acgctcgccc gcctcgactc cgagggctgc 480

gcccgctacg tcgtcaccga catcgccaag gacggcaccc tccagggccc caacctggag 540

ctgctcaaga acgtctgcgc ggccaccgac aagccggtcg tcgcctccgg cggcgtctcc 600

tcccttgacg atctgcgggc cattgccagt ctggtaccgg agggtgtcga aggcgcgatc 660

gtgggcaagg ccctctacgc gaaggcgttc accttggaag aggccctgga ggcagtgtcc 720

gtatga 726

<210> 11

<211> 233

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) SMDS_4889

<400> 11

atgagtgaga ccccggctcc gcagcgcgtg cagacagaca gtccctggga agcgacgatc 60

ggcttcgcac gtgccgtggc ggccggggac cgggtgcacg tcgccggcac gatgccgctc 120

gtcgacggcg tcctcgtcgg cgagggcgac ccctacgagc aggcccgggc cgccttctcc 180

aacgcgctcg ccgcgctgga gaagttcggc ctcggccccg agtccgtcgt ccg 233

<210> 12

<211> 651

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) SMDS_4890

<400> 12

atggcccgcg tctacgggcg ggaaggcgcc gacgagctca ccttcctcga catcacggcc 60

tcttccggta atcgtgagac cacttatgac gtggtgcggc ggaccgccga gcaggttttc 120

atcccgctca ccgtgggggg cggggttcgg accgccgacg acgtcgacaa gttgctgcgg 180

gccggggccg acaaggtcgg ggtcaatacg gcggctattg agcggcccga tctcgtgcgg 240

gagatcgccg agcggttcgg gcggcaggtg ctggtgttgt cggttgacgc gcggcggact 300

ccgtccgggt ctttcgaggt caccacgcat ggcgggcggc gggggaccgg gctcgacgcc 360

gtcgagtggg cgcatcgggc ggcggagctc ggggccgggg agattctgct caactcgatg 420

gacgcggacg ggacgaagga cgggtacgac acggagatga tcgccgctgt gcggcggcat 480

gtgtcggtgc cggttatcgc cagcggcggc gcgggggagc tcgcgcactt cgcccctgcg 540

gtggcggcgg gcgcggacgc ggttctggcc gcgtccgtgt tccacttcgg tgatctgcgg 600

atcggggagg tcaagggggc gttgcgggag gctgggcatc ccgtgcggtg a 651

<210> 13

<211> 496

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) PhisD

<400> 13

ccggccggcg tatcactggg tggtacggag agccgtgcgg cgggacgggt ctgagacaat 60

tggccatgtg atctcccgaa tcgatctgcg cggcggagcc gtcaccgacg gcgtcatcga 120

ccgcgacctg ctgccccgag ccgaactcga cgtcgaggcc gccctggaga aggtgcggcc 180

catctgcgag gacgtgcatc atcgcgggac ggcggcactg atcgactacg cggagaggtt 240

cgacggcgtc accatcgacc gggtgcgcgt cgcgcccgag gcgatcgagc gcgccctggc 300

ggagctggac ccggcggtcc gcgccgccct ggaggagtcc atccgccgcg cccgcctcgt 360

ccaccgcgag cagcgccgca ccgacaagac cgtcaccgtc gtccccggcg gcacggtcac 420

cgagcgctgg gtgcccgtcg agcgcgtcgg cctgtacgtg ccgggcggca acgccgtcta 480

cccgtcgtcc gtcgtg 496

<210> 14

<211> 828

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) SMDS_5474

<400> 14

atgaccacac gccaccgcgc ggccgtcctc ggctcgccca tcgcccactc gctctccccg 60

gtcctgcacc gggccgccta cgccgcgctc ggcctggggg agtggacgta cgaccggtac 120

gaggtcgacg aggccgcgct gccggccttc gtcgagcggc tggacgacag ctgggccggc 180

ctctcgctga ccatgccgct caagcgggcg gtcatcccgc tgctggacgg gatcagcgac 240

accgcgcggt ccgtcgaggc cgtcaacacc gtcctcgtcg gcgaggacgg ccggctcacc 300

ggcgacaaca cggacatccc gggcctggtc gccgccctgc gcgagcgcgg cgtcgacaag 360

gtcgcctcgg ccgccgtgct gggcgccggg gccaccgcgt cctcggcgct cgccgcgctc 420

gccgggatct gcgccggcga ggtcaccgcc tacgtccgca gcgccgggcg ggccgccgag 480

atgcggcggt ggggtgaacg gctcggggtg cctgtccgca ccgccgactg gtcccgcgcc 540

gccgaggcgt tcgaggcccc gctggtcgtc gcgaccaccc cggccggggc cgcggacgcg 600

ctcgcggccg ccgtccccga ccggcccggc accctcttcg acgtcctcta cgagccctgg 660

ccgaccccgc tggcggcggc ctgggccgcg cgcggcggca cggtcctggg cggcctcgac 720

ctgctcgtcc accaggcggt gctccaggtc gagcggatga cgggcgtctc gccggcaccg 780

ctcgcggcca tgcgggccgc cggggaagcg gccctcgcgg cccgctga 828

<210> 15

<211> 1086

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) SMDS_5475

<400> 15

atggtggcgg accacctggc ccggcggcgc ctcggctatg ggcgcggcgc ccggatgaag 60

ttcgagcggg acgaggtgac cttcctcggc ggggtgcggc acggcctgtc catgggctcc 120

ccggtcgcgg tcatggtggg caacaccgag tggcccaagt gggagaaggt catggccgcc 180

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cgccccggcc acgcggacct cgccggcatg cagaagtacg gcttcgacga ggcccgtccg 300

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cgctccttcc tgaaggaggc ggccggcatc gagatcgtct cccacgtcgt cgagctggcc 420

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gacccggtgc gctgcctcga cgccgccgcg agcgaggcga tggtcgcaga gatcgaccag 540

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gtcggcctcg gctcgcacgt gcactgggac cggcggctgg acgcccggct cgccgccgcc 660

ctgatgggca tccaggcgat caagggcgtc gagctcggcg acggcttcga cctggcccgg 720

gtgcccggct cgaaggcgca cgacgagatc gtcgccaccg aggagggcgt gcgccgcacg 780

tccggccgct ccggcggcac cgagggcggc ctgaccaccg gcgaactgct gcgcgtccgc 840

gccgcgatga agcccatcgc caccgtgccg aaggcgctcg ccaccatcga cgtcaccacc 900

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atcgtcgccg aggcgatggt ggcgctcgtc ctggcggacg ccgtggtgga gaagttcggc 1020

ggcgacagcg tcaccgagac ccgccgcaac gtccgcggct acctcgacaa cctggccatc 1080

aagtga 1086

<210> 16

<211> 288

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) SMDS_5476

<400> 16

atggacccgg acacccgggc gctgctcaag gggctgcccg tcgtcttcct cgacgtcgac 60

ctggccgacg cggtacggcg ggtggggctg gacgccccgc gtccgctgct ggccgtcaac 120

ccgcgcaagc ggtggcggga gctgatggag gcccgccgcc cgctctacac cgaggtcgcc 180

cgggtcgtcg tcgccaccgg aggccgcggc ccggccgagg tggccgacgc ggtgctcgac 240

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<210> 17

<211> 1092

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) SMDS_5477

<400> 17

atgaccgacg cacccacccg tatccaggtc gccggcaccg ccggcaccgc gccgtatgag 60

gtcctgatcg ggcaccggct gctgggcgaa ctgcccgcgc tcatcgggac ggacgcccgg 120

cgcgtggccg tcctgcaccc ggaggcgctg gccgagaccg gcgaggtgct ccgcgccgac 180

ctggccgacc agggctacga ggccatcgcc atccaggtgc cgaacgcgga ggaggccaag 240

accgccgagg tcgccgccta ctgctggaag gcgctcgggc agtccggctt cacccgcacc 300

gacgtcgtcg tcggcgtcgg cggcggcgcc accaccgacc tggccggctt cgtcgccgcc 360

acctggctgc gcggcgtgcg ctggatcgcg gtgcccacca ccgtgctggc gatggtcgac 420

gccgccgtcg gcggcaagac cggcatcaac accgccgagg gcaagaacct cgtcggcgcc 480

ttccacccgc cggccggggt gctctgcgac ctgtccgcgc tggagtcgct gccggtccac 540

gactacgtca gcgggctcgc cgaggtcatc aaggccggct tcatcgccga cccggtgatc 600

ctcgacctga tcgagagcga ccccgcggcc gcccgcaccc cgtccggcgc gcacaccgcc 660

gagctcatcg agcgcgccat ccgggtcaag gccgacgtcg tctcccagga cctcaaggag 720

tccggcctcc gcgagatcct caactacggg cacaccctcg cccacgccat cgagaagaac 780

gagcggtaca actggcggca cggcgcggcc gtcgccgtcg gcatggtctt cgccgccgaa 840

ctcggccgga tcgccggccg gctggacgac gcgacggccg accggcaccg cgcggtgctg 900

gagtccgtcg gactgccggt gacctaccgg ggcgaccagt ggcccaagct gctggagacg 960

atgaagatcg acaagaagac gcggggcgac cggctgcgct tcatcgtgct cgacgggctg 1020

gcgaagccgg tggtgctgga ggctccggat ccggcgatgc tgctggccgc gcatgcggag 1080

atcgcggcgt ga 1092

<210> 18

<211> 186

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) SMDS_5478

<400> 18

atgcgggacg ccgcctctca gcggaccgcg ccgctgatcg aggtgcacat ctccaatccg 60

catgcgcggg aggcgttccg gcacacctcc gtgatctccg ctgtcgcgtc cgggacgatc 120

gccgggttcg gtgtcgggtc gtaccggctc gcgttgcggg cgctcgcgga ggaactccgc 180

ggctga 186

<210> 19

<211> 464

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) ParoE

<400> 19

acctggaggg caaggccaag gagctgggcc tcaagtcccc gctccaggtg atcaccgtcg 60

ccagcctggt ccaggtcgag ggcaagtaca agcacgactt cgacaagatc gcccgggtcg 120

tctacaaccg gctcaagccg gacaacaagg agacgtacgg cctcctggac ttcgactcca 180

cggtcaacta cgccaagagc cagtccaccc tggacaccgg ctccgtcaac gacctgcgca 240

agttcaagga cccgtacaac acctacagca tcaagggcct gccgcccggg ccgatcagca 300

accccggcat ggacgccctg aagtcggcgc tcgaacccgc ctccgggccc tggtactact 360

tcgtctcgat caacgagaac gagacgcttt tcgcggtgac caacgcggag cacaacagga 420

accgggagcg gtaccggcag gagcacggaa agaccggcca atga 464

<210> 20

<211> 1029

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) SMDS_5364

<400> 20

atggcaatac gagcggcagt ggccggagcg agcggatacg cgggcggcga agtgctgcgt 60

ctgctgctcg ggcacccccg tgtcgagatc ggggcgctga ccggcaacag cagtgccggg 120

cggacgctcg gcgaggtgca gccccatctg ccggcgctgg ccgagcgggt cctccaggag 180

acctccgccg acgccctcgc cgggcatgac gtcgtcttcc tcgccctgcc gcacggacag 240

tccgccgcga tcgccgagca gctcggaccc gacgtcctcg tgatcgactg cggtgcggat 300

ttccggctgc gggacgcggg ggagtgggtg cggttctacg ggtcgccgca tgcggggacg 360

tggccgtacg ggctgccgga gctgccgggg gcgcgggagg cgttgcgggg aacgaagcgg 420

gtggcggtgc cggggtgtta tccgacggcg gtgtcgttgg cgttgtggcc ggtgttcgcg 480

gcggcgctgg tggagttgga ggcggtggtc gtggcggcgt cggggacgtc gggtgcgggg 540

aaggcggcga ggccgcatct gctgggcagt gaggtgatgg ggtcgatgag tccgtacggg 600

gtcgggggcg ggcaccggca tacgccggag atcgcgcaga acctggccgc cgtcgccggg 660

gggccggtga gcgtctcctt caccccgacc ctcgcgccca tgccccgcgg catcctcgcc 720

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aaggcgtacg gcgacgagcc gttcgtccgc ctcctgcccg aggggcgctg gccgtccacc 840

ggcgcggtga ccgggtccaa cgtggcgcag gtccaggtcg tcctggacga cgcggcgggc 900

cgcgtgatcg cggtgagcgc gatcgacaac ctgacgaagg gcactgccgg tggtgcggtg 960

cagagcatga acatcgccct cgggctggcc gaggagctgg gactttccac gacaggggtg 1020

gctccgtga 1029

<210> 21

<211> 243

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) SMDS_5365

<400> 21

atgagcccgg tggaggccac cgcgacctcg ccggcgccgc agccgagcgc ctccgccgcc 60

ttctccgccg tcgcgtgggt gtcctggaag ccctccgggc cggtgcaggc gttggcgcca 120

ccggagttga ggacgaccgc cgccgcctcc cccgacttca gcacctgctg cgaccacagc 180

accggagccg ccttgacccg gttggaggtg aacacccccg ccgccgcccg cgacggcccc 240

tga 243

<210> 22

<211> 801

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) SMDS_5366

<400> 22

atggataagc tgctgccggg cgtggagaag gccgcggcga gcctgtcggc gcacggcggc 60

gagaaggccg ccatcgcgat caagacgacg gacaccgtgc acaagacggc ggtcgtggag 120

cgggacggct gggtggtcgg gggcatggcc aagggcgcgg ggatgctcgc cccggggctg 180

gccacgatgc tcgtggtcct gaccaccgac gcggacgtgg acgcgcccgg cctggacgac 240

gcgctgcgtg ccgccgtccg cacgaccttc gaccgggtcg actccgacgg gtgcatgtcc 300

accaacgaca ccgtgctgct cctgtcctcc gccgcctccg ggatcgtccc ggatgccgcc 360

gtcttcaccg atgccgtgcg cgaggtgtgc gacgacctgg cgcggcagct gatcggggac 420

gcggaagggg cgagcaagga catccgcatc gaggtgatca acgcggccag cgaggaggac 480

gcggtggagg tgggccggtc catcgcccgc aacaacctgc tcaagtgcgc gctgcacggt 540

gaggatccca actggggccg ggtgctgtcc gcgatcggta ccacctccgc cgccttcgat 600

cccgaccggc tcaacgtggc gatcaacgac gtgtgggtct gccgcaacgg ctccgtcggt 660

gatgaccgcg acctcgtcga catgcgttac cgcgaggtcc gcatcaccgc cgacctggcc 720

gaaggcggcg aatccgccgt catctgggcc aacgacctca ccgccgacta cgtccacgag 780

aacagcgcct actcctcatg a 801

<210> 23

<211> 1044

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) SMDS_5367

<400> 23

atgagcacca cgatcaccag cggaagcggc agcacccgca aacacaccgc cctcccgaag 60

gcccgcaccc tcgtcgaggc gctgccctgg ctgacgcggc accacggcaa gacggtcgtc 120

atcaagttcg gcggaaacgc catggtggac gacgagttga aggccgcctt cgcccaggac 180

gtcgtcttcc tccggcacgc cgggctccgc cctgtcgtcg tgcacggtgg cgggccgcag 240

atcagcgcgc agctcgaccg gttcgggatc gcgtccgagt tcaaggcggg cctgcgggtg 300

accacgcccg aggcgatgga cgtcgtccgg atggtcctcg ccgggcaggt ccagcgcgaa 360

ctcgtcggcc tgctcaaccg gcacggcccc ctcgccgtcg gcctcaccgg cgaggacgcc 420

cacaccatga ccgccacccg gcactacgcc cgcatcgacg gcgaacgcgt ggacctcggc 480

cgcgtcggcg agatcaccgc catcgacacc ggcgccgtcc aggccctgct cgacaacggc 540

cgcatcccgg tcgtctcctc gatcgcccgc agcgccgagg acgggcacgt ctacaacgtc 600

aacgccgaca ccgccgccgc cgcgctcgcc gccgccctcg gcgccgagac gctgatggtc 660

ctcaccgacg tcgagggcct ctacgcggac tggccgcaca gcgacgacgt catcagccgc 720

ctcaccgcga gcgaactgga ggcgctgctc ccggaactgt cgagcggcat ggtgcccaag 780

atggaggggt gtctgtacgc cgtccgcaac ggggtcgcca acgcccgcgt catcgacggc 840

cgggtgcagc actcgatcct gctggagatc ttcacggacg aggggatcgg cacgatggtc 900

gtcccggacg ttccggagaa caccgatcac ccgacacagc ccgggggtac cgcatcatga 960

gggcaggtgc tgctgaccac cgacgacacc agccgccgcg cgcactaccg caacgcccgc 1020

cggaccctgg accagctgct ggcc 1044

<210> 24

<211> 1260

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) SMDS_5368

<400> 24

atgaccgcca ccaacgccga cctgacccgg cgctggcaga acgccctgat ggacaactac 60

ggcaccccgc gcgtcccgct cgtgcgcggc gagggcagca cggtctggga cgccgacggc 120

acggcgtacc tcgacctcgt cggcggcatc gccgtcaacg cgctcggcca cgcccacccg 180

gccgtcgtcc gcgcggtctc cgaccagatc gccaccctgg gccacgtctc caacctctac 240

gtggccgagc cccccgtggc gttggcggaa cggctgctgg agctggccgg ccgcgacgga 300

cgcgtctact tctgcaattc cggcgccgag gcggtcgagg ccgcgttcaa gatcgcccgg 360

cggaccgggc ggccgcgcat cgtcgccgcg cggggcgggt tccacggccg gacgatgggc 420

gccctcgcgc tcaccggcca gccggccaaa caggaaccct tcctcccgct ccccggcgac 480

gtcacccacg tcccgtacgg cgacaccgaa gccctgcgcg ccgccgtcac ggaacagacc 540

gccgccgtgt tcctggagcc ggtgcagggc gagaacggcg tcgtcgtccc gccgcccggc 600

tacctcgccg ccgcccgcga gatcacccag gcggcgggag cactgctggt gctggacgag 660

atccagacag gtatcggccg caccggccac tggttcgagc acctcgccca gggcgtcgaa 720

cccgacgtcg tcaccctcgc caagggcctc ggcggcggcc tccccatcgg cgccaccctc 780

gccttcggcg acgcggcggg cctgctgacc cccggtcagc acggttcgac gttcggcggc 840

aaccccgtcg cctgcgccgc cgccctcgcc gtcctcgaca ccctcgccgc cgaggacctc 900

cccgcgcgcg ccggccgcac cgggaccctg ctccgtgacg ggatcgccgc gctcggccac 960

cctctcgtcg accacgtccg tggcgcgggc ctgctgctgg gtattgtcct ttccaagccc 1020

ctcgcaccgg acgtgcagcg ggcggctcag gaagccggtc tcctggtgaa cgcggtcgcg 1080

cccgacgtgg tgcggctggc tcctccgctg atcatcacgg aagatgaggt ggagacgttc 1140

ctccgggtgc tccccggggt cctcgacgcc gtcgccgcca ccgccgctgt cgccgccgag 1200

gcaggggcgg ccgccgcagc cctgacgggg ggctcaggag aaccacgatc cggagactga 1260

<210> 25

<211> 1233

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) SMDS_5394

<400> 25

atgcctacca ccgcatgtga tgcacgtaag gagaatcccg tgaccgagcg cgtcgtactc 60

gcctactcgg gcggcctgga cacctccgtc gccatcggct ggatcgccga ggagacgggc 120

gccgaggtca tcgccgtcgc cgtggacgtc ggccagggcg gcgaggacct ggacgtcatc 180

cgcaagcgcg cgctcgcctg cggtgcggtg gaggcggagg tcgccgacgc caaggacgag 240

ttcgccgagg agtactgcct cccggcgatc aaggccaacg ccctctacat ggaccggtac 300

ccgctggtct ccgccctctc ccggccgacg atcgtcaagc acctcgtcgc cgccgcgcgg 360

aagcacggcg ccaccacggt cgcccacggc tgcaccggca agggcaacga ccaggtgcgg 420

ttcgaggccg ggatctcctc gctcgcgccg gacctgaagt gcatcgcgcc cgtccgggac 480

tacgccatga cccgggacaa ggccatcgcc ttctgcgagg ccaagggcct gccgatcgcc 540

accaccaaga agtcgccgta ctcgatcgac cagaacgtct tcggccgggc cgtcgagacc 600

ggcttcctgg aggacatctg gaacgcgccc atcgaggacg tctacgacta cacggccaac 660

ccggccaccc cgcgcgacgc cgacgaggtc gtcatcacct tcgaggccgg cgtcccggtc 720

gcgatcgacg gccaggccgt caccgtcctc caggcgatcc agcagctcaa cgagcgggcg 780

ggcgcccagg gcatcggccg gatcgacatg gtcgaggacc ggctcgtggg catcaagtcc 840

cgggagatct acgaggcgcc cggcgccatc gcgctgatca ccgcccacca ggagctggag 900

agcgtcaccg tcgagcgcga actcgcccgc tacaagcggc aggtcgagca gcggtggagc 960

gaactggtct acgacgggct gtggttctcg ccgctcaagc gggcgctgga cggtttcatc 1020

gccgaggcca acgagcacgt cagcggcgac atccggatga ccctgcacgg cggccgggcc 1080

gtcgtcaccg gccggaagtc cgccaagtcg ctctacgact tcaacctcgc cacctacgac 1140

acgggtgaca ccttcgacca gtcgctctcc aagggcttca tcgagatctt cggcctctcg 1200

tcgaagatcg ccgccaagcg ggacctggtc tga 1233

<210> 26

<211> 1242

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) SMDS_5395

<400> 26

atgctggacg ggctcgaccg gctggaggcc gacgtggcca ccggcgcctt caccggcacc 60

gtcgccgacg aggacgtcca caccgcgctg gagcgcggcc tcctcgaacg gctcggcccc 120

gacctcggcg gcaagctgcg cgccggacgc tcccgcaacg accaggtcgc caccctcttc 180

cggatgtacc tgcgcgacca cgcgcggatc atcggcggac tgctcaccga gctccaggaa 240

gcgctcgtcg gcctcgccga ggcacaccag gacgtggcga tgcccggccg gacccacctc 300

cagcacgccc agcccgtcct cttcgcccac cacgtcctcg cccacgtcca ggcgctcggc 360

cgggacgcgg aacggctgcg gcagtgggac gagcggacgg ccgtctcccc gtacggcgcc 420

ggcgccctcg ccgggtcctc actcggcctc gacccggagg cggtcgccgc cgacctcggc 480

ttcgagcgcg gctcggtggg caactccatc gacggcacgg cgtcccggga cttcgtcgcc 540

gagttcgcgt tcatcacggc gatgatcggg atcgatctct cgcggatcgc cgaggagatc 600

atcatctgga acacgaagga gttctccttc gtcaccctcc acgacgcgtt ctcgaccggc 660

tcgtcgatca tgccgcagaa gaagaacccg gacatcgcgg agctggcgcg cggcaagtcg 720

gggcggctga tcggcaatct gaccgggctg ctcgcgacgc tcaaggcgct gccgctcgcc 780

tacaaccgcg acctccagga ggacaaggag ccggtcttcg actcctgcga ccagctggag 840

atcctgctgc ccgccttcac cgggatgatg gcgacgctca ccgtgcaccg ggagcgcatg 900

gaggagctgg cgcctgccgg gttctcgctg gccacggaca tcgcggagtg gctggtgcgg 960

cagggggtgc cgttccgggt ggcgcatgag gtggcggggg agtgcgtgaa ggtgtgtgag 1020

cggcggggga tcgagctcga cgggctcacg gacgaggagt tcgcggcgat ctcgccgcat 1080

ttgacgccgg aggtgcggac cgttctggac gttccggggt cgctcgcttc ccgtagcggg 1140

cggggcggta cggcgccttc cgcggtcgcc gcgcagctgg ccgaggtgaa ggcggagctg 1200

gtggtgcagc gggagtgggc gggcgcgaag cggcgggggt ga 1242

<210> 27

<211> 382

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) P5364

<400> 27

agtccgggcc gtgcagccac aggctctccg ccgcctcccg cagcagcacc ggatcgtccg 60

gccgttgcag cagcaccagc cggtacgcca ggttccgtat ccacaccggc aggtagccgt 120

cgaccaggta cgggctcagc tcgcgcagca tggcgaggat ctcgtccgcg ccggcgaagg 180

tcagctcctc gacgaagtag tgctccgcgt gccgcgcggc gcactccggc gtgggccggt 240

gttcgtcccc gtagaggcag cgggcgtgct cggtcagcgt ggtgtgcatg acgggcagcg 300

taggcggccg cacgcgaccg ccccccattg aataaatctt ctctccttcg tatagtcatg 360

ccatcgacga ggaggcaccc cg 382

<210> 28

<211> 500

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌IPIO(Streptomyces mobaraensis IPIO) P5394

<400> 28

tagtcgttct tgtcgttctt cgacgagacg atctcgatcg cggccaagag atcttcatgc 60

gagtacgggt ctgtcgatcc gtcgtcggtg atcgccacgt ccgggcaccg atcgggctcc 120

ccggggaagc cgaactccac atcattcagg acgcgttgcc tgtcgacacc ggacgcgacg 180

attgcggtct ggacgtcgaa gacggtccag ctccgaacgc tgctctgcgg agtcatgatg 240

acccggtccc ccactgcctc gatcttgaag cccttgagca gcggcgacac gcgttcgatg 300

gcgttccgca tggattcgat ccccgcgtcg tgcggggact ccatccgcgc gttgtgcggg 360

cgctcaagct gcgcagtcat ggtctgcctc ccctactcgg gcctcgcgat actcgcatcg 420

tagaacgccc cgccgatacc cgtgcccgct tgattcaccc tttcgagccc ttgacgaaac 480

atacggcgca ctgcatagtt 500

<210> 29

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

atattctaga cgcgagtagc gccgcggcct gt 32

<210> 30

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

atatgaattc tcagccccgg atgtgcccgt cg 32

<210> 31

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gcttgggctg caggtcgact ctagaccggc cggcgtatca ctgggtg 47

<210> 32

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

tacgaattac tagtcatgag aattctcacc gcacgggatg cccagcc 47

<210> 33

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

cttgggctgc aggtcgactc tagaacctgg agggcaaggc caaggagctg 50

<210> 34

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tacgaattac tagtcatgag aattctcagc cgcggagttc ctccgcgagc 50

<210> 35

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

atattctaga agtccgggcc gtgcagccac ag 32

<210> 36

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

atatgaattc tcagtctccg gatcgtggtt ct 32

<210> 37

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

atatgaattc tagtcgttct tgtcgttctt cgac 34

<210> 38

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

atatactagt tcacccccgc cgcttcgcgc c 31

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

accgcatcag gcgccattcg 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gccgccggtg ccgacgcccg 20

<210> 41

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

ccgctccacg tgcttcgtcg cg 22

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

ggcgcgggac cagtcggcgg t 21

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

ccggtgcccg cccccgaccc 20

Claims

1.一种通过增强氨基酸合成基因的转录水平而获得的TG酶高产菌株，其特征在于，所述菌株的脯氨酸、组氨酸、芳香族氨基酸或精氨酸合成途径中的基因过量表达。

2.如权利要求1所述的增TG酶高产菌株，其特征在于，在茂源链霉菌IPIO中分别过量表达来源于茂源链霉菌IPIO的脯氨酸合成基因SMDS_4329-SMDS_4331、组氨酸合成基因SMDS_4883-SMDS_4890、芳香族氨基酸合成基因SMDS_5474-SMDS_5478、精氨酸合成基因SMDS_5364-SMDS_5368和精氨酸合成基因SMDS_5394-SMDS_5395。

3.一种用于过量表达氨基酸合成基因的整合型质粒载体，其特征在于，所述载体包含源于茂源链霉菌IPIO的脯氨酸合成基因SMDS_4329-SMDS_4331及其启动子P_proB，组氨酸合成基因SMDS_4883-SMDS_4890及其启动子P_hisD，芳香族氨基酸合成基因SMDS_5474-SMDS_5478及其启动子P_aroE，或精氨酸合成基因SMDS_5364-SMDS_5368、SMDS_5394-SMDS_5395及其启动子P₅₃₆₄、P₅₃₉₄。

4.根据权利要求3所述的整合型质粒载体，其特征在于，

所述脯氨酸合成基因SMDS_4329-SMDS_4331的序列如SEQ ID NO.1-NO.3所示，所述启动子P_proB的序列如SEQ ID NO.4所示；

所述组氨酸合成基因SMDS_4883-SMDS_4890的序列如SEQ ID NO.5-NO.12所示，所述启动子P_hisD的序列如SEQ ID NO.13所示；

所述芳香族氨基酸合成基因SMDS_5474-SMDS_5478的序列如SEQ ID NO.14-NO.18所示，所述启动子P_aroE的序列如SEQ ID NO.19所示；

所述精氨酸合成基因SMDS_5364-SMDS_5368的序列如SEQ ID NO.20-NO.24所示，所述启动子P₅₃₆₄的序列如SEQ ID NO.27所示；

所述精氨酸合成基因SMDS_5394-SMDS_5395的序列如SEQ ID NO.25-NO.26所示，所述启动子P₅₃₉₄的序列如SEQ ID NO.28所示。

5.一种根据权利要求3或4所述的整合型质粒载体的构建方法，其特征在于，构建步骤如下：

通过PCR扩增得到P_proB和SMDS_4329-SMDS_4331基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pSET152中的XbaI/EcoRI位点，获得整合型质粒载体pLQ1766；

或，通过PCR扩增得到P_hisD和SMDS_4883-SMDS_4890基因序列的PCR片段，通过Gibson连接的方法连入整合型质粒pSET152中的XbaI/EcoRI位点，获得整合型质粒载体pLQ1769；

或，通过PCR扩增得到P_aroE和SMDS_5474-SMDS_5478基因序列的PCR片段，通过Gibson连接的方法连入整合型质粒pSET152中的XbaI/EcoRI位点，获得整合型质粒载体pLQ1770；

或通过PCR扩增得到P₅₃₆₄和SMDS_5364-SMDS_5368基因序列的PCR片段与3255bp的P₅₃₉₄和SMDS_5394-SMDS_5395基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pSET152中的XbaI/SpeI位点，获得整合型质粒载体pLQ1772。

6.一种高产谷氨酰胺转氨酶的茂源链霉菌菌株，其特征在于，将如权利要求3或4所述的整合型质粒载体，或如权利要求5所述的方法构建得到的整合型质粒载体分别接合转移导入受体菌茂源链霉菌IPIO中进行位点特异性重组获得所述菌株。

7.一种提高谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于，通过增强脯氨酸、组氨酸、芳香族氨基酸或精氨酸合成基因的转录水平，最终提高茂源链霉菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶的产量。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在茂源链霉菌IPIO中过量表达来源于茂源链霉菌IPIO的脯氨酸合成基因SMDS_4329-SMDS_4331、组氨酸合成基因SMDS_4883-SMDS_4890、芳香族氨基酸合成基因SMDS_5474-SMDS_5478或精氨酸合成基因SMDS_5364-SMDS_5368和SMDS_5394-SMDS_5395，获得过量表达突变株，发酵，获得谷氨酰胺转氨酶。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵包括以下步骤：将活化后的过表达突变株孢子接种于种子培养基中，30℃、200-220rpm条件下培养24h，按10％接种量转接至发酵培养基中，30℃、200-220rpm的条件下发酵28-32h。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，以w/v计，所述种子培养基包括甘油1-3％，酵母提取物0.4-0.8％，鱼粉蛋白胨1-3％，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.3％，K₂HPO₄·3H₂O 0.1-0.3％；

以w/v计，所述发酵培养基包括甘油1-3％，酵母提取物0.4-0.8％，鱼粉蛋白胨1-3％，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.3％，K₂HPO₄·3H₂O 0.1-0.3％，发酵促进剂0.1-0.4％。