CN101429514A

CN101429514A - 一种双羰基还原酶、其基因及其应用

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Publication number: CN101429514A
Application number: CNA2007101353918A
Authority: CN
Inventors: 陈依军
Original assignee: Individual
Current assignee: CHANGZHOU JINLONG BIOLOGICAL MEDICINE Co Ltd
Priority date: 2007-11-08
Filing date: 2007-11-08
Publication date: 2009-05-13
Anticipated expiration: 2027-11-08
Also published as: CN101429514B

Abstract

本发明公开了一种双羰基还原酶的基因，它的核苷酸序列与SEQ ID NO.1具有80％以上的同源性。一种双羰基还原酶，由与SEQ ID NO.2具有80％以上的同源性的氨基酸序列组成。上述获得的双羰基还原酶可用于催化双羰基化合物还原成双羟基产物反应，具备高度的立体选择性。

Description

一种双羰基还原酶、其基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种新的基因及其蛋白质产物，具体涉及一种双羰基还原酶的基因；同时涉及该基因在催化手性醇合成中的应用。

背景技术

手性醇是一类重要的中间体化合物，广泛应用于手性药物和其他手性精细化学品的合成。目前，采用生物催化合成这类化合物是一种有效的方法，即将含有羰基的底物通过特定的酶催化还原为相应的手性醇。

然而，当底物中含有两个或两个以上手性羰基时，生物催化反应会因为酶的立体选择性问题而带来较大的困难。以3，5-双羰基-6苄氧基-己酸乙酯为例，该化合物的β，γ位上含有两个羰基，存在立体选择性问题。对此，美国发明专利US5324662报道了一种微生物Acinetobacter calcoaceticusATCC33305能立体选择性地还原上述底物，反应式如下：

但该发明专利并没有分离出其中的活性酶和基因。随后，Guo等人在文献Tetrahedron：Asymmetry，2006，17，P.1589-1602中报道了在Acinetobactersp.SC13874中存在三种不同的羰基还原酶并对其进行了纯化，其中，还原酶III表现出了与整体微生物相似的催化活性和底物选择性。虽然上述文献给出了三段短肽序列，但对该酶的完整基因及蛋白质序列尚一无所知。此外，对于该酶是否能直接催化双羰基一步直接还原成单一手性双羟基产物也无直接证据。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的基因及其蛋白质序列，其可以通过基因表达后大量产生具有高度立体选择性的双羰基还原酶，用以直接还原在β，γ位上含有双羰基的己酸酯类生成单一非对映异构体的手性双醇。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种双羰基还原酶的基因，它的核苷酸序列与SEQ ID NO.1具有80％以上的同源性。

进一步的技术方案是，双羰基还原酶的基因，它的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

一种双羰基还原酶，由与SEQ ID NO.2具有80％以上的同源性的氨基酸序列组成。

进一步的技术方案，所述双羰基还原酶，由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成。

上述双羰基还原酶在催化双羰基化合物还原成双羟基产物反应中作为催化剂的应用。

所述双羰基化合物由以下化学通式表达：

其中，R¹选自芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂环基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基；

R²选自烷基、环烷基、卤烷基或卤环烷基。

所述的双羟基产物由以下化学通式表达：

其中，R¹是芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂环基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基；

R²是烷基、环烷基、卤烷基或卤化烷基。

其制备方法是：从Acinetobacter calcoaceticus ATCC33305的基因组中克隆双羰基还原酶的基因；应用合适的表达载体将该基因在大肠杆菌中有效地表达重组蛋白质；采用合适的检测方法测定该酶的催化功能和性质。

上述技术方案中，所述的基因是指由四种核苷酸碱基排列组合成一定长度的序列；所述的蛋白质是指由20种氨基酸排列组合成一定长度的序列；所述的酶是指具有催化活性的蛋白质。

根据现有的公共知识，任何基因经操作或改造后再接到各种表达载体上，然后导入宿主细胞中，其启动子在适当的诱导剂或外界条件变化时可诱导产生过量的蛋白质。用于表达的载体既可来源于商业途径，也可来自通过DNA重组技术构建。宿主细胞可以是像大肠杆菌、链霉菌等原核细胞，也可以是像酵母菌、CHO等真核细胞。

任何基因通过DNA重组技术可以改变其序列，从而产生各种不同的突变体。这些突变体所表达的蛋白质通常具有类似的性质。当基因或蛋白质序列达到一定的同源性时，它们所表达的蛋白质的性质随同源性增加而更为相似。本发明涉及的基因及其产物也具有相同的特点。当同源性达到80％以上时，类似基因所表达的蛋白质将会具有催化双羰基化合物还原为双羟基化合物的性质。

本发明所涉及的基因是通过DNA重组技术从细菌Acinetobactersp.ATCC33305的染色体中克隆，并经连接在pET22b(+)表达载体后在大肠杆菌中过量表达。经过量表达的双羰基还原酶在SDS-PAGE上呈现的分子量约为30KD，其最佳反应pH为6.0，有效作用的pH范围为4.5～7.0，并且在20～50℃均具备良好的催化活性。

由于上述技术方案的使用，本发明的有益效果是：

利用本发明的基因进行表达，获得双羰基还原酶，在辅酶NADH或NADPH或再生体系存在的情况下，该酶能有效地催化双羰基化合物的还原，例如使3，5-二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯直接生成3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯，同时该生物催化反应具备高度立体选择性，产物的ee值达99.5％以上，de值也达99.5％以上。如此高效和高选择性的双羰基还原反应尚无先例。

附图说明

图1是实施例二中双羰基还原酶过量表达的SDS-PAGE分析；

图2是实施例二中双羰基还原酶过量表达与时间的关系；

图3是实施例四中双羰基还原酶的最适pH范围；

图4是实施例五中双羰基还原酶的最适反应温度；

图5是实施例三中产物光学纯度的HPLC分析图谱；

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：双羰基还原酶基因的克隆

1.菌种及培养条件

菌种Acinetobacter sp.ATCC33305从美国ATCC购得并按说明在培养基中生长，生长后的菌种于甘油冻存管在-70℃保存。

甘油冻存管用LB培养基(基本组分：每升含10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl)在37℃，250rpm条件下培养20小时，然后离心收集细菌，用SDS加溶菌酶的方法破细胞后，用酚-氯仿方法获得基因组DNA。

2.基因的克隆

根据双羰基还原酶已知N-末端部分的氨基酸序列TGITNVTV(引物NO.1：5＇-ACIGGIATIACIAAYGTIACIGTI-3＇)和已知中间肽序列GELAPAK(引物NO.2：5＇-GGIGARCTRGCICCIGCIAAR-3＇)设计随机引物组，其中“A”，“G”，“C”，“T”，“I”分别代表腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、脱氧腺苷；“R”＝A+G和“Y”＝C+T。利用这对引物和Acinetobacter sp.ATCC33305基因组DNA扩增获得双羰基还原酶基因基因片段，其PCR扩增条件如下：94℃ 1分钟94℃ 30秒，45℃ 30秒，72℃ 30秒(30个循环)，最后72℃ 5min。利用凝胶回收试剂盒(Axygen Scientific，Inc.，美国)从琼脂糖凝胶上回收分子量大约为350bp的PCR片段，并且连接到克隆载体pTOPO-TA中。通过DNA序列分析发现该基因编码的氨基酸序列与已知的双羰基还原酶的肽段序列组成相吻合，但不是全长的完整基因。

为了得到完整的基因序列，采用质粒文库构建试剂盒构建Acinetobactersp.ATCC33305的DNA文库，然后用地高辛标记的上述双羰基还原酶-特异PCR片段为探针在42℃杂交18小时。经洗脱后，用抗地高辛抗体进行检测，然后用碱裂解法从细菌中提取获得基因组DNA。用一系列的限制性内切酶对上述DNA进行酶切，经Kpnl酶切和电泳后可以分离得到一个全长约5.2kb并含完整双羰基还原酶基因的DNA片段，并从胶上回收此DNA片段。根据已经测定序列的PCR片段合成引物，经相同的PCR反应条件得到完整双羰基还原酶基因的5＇和3＇序列。经上海英俊生物技术公司测序后，得到全长849bp的双羰基还原酶基因，其翻译后的蛋白质序列由283个氨基酸组成。

实施例二双羰基还原酶的表达

为了便于双羰基还原酶基因的表达，在寡聚核苷酸引物的5’和3’末端设计了兼容的限制性酶切位点。其引物对为引物NO.3(5’-ATACGTGCCATATGACCGGCATCACGAATGTCACCGTTCT3’)

和引物NO.4

(5’-ATACGTGCAGATACGTGCAGGATCCTCAGTACCGGTAGAAGCCCTCG-3’)，分别带有NdeI和BamHI酶切位点。以5.2kb KpnI DNA片断作为模板，引物NO.3和引物NO.4为引物对，进行PCR扩增。经琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶回试剂盒回收得到连接引物的目的基因。用NdeI和BamHI分别将目的基因和pET22b(+)质粒同时进行酶切，T4DNA连接酶进行连接反应，经纯化后将连接产物转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株的感受态中，涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养平皿中，37℃培养过夜。挑取上述培养平皿上的单菌落接种于25mL含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB液体培养基内，37℃过夜培养，取500μl接种到50mL含氨苄青霉素的新鲜LB液体培养基内，37℃振荡培养至OD_600nm值约为0.8时，加入IPTG至终浓度分别为1000uM，500uM，200uM和50uM，在20℃下进行诱导表达，并且设立空白载体pET22b(+)对照和不加IPTG诱导剂的阴性对照。诱导12h后，取出菌液，13,500rpm/min离心收集菌体。然后再用高压细胞破碎仪破碎细胞，13,500离心40min获得上清液和沉淀用垂直电泳仪进行SDS—PAGE检测。结果发现50uM IPTG浓度时诱导表达双羰基还原酶的量最多。为确定是否可溶性表达，将含有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG终浓度为50uM，15℃条件下诱导表达，并且设立空白载体pET22b(+)对照和不加IPTG诱导剂的阴性对照。诱导时每隔2小时，每组取1.5ml菌液，离心称重，以考察诱导时间对酶表达量的影响。诱导14小时后收集菌体，离心称重，然后再用高压细胞破碎仪破碎细胞，13,500离心40min获得上清液和沉淀用垂直电泳仪进行SDS—PAGE检测以确定该酶是否为可溶性表达。取20ul上清液用1×SDS上样缓冲液80ul进行处理，收集的菌体和破碎后的菌体沉淀均用重量×100的1×SDS上样缓冲液处理，上样量均为15ul，标准分子量的蛋白质购自于美国Sigma公司。SDS—PAGE的胶浓度为15％，先60V进行浓缩电泳，再改为150V进行分离电泳。结果表明随着诱导时间的增长，双羰基还原酶的表达量逐渐增加，大约在诱导12小时后达到最大表达量。并且在此条件下，大部分双羰基还原酶(分子量30kD)表达在可溶性部分。

参见图1，双羰基还原酶过量表达的SDS-PAGE分析。15％ SDS-PAGE分析IPTG诱导时间对双羰基还原酶(30KD)表达的影响：泳道1为不同分子量的蛋白质标准品。泳道2，3，4，5，6，7，8分别是IPTG诱导后0h，2h，6h，8h，10h，12h，14h。

参见图2，双羰基还原酶过量表达与时间的关系。15％ SDS-PAGE：泳道1为不同分子量的蛋白质标准品；泳道2和3分别是含空白载体pET22b(+)诱导和不诱导的全菌蛋白；4和5分别表示含重组质粒不诱导和IPTG诱导；6是含重组质粒经IPTG诱导后大肠杆菌的上清液；7是含重组质粒经诱导后大肠杆菌的沉淀。

实施例三双羰基还原酶的活性测定

双羰基还原酶的活性是通过HPLC和紫外吸收的两种方法来进行的测定，其测定的方法和结果如下：

1 HPLC方法

该方法用的反应体系是：

双羰基底物 2.5mM

NAD⁺ 0.5mM

甲酸脱氢酶 2U

甲酸钠 200mM

双羰基还原酶 0.1-2mg

用0.1M的pH 6.0磷酸盐缓冲液补到最终体积为0.5ml。反应在28℃，200rpm的条件下进行18h后，用同等体积的乙醇终止。混匀，离心5min，上清液用于HPLC(日本岛津)检测，洗脱溶剂为A.含0.1％ TFA的水；B.含0.1％ TFA的乙腈。HPLC洗脱的梯度为20—90％ B，梯度时间为12min。其酶的活力以得到1μg产物所需要酶的量为1个单位。参见附图5所示，为产物光学纯度的HPLC分析图谱，3R，5S-双羟基产物的保留时间为23.6分钟，而其他光学异构体的保留时间在17—22分钟之间。通过HPLC数据分析其活力为49.80μg/h/mg蛋白质。

2 紫外分析方法

该方法的反应体系为：

双羰基底物 0.25mM

NADH 0.15mM

双羰基还原酶 5ul

0.1M，pH6.0磷酸缓冲液 2950ul

该方法是利用恒温紫外仪UV-1700(日本岛津)检测NADH在340nm吸光度的降低来测定酶的活性。其活力单位定义是：在30℃，pH6.0条件下A340_nm/min下降。以每分钟氧化1μmole NADH所需的酶量为1个单位。通过计算得到该酶的活力为37.45U/ml。

实施例四双羰基还原酶的最佳pH

参见附图3，利用恒温紫外仪UV-1700(日本岛津)检测在室温条件下，不同pH缓冲液中NADH在340nm吸光度的降低来测定不同pH条件下双羰基还原酶的活性，从而确定双羰基还原酶最适反应pH。其反应体系为：

双羰基底物 0.25mM

NADH 0.15mM

双羰基还原酶 5ul

0.1M，不同pH缓冲液 2950ul

双羰基还原酶在不同pH缓冲液中具有不同的活性，在pH6.0的磷酸缓冲液中该酶的活力最高，因此双羰基还原酶最佳反应pH为6.0。

实施例五双羰基还原酶的最佳温度

参见附图4，利用恒温紫外仪UV-1700(日本岛津)检测在pH6.0磷酸缓冲液中，不同温度的条件下，反应体系中NADH在340nm吸光度的降低来测定不同反应温度条件下双羰基还原酶的活性，从而确定双羰基还原酶最佳反应温度。其反应体系为：

双羰基底物 0.25mM

NADH 0.15mM

双羰基还原酶 5ul

0.1M，pH6.0磷酸缓冲液 2950ul

双羰基还原酶的最适反应温度大约在40℃左右。

实施例七还原反应及反应产物鉴定

由于要对产物进行光学纯度检测，故该反应体系适当地增加了底物的浓度，其反应体系如下：

双羰基底物 2mg/ml

NAD⁺ 0.5mM

甲酸脱氢酶 4U/ml

双羰基还原酶 33.3ul

用0.1M的pH 6.0磷酸盐缓冲液补到最终体积为1.0ml。反应在28℃，200rpm的条件下进行18h后，用同等体积的正己烷提取。有机相吹干后用乙醇溶解，进行C18—HPLC分析。通过对双羟基产物的峰面积的计算得出底物的转化率为100％。然后再用OD-RH手性分析柱(Daicel chemical industries，美国)进行手性分析，洗脱溶剂为A.含0.1％ TFA的水；B.含0.1％ TFA的乙腈，洗脱的梯度为B20—25％，梯度时间为25分钟并在25％ B保持5分钟。经对产物峰面积的积分计算得3R，5S-双羟基目标产物的de和ee值均为100％。

<110>陈依军

<120>一种双羰基还原酶、其基因及其应用

<160>2

<210>1

<211>852

<212>DNA

<213>双羰基还原酶(diketoreductase)

<400>1

atgaccggca tcacgaatgt caccgttctc ggaaccggcg tgctgggttc gcag 54

atcgcgttcc agaccgcgtt ccacggcttc gccgtcaccg cgtacgacat caac 108

accgacgcgc tcgacgccgc caagaagcgc ttcgagggcc tcgcggccgt gtac 162

gagaaggagg tcgcgggcgc tgcagacggc gccgcgcaga aggcgctggg cggc 216

atccgctact ccgacgacct ggcgcaggcc gtgaaggacg ccgacctcgt catc 270

gaggccgtgc cggagagcct cgacctcaag cgcgacatct acacgaagct gggc 324

gagctggcgc cggcgaagac gatcttcgcc accaactcct ccaccctgct gccg 378

agcgacctgg tcggctacac cggccggggc gacaagttcc tcgccctgca cttc 432

gccaaccacg tgtgggtgaa caacaccgcc gaggtgatgg gcacgacgaa gacc 486

gaccccgagg tgtaccagca ggtcgtcgag ttcgcctccg cgatcgggat ggtg 540

ccgatcgagc tgaagaagga gaaggcgggc tacgtgctca actccctcct cgtc 594

ccgctgctgg atgcggcggc cgagctgctg gtggacggca tcgccgaccc cgag 648

acgatcgaca agacgtggcg catcggcacg ggcgcaccca agggtccgtt cgag 702

atcttcgaca tcgtcggcct cacgacggcc tacaacatct cctcggtctc cggc 756

cccaagcagc gcgagttcgc cgcgtacctc aaggaaaact acatcgacaa aggc 810

aagctgggcc tcgcgaccgg cgagggcttc taccggtact ga 852

<210>2

<211>283

<212>PRT

<213>双羰基还原酶(diketoreductase)

<400>2

Met Thr GlyIle Thr Asn Val Thr Val Leu Gly Thr Gly Val Leu Gly

1 5 10 15

Ser Gln Ile Ala Phe Gln Thr Ala Phe His Gly Phe Ala Val Thr Ala

20 25 30

Tyr Asp Ile Asn Thr Asp Ala Leu AspAla Ala Lys Lys Arg Phe Glu

35 40 45

Gly Leu Ala Ala Val Tyr Glu Lys Glu Val Ala Gly Ala Ala Asp Gly

50 55 60

Ala Ala Gln Lys Ala Leu Gly GlyIle Arg Tyr Ser Asp Asp Leu Ala

65 70 75 80

Gln Ala Val Lys Asp Ala Asp Leu Val Ile Glu Ala Val Pro Glu Ser

85 90 95

Leu Asp Leu Lys Arg Asp Ile Tyr Thr Lys Leu Gly Glu Leu Ala Pro

100 105 110

Ala Lys Thr Ile Phe Ala Thr Asn Ser Ser Thr Leu Leu Pro Ser Asp

115 120 125

Leu Val Gly Tyr Thr Gly Arg Gly Asp Lys Phe Leu Ala Leu His Phe

130 135 140

Ala Asn His Val Trp Val Asn Asn Thr Ala Glu Val Met Gly Thr Thr

145 150 155 160

Lys Thr Asp Pro Glu Val Tyr Gln Gln Val Val Glu Phe Ala Ser Ala

165 170 175

Ile Gly Met Val Pro Ile Glu Leu Lys Lys Glu Lys Ala Gly Tyr Val

180 185 190

Leu Asn Ser Leu Leu Val Pro Leu Leu Asp Ala Ala Ala Glu Leu Leu

195 200 205

Val Asp Gly Ile Ala Asp Pro Glu Thr Ile Asp Lys Thr Trp Arg Ile

210 215 220

Gly Thr Gly Ala Pro Lys Gly Pro Phe Glu Ile Phe Asp Ile Val Gly

225 230 235 240

Leu Thr Thr Ala Tyr Asn Ile Ser Ser Val Ser Gly Pro Lys Gln Arg

245 250 255

Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Lys Glu Asn Tyr Ile Asp Lys Gly Lys Leu

260 265 270

Gly Leu Ala Thr Gly Glu Gly Phe Tyr Arg Tyr

275 280

Claims

1.一种双羰基还原酶的基因，它的核苷酸序列与SEQ ID NO.1具有80％以上的同源性。

2.根据权利要求1所述的双羰基还原酶的基因，它的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

3.一种双羰基还原酶，由与SEQ ID NO.2具有80％以上的同源性的氨基酸序列组成。

4.根据权利要求3所述的双羰基还原酶，由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成。

5.权利要求3或4所述的双羰基还原酶在催化双羰基化合物还原成双羟基产物反应中作为催化剂的应用。

6.权利要求5所述的应用，其特征在于：所述双羰基化合物由以下化学通式表达：

R²选自烷基、环烷基、卤烷基或卤环烷基。

7.权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的双羟基产物由以下化学通式表达：

R²是烷基、环烷基、卤烷基或卤化烷基。